CN111909904A - 一株巴氏杆菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株巴氏杆菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用，该噬菌体被命名为vB_PmuP_PS01，于2020年05月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物学中心，其保藏编号为CGMCC No.19971。该噬菌体对兔源巴氏杆菌具有较强的裂解作用，可以有效防控家兔养殖场巴氏杆菌病，减少多杀性巴氏杆菌引起的兔群败血症和出血性炎症，且使用安全、无副作用，在解决因巴氏杆菌造成的感染的同时，避免了因使用抗生素造成的抗生素残留、以及诱发耐药性巴氏杆菌的问题。此外，该噬菌体的应用广泛，还可用于制备饲兔料添加剂、以及环境、饲料消毒剂、检测试剂盒等。

Description

一株巴氏杆菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株巴氏杆菌噬菌体及包含该噬菌体的组合物及其应用。
背景技术
多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida，Pm)是一类能引起畜、禽、宠物、野生动物及人类感染，并严重发病的重要人畜共患性病原菌。研究报道，该病原菌广泛流行于世界各地，无宿主特异性，可通过相互接触经呼吸道进行水平和垂直传播；Davies等2004年报道该菌甚至可以在不同的宿主间发生种间传播。自从1959年WHO将巴氏杆菌病定为一类重要的动物传染病，Pm 就一直受到各国学者的关注。
兔巴氏杆菌病又名出血性败血症，是由多杀性巴氏杆菌引起的一种多型性、散发性或地方流行性、细菌性传染病，该病病原菌是一种条件性致病菌。兔巴氏杆菌病是由Fo型多杀性巴氏杆菌引起的，其血清型为7:A、5:A，该菌一般寄生于兔鼻腔黏膜和扁桃体内，正常情况一般不引起发病，但当外界应激过大或动物机体抵抗力较低下时家兔会发病，而且该病一旦在地区内流行，兔群则很难在短时间内净化；如不及时采取有效措施还会引起家兔慢性消耗性疾病的发生，致使其生长缓慢，料肉转换率降低或大批死亡，给养兔业造成严重的损失。传统的治疗方法是采用抗生素，巴氏杆菌对阿莫西林、先锋Ⅵ、先锋Ⅴ、丁胺卡那霉素具有较强的耐药性，由于抗菌药物的滥用，使兔巴氏杆菌的耐药菌株大量出现，给此病的临床防治带来了困难。因此，研发一种疗效显著、使用安全的新型噬菌体制剂用于防治兔巴氏杆菌病迫在眉睫。
噬菌体治疗有几大优势，首先是增殖效率高，一个噬菌体可产生数百子代，而这种能力也是该治疗方式的一个显著优势，在治疗时起着至关重要的作用；使用噬菌体进行治疗无副作用，这一点可与抗生素治疗相区别，使用抗生素进行治疗不仅会清除引起感染的菌属，还会对肠道内的其它菌群造成影响，引起微生态的失衡，引起机体免疫力下降，而噬菌体具有专一性，且不会对其它种属的细菌产生影响；噬菌体治疗无需考虑残留问题，他是严格宿主依赖性生物，不会在动物体内残留。
但是，目前还没有出现有效的巴氏杆菌噬菌体，能用于防治由于巴氏杆菌感染导致的各类疾病，因此，现有技术有待进一步改进。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一株广谱强裂解性的巴氏杆菌噬菌体 vB_PmuP_PS01，由该噬菌体复配的噬菌体组合物；该噬菌体不仅可用于制备预防和治疗兔巴氏杆菌感染的疾病的药物，还可用于制备饲兔料添加剂、以及环境、饲料消毒剂等。该噬菌体及其噬菌体组合物使用安全、无副作用，在解决因巴氏杆菌造成的感染的同时，避免了因使用抗生素造成的抗生素残留、以及诱发耐药性巴氏杆菌的问题。
本发明的技术方案具体如下：
第一方面，本发明提供了一株广谱强裂解性的巴氏杆菌噬菌体 vB_PmuP_PS01，该噬菌体自山东青岛某养殖场的兔粪中分离得到的，已于 2020年05月15日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.19971，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS01在双层琼脂培养基上可形成直径约0.5～ 1.5mm、透亮的圆形噬菌斑，边界清照。电镜下观测到：该噬菌体的头部呈直径55nm左右的多面体，非伸缩性尾部长20nm，根据国际病毒分类委员会 (The International Committee onTaxonomy of Viruses，ICTV)第九次报告的分类标准，可确定该噬菌体为短尾噬菌体科，命名为vB_PmuP_PS01。
第二方面，本申请还提供了上述巴氏杆菌噬菌体在制备预防和治疗因巴氏杆菌感染导致疾病的药物中的应用。本文中术语“预防”是指包括通过给予所述噬菌体来抑制或延迟所述疾病的所有行为。本文中术语“治疗”是指包括通过给予所述噬菌体而使所述疾病好转或有所改善的所有行为。
优选的，上述巴氏杆菌感染的疾病包括由巴氏杆菌感染引发的家禽及家畜的巴氏杆菌病。优选地，所述巴氏杆菌选自兔源巴氏杆菌。其中，兔源巴氏杆菌病包括兔群败血症和出血性炎症。
第三方面，本发明还提供一种噬菌体组合物，包括如上所述的巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS01。这种噬菌体组合物可通过巴氏杆菌噬菌体 vB_PmuP_PS01与其他巴氏杆菌噬菌体进行复配，用于制备防治水产品巴氏杆菌病的产品。
优选地，上述噬菌体组合物还包括噬菌体vB_PmuP_PS01的突变体中的一种或多种；所述突变体与对应的噬菌体的同源性不小于90％，且保持基本相同的抑菌活性。
由于噬菌体在复制过程中非常容易发生突变，因而优选的，上述噬菌体的突变体也在本申请请求保护的范围内。通过现有技术中公知的计算机程序可以适当地进行同源性的测定，vB_PmuP_PS01的突变体与该噬菌体的天然序列同源性至少达到90％；更优选的，突变体有92％、94％、95％、96％、97％、 98％或99％与各自对应的噬菌体的天然序列相同。其中，vB_PmuP_PS01的序列可根据本发明保藏的生物材料通过公知的方法测序得到。上述噬菌体的突变体可为点突变、缺失突变或添加突变，相对于最初的噬菌体序列，有1 个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多碱基可发生变化。对于本领域技术人员来说，根据本发明提供的噬菌体筛选出与其性状相似的突变体并不需要付出创造性的劳动。
第四方面，本发明还提供一种噬菌体药物制剂，其有效成分主要为上述的巴氏杆菌噬菌体或上述噬菌体组合物。优选地，所述噬菌体药物制剂还包括其他特定病原菌的噬菌体。
可选地，上述噬菌体药物制剂的剂型为口服给药剂型、注射给药剂型，优选地，注射给药为腹腔注射。上述药物制剂的剂型具体为溶液剂、粉剂、凝胶剂、颗粒剂、冻干剂。
可选地，所述噬菌体药物制剂中还包含药学上可接受的载体。本文所使用的术语“药学上可接受的载体”指不对生物体造成显著刺激且不消除所给予的活性组分的生物活性和特性的载体或稀释剂。为了将所述药物组合物配制成液体制剂，药学上可接受的载体必须适于无菌和生物相容性。实例包括盐水、无菌水、Ringer’s溶液、缓冲生理盐水、白蛋白输注液、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油和乙醇。它们可以单独使用或以其任意组合使用。如果需要，可以加入其它常规添加剂，例如，抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂等。当还与稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和/或润滑剂组合时，还可以将本发明的组合物制备成注射剂(例如，水性溶液、悬浮液和乳液)，或者丸剂、胶囊、粒剂或片剂。
第五方面，本申请还提供一种对兔饲料添加剂，其包括如上所述的巴氏杆菌噬菌体或噬菌体组合物，通过与对兔饲料进行混拌后，对兔群进行饲喂，从而达到预防或治疗兔源巴氏杆菌病的效果。优选地，饲料中每种噬菌体的效价至少为1×108PFU/g。
第六方面，本申请还提供一种消毒剂，其有效成分主要为所述的巴氏杆菌噬菌体或噬菌体组合物。优选地，噬菌体的效价为1×108PFU/ml以上。环境消毒剂还包含其他用于环境中病毒、细菌抑制或消灭的活性成分。消毒剂采用的溶剂为生理盐水或蒸馏水。
上述消毒剂可用于家禽及家畜养殖场所的环境消毒和饲料消毒防腐，可用于代替抗生素或传统消毒产品，且所述噬菌体及其环境消毒剂的代谢产物不会对人体或其他动物造成损害。所述环境消毒剂可通过喷雾、浸泡对养殖环境、饲养器具等进行全面的巴氏杆菌消毒。所述养殖环境包括料槽、地面、墙壁、粪便、垫料。所述液体浸泡、喷洒形式包括但不限于洗涤剂、消毒剂、去污剂等。优选的，所述养殖场为兔舍。
第七方面，本发明还提供一种检测试剂盒，其包括如上所述的巴氏杆菌噬菌体或噬菌体组合物。本领域技术人员可根据本发明公开内容和本领域常识利用上述巴氏杆菌噬菌体或其噬菌体组合物制备检测试剂盒，用于检测其特异侵染的巴氏杆菌、或用于防控由其宿主巴氏杆菌侵染导致的疾病。
第八方面，本发明还提供用于家禽及家畜生鲜食品消毒的生物抑菌剂，其有效成分主要为上述巴氏杆菌噬菌体或噬菌体组合物。生物抑菌剂的使用方法为：对家禽及家畜的生鲜产品表面进行浸泡或者喷雾消毒，来抑制产品加工或保鲜过程中巴氏杆菌的增殖。
本发明具有以下有益效果：
1、该噬菌体对兔源巴氏杆菌具有较强的裂解作用，可以有效防控家兔养殖场巴氏杆菌病，极大地降低由于多杀性巴氏杆菌引起的兔群败血症和出血性炎症的病发概率，还可以对饲养环境，饲料、饮水等进行巴氏杆菌的消毒。
2、本发明涉及的上述噬菌体从自然界中获得，易于进行工业化生产，由上述噬菌体制备的药物或消毒剂不仅可降低成本，还具有绿色环保的优点。
3、本发明的巴氏杆菌噬菌体及其噬菌体组合物应用广泛，不仅可用于制备防治巴氏杆菌病的药物制剂，并且通过与饲料混合及随水饮用，以及作为消毒剂使用，可广泛用于家畜和家禽养殖过程中的容易因巴氏杆菌感染造成损失的各个环节、养殖环境的日常消毒、以及生鲜产品抑菌等方面，有益于家禽、家畜养殖业，尤其是兔养殖业的健康发展。
附图说明
图1为噬菌体vB_PmuP_PS01的噬菌斑照片；
图2为噬菌体vB_PmuP_PS01的电镜照片；
图3为噬菌体vB_PmuP_PS01的热稳定性检测结果；
图4为噬菌体vB_PmuP_PS01的pH稳定性检测结果；
图5为感染噬菌体vB_PmuP_PS01的巴氏杆菌的OD600的变化结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1噬菌体的分离培养和生物学特性
(一)菌种的复苏培养和菌悬液的制备
挑取巴氏杆菌的冻存菌液在TSA平板(加5％新生牛血清)上三区划线，分离单菌落，37℃恒温箱中培养16～24h。挑取单菌落，接种5ml TSB肉汤(加 5％新生牛血清)中，37℃空气振荡器中，180rpm振荡培养18h，得到单一的菌悬液。
(二)噬菌体的分离与纯化
取兔粪样、垫料、污水以及皮毛等样品，加入适量的TSB肉汤，37℃，170rpm 振荡30min，10000rpm离心5min，取上清0.22μm细菌滤器过滤备用。
每个三角瓶中按照80％的量加入各株巴氏杆菌，按照20％的量加入离心过滤的上清液(加5％新生牛血清)搅拌均匀后，于37℃的空气振荡器中，180rpm 振荡培养过夜，10000rpm离心5min，0.22μm的细菌滤器过滤除菌。将滤液和宿主菌混合，37℃孵育5min后倒双层平板，待凝固后放入37℃的恒温箱中倒置培养过夜。若有噬菌体存在，则会在培养基上形成透明、规则的圆形空斑，即为噬菌斑。抠取单个噬菌斑，于1ml TSB肉汤中，37℃的空气振荡器中孵育30min，10000rpm离心5min，取上清再用双层平板法得到单个的噬菌斑，如此重复3～5次直至形成圆形透明斑块，边界清晰，斑块直径约0.5～1.5 mm的噬菌斑，见图1。
(三)噬菌体的增殖和效价测定
取100μl宿主菌和噬菌体抠斑浸出液加入到5ml TSB肉汤(加5％新生牛血清)中，于37℃的空气振荡器180rpm培养5～6h，待混合液变澄清，得到噬菌体增殖液。10倍倍比稀释噬菌体增殖液，双层平板法测效价，每个稀释度分别做3个平行样。取稀释度为10-6的3个平行样计数，结果分别为：232、 250、241个噬菌斑，计算效价为2.41×109PFU/ml。
(四)透射电镜观察噬菌体的形态
取高于1×109PFU/ml噬菌体样品20μl滴于微孔铜网上，沉淀15min，用滤纸吸去多余的液体。在铜网上滴加15μl的2％的磷钨酸(PTA)，染色5min，用滤纸吸去多余的染液，干燥后用透射电镜观察并拍照，电镜照片见图2。
电镜观察发现：该噬菌体的头部呈直径55nm左右的多面体，非伸缩性尾部长20nm，根据国际病毒分类委员会(The International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)第九次报告的分类标准，可确定该噬菌体为短尾噬菌体科，命名为vB_PmuP_PS01。
(五)噬菌体的热稳定性检测
将2.41×109PFU/ml的噬菌体vB_PmuP_PS01的增殖液分别于40℃、50℃、 60℃、70℃、80℃条件下，水浴中作用20min、40min、60min，每个温度设两个平行组。采用双层平板法测定噬菌体的效价。
结果如图3所示，噬菌体vB_PmuP_PS01在40℃和50℃作用1h后基本保持原活性；60℃作用20min效价下降2个数量级，1h后效价降低4个数量级； 70℃及80℃的高温作用下，20min噬菌体基本失活。试验结果说明噬菌体 vB_PmuP_PS01能够耐受一定的高温。
(六)噬菌体的pH稳定性检测
取无菌试管中加入不同pH值(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13)的TSB肉汤4.5ml，各三支，置于37℃的水浴锅中，待温度稳定之后，各加入500μl2.41×109PFU/ml的噬菌体增殖液，混匀37℃水浴作用1h、2h、 3h。作用结束之后，向混合液中加入适量的HCl或者NaOH使混合液的pH 值约为7，双层平板法测定噬菌体的效价。
结果如图4所示，在pH5～11范围内噬菌体vB_PmuP_PS01效价几乎没变或略有降低，仍然在109PFU/ml以上；而在pH为4的条件下处理3h，其效价仅下降1个数量级，可见该噬菌体对pH的适应范围较广。
(七)噬菌体的最佳感染复数(MOI)测定
按照常规方法分别对巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS01和宿主菌巴氏杆菌进行增殖，测定噬菌体初始效价及宿主菌浓度，并将噬菌体vB_PmuP_PS01 和宿主菌进行适当的稀释。分别按照感染复数为100、10、1、0.1、0.01的比例各取100μlvB_PmuP_PS01和宿主菌加入到TSB肉汤中。于37℃，180rpm 振荡培养至液体变澄清，记录液体变澄清时间。10000rpm离心5min，双层平板法测定噬菌体的效价，结果如表1。
表1噬菌体的最佳感染复数(MOI)测定结果
Figure BDA0002564703580000081
从表1的测定结果可知：该噬菌体的最佳感染复数是10，该条件下噬菌体感染宿主菌产生子代噬菌体的滴度为2.94×109PFU/ml，在5个感染复数中噬菌体滴度最高。
实施例2噬菌体裂解谱的测定和体外裂解试验
(一)噬菌体裂解谱的测定
采用双层平板法测定噬菌体的裂解谱，步骤如下：按照实施例1中的方法得到宿主菌的菌悬液(47株巴氏杆菌分别来源于山东、青海、四川等省的各地区的病死兔)。将300μl的菌悬液与300μl的巴氏杆菌噬菌体37℃孵育5min 后，加入上层琼脂中(加5％新生牛血清)制备双层平板，待琼脂凝固后置于 37℃的恒温箱中倒置培养过夜观察结果。
从表2的实验结果得到：47株不同来源的巴氏杆菌宿主菌中，噬菌体 vB_PmuP_PS01能裂解其中的40株，裂解率达85％，结果显示该噬菌体对兔源巴式杆菌具有很好的裂解能力。
表2巴氏杆菌噬菌体的裂解谱
Figure BDA0002564703580000091
Figure BDA0002564703580000101
注：“+”代表耐药，“—”代表不耐药。
(二)vB_PmuP_PS01对巴氏杆菌菌株体外裂解试验
实验方法：按照一定的比例加入巴氏杆菌菌液和噬菌体vB_PmuP_PS01，巴氏杆菌的终浓度为1.00×108CFU/ml，噬菌体的终浓度分别为 1.00×109PFU/ml，1.00×108PFU/ml，1.00×107PFU/ml，1.00×106PFU/ml，对照组加入与噬菌体相同量的无菌肉汤，菌液和噬菌体混合后(加5％新生牛血清) 在37℃，180rpm的摇床内振荡培养。每隔一定的时间测定OD值直至混合液变清亮，涂布平板法测定作用一定时间后各组菌的残留量。
实验结果可得：vB_PmuP_PS01对巴氏杆菌菌株的裂解效果很好，4个不同浓度的该噬菌体对巴氏杆菌菌株的裂解效率都可以达到98.80％以上，只是时间长短不同，但是6h以内都能够达到较好的杀灭效果，具体数据见下表3 和表4。
表3各时间段OD值变化
Figure BDA0002564703580000111
表4 OD值测定结束后菌残留量的测定
Figure BDA0002564703580000121
实施例3噬菌体的安全性试验
实验方法：选择20只体重为18～20g的健康BALB/C小鼠，雌雄各半，分成实验组和对照组，每组小鼠雌雄各半，实验组灌服纯化的200μl的噬菌体增殖液(效价为109PFU/ml)，对照组灌服生理盐水(200μl)，连续灌服7d，观察小鼠的行为表现，并剖检观察小鼠脏器的变化。
实验结果：实验组和对照组的小鼠行为均无异常，剖检肝脏、肺脏、心脏、脾脏、肾脏后，显示脏器正常，实验组与对照组的检测结果无明显差别。
实施例4噬菌体对兔巴氏杆菌攻毒后的治疗作用试验
(一)通过拌料饲喂方式对兔巴氏杆菌攻毒后的治疗试验
实验方法：选择2～2.5kg的健康兔20只，10只公兔，10只母兔，分为试验组和对照组，每组公母各一半。按照4×104CFU/只的量腹腔注射巴氏杆菌临床分离菌株4h后，试验组每天给予拌料饲喂20g拌有1ml 109PFU/ml的 vB_PmuP_PS01噬菌体治疗，对照组口服等量无菌生理盐水。1次/d，用药1 周后，记录兔的死亡情况，以及剖检观察兔肺脏病死灶等病变且肺脏分离巴氏杆菌。判断是否发生病变的标准为：兔剖检肺脏发现有坏死灶并同时能分离出巴氏杆菌。
结果显示：噬菌体vB_PmuP_PS01拌料饲喂后，试验组兔死亡率为20％，对照组死亡率为60％。剖检未死亡的兔肺脏观察临床症状，发现试验组病变率30％，对照组病变率90％，使用拌料饲喂方式对兔巴氏杆菌攻毒的保护率为80％，故表明使用拌料饲喂噬菌体能够防治兔巴氏杆菌病且效果明显。
(二)通过腹腔注射方式对兔巴氏杆菌攻毒后的治疗作用试验
实验方法：选择2～2.5kg的健康兔20只，10只公兔，10只母兔，分为试验组和对照组，每组公母各一半。按照4×104CFU/只的量腹腔注射巴氏杆菌临床分离菌株4h后，对试验组每只兔给予腹腔注射1ml 109PFU/ml的 vB_PmuP_PS01噬菌体治疗，对照组注射等量无菌生理盐水。用药1周后，记录兔的死亡情况，以及剖检观察未死亡兔肺脏病死灶等病变且肺脏分离巴氏杆菌。
结果显示：进行噬菌体vB_PmuP_PS01腹腔注射后，试验组兔死亡率为 10％，对照组死亡率为50％。剖检未死亡兔肺脏观察临床症状，发现试验组病变率10％，对照组病变率90％。使用腹腔注射方式对兔巴氏杆菌攻毒的保护率为90％，该结果说明：腹腔注射噬菌体vB_PmuP_PS01的给药方式，对兔巴氏杆菌病的防治效果优异，且高于拌料饲喂的给药方式的治疗效果。
实施例5噬菌体在体内对巴氏杆菌的预防试验
实验方法：选择2～2.5kg的健康兔20只，10只公兔，10只母兔，分为2 组，每组公母各一半。实验组每只兔饲喂20g拌有1ml、效价109PFU/ml的 vB_PmuP_PS01的饲料，对照组每只兔饲喂20g拌有1ml生理盐水的饲料，饲喂噬菌体1h后，实验组和对照组按照4×104CFU/只的量腹腔注射巴氏杆菌临床分离菌株，攻菌后记录兔死亡情况，连续观察7d。7d后所有兔处死剖检观察症状并分离巴氏杆菌。
实验结果显示：观察7d内，饲喂噬菌体的实验组的死亡率为0，对照组兔死亡率为50％；饲喂噬菌体的实验组病变率为10％，对照组的病变率为80％。说明该噬菌体会对兔体内的巴氏杆菌产生抑制杀灭作用。
实施例6噬菌体vB_PmuP_PS01对兔场巴氏杆菌的净化作用
实验方法：选择青岛某兔场进行实验，该兔场的多个兔舍爆发巴氏杆菌病。选择3月龄獭兔，试验组500只，对照组500只，试验组在每天8～9点通过饲料添加方式饲喂噬菌体，其他按照兔场规程正常饲养、用药、免疫；对照组不使用噬菌体，其他按照兔场规程正常饲养、用药、免疫。连续用药1月，记录试验组和对照组的死淘率，每组随机抽取200只兔，采鼻拭子检测巴氏杆菌浓度。
实验结果显示：对照组的死淘数为289只，其死淘率为57.8％；给予噬菌体饲喂的试验组的死淘数为32只，死淘率为6.4％；试验组的死淘率比对照组的死淘率降低了51.4％，这说明使用噬菌体能明显降低兔的死淘率。上述结果表明，噬菌体vB_PmuP_PS01可为巴氏杆菌的净化提供一种新型生物制剂或饲料添加剂。
实施例7噬菌体vB_PmuP_PS01对饲料的消毒试验
实验方法：取20g兔饲料，均匀分成2份，每份10g，平铺于灭菌后的平皿上，实验组和对照组均取取1ml 108CFU/ml的巴氏杆菌均匀喷洒在饲料表面，待干燥后实验组将1ml108PFU/ml的vB_PmuP_PS01噬菌体均匀喷洒于饲料表面，对照组喷洒相同量的肉汤，分别0h、1h、2h、4h、6h、8h利用涂布平板法测定饲料携带的巴氏杆菌浓度，采用双层平板法测定噬菌体的含量。实验组与对照组菌和噬菌体含量如表6。
表6实验组与对照组的巴氏杆菌和噬菌体含量
Figure BDA0002564703580000141
Figure BDA0002564703580000151
实验结果显示：噬菌体vB_PmuP_PS01可在饲料中存活8h以上，最高效价可以达到3.13×107PFU/g；喷洒噬菌体后4-6h，饲料中的巴氏杆菌的含量显著下降，最多下降5个滴度，显然，噬菌体vB_PmuP_PS01可有效用于饲料的消毒和防腐。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (12)

1.一株巴氏杆菌噬菌体，其特征在于，被命名为vB_PmuP_PS01，其保藏编号为CGMCCNo.19971。
2.如权利要求1所述的巴氏杆菌噬菌体在制备预防和治疗巴氏杆菌感染的疾病的药物中的应用。
3.一种噬菌体组合物，其特征在于，包括如权利要求1所述的巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS01。
4.根据权利要求3所述的噬菌体组合物，其特征在于，还包括噬菌体vB_PmuP_PS01的突变体中的一种或多种；所述突变体与对应的噬菌体的同源性不小于90％，且保持基本相同的抑菌活性。
5.一种噬菌体药物制剂，其有效成分包括如权利要求1-4中任一项所述的巴氏杆菌噬菌体或噬菌体组合物；优选的，所述噬菌体药物制剂还包括其他特定病原菌的噬菌体。
6.根据权利要求5所述的噬菌体药物制剂，其特征在于，所述药物制剂形式为口服给药剂型及注射给药剂型。
7.根据权利要求5所述的噬菌体药物制剂，所述噬菌体药物制剂中还包含药学上可接受的载体，其剂型为溶液剂、粉剂、凝胶剂、颗粒剂或冻干剂。
8.一种对兔饲料添加剂，其特征在于，包括如权利要求1-4中任一项所述的巴氏杆菌噬菌体或噬菌体组合物；优选地，饲料中每种噬菌体的浓度至少为1×109PFU/g。
9.一种消毒剂，其特征在于，有效成分包括权利要求1-4中任一项所述的巴氏杆菌噬菌体或噬菌体组合物；其中还包含其他用于环境中病毒、细菌抑制或消灭的活性成分；优选地，噬菌体的使用浓度为1×108PFU/ml以上。
10.如权利要求9的消毒剂的应用，其特征在于，所述消毒剂可通过喷雾、浸泡的方式对养殖环境、饲养器具和饲料进行巴氏杆菌的消毒，所述养殖环境包括棚舍、料槽、地面、墙壁、粪便和垫料。
11.一种检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1-4中任一项所述的巴氏杆菌噬菌体或噬菌体组合物。
12.一种用于生鲜食品消毒的生物抑菌剂，其特征在于，包括如权利要求1-4中任一项所述的巴氏杆菌噬菌体或噬菌体组合物；生物抑菌剂的使用方法为：对生鲜食品产品表面进行浸泡或者喷雾消毒，来抑制产品加工或保鲜过程中巴氏杆菌的增殖。
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