CN108314722A - 一种抗菌肽及其应用 - Google Patents

Abstract

一种抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列为SEQ ID No.1。本发明在对猪源抗菌肽PMAP‑36的氨基酸序列进行空间结构分析的基础上，将猪源抗菌肽PMAP‑36氨基酸序列中的5处氨基酸进行突变，分别是L7V，T11S，I18E，I25A和I32A，获得了一种抗菌活性更高、安全性更好的抗菌肽产品。

Description

一种抗菌肽及其应用

技术领域：

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种抗菌肽及其应用。

背景技术：

我国是世界上最大的抗生素生产和使用国，也是抗生素滥用和细菌耐药性的重灾区。抗生素滥用，特别是畜牧业领域尤其严重。畜牧业养殖户之所以喜欢使用抗生素,原因在于抗生素不仅可以防病治病,而且还能促进动物生长、提高产量，许多养殖户普遍将饲用抗生素添加到饲料中，当做保健品来促生长。而这导致的“超级细菌”风险、环境污染加重等问题，正在挑战国人健康底线，兽用抗生素所导致的细菌抗药性和所产生的“超级细菌”，不会局限于禽畜,也会影响到人类。 数据显示，全国2013年使用的 16.2万吨抗生素中，兽用52%，人用48%，一年超过5万吨抗生素排放进水土环境中。2014年以来，抗生素使用量仍在上升，其中绝大部分是作为饲料添加剂而不是治疗疾病使用。抗生素由于具有药物残留及细菌耐药性问题， 因此迫切需要发现一种绿色、无污 染和无细菌耐药性的抗生素替代物。

抗菌肽（antimicrobial peptide）是一种具广谱抗菌、抗病毒甚至抗寄生虫活性的阳离子短肽，是生物体内广泛存在一种具有抗菌作用的活性多肽，是生物非特异性防御系统的免疫应答产物， 具有广谱抗菌活性， 可以抑制多种细菌或真菌的生长。抗菌肽由于其主要通过物理渗透作用于细菌胞膜而产生抑菌或者杀菌作用， 而细菌等微生物很难改变其自身磷脂双分子层的胞膜结构， 因此使得抗微生物肽产生耐药性的几率大大降低。并且大部分抗菌肽具有热稳定性高的特点，所以抗菌肽越来越引起人们的重视。抗菌肽广泛存在于微生物以及动植物体内，目前已发现的抗菌肽有1800多种。至今在鱼类中鉴定出的抗菌肽包括hepcidin，defensins，pleurocidin，piscidin，moronecidin，misgurain，pardaxin，parasin，LEAP-2和NK-lysin等数十种。抗菌肽的研究已成为基因工程和 药物开发等领域的研究热点， 具有极为广阔的市场应用前景。

发明专利申请CN201510084023.X公开了一种抗菌肽C-BF在制备防治仔猪断奶应激药物中的应用；抗菌肽C-BF能改善肠道形态，增加绒毛高度，缓解肠道炎症，提高断奶仔猪生长性能，减少腹泻率；抗菌肽C-BF通过腹腔注射给药。发明专利申请CN201410669038.8通过生物软件对猪源抗菌肽PR-39的氨基酸序列进行空间结构分析，将其39个氨基酸中的3处氨基酸进行突变，获得一种新型猪源抗菌肽PR-39突变体，使其抗菌效力获得显著提高。在此基础上，选用毕赤酵母偏爱密码子，人工合成新型猪源抗菌肽PR-39突变体基因，克隆于毕赤酵母中表达，获得新型抗菌肽重组酵母菌株，并将发酵规模放大到发酵罐水平，实现抗菌肽产品的高密度发酵和高效表达。发酵液进一步纯化后可制成粉剂、液体等抗菌肽制剂用于畜禽疾病的预防和治疗。发明专利申请CN200710176477.5公开了一种提取猪血抗菌肽的方法，该方法包括以下步骤：1)将猪血粉溶入缓冲液中，然后在混合液中加入木瓜蛋白酶进行酶解，调整酶解液的pH为3.5～4.5；2)将氯仿和亚硫酸氢钠加入到所述酶解液中进行脱色，然后调整脱色后酶解液的pH值至6.0～7.0，成为猪血抗菌肽的粗提物。为了得到猪血抗菌肽的精制品，对所述粗提物进行以下纯化步骤：1)冷冻干燥所述猪血抗菌肽的粗提物，并将所述粗提物过凝胶型阳离子交换柱，对交换柱进行洗脱，收集洗脱液；2)对所述洗脱液进行真空冷冻干燥，成为猪血抗菌肽。翟少伟（水生生物学报）等研究了饲料中添加抗菌肽Surfactin对吉富罗非鱼肠道健康指标的影响，试验表明,吉富罗非鱼饲料中适量添加抗菌肽Surfactin可增加肠道皱襞高度、调节肠道菌群和提高肠道抗氧化能力而改善肠道健康状态。李伦锋（中国动物传染病学报）等以猪链球菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪支气管败血波氏杆菌、猪致病性大肠杆菌、化脓性链球菌7株猪呼吸道常见菌为实验菌,检测猪小肠抗菌肽对常见的猪呼吸道菌的抑菌效果。结果显示,猪小肠抗菌肽对这7株呼吸道菌均有不同程度的抑菌作用,对化脓性链球菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌作用最为明显,最小抑菌浓度均为49.5μg/m L,对猪链球菌和大肠杆菌也有较为明显的抑菌活性,而对猪支气管败血波氏杆菌的最小抑菌浓度为398μg/mL。尽管抗生肽的研究较多，但是也存在一些问题，例如，抗菌活性低，对于正常细胞如红细胞等也造成溶血作用等等问题。

发明内容：

基于现有技术中抗菌肽生产和使用中存在的诸多问题，以及丰富抗菌肽种类的考虑，本发明旨在提高一种新的抗菌肽，其通过对猪源抗菌肽PMAP-36进行改造，获得了一种抗菌活性更高、安全性更好的抗菌肽产品。

为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种猪源抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列为SEQ ID No.1。

所述SEQ ID No.1的氨基酸序列为：

VGRFRRVRKKSRKRLKKEGKVLKWAPPIVGSAPLGCG。

本发明所述的抗菌肽相比原始的猪源抗菌肽PMAP-36氨基酸序列（SEQ ID No.2）中的5处氨基酸进行突变，分别是L7V，T11S，I18E，I25A和I32A。所述原始的猪源抗菌肽PMAP-36氨基酸序列为SEQ ID No.2：VGRFRRLRKKTRKRLKKIGKVLKWIPPIVGSIPLGCG。

本发明还请求保护氨基酸序列为SEQ ID No.1的猪源抗菌肽在制备治疗仔猪腹泻的药物中的应用。

其中所述药物为口服液饮剂，所述抗菌肽在该药物中的浓度为20μg/mL。

其中所述药物用于治疗仔猪腹泻时，每头份服用饮剂5mL。

本发明还请求保护氨基酸序列为SEQ ID No.1的猪源抗菌肽在制备畜禽饲料添加剂中的应用，所述饲料添加剂能够预防和/或治疗由大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鸡沙门氏菌和猪副伤寒沙门氏菌等致病菌所导致的疾病。

本发明在对猪源抗菌肽PMAP-36 的氨基酸序列进行空间结构分析的基础上，将猪源抗菌肽PMAP-36氨基酸序列中的5处氨基酸进行突变，分别是L7V，T11S，I18E，I25A和I32A，获得了一种抗菌活性更高、安全性更好的抗菌肽产品。

附图说明：

图1：通过分析软件模拟的猪源抗菌肽PMAP-36改造后和改造前的二级结构模型。其中A为本发明的抗菌肽，即改造后的猪源抗菌肽PMAP-36；B为原始的猪源抗菌肽PMAP-36。

图2：抑菌试验。其中阳性对照为氨苄青霉素溶液，阴性对照为蒸馏水，A和B孔分别滴加浓度为50μg/ml的改造后的猪源抗菌肽PMAP-36突变体和改造前的PMAP-36（其氨基酸序列为SEQ ID No.2）。

具体实施方式：

实施例1：猪源抗菌肽PMAP-36突变体的制备

第一，猪源抗菌肽PMAP-36(SwissProt ID: P49931) 是由37个氨基酸组成的抗菌肽。然而，通过结构分析表明，该抗菌肽具有多个折叠结构（参见图1B），不利于抗菌肽的表达和在抗菌过程的穿膜，为了进一步提高其抑菌活性，通过对猪源抗菌肽PMAP-36 的氨基酸序列进行空间结构分析，最后完成猪源抗菌肽PMAP-36中 5处氨基酸突变 (L7V，T11S，I18E，I25A和I32A)，获得猪源抗菌肽PMAP-36突变体，其氨基酸序列为 SEQ ID NO:1。

第二，委托相关多肽合成公司，采用固相合成法合成制备得到氨基酸序列为SEQID No.1的猪源抗菌肽PMAP-36突变体，经检测，纯度高达98%。

实施例2：抑菌试验

以实验室活化后的试验菌株大肠杆菌为受试对象，釆用抑菌操作方法，设置阳性对照（氨苄青霉素溶液），阴性对照（蒸馏水），研究改造前的抗菌肽PMAP-36以及实施例1所制备得到的改造后的氨基酸序列为SEQ ID No.1的猪源抗菌肽PMAP-36突变体的抑菌效果。其中以大肠杆菌为受试菌，做抗菌肽对大肠杆菌的抑菌试验，培养条件为37℃恒温培养箱中培养。其中各孔分别滴加50μL待测样品，阳性对照组的amp浓度为1M，A和B孔分别滴加浓度为50μg/ml的改造后的猪源抗菌肽PMAP-36突变体和改造前的PMAP-36（其氨基酸序列为SEQID No.2）。

由图2的试验结果可知，阳性对照组（氨苄青霉素溶液）的抑菌圈大小为2.31cm，而A孔（改造后的猪源抗菌肽PMAP-36突变体）的抑菌圈大小为2.96cm，B孔（固相合成的改造前的PMAP-36）的抑菌圈直径大小为1.76cm。由此可以表明，改造前的PMAP-36的抑菌能力弱于氨节青霉素溶液，而改造后的的猪源抗菌肽PMAP-36突变体的抑菌能力略强于氨苄青霉素溶液，明显强于改造前的PMAP-36。

实施例3：最低溶血浓度测定 (MHC)

参照发明专利申请CN201410669038.8的实施例5，进行抗菌肽的最低溶血浓度测定。具体方法如下：

（1）将重悬于 PBS 中的 8％猪红细胞 100μL加入 96 孔板中，再加入 PBS 系列稀释的抗菌肽 100μL，使各孔中抗菌肽的浓度分别为100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.12μg/mL、1.56μg/mL 和0.78μg/mL。阳性对照孔加入100μl 0.2％Triton X-100，阴性对照孔加100μL PBS，37℃孵育1h后，3000rpm离心5min后，从各孔吸取100μL上清到另一96 孔板中，550nm 波长测定 OD 值，计算溶血百分比＝[(实验孔OD值 - 阴性孔 OD值)/(阳性孔OD值-阴性孔OD值 )]×100。同时设立猪源抗菌肽 PMAP-36 作为对照。

（2）结果表明：原始的PMAP-36在浓度较高时出现一定的溶血现象，例如，浓度为50和100μg/mL时，表现出一定的溶血现象，当然不排除试验误差的存在。但是，改造后的PMAP-36突变体始终没有表现出溶血现象。表明猪源抗菌肽PMAP-36突变体对猪红细胞基本无溶血活性，是一种安全的抗菌肽。

表1 不同浓度抗菌肽对猪红细胞的溶血百分比 (％ )

抗菌肽浓度（μg/mL）	0.78	1.56	3.12	6.25	12.5	25	50	100
									PMAP-36突变体	0	0	0	0	0	0	0	0
原始PMAP-36	0	0	0	0	0	0	2	2

实施例4：猪源抗菌肽突变体的最小抑菌浓度测定 (MIC)

委托陕西诺威利华生物科技有限公司参照发明专利申请CN201410669038.8的实施例4，进行抗菌肽的最低溶血浓度测定。具体结果如下：

表2 抗菌肽对多种细菌的最低抑菌浓度

MIC（μg/mL）	原始的PMAP-36	实施例1 PMAP-36变体
			金黄色葡萄球菌	24	8
大肠杆菌	12	6
			鸡沙门氏菌	16	6
猪副伤寒沙门氏菌	18	5

由以上试验结果可知，实施例1中改造后的PMAP-36变体相比原始的PMAP-36具有更高的抑菌活性。

实施例5：

陕西某猪场爆发仔猪腹泻，经检验为金黄色葡萄球菌和沙门氏菌感染所导致的仔猪腹泻，选取150只腹泻仔猪，随机分为3组，（每组设5个平行试验组，每个平行试验组有10头腹泻仔猪）。其中组1为抗生素对照组，采用注射青霉素和链霉素治疗；组2为原始PMAP-36对照组，采用灌服饮剂的形式进行治疗，组3为试验组，采用实施例1制备得到的PMAP-36制备得到的饮剂进行治疗，其中组2和3的抗菌肽在该药物中的浓度为20μg/mL，每头仔猪每天灌服5mL。观察治疗情况，结果见下表：

表3：治疗试验结果

痊愈率	3天	7天	10天	14天	21天
						组1	50%	78%	96%	100%	100%
组2	40%	60%	78%	90%	100%
						组3	68%	88%	98%	100%	100%

由以上治疗试验结果可知，本发明实施例1的抗菌肽能够有效的治疗由于金黄色葡萄球菌和沙门氏菌所导致的仔猪腹泻，且具有与青霉素和链霉素相近的治疗效果，而相比改造前的PMAP-36，其起效更快，在服用10天左右即可实现仔猪腹泻的全部痊愈。

序列表

<110> 九江牧威利元科技中心（普通合伙）

<120> 一种抗菌肽及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 37

<212> PRT

<213> 猪源抗菌肽(pig)

<400> 1

Val Gly Arg Phe Arg Arg Val Arg Lys Lys Ser Arg Lys Arg Leu Lys

1 5 10 15

Lys Glu Gly Lys Val Leu Lys Trp Ala Pro Pro Ile Val Gly Ser Ala

20 25 30

Pro Leu Gly Cys Gly

35

<210> 2

<211> 37

<212> PRT

<213> 原始的猪源抗菌肽PMAP-36(pig)

<400> 2

Val Gly Arg Phe Arg Arg Leu Arg Lys Lys Thr Arg Lys Arg Leu Lys

1 5 10 15

Lys Ile Gly Lys Val Leu Lys Trp Ile Pro Pro Ile Val Gly Ser Ile

20 25 30

Pro Leu Gly Cys Gly

35

Claims (5)

1.一种抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列为SEQ ID No.1。

2.根据权利要求1所述的抗菌肽在制备治疗仔猪腹泻的药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其中所述药物为口服液饮剂，所述猪源抗菌肽在该药物中的浓度为20μg/mL。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其中所述药物用于治疗仔猪腹泻时，每头份服用饮剂5mL。

5.根据权利要求1所述的抗菌肽在在制备畜禽饲料添加剂中的应用，所述饲料添加剂能够预防和/或治疗由大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鸡沙门氏菌和猪副伤寒沙门氏菌等致病菌所导致的疾病。