KR101837658B1

KR101837658B1 - 신규한 아에로모나스 히드로필라 특이 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물

Info

Publication number: KR101837658B1
Application number: KR1020160132241A
Authority: KR
Inventors: 박성혁; 최인영; 박미경
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2016-10-12
Filing date: 2016-10-12
Publication date: 2018-03-12

Abstract

본 발명은 아에로모나스 히드로필라에 특이적인 사멸능을 갖는 신규 박테리오파지 KFS-A9, 상기 박테리오파지를 포함하는 아에로모나스 히드로필라에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 항생용 조성물, 사료 첨가용 조성물, 사료, 소독제 또는 세척제 및 상기 박테리오파지를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 아에로모나스 히드로필라에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명의 박테리오파지 KFS-A9를 이용한 아에로모나스 히드로필라에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료 방법은 기존의 항생제 등의 화학물질에 비해 아에로모나스 히드로필라에만 특이적으로 작용하여 우수한 용균 활성과 물리화학적 환경에 강하다는 장점을 가지고 있다. 또한 본 발명의 박테리오파지 KFS-A9는 항생제의 오남용으로 인한 항생제 내성균의 문제점, 식품 내의 항생제의 잔류 문제, 광범위한 숙주범위의 문제점을 해결할 수 있는 장점이 있다. 따라서, 본 발명의 박테리오파지 KFS-A9는 아에로모나스 히드로필라에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료, 항생용 조성물, 사료 첨가용 조성물, 사료, 소독제, 또는 세척제 분야에서 다양하게 사용될 수 있으므로 양식 산업 및 축산업의 경쟁력 및 국민보건향상에 이바지할 수 있는 효과가 있다.

Description

신규한 아에로모나스 히드로필라 특이 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물{Novel Aeromonas hydrophila specific bacteriophage and antibacterial composition comprising the same}

본 발명은 아에로모나스 히드로필라에 특이적인 사멸능을 갖는 신규 박테리오파지 KFS-A9, 상기 박테리오파지를 포함하는 아에로모나스 히드로필라에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 항생용 조성물, 사료 첨가용 조성물, 사료, 소독제 또는 세척제 및 상기 박테리오파지를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 아에로모나스 히드로필라에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.

아에로모나다세애(Aeromonadaceae)에 속하는, 운동성 아에로모나스(motile aeromonas)인 아에로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila)는 광범위하게 다양한 어류에 감염되어 패혈증, 출혈, 궤양 등을 유발하고 이로 인한 집단 폐사는 심각한 경제적 피해를 일으킨다. 특히, 국내 양식장의 경우, 제한된 공간으로 인하여 사육의 밀집 정도가 심하므로, 아에로모나스 히드로필라 발병시 전염성이 강하게 나타난다. 또한 최근에는 수인성 원인균으로 간주되어 왔던 아에로모나스가 다양한 범위에 과채류를 오염시켜 식중독을 발병시키기도 하는 것으로 보고되고 있으므로, 이의 감염에 대한 예방이 필요하다.

현재 아에로모나스 히드로필라 감염증을 예방 및 치료하기 위해 항생제를 주로 사용하고 있으나 최근 많은 분야에서 항생제 내성에 대한 문제가 발생되고 있어 이에 대한 원인을 항생제 오남용으로 규명하고 항생제를 충분히 사용하지 못하게 되었다. 이에 따라 산업동물의 배합 사료 내에 성장촉진제로 사용하는 항생제를 금지하기 시작하였고, 유럽연합에서는 2006년부터, 우리나라에서는 2011년 하반기부터 항생제 사용을 규제하기 시작하였다. 또한 항생제가 없는 안전한 먹거리에 대한 소비자의 요구가 증대되고 있어 항생제의 사용은 점차 감소하게 될 것이다. 따라서, 항생제를 대체할 수 있는 친환경 소재를 기반으로 한 제어법에 대한 연구 및 요구가 더욱 증가할 것으로 기대되고 있다. 이러한 연구 중 하나가 자연계 환경 도처에 존재하면서 특정 세균만을 죽이는 바이러스인 박테리오파지를 활용하는 것이다.

박테리오파지(bacteriophage)는 특정 세균만을 감염시켜 감염된 세균의 성장을 억제하고 저해하는 세균 특이적인 바이러스를 의미한다. 박테리오파지의 기원은 1915년 영국의 세균학자 Twort에 의해 포도상구균(Micrococcus) 집락이 어떤 것에 의해 투명하게 녹는 현상으로부터 연구가 시작되었다. 또한, 1917년에는 프랑스의 세균학자 d'Herelle이 이질환자 변의 여과액 중에 적리균(Shigella disentriae)을 녹이는 작용을 가진 것이 있다는 것을 발견하고 이에 대한 연구를 통해 독립적으로 박테리오파지를 발견하였으며, 박테리아를 잡아먹는다는 뜻에서 박테리오파지라고 명명하였다. 박테리오파지는 박테리아에 감염(infection)한 후 박테리아 세포 내부에서 증식을 하고, 증식 후 자손 박테리오파지들이 박테리아 밖으로 나올 때 숙주인 박테리아의 세포벽을 파괴하는 방식으로 박테리아를 사멸시키는 능력을 갖고 있다. 박테리오파지의 박테리아 감염 방식은 매우 특이성이 높아서 특정 박테리오파지는 특정 박테리아만을 사멸시키고 다른 박테리아에는 영향을 주지 않는 것이 장점이다.

박테리오파지를 이용한 연구는 항생제의 출현으로 인해 동유럽과 구소련에서만 지속적으로 연구되었으나, 최근 항생제의 오남용으로 인한 다재내성(Multidrug-resistant)을 지닌 슈퍼박테리아 출현 등 기존 항생제의 많은 문제점들이 부각되면서, 항생제를 대체할 수 있는 친환경 소재로서 각광받고 있다. 특히, 항생제 대비 개발시간이 짧고 개발비용이 적게 소요되며, 높은 선택성, 지속성 및 부작용 등의 측면에서 우위가 인정된다.

따라서, 어류 양식 산업에 막대한 경제적 피해를 일으키고 과채류를 오염시킬 수 있는 아에로모나스 히드로필라에 의한 감염을 예방 또는 치료하기 위한 신규한 박테리오파지에 대한 연구가 절대적으로 필요하므로, 아에로모나스 히드로필라에 특이적인 용균활성을 갖는 박테리오파지 및 이의 응용에 대한 기술 개발이 필요하다.

이에 본 발명자들은 아에로모나스 히드로필라에 특이적인 용균활성을 갖는 박테리오파지를 분리하고 분리된 박테리오파지의 형태적 및 유전적 특성을 분석하여 상기 박테리오파지가 아에로모나스 히드로필라를 선택적으로 사멸시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 아에로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila)에 특이적인 사멸능을 갖는, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 박테리오파지 KFS-A9를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 박테리오파지 KFS-A9를 포함하는, 아에로모나스 히드로필라에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 박테리오파지 KFS-A9를 포함하는, 항생용 조성물, 사료 첨가용 조성물, 사료, 소독제 또는 세척제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 박테리오파지 KFS-A9를 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 아에로모나스 히드로필라에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아에로모나스 히드로필라에 특이적인 사멸능을 갖는, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 박테리오파지 KFS-A9를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 KFS-A9를 포함하는, 아에로모나스 히드로필라에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 KFS-A9를 포함하는, 항생용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 KFS-A9를 포함하는, 사료 첨가용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 KFS-A9를 포함하는, 소독제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 KFS-A9를 포함하는, 세척제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 KFS-A9를 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 아에로모나스 히드로필라에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 박테리오파지 KFS-A9를 이용한 아에로모나스 히드로필라에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료 방법은 기존의 항생제 등의 화학물질에 비해 아에로모나스 히드로필라에 대한 특이성이 매우 높고, 상기 박테리오파지 KFS-A9는 아에로모나스 히드로필라에 감염하여 증식함으로써 용균 활성이 우수하고 물리화학적 자극에 강하다는 장점을 가지고 있다. 또한 본 발명의 박테리오파지 KFS-A9는 항생제의 오남용으로 인한 항생제 내성균의 문제점, 식품 내의 항생제의 잔류 문제, 광범위한 숙주범위의 문제점을 해결할 수 있는 장점이 있다. 따라서, 본 발명의 박테리오파지 KFS-A9는 아에로모나스 히드로필라에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료, 항생용 조성물, 사료 첨가용 조성물, 사료, 소독제, 또는 세척제 분야에서 다양하게 사용될 수 있으므로 양식 산업의 경쟁력 및 국민보건향상에 이바지할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 박테리오파지 KFS-A9의 아에로모나스 히드로필라에 대한 용균반 형성 활성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 박테리오파지 KFS-A9의 전체 유전자 크기를 전기영동으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 전자 현미경을 통해 박테리오파지 KFS-A9의 형태학적 특성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 박테리오파지 KFS-A9의 단백질 패턴을 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 박테리오파지 KFS-A9의 pH 안정성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 박테리오파지 KFS-A9의 열 안정성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 아에로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila)에 특이적인 사멸능을 갖는, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 박테리오파지 KFS-A9를 제공한다.

본 발명에서, 용어 “박테리오파지(bacteriophage)”는 특정 세균에 감염하여 당해 세균의 성장을 억제하고 저해하는 세균 특이적 바이러스로, 단일 혹은 이중 사슬의 DNA 또는 RNA를 유전 물질로 포함하는 바이러스를 의미한다.

본 발명의 박테리오파지 KFS-A9는 아에로모나스 히드로필라에 대해 용균활성이 탁월하다. 상기 박테리오파지 KFS-A9는 각이 진 머리와 꼬리를 갖는 형태인 시포비리대에 속함을 확인하였으며, 단백질 패턴 분석 결과 37 kDa, 그리고 90 kDa의 단백질을 포함하고, 전체 염기서열 분석 결과 40 kbp의 크기를 갖고 전체 ORF의 수는 46개임을 확인하였으며 그 전체 염기서열을 서열번호 1로 표시하였다. 또한 상기 박테리오파지 KFS-A9는 열 및 pH에 대한 안정성이 우수한 특성을 가지고 있다.

박테리오파지 KFS-A9는 서열번호 1의 염기서열을 전체 유전자의 전체 또는 일부로서 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 박테리오파지 KFS-A9는 서열번호 1의 염기서열, 및 상기 염기서열의 기능적 동등물로 이루어질 수 있다. 상기 기능적 동등물이란 염기서열의 변형, 치환의 결과, 상기 서열번호 1의 염기서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1의 염기서열과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 서열을 의미한다.

상기와 같은 아에로모나스 히드로필라 특이적 용균활성, 내산성, 내염기성 및 내열성은 본 발명의 박테리오파지 KFS-A9를 아에로모나스 히드로필라에 의한 감염성 질병의 예방 및 치료용 조성물, 및 상기 박테리오파지 KFS-A9를 유효성분으로 포함하는 다양한 제품에 적용함에 있어, 다양한 온도 및 pH 범위의 적용이 가능하게 한다.

본 발명의 박테리오파지 KFS-A9는 닭 공장의 닭 내장 처리공정으로부터 시료를 채취하여 분리한 박테리오파지로서, 박테리오파지 KFS-A9로 명명하고 2016년 09월 26일에 생물자원센터에 기탁번호 KCTC13119BP로 기탁하였다.

본 발명의 박테리오파지 KFS-A9는 pH 3.0 내지 pH 11.0의 범위, 바람직하게는 pH 4.0 내지 pH 11.0의 범위 내에서 용균활성이 유지되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 박테리오파지 KFS-A9는 4℃ 내지 60℃의 범위, 바람직하게는 4℃ 내지 40℃의 범위 내에서 용균활성이 유지되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 박테리오파지 KFS-A9는 아에로모나스 히드로필라에 특이적인 사멸능을 가지므로, 아에로모나스 히드로필라에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 사용될 수 있다.

본 발명에서, 아에로모나스 히드로필라에 의한 감염성 질병은 패혈증, 출혈, 궤양, 식중독 및 아에로모나스 감염증(Aeromonas infection)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 아에로모나스 감염증은 아에로모나스의 감염 및 아에로모나스의 감염에 의해 발현되는 증상을 포함한다.

본 발명의 약학적 조성물은 10³내지 10¹⁰ PFU/mL의 박테리오파지를 포함하며, 바람직하게는 10⁶ 내지 10⁹ PFU/mL의 박테리오파지를 포함한다. 본 발명에 사용된 용어, “PFU(plaque forming unit)”는 박테리오파지가 세균 사멸 후 나타나는 용균반을 수치화한 단위이다.

본 발명의 용어 “예방”이란 조성물의 투여로 질병을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 용어 “치료”란 조성물의 투여로 상기 질병의 증세가 호전되거나 상기 질병의 억제 또는 경감 및 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, “약학적으로 허용 가능한 담체”란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로오스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 질환 부위에의 도포 또는 분무하는 방법으로 이용할 수 있으며, 그 밖에 비강 분무, 경구 투여 또는 비경구 투여를 통해 투여할 수도 있으며, 비경구 투여의 경우 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 도 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 도포, 분무 및 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 대상이 되는 동물 및 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감음성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사나 수의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물을 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 제형으로는, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마스네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐 제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물을 유효성분으로 포함하는 비경구 투여용 제형으로는, 정맥주사 또는 근육 내 주사 등의 주사용 형태, 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.

본 발명에서, 용어 “항생용 조성물”은 약제 형태로 동물에게 제공되어 균을 사멸시킬 수 있는 제제를 의미하며, 방부제, 살균제, 항생제 및 항균제를 총칭하는 것이다.

본 발명의 박테리오파지 KFS-A9는 기존 항생제에 비하여 아에로모나스 히드로필라에 의한 감염성 질병에 대한 특이성이 매우 높으므로, 유익균은 죽이지 않고, 특정 병원균만 사멸시킬 수 있고, 약물 내성 내지 저항성을 유도하지 않아, 기존의 항생물질에 비하여 제품수명(life cycling)이 긴 신규 항생제로서 이용될 수 있다.

양식 산업이나 축산업에서 사용되는 사료 첨가용 항생제는 질병의 예방 목적으로 사용되고 있는데, 예방 목적의 항생제 투여는 내성균 발생 가능성을 높이고 어류에 잔류하는 항생제가 사람에게 전달될 수 있어서 문제이다. 항생제가 육류나 어류를 통해 인체에 흡수되면 항생제 내성을 유발해 질병의 확산을 부를 수도 있다. 또한, 사료에 섞여 먹이는 항생제의 종류가 많고 이는 다제 내성균 발생 확률이 높아지는 문제점이 있기 때문에 좀 더 자연 친화적이면서도 기존의 항생제의 사용에서 발생한 문제를 해결할 새로운 사료 첨가용 항생물질로서 본 발명의 상기 박테리오파지 KFS-A9를 이용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 사료 첨가용 조성물을 포함하는 사료를 제공할 수 있으며, 본 발명의 사료는 박테리오파지를 사료 첨가제 형태로 따로 제조하여 사료에 혼합시키거나, 사료 제조 시 직접 첨가시키거나 양식수에 직접 첨가하여 제조할 수 있다. 본 발명의 사료 내 박테리오파지는 액상 또는 건조상태일 수 있으며, 그 사용 용도에 맞게 사용할 수 있다. 건조방법은 통풍건조, 자연건조, 분무건조 및 동결건조가 가능하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 박테리오파지는 분말형태로 사료 중량의 0.05 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 2 중량%의 성분비로 혼합될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 사료는 본 발명의 박테리오파지 외에 사료의 보존성을 높일 수 있는 통상의 첨가제들을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 사료 첨가용 조성물에는 비병원성의 다른 미생물이 추가로 첨가될 수 있다. 첨가될 수 있는 미생물로는 단백질 분해 효소, 지질 분해효소 및 당 전환 효소를 생산할 수 있는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 고초균, 소의 위와 같은 혐기적 조건에서 생리적 활성 및 유기물 분해능이 있는 락토바실러스 균주(Lactobacillus sp.), 가축의 체중을 증가시키며 우유의 산유량을 늘리고 사료의 소화 흡수율을 높이는 효과를 보여주는 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae)와 같은 사상균 및 사카로미세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 박테리오파지 KFS-A9를 포함하는 사료에는 식물성으로는 곡물류, 근과류, 식품가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류, 곡물부산물류 등이 있으며, 동물성으로는 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질, 동물성 플랑크톤류, 남은 음식물 등이 있으며 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 사료 첨가용 조성물에는 품질 저하를 방지하기 위하여 첨가하는 결착제, 유화제, 보존제 등이 포함될 수 있고, 효용 증대를 위하여 사료에 첨가하는 아미노산제, 비타민제, 효소제, 생균제, 향미제, 비단백태질소화합물, 규산염제, 완충제, 착색제, 추출제, 올리고당 등이 있으며, 그 외에도 사료 혼합제 등을 추가로 포함할 수 있다.

아에로모나스 히드로필라에 특이적 사멸능을 갖는 본 발명의 박테리오파지 KFS-A9를 포함하는 소독제는 병원감염을 막기 위한 병원 및 보건용의 소독제로 유용하게 사용될 수 있고 일반 생활 소독제, 식품 및 조리 장소 및 설비의 소독제, 양식장 등의 건물, 축체, 음수, 깔짚, 난좌, 운반차량, 식기 등의 각종 생육 용품의 소독 등에 사용될 수 있다.

본 발명의 박테리오파지 KFS-A9는 아에로모나스 히드로필라에 특이적 사멸능을 가지므로, 상기 아에로모나스 히드로필라에 노출되었거나 노출될 가능성이 있는 동물의 피부 표면 또는 신체 각 부위 등을 세척하는 용도로도 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 KFS-A9를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 아에로모나스 히드로필라에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 아에로모나스 히드로필라에 의한 감염성 질병, 예컨대 설사증, 패혈증, 출혈, 궤양, 식중독 및 아에로모나스 감염증(Aeromonas infection)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상이 발생한 개체에 박테리오파지 KFS-A9를 투여하는 단계를 포함한다. 또한 본 발명에서 치료될 수 있는 아에로모나스 히드로필라에 의한 감염성 질병은 상기 질병으로 인해 나타나는 증상, 예컨대 구토, 메스꺼움, 복통, 발혈, 오한과 같은 일반적인 식중독 증상을 포함한다. 또한, 담수어의 경우 복수증과 안구돌출, 항문돌출, 피부와 근육의 궤양, 혈관 출혈, 궤양성 피부염 등의 세균성 패혈증을 포함한다.

본 발명에서, 용어 "개체"는 인간 및 인간을 제외한 동물을 모두 포함할 수 있으며, 바람직하게는 인간 또는 어류를 말하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 어류에는 잉어, 시클리드, 농어, 대구, 붕어, 연어, 우럭, 미꾸라지. 메기 또는 망둑어가 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 방법에서 상기 박테리오파지 KFS-A9 또는 조성물은 약학적 제제의 형태로 동물에게 투여되거나, 가축 또는 어류의 사료 또는 음용수에 혼합하여 이를 섭식시키는 방법을 통해 투여될 수 있다.

본 발명의 방법에서 상기 박테리오파지 KFS-A9 또는 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.

본 발명의 방법에 투여되는 상기 박테리오파지 KFS-A9의 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 개체에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 동물의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.

본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예, 제제예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예, 제제예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예, 제제예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 신규한 박테리오파지의 분리 및 배양

1.1 아에로모나스 히드로필라 ( Aeromonas hydrophila )에 감염하는 박테리오파지의 스크리닝 및 단일 박테리오파지의 분리

아에로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila)에 특이적인 박테리오파지를 스크리닝 및 분리하기 위해서 용균반 분석을 수행하였다. 경상북도 상주시 소재 닭 공장의 닭 내장 처리공정으로부터 수득한 세척수 25 ml을 시료액으로 준비하고, 이를 이용하여 탑-아가 (top-agar), 0.4% 한천을 이용하여 고체 배지 위에 붙이는 소프트 아가 오버레이 (soft agar overlay) 방법을 수행하였다.

구체적으로, TSB 배지 225 ml에 세척수 시료액 25 ml와 서울대학교 수의과학대학에서 입수한 아에로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila) SNUFPC A9 진탕 배양액 (OD₆₀₀ = 0.465) 1%를 혼합하고 이를 37℃에서 18시간 동안 배양한 다음, 상기 배양액을 8,000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 그 상등액을 0.25 μm 필터로 여과하였다. 그 다음, TSA 평판 배지 상부에 TA 소프트 아가 (0.4%(w/v) 아가, 영양배지, NaCl, MgSO₄, CaCl₂) 4 ml과 아에로모나스 히드로필라 SNUFPC A9 진탕 배양액 (OD₆₀₀ = 0.465) 200 μl을 넣은 혼합액을 부어 굳힌 후, 그 위에 상기 세척수 시료액 10 μl를 적가하고 37℃에서 18시간 동안 배양하여 용균반의 형성 여부를 확인하였다. 용균반 형성을 확인한 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 용균반을 형성하는 박테리오파지를 확인하였고, 상기 박테리오파지는 아에로모나스 히드로필라 특이적인 용균능을 갖는 박테리오파지임을 확인하였다.

또한, 하나의 용균반에는 한 종류의 박테리오파지가 존재한다고 알려져 있기 때문에, 상기 형성된 용균반으로부터 단일 박테리오파지를 분리하고자 하였다. 구체적으로, 상기 용균반을 900 μl의 SM 완충용액 (50 mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 10mM MgSO₄)에 넣은 후, 실온에서 2시간 동안 방치하여 박테리오파지 용액을 수득하였다.

1.2 박테리오파지의 대량 배양 및 정제

상기 실시예 1.1에서 확인한 아에로모나스 히드로필라 특이적 박테리오파지를 대량 배양하기 위하여, 아에로모나스 히드로필라 SNUFPC A9을 이용하여 대량으로 배양하고 이로부터 박테리오파지를 정제하였다.

구체적으로, 아에로모나스 히드로필라 SNUFPC A9을 진탕배양하여 TA 배양액 (nutrient broth, NaCl, MgSO₄, CaCl₂) 3 ml에 분주한 후, 2시간 동안 배양시킨다. 상기 실시예 1.1에서 수득한 박테리오파지를 분주하여 2시간 배양시킨 후, 원심분리 후 필터링하여 박테리오파지만을 분리하였다. 동일한 방법으로 TA 배양액의 양을 증가 (8, 20, 200, 800 ml의 순서)시켜가며 진행하였다. 그 다음 최종 농도가 10%(w/v)가 되도록 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)과 1M NaCl을 가한 후 4℃에서 16시간 동안 정치한 후, 4℃에서 8,000 rpm으로 20분간 원심 분리하여 침전물을 수득하였다.

정제된 파지는 CsCl 밀도 구배 울트라원심분리 (밀도 구배: 1.20, 1.30, 1.40, 1.45, 1.50, 1.70g/ml; 22,000rpm; 2시간; 4℃)하고, SM 완충용액 (50 mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 10mM MgSO₄)에서 투석한 후 사용 전까지 4℃의 암소에 보관하였다.

이와 같이 분리된 박테리오파지를 "박테리오파지 KFS-A9(Bacteriophage KFS-A9)"로 명명하고, 2016년 09월 26일 생물자원센터 (Korean Collection for Type Cultures, 한국)에 기탁하고, 기탁번호 KCTC13119BP를 부여받았다.

실시예 2: 박테리오파지 KFS -A9의 전체 유전자 분석

박테리오파지 KFS-A9의 전체 유전자를 분석하기 위해, 박테리오파지의 유전체를 Phage DNA Isolation Kit (NORGEN, Canada)를 사용하여 분리하였다. 분리된 박테리오파지의 전체 유전자 분석은 454 및 Illumina sequencing platforms의 혼합 방법과 CodonCode Aligner 3.7.1에 의하여 수행하였다. 전체 유전자의 크기를 전기영동으로 확인하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이 박테리오파지 KFS-A9의 전체 유전자 분석 결과, 이중가닥 DNA로 크기가 40 kbp이며, 전체 ORF 수는 46개임을 확인하였다. 박테리오파지 KFS-A9의 전체 유전자 서열을 서열번호 1로 나타내었다.

실시예 3: 박테리오파지 KFS -A9의 형태학적 특성

박테리오파지 KFS-A9의 형태학적 특성을 알아보기 위해, 투과전자현미경 관찰을 수행하였다. 박테리오파지 KFS-A9를 구리 그리드에 로드(load)한 후에, 2% 우라닐 아세테이트로 음성 염색하고 건조하였다. 전자현미경 촬영은 경북대학교 공동실험실습관에서 수행하였고, 박테리오파지 KFS-A9의 형태는 H-7100 (Hitachi)를 이용해 100 kV의 전압으로 관찰한 후, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 박테리오파지 KFS-A9에서 각이 진 머리(icosahedral head)와 꼬리(tail)가 관찰되었으므로 시포비리대(siphoviridae)에 속하는 것으로 추정된다.

실시예 4: 박테리오파지 KFS -A9의 단백질 패턴 분석

박테리오파지 KFS-A9의 단백질 패턴을 분석하기 위해, 10¹¹ PFU/ml 농도로 정제된 박테리오파지 KFS-A9 용액 40 μl와 SDS 시료 용액 10 μl를 혼합하고 5분간 가열한 후, 10% SDS-PAGE를 수행하였다. SDS-PAGE 수행 후 단백질 전기영동 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 박테리오파지 KFS-A9는 37 kDa 및 90 kDa 크기의 주요 단백질로 구성되어 있음을 확인하였다.

실시예 5: 박테리오파지 KFS -A9의 병원성 균주에 대한 특이성 조사

박테리오파지 KFS-A9의 아에로모나스 히드로필라 이외의 다른 병원성 식중독 균주에 대한 용균 활성을 확인하기 위해 특이성 검토를 수행하였다.

구체적으로, 서울대학교 수의과학대학에서 입수한 아에로모나스 히드로필라와 기타 병원성 균주 9종을 각각 배양하여 그 배양액을 수득한 후, 각각의 배양액과 정제한 박테리오파지 KFS-A9를 이용한 소프트 아가 오버레이 방법을 통해 용균반의 형성 여부를 확인하였다. 결과를 표 1에 나타내었다.

균주 명칭	용균반 형성 여부
A. hydrophila SNUFPC A9	O
Bacillus cereus ATCC 14579	X
Esherichia coli O157:H7 ATCC 43895	X
Listeria monocytogenes ATCC 19116	X
Salmonella Enteritidis ATCC 13076	X
Salmonella Typhimurium ATCC 19586	X
Shigella sonnei ATCC 9290	X
Staphylococcus aureus ATCC 25923	X
Vibrio parahaemolyticus ATCC 43996	X
Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145	X
Yersinia enterocolitica ATCC 23715	X
Salmonella Typhimurium ATCC 19586	X
Esherichia coli O157:H7 ATCC 43895	X
Shigella sonnei ATCC 9290	X
Vibrio parahaemolyticus ATCC 43996	X

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 박테리오파지 KFS-A9는 바실러스 세레우스, 살모넬라 엔테리티디스 등 다른 속의 병원성 식중독 균주에 대해서는 용균활성이 없는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 박테리오파지 KFS-A9는 아에로모나스 하이드로필라에 특이적으로 용균활성을 나타내는 박테리오파지임을 확인하였다.

실시예 6: 박테리오파지 KFS -A9의 pH 안정성 조사

박테리오파지 KFS-A9의 pH 안정성을 확인하기 위하여, 다양한 pH 범위(pH 3, 4, 5, 7, 9, 11)의 TSB 배지 900 μl와 1.23 ×10⁹ PFU/ml 농도의 박테리오파지 KFS-A9 100 μl를 섞은 후, 1시간 동안 상온에서 정치하였다. 한 시간 반응시킨 KFS-A9을 소프트 아가 오버레이 방법을 이용하여 37℃에서 18시간 동안 배양한 후, 잔존하는 박테리오파지 KFS-A9의 활성을 측정하였다. 측정 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, pH 4.0 내지 pH 11.0의 범위에서는 박테리오파지 KFS-A9의 활성이 안정적으로 유지됨을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명의 박테리오파지 KFS-A9는 pH 4.0-11.0의 범위에서 그 활성이 유지됨을 확인하였으므로 pH 안정성이 우수한 박테리오파지임을 알 수 있다.

실시예 7: 박테리오파지 KFS -A9의 열 안정성 조사

박테리오파지 KFS-A9의 열 안정성을 확인하기 위하여, 다양한 온도 범위(4℃, 22℃, 37℃, 50℃, 60℃, 70℃)에서 KFS-A9의 활성을 측정하였다.

구체적으로, 1.23 ×10⁹ PFU/ml 농도의 박테리오파지 KFS-A9 용액 1 ml과 TSB 배지용액을 혼합한 후, 각각의 온도(4℃, 22℃, 37℃, 50℃, 60℃ 및 70℃)에서 1시간 동안 정치하였다. 한 시간 반응시킨 KFS-A9을 소프트 아가 오버레이 방법을 이용하여 37℃에서 18시간 동안 배양한 후, 잔존하는 박테리오파지 KFS-A9의 활성을 측정하였다. 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 박테리오파지 KFS-A9는 4-37℃에서는 안정하였으며, 50℃부터는 약 3 log, 60℃에서는 4 log로 활성이 감소됨을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명의 박테리오파지 KFS-A9는 내열성이 비교적 우수한 박테리오파지이므로, 사료 첨가제로 이용할 경우 박테리오파지의 제형 과정에서 발생하는 열에 대해 안정적으로 제형화할 수 있음을 확인하였다.

상기 실험으로부터 본 발명의 박테리오파지 KFS-A9를 이용한 아에로모나스 히드로필라에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료 방법은 기존의 항생제 등의 화학물질에 비해 아에로모나스 히드로필라에 대해 특이성이 매우 높았고, 용균 활성이 우수하며 물리화학적 환경에 강하다는 장점을 가지고 있음을 확인하였다. 또한 본 발명의 박테리오파지 KFS-A9는 항생제의 오남용으로 인한 항생제 내성균의 문제점, 식품 내의 항생제의 잔류 문제, 광범위한 숙주범위의 문제점을 해결할 수 있는 장점이 있다. 따라서 본 발명의 박테리오파지 KFS-A9는 양식 산업 및 축산업의 경쟁력 및 국민보건향상에 이바지할 수 있는 효과가 있다.

비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한 첨부된 청구 범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.

이하 본 발명의 박테리오파지 KFS-A9를 포함하는 감염성 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명을 한정하고자 함이 아니고 단지 이를 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1: 의약품의 제조

1.1 주사제의 제조

박테리오파지 KFS-A9 1 ×10⁶ PFU/mL

주사용 멸균 증류수 적량

pH 조절제 적량

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 mL) 상기의 성분 함량으 로 제조한다.

1.2 액제의 제조

박테리오파지 KFS-A9 1 ×10⁶ PFU/mL

설탕 20g

이성화당 20g

레몬향 적량

정제수를 가하여 전체 1,000 mL로 맞추었다. 통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조한다.

1.3 정제의 제조

박테리오파지 KFS-A9 1 ×10⁶ PFU/mL

옥수수전분 100mg

유당 100mg

스테아린산 마그네슘 2mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

생물자원센터

KCTC13119BP

20160926

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Novel Aeromonas hydrophila specific bacteriophage and antibacterial composition comprising the same <130> 1_288 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 40071 <212> DNA <213> bacteriophage KFS-A9 <400> 1 cgttgagggc atggagtggc gctcattcaa cgaggaaatg atggcctata acgttcagga 60 cgttgtggtc actaaggccc tccttgagaa gctgctgtcc gataagcact acttcaagcc 120 tgagattgac ttcacggatg tctctgcgga taccttctgg atggaagcta tcgaggcgat 180 tgacgtggag caccgagccg cttggttgct cgctaagcag gagcgcaatg gctacccgtt 240 caacaccaag gctatcgaag acctgtacgt tgagctggcc tctcgccgct ctgagctgct 300 gatgcgcctg accgatacct tcggctcttg gtatcagccc aagggcggca ccgaaatgtt 360 cctgcacccg agaacaggtc agccgctccc gaagtacccg cgagtgaaga ccccgaaagt 420 gggaggaatc ttcaagaagc ccaagaacaa agcccaacgt gaaggccgtg agccttgtga 480 gctggacact cgggacttcg ttgcgggtgc cgtttacact ccggtggagc acgttgtctt 540 caatccttcg tcccgcgacc acatccagaa gaagctccaa gaggctggct gggtgcccga 600 gaagttcacc 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caaccaagcc gcgccaagac gttggtgttc gggagattag acagtggcac 35640 aaggagcaag gctatctcga tattggatac cattttgtga ttagacgaga tggtactgtt 35700 gaagatggcc gagacgttaa cgccgttggc tctcacgccc gtggttacaa ccacaactcc 35760 gtaggcgtgt gccttgttgg aggcattgac gagaagggtc ggcacgaagc caacttcact 35820 cctcaacaga tgtctgccct gcgcaccctg ctggaagtcc tgatggacaa gtacccgagc 35880 gcggtactta aagcccacca cgatgttgca ccgaaggctt gcccttcgtt cgacctgcaa 35940 cgctggtgga agcacaatga gctggtcact tctgaccgag gctaatacga ctcactaaag 36000 ggatgaccga aaggttgtcc ctttcaacac aaggaggaat ctatgagtga attattcaaa 36060 gacctagtga ttgactcaga gagtccttct ggtctacgct ggtcagattc cgctaggtat 36120 cagcaagcgg gtaaacctgc gggtacgtta cagaagaacc ctaagtattg ggttgtttgg 36180 ttaaacaaga gaatctatag ggtacatagg gtcattatgt gtctattaca caacttggag 36240 tatgctgaat gtccagttgt tgaccacata gacggagatg gctctaacaa ccgtgtagaa 36300 aatctgaggt tagtatcacg cgctcagaac tcagccaata tgaagacacc gaagagtaac 36360 acgtccggaa tcaaaggagt aagttacgat aggaagcgcg gtaagtatag gggctatgta 36420 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Claims

아에로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila)에 특이적인 사멸능을 갖는, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 박테리오파지 KFS-A9(기탁번호 KCTC13119BP).
삭제
제1항에 있어서, 상기 박테리오파지는 pH 4.0 내지 pH 11.0의 범위에서 용균활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 박테리오파지 KFS-A9(기탁번호 KCTC13119BP).
제1항에 있어서, 상기 박테리오파지는 4℃ 내지 40℃ 범위에서 용균활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 박테리오파지 KFS-A9(기탁번호 KCTC13119BP).
삭제
삭제
제1항의 박테리오파지 KFS-A9(기탁번호 KCTC13119BP)를 포함하는, 항생용 조성물.
제1항의 박테리오파지 KFS-A9(기탁번호 KCTC13119BP)를 포함하는, 사료 첨가용 조성물.
제8항의 사료 첨가용 조성물을 포함하는, 사료.
제1항의 박테리오파지 KFS-A9(기탁번호 KCTC13119BP)를 포함하는, 소독제.
제1항의 박테리오파지 KFS-A9(기탁번호 KCTC13119BP)를 포함하는, 세척제.
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