CN113087781B

CN113087781B - 一种抗菌肽及其应用

Info

Publication number: CN113087781B
Application number: CN202110336189.1A
Authority: CN
Inventors: 曹荣田; 秦永全; 张志刚; 赵树发; 林清香; 刘本国; 王昌业; 王庆军; 张世强; 徐赓; 胡海燕; 谢永兴
Original assignee: Beijing Shihua Kangyuan Biotechnology Co ltd; Shandong Zhongke Kangyuan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Shihua Kangyuan Biotechnology Co Ltd; Shandong Zhongke Kangyuan Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-03-30
Filing date: 2021-03-30
Publication date: 2022-06-14
Anticipated expiration: 2041-03-30
Also published as: CN113087781A

Abstract

本发明以猪源抗菌肽PMAP‑23为基础，对其肽段进行了改造设计，从而获得了活性更高的抗菌肽，研究表明，改造后的的抗菌肽先比原始的猪源抗菌肽PMAP‑23提高了生物活性和安全性，表现出对金黄色葡萄球菌、致病性大肠杆菌和沙门氏菌具有更好的抑菌活性，而在溶血活性方面，溶血率略有降低。本发明所制备得到的抗菌肽具有更好的安全性，对于畜禽常见的细菌感染具有一定的治疗作用，且本发明的抗菌肽经过改造后具有更好的热稳定性，在高温长时间热处理后仍然保持较高的活性。

Description

一种抗菌肽及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种抗菌肽及其在应用，具体涉及抗菌肽及其在制备畜禽药物、饲料中应用。

背景技术：

抗生素是治疗和预防动物感染性疾病的首选药物，其在动物生产中已经有60-70年的使用历史，能够起到预防和治疗有害细菌导致的疾病，对于动物生长具有一定的促进作用，层对畜禽和水产养殖业的发展起到了巨大的推动作用。然而，随着抗生素在畜牧养殖行业广泛使用，一些问题逐渐显现，如兽药残留和环境中抗生素污染可对人体产生直接毒性及过敏作用，再例如，多药耐药菌迅速蔓延，甚至不断出现“超级细菌”，导致临床疾病难以治疗，对全球健康构成威胁。鉴于此，欧盟等发达国家开始禁止在畜禽饲料中使用抗生素，我国也于2020 年1 月1 日开始在饲料中禁止使用抗生素，因此，寻找替代抗生素已经成为预防和治疗耐药菌感染的首要任务，特别是对饲料加工和养殖行业的发展具有重要的意义。

在现有研究中，有研究采用金属离子、中草药提取物、益生菌制剂、有机酸和抗菌肽等替代抗生素，其中抗菌肽是替代抗生素的首选成分之一。抗菌肽通常是指具有抗菌作用的小分子活性多肽，存在于从细菌到植物、脊椎动物和无脊椎动物的所有生命形式中，是宿主黏膜表面防御的一类重要分子，对细菌、真菌、病毒等微生物与寄生虫有抑杀活性，是固有免疫防御的普遍组成部分。抗菌肽具有抗菌谱广、热稳定性好、毒性小等特点，且其主要是通过物理渗透作用作用于细菌胞膜或其他广义靶点而产生抑菌和杀菌作用，而细菌等微生物难以改变其自身的胞膜结构，因而，抗菌肽使得细菌通过基因突变获得耐药性的可能性变得很小。目前，已经筛选和得到上千种抗菌肽，例如，猪源抗菌肽是从猪的组织和器官中分离得到的具有抗菌活性为小肽，目前已经发现11中猪源抗菌肽，这11中猪源抗菌肽包括PR39、PF-1、PF-2、PG-1、PG-2、PG-3、PG-4、PG-5、PMAP-23、PMAP-36和 PMAP-37。

发明内容：

为了解决现有技术中抗菌肽使用中存在的问题，本发明旨在提供一种抗菌肽，其具有改善的热稳定性和酸碱稳定性，相比原始的猪源抗菌肽PMAP-23提高了生物活性和安全性，表现出对金黄色葡萄球菌、致病性大肠杆菌和沙门氏菌具有更好的抑菌活性和安全性。

为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的为氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。其中SEQ ID NO：1的氨基酸序列为：N-RIIDLKWRVRRPQKPKFVTCWVRR-C。

本发明还请求保护所述抗菌肽在制备用于治疗畜禽细菌性感染所导致的疾病中的药物中的应用。

优选的，所述细菌性感染所导致的疾病是指猪致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌中的一种或多种感染所导致的畜禽疾病。

优选的，所述畜禽是指猪、鸡、鸭中的一种或多种。

优选的，所述猪细菌性感染所导致的疾病是腹泻，特别是仔猪腹泻。优选的，所述药物为口服制剂。

本发明还请求保护所述抗菌肽在制备猪饲料添加剂中的应用。

本发明还请求保护所述抗菌肽在制备猪饲料中的应用。

基于以上技术方案，本发明具有如下优点和有益效果：

第一，本发明以猪源抗菌肽PMAP-23为基础，对其肽段进行了改造，具体将第6位的亮氨酸（L）突变为赖氨酸（K），将第20位的缬氨酸（V）突变为半胱氨酸（C），且在C端增加了富含正电荷的精氨酸（R），从而获得了活性更高的抗菌肽，且研究表明，改造后的抗菌肽相比原始的猪源抗菌肽PMAP-23提高了生物活性和安全性，表现出对金黄色葡萄球菌、致病性大肠杆菌和沙门氏菌具有更好的抑菌活性，而在溶血活性方面，溶血率略有降低。

第二，本发明所制备得到的抗菌肽具有更好的安全性，对于畜禽常见的细菌感染具有一定的治疗作用，且本发明的抗菌肽经过改造后具有更好的热稳定性，在高温长时间热处理后仍然保持较高的活性，其相比原始的猪源抗菌肽PMAP-23更适合在饲料生产中应用，例如经过高温膨化制粒的仔猪颗粒饲料等。

基于以上技术方案，本发明在猪源抗菌肽PMAP-23通过对其肽段进行改造，提高了抗菌肽的抑菌活性和安全性，且具有改善的热稳定性，方便在饲料加工中使用。

说明书附图：

图1：抑菌活性试验结果。

图2：抗菌肽的杀菌动力学曲线。

图3：抗菌肽的酸碱稳定性曲线。

图4：抗菌肽的热稳定性曲线。

图5：抗菌肽的溶血活性曲线。

具体实施方式：

实施例1：抗菌肽的制备、抑菌活性试验以及杀菌动力学试验

（1）抗菌肽的设计与合成：

在原始猪源抗菌肽PMAP-23的基础上，对抗菌肽的部分氨基酸进行了改造，得到了以下氨基酸序列的抗菌肽：

抗菌肽A：将PMAP-23第6位的亮氨酸（L）突变为赖氨酸（K），得到氨基酸序列为SEQID No：3的抗菌肽A；

SEQ ID NO：3：N-RIIDLKWRVRRPQKPKFVTVWVR-C

抗菌肽B：将PMAP-23第6位的亮氨酸（L）突变为赖氨酸（K），第20位的缬氨酸（V）改为半胱氨酸（C），得到氨基酸序列为SEQ ID No：4的抗菌肽B；

SEQ ID NO：4：N-RIIDLKWRVRRPQKPKFVTCWVR-C

抗菌肽C：将PMAP-23第6位的亮氨酸（L）突变为赖氨酸（K），第20位的缬氨酸（V）改为半胱氨酸（C），且在C段增加了富含正电荷的精氨酸（R），得到氨基酸序列为SEQ ID No：1的抗菌肽C。

SEQ ID No：1，N-RIIDLKWRVRRPQKPKFVTCWVRR-C

在以上抗菌肽分子设计的基础上，委托杭州专肽生物技术有限公司合成序列为SEQ ID No：1-4的抗菌肽。

（2）试验菌株：

本发明所选用的菌株包括大肠埃希菌CVCC1510、金黄色葡萄球菌CVCC2086、肠炎沙门氏菌CVCC3949和鼠伤寒沙门氏菌CVCC2221，以上菌株是导致畜禽腹泻的常见致病性菌株，均购自中国兽医微生物菌株保藏管理中心。

（3）抑菌活性试验：

将灭菌后的培养基 20-25mL 迅速倒入无菌培养皿，冷却凝固后倒置备用。从细菌悬浮液(10⁸CFU/mL)中各取 100 µL 加到培养基表面，用灭菌涂布棒将其涂布均匀。将吸附有抗菌肽的药敏片（d=5mm）贴于培养基上，药敏片的含药量为10μg，将培养基置于恒温培养箱中，37℃下培养 24 h。观察各个培养皿中菌的生长情况，用十字交叉法测量抑菌圈的直径（包括滤纸片直径），具体结果如图1所示。

基于图1展示的结果可知，氨基酸序列为SEQ ID No：1的抗菌肽C相比抗菌肽A和B以及原始的PMAP-23抗菌肽具有相对更好的抑菌效果，特别是对于大肠埃希氏菌，抗菌肽C的抑菌圈大小为20.5mm，而抗菌肽A和B的抑菌圈分别为14mm和13mm，原始PMAP-23的抑菌圈大小为12mm，其相比原始的PMAP-23，抑菌圈增加了8.5mm，抑菌效果明显优于原始的PMAP-23，可见，本发明改造后的抗菌肽C对于致病性的大肠埃希菌具有明显的抑制作用，同时对金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌表现出增强的抑菌活性。

（4）杀菌动力学研究

将大肠埃希菌CVCC1510在LB液体培养基中培养至对数期（OD₆₀₀=1.0），将终浓度为100μg/mL的抗菌肽C、原始的PMAP-23（图示中为原PMAP-23）分别添加到大肠埃希菌培养液中，阴性对照组添加去离子水，阳性对照组添加浓度为100μg/mL氨苄青霉素（图示中为AMP），37℃摇床孵育0 min、60 min、120 min、240 min、360 min、480 min 后，测定菌液OD600。结果见图2所示。

基于图2展示的结果，与对照组相比，添加抗菌肽C和原始的PMAP-23的组OD值在60min时开始出现下降，而抗菌肽C的下降较为明显，与阳性对照组相近，在120min时，基本达到与氨苄青霉素同等的抑菌水平，在480min时都达到0.2左右的OD值，而原始的PMAP-23组的抑菌活性低于抗菌肽C和氨苄青霉素，在480min时，其维持在0.4左右的OD值，以上结果表明，通过改造得到的抗菌肽C相比原始的PMAP-23具有更高的抑菌活性，其基本达到常规抗生素氨苄青霉素的同等抑菌水平。

实施例2：酸碱稳定性、热稳定性试验

（1）酸碱稳定性试验

为检测 pH 值，温度和盐对抗菌肽抑菌活性的影响，用HCl 和NaOH 配制ddH₂O，使其 pH 值分别为2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13，将配制不同 pH 值的 ddH₂O 溶解抗菌肽A-C和原始PMAP-23，按照实施例1中“（3）抑菌活性试验”的方法，以大肠埃希氏菌作为标志菌，观察不同处理对于抗菌肽抑菌活性的影响，具体结果见图3所示。

基于图3展示的结果可知，原始PMAP-23在pH超过7以后出现活性的下降，而当其pH达到13时，其活性基本消失；对于改造后的抗菌肽A和B，也分别在pH为9或10时出现了活性的下降，本发明的抗菌肽C，其是在pH为12时出现了活性的明显下降，当pH为13时，四种抗菌肽的活性基本上都消失了。基于以上结果可知，本发明的抗菌肽C相比原始的PMAP-23具有更广泛的pH适应性，更加方便其用于饲料加工和药物的生产。

（2）热稳定性试验

用 ddH₂O 溶解抗菌肽A-C以及原始PMAP-23抗菌肽，经过沸水浴处理，分别处理0min、15min、30min、45min、60min、120min、180min，按照实施例1中“（3）抑菌活性试验”的方法，以大肠埃希氏菌作为标志菌，观察不同处理对于抗菌肽抑菌活性的影响，具体结果见图4所示。

由图4展示的结果可知，抗菌肽在沸水浴15min内抗菌活性变化不大，而随着时间的延长，其抗菌活性呈现出下降趋势，本发明的抗菌肽C经过加热后，其热稳定性最好，在加热45min内，其活性基本变化不明显，而在加热180min后，其仍保留一定的抑菌活性，基本能达到10mm的抑菌圈大小，与原始的PMAP-23抗菌肽的抑菌能力相差不大。以上结果表明，本发明通过对抗菌肽的改造设计使得抗菌肽即使经过高温处理，仍然能够保持较高的抑菌活性，其有利于抗菌肽在饲料加工，也别是需要经过高温加热、高温挤压处理的饲料中添加使用。

实施例3：溶血活性试验、饲用安全性试验

为了评估抗菌肽对于动物的安全性，开展了溶血活性试验以及饲用安全性试验，具体试验方案如下：

（1）溶血活性试验

取脱纤维猪血1000 rpm离心10 min，弃上清，用PBS 反复多次洗涤红细胞，直至上清透亮。用10倍体积的PBS 重悬红细胞，制备红细胞悬液。用PBS 按照倍比稀释法将抗菌肽抗菌肽C、原始PMAP-23抗菌肽分别进行梯度稀释，稀释为10240、5120、2560、1280、640、320、160、80、40μg /mL的浓度，分别取10μL抗菌肽溶液加入96孔板中，作为实验组和对照组，另取10μL PBS和10%的Triton X-100 分别作为阴性对照组和阳性对照组。每孔加入1×10⁵个红细胞悬液，每组5个复孔。5% CO₂、37℃ 孵育30 min，1500rpm离心10 min，取上清至新的96 孔板中，于450 nm 处测光密度值OD₄₅₀，并计算溶血率，当溶血率＜5%时认为其不具有溶血活性。其中溶血率=[实验组OD₄₅₀-阴性对照组OD₄₅₀]/[阳性对照组OD₄₅₀ -阴性对照组OD₄₅₀］*100%。具体溶血试验结果见图5所示。

基于图5的展示的结果可知，对于原始PMAP-23抗菌肽，其在浓度高于256μg /mL时，具有明显的溶血活性，而本发明的抗菌肽C仅在浓度高于10240μg /mL时才表现出溶血活性，且其浓度为512μg /mL，溶血率大概4%左右，也明显低于原始PMAP-23抗菌肽，以上试验表明，本发明的抗菌肽C相比原始PMAP-23抗菌肽具有更好的动物安全性。

（2）安全性试验

将40只健康昆明种小白鼠随机分成4组，每组10只（雌雄各半），预饲5天后进行试验，对于试验小鼠灌喂用生理盐水稀释的抗菌肽C，灌胃前禁食12 h，组1-4分别按照每千克体重灌喂抗菌肽C的重量为2g/kg体重、0.4g/ kg体重、0.08g/ kg体重、0 g/ kg体重（即仅灌喂生理盐水）。灌喂后每天定时饲喂并观察所有组小鼠的精神状态和死亡状况，连续观察14天，各组均未发现小鼠精神状态和采食情况等明显差异，也未发现灌喂抗菌肽C的小鼠出现明显的中毒现象。

将20只健康昆明种小白鼠随机分成2组，每组10只（雌雄各半），预饲5天后进行试验，试验期间每天对试验小鼠灌喂用生理盐水稀释的抗菌肽C，组1为试验组，按照0.4g抗菌肽C/kg体重灌喂，组2为对照组，每天灌喂等体积的生理盐水，持续30天，试验结束后处死小鼠，解剖，通过观察不同组小鼠的脏器及组织，结果发现各试验组无脏器出现变性或坏死的发生，且各试验组和对照组间脏器的色泽、形态、质地等均没有差异。由此说明，本发明的抗菌肽C不会造成脏器和组织的急性病理现象。

实施例4：抗菌肽C对断奶仔猪大肠杆菌攻毒保护试验

选取28日龄（21日龄断奶）健康长白断奶仔猪16只，公母各半，按照体重和性别随机分为2组，均采用正大乳猪宝乳猪配合饲料饲喂到35日龄，随后，采用大肠埃希菌CVCC1510培养液（10⁸CFU/mL，0.1mL/kg体重）进行攻毒，其中组1为对照组，攻毒后继续采用正大乳猪宝乳猪配合饲料进行饲喂；组2为处理组，攻毒12小时后，在正大乳猪宝乳猪配合饲料中按照40mg/kg饲料的量抗菌肽C，试验期持续14天。记录各组的日增重、采食量和腹泻率，计算平均日增重、采食量和腹泻率，具体结果见下表1。

表1 攻毒后的平均日增重、采食量和腹泻率

基于以上表1的结果可知，在攻毒后，在饲料中拌用抗菌肽C能够显著降低仔猪的平均腹泻率，改善断奶仔猪的腹泻状况，同时，处理组的精神状态良好，平均日采食量高于对照组，其平均料肉比也相应降低了，提高了饲料的利用率，以上结果表明本发明的抗菌肽C能够用于饲料或用作畜禽抗感染药物，用于预防或治疗大肠杆菌感染导致的仔猪腹泻，提高饲料的转化率。

实施例5：抗菌肽C用于鸡白痢的治疗

2020年上半年，山东日照某养殖场爆发鸡白痢，该鸡场共养殖5000羽海兰褐蛋雏鸡，发病率约40%，对于其中的1000羽病症明显的蛋雏鸡随机分为2组，其中一组在采用磺胺甲基嘧啶拌喂饲料，磺胺甲基嘧啶的用量为0.5%；另一组灌喂本发明的抗菌肽C的生理盐水溶液，抗菌肽C的浓度为100μg/mL，每羽病鸡灌喂1mL/次，每日3次，连续用药3天后，记录治愈率和存活率，其中磺胺甲基嘧啶的治愈率为72%，存活率为92%；抗菌肽C治疗组的治愈率为68%，存活率为90%，以上结果表明本发明的抗菌肽C对于沙门氏菌等导致的鸡白痢具有一定的治疗作用，其治愈率和存活率与现有抗生素类药物的效果接近。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京世华康源生物科技有限公司

<120> 一种抗菌肽及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Arg Ile Ile Asp Leu Lys Trp Arg Val Arg Arg Pro Gln Lys Pro Lys

1 5 10 15

Phe Val Thr Cys Trp Val Arg Arg

20

<210> 2

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Arg Ile Ile Asp Leu Leu Trp Arg Val Arg Arg Pro Gln Lys Pro Lys

1 5 10 15

Phe Val Thr Val Trp Val Arg

20

<210> 3

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Arg Ile Ile Asp Leu Lys Trp Arg Val Arg Arg Pro Gln Lys Pro Lys

1 5 10 15

Phe Val Thr Val Trp Val Arg

20

<210> 4

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Arg Ile Ile Asp Leu Lys Trp Arg Val Arg Arg Pro Gln Lys Pro Lys

1 5 10 15

Phe Val Thr Cys Trp Val Arg

20

Claims

1.一种抗菌肽在制备用于治疗畜禽细菌性感染所导致的疾病的药物中的应用，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，细菌性感染所导致的疾病是指猪致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌中的一种或多种感染所导致的畜禽疾病，所述药物为口服制剂。

2.根据权利要求1所述的应用，所述畜禽是指猪、鸡、鸭中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的应用，所述疾病是腹泻。

4.根据权利要求3所述的应用，所述疾病是仔猪腹泻。