CN112538463A - 一种新型嗜水气单胞菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用 - Google Patents

一种新型嗜水气单胞菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用 Download PDF

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Abstract

本申请涉及微生物的领域，具体公开了一种新型嗜水气单胞菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用，所述新型嗜水气单胞菌噬菌体为嗜水气单胞菌噬菌体AH‑P1(Aeromonas hydrophila phage AH‑P1)，保藏编号为CCTCC NO:M 2020251，本申请的噬菌体可有效杀灭不同动物宿主来源的嗜水气单胞菌低浓度下仍能有效抑菌杀菌；所述组合物中至少含有一株嗜水气单胞菌噬菌体AH‑P1；所述试剂盒中带有嗜水气单胞菌噬菌体AH‑P1或嗜水气单胞菌噬菌体AH‑P1的组合物；所述嗜水气单胞菌噬菌体AH‑P1的组合物用于但不限于杀死嗜水气单胞菌。

Description

一种新型嗜水气单胞菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用
技术领域
本申请涉及噬菌体领域，更具体地说，它涉及一种新型嗜水气单胞菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用。
背景技术
嗜水气单胞菌属弧菌科气单胞菌属，为革兰阴性短杆菌，极端单鞭毛，无芽孢，无荚膜，散在排列，生长温度为5～40℃，pH为6～11。嗜水气单胞菌在自然界中广泛分布，普遍存在于淡水、污水、淤泥、土壤和人类粪便中。近年来，嗜水气单胞菌引起我国水产动物细菌性败血症的流行，危害严重，造成了巨大的经济损失，已成为我国水产养殖中重点关注的问题。
目前，在淡水鱼细菌性败血病的治疗中，相关技术中一方面采用化学消毒剂、抗生素、部分中草药和疫苗对嗜水气单胞菌均有一定的杀灭作用，但是这样的防治方法，步骤繁琐，成本高，难以大规模使用，并且覆盖率及治愈率较低，嗜水气单胞菌还会出现耐药性以及对水产品的品质造成严重影响。另一方面，通过噬菌体与细菌细胞表面特异位点结合，达到杀灭特异性细菌病毒的目的，具有杀菌特异性强，对细菌耐药性适应性强，无副作用，无药物残留，对人畜环境无毒无害。
但是，关于嗜水气单胞菌噬菌体的研究较少，且主要集中于嗜水气单胞菌噬菌体的分离方面，针对更多病原的嗜水气单胞菌噬菌体的裂解特性的研究鲜见报道，综上，急需开发一种裂解谱宽的新型嗜水气单胞菌噬菌体。
发明内容
为了拓宽嗜水气单胞菌噬菌体的裂解特性，本申请提供一种新型嗜水气单胞菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用。
本申请提供的一种新型嗜水气单胞菌噬菌体，采用如下的技术方案：
第一方面，本申请提供一种新型嗜水气单胞菌噬菌体，采用如下的技术方案：
一种新型嗜水气单胞菌噬菌体，所述嗜水气单胞菌噬菌体为嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophila phage AH-P1)，保藏编号为CCTCC NO:M 2020251。
通过采用上述技术方案，本申请提供一种新型嗜水气单胞菌噬菌体，具有较宽的裂解谱以及较强的耐紫外特性，现已存放在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号为CCTCC NO:M 2020251。
优选的，所述嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophila phage AH-P1)为烈性噬菌体，有一呈多面体对称的头部和可伸缩的尾部，头部直径为50～60nm，尾部长为150～200nm，尾部直径为7～10nm。
通过采用上述技术方案，所述嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophilaphage AH-P1)具有多面体立体对称的头部和可伸缩的尾部，有助于头部的核酸注入宿主菌中，还可有效识别宿主菌表面的特殊受体。
优选的，所述嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophila phage AH-P1)具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
优选的，所述嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophila phage AH-P1)在MOI＝0.001条件下培养8h，效价为4.1×1010pfu/mL。
通过采用上述技术方案，感染复数(MOI)是噬菌体数量与细菌数量的比值，是研究噬菌体感染细菌与产出噬菌体子代量效关系的重要依据。本申请的嗜水气单胞菌噬菌体只需添加适量，即可侵染嗜水气单胞菌增殖获得大量子代噬菌体。本发明为工业化生产噬菌体杀菌剂提供了优质噬菌体菌株来源。
优选的，所述嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophila phage AH-P1)在pH＝4～10的条件下具有良好的稳定性，同时供试噬菌体在酸性条件下耐受性良好，对碱性条件具有一定耐受性；经紫外辐射8h后，噬菌体AH-P1的效价下降较少，表明噬菌体AH-P1具有优异的紫外耐受性。
第二方面，本申请提供一种新型嗜水气单胞菌噬菌体的组合物，采用如下的技术方案：一种新型嗜水气单胞菌噬菌体的组合物，所述组合物中至少含有一株嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophila phage AH-P1)。嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophila phage AH-P1)对碱性及紫外均具有良好的耐受性，可以与其他噬菌体组合联用，也可以与其它物质混合，满足特异性需求。
优选的，所述组合物包括其他噬菌体，具体为：副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrioparahaemolyticus phage VP46)，保藏编号为CCTCC NO：M 2016290；副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)，保藏编号为CCTCC NO:M 2016289；溶藻弧菌噬菌体VAP7(Vibrio alginolyticus phage VAP7)，保藏编号为CCTCC NO:M 2018767；或溶藻弧菌噬菌体VAP21(Vibrio alginolyticus phage VAP21)，保藏编号为CCTCC NO:M2018768中的一种。
通过上述技术方案，将嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophila phageAH-P1)和其他噬菌体联合使用，以获得对目标细菌更好的杀灭效果。作为示例性的说明，嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1与其他噬菌体之间的比例关系可以由本领域技术人员结合本发明以及实际的应用领域以及本领域常识进行确定。
优选的，所述组合物还包括化学药剂。
通过采用上述技术方案，本申请还提供一种新型嗜水气单胞菌噬菌体的组合物，含有至少一株嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1，或者含有至少一株嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1与化学性杀菌剂形成的复配物，该组合物对淡水鱼细菌性败血病具有较好的防治作用。本申请将所述的嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1和化学性杀菌剂作为组合物联合使用。作为示例性的说明，嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1与6mg/L过氧乙酸之间的比例关系可以由本领域技术人员结合本申请以及实际的应用领域以及本领域常识进行确定。
第三方面，本申请提供一种新型嗜水气单胞菌的试剂盒，采用如下的技术方案：
一种新型嗜水气单胞菌的试剂盒，所述试剂盒中带有所述新型嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophila phage AH-P1)或新型嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophila phage AH-P1)的组合物。
通过采用上述技术方案，本申请的嗜水气单胞菌噬菌体应用于嗜水气单胞菌的快速检测，包括但不限于以试纸、试纸盒等形式对嗜水气单胞菌进行检测，或对临床样本中的目标致病菌进行筛选，有效确保检测的灵敏度。
第四方面，本申请提供一种新型嗜水气单胞菌噬菌体及其组合物的应用，采用如下的技术方案：
所述嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophila phage AH-P1)及其组合物可用作为生物类消毒剂或生物类药剂的有效成分，可作为治疗淡水鱼细菌性败血症、蛙类的红腿病、中华鳖的红脖子病、红底斑病、鸟类、食鱼的水禽、爬行的鳄鱼、哺乳动物如貂、野兔、牛败血症疾病的药物的应用，同时还可防治但不限于由嗜水气单胞菌引起的细菌性疾病。
通过采用上述技术方案，本申请涉及的嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1及其组合物可用于治疗上述病症，特别是针对淡水鱼细菌性败血症具有较好的防治效果。同时，嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophila phage AH-P1)及其组合物可以用于治疗和预防由嗜水气单胞菌、且不限于由嗜水气单胞菌引起的细菌感染；同时可用作防治由嗜水气单胞菌、且不限于由嗜水气单胞菌引起的细菌性病害的生物药剂。作为示例性的说明，嗜水气单胞菌AH-P1与其他噬菌体之间的比例关系可以由本领域技术人员结合本发明以及实际的应用领域以及本领域常识进行确定。
第五方面，本申请提供一种上述嗜水气单胞菌噬菌体及其组合物的另一种应用，采用如下技术方案：
所述的嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophila phage AH-P1)及其组合物用作于生物杀菌剂。
通过采用上述技术方案，本申请所述的嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonashydrophila phage AH-P1)及其组合物可以用作为日常的杀菌剂，可以特异性地杀灭环境中的嗜水气单胞菌、且不限于嗜水气单胞菌，改善环境中的微生物分布；也可以用作在水产动物养殖、运输及保存中的生物杀菌剂，用于防治在水产养殖、运输及保存过程中致病性的嗜水气单胞菌及其他细菌污染；也可以与其它杀菌剂混合使用，喷洒于食品生产车间，防治食品加工过程中嗜水气单胞菌及其他细菌的污染。
第六方面，本申请提供一种上述嗜水气单胞菌噬菌体及其组合物的另一种应用，采用如下技术方案：
所述的嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophila phage AH-P1)及其组合物用作于饲料添加剂。
通过采用上述技术方案，嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophilaphage AH-P1)及其组合物可用于添加于饲料中，可特异性、持续性防治饲料中嗜水气单胞菌、且不限于嗜水气单胞菌的生存和繁殖，防治饲料存储及动物养殖中因嗜水气单胞菌、且不限于因嗜水气单胞菌引起的污染。
综上所述，本申请至少具有以下有益效果：
1、本申请的嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophila phage AH-P1)是从自然界中分离的烈性噬菌体，具有较宽的裂解特性，对温度、紫外线、pH具有较高的耐受性，适用在不同的防治环境中，能够对淡水鱼细菌性败血症起到较好的生物防治效果；
2、本申请的嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophila phage AH-P1)具有高度亲和性及裂解能力，在培养8h内可达到1010PFU/mL以上的效价；嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1可以特异性地部分或完全灭活嗜水气单胞菌，仅需少量初始噬菌体即可完成大量增殖，为工业化生产噬菌体杀菌剂提供优质噬菌体菌株来源；本领域技术人员可以根据本申请的记载及本领域常识将本申请所述的嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1或其组合物制备成应用于检测、消毒及动物防护等方面的各种产品并加以工业应用；产品形式可包括但不限于以载体携带、浓缩注射或药剂浸泡等形式施用于被防治的寄主体表、口部、体内等部位；作为实施方案之一，所述载体携带形式包括但不限于口服含水性载体、口服无水性载体、乳膏制剂等；浓缩注射形式包括但不限于疫苗注射、胸膜腔注射、经脉注射等；药剂浸泡形式包括但不限于气雾剂、漂洗剂等。
3、本申请的嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophila phage AH-P1)为严格的烈性噬菌体，经毒理实验证明其安全、无任何副作用；供试噬菌体不含毒力基因或不良基因；本发明未对供试噬菌体进行任何遗传修饰。
4、嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophila phage AH-P1)对宿主菌具有高度专一性和裂解性，并且具有较广的宿主范围，对45株不同来源的嗜水气单胞菌的裂解率高达94％；
5、本申请的嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophila phage AH-P1)与非宿主性致病性细菌的互作，无法识别34株供试非宿主性致病性细菌中的任何一株，特异性良好；
6、本申请的嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophila phage AH-P1)对其他联用物质无拮抗作用，同时可以和化学性消毒剂进行联用；嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1可作为应用于环境消毒的各种产品的有效成分，例如包括但不限于以液体浸泡、喷洒、与含水性载体联合使用等形式对配水系统、灌溉设施、养殖业设施、公共及私人设施或其他环境表面进行消毒去污，可有效控制目标细菌的生长及活性；所述液体浸泡、喷洒形式包括但不限于洗涤剂、消毒剂、去污剂等；所述含水性载体包括但不限于磷酸盐缓冲液、TSB培养基、LB培养基、氯游离水等；
7、本申请的嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophila phage AH-P1)稳定性良好，在pH＝4～10的条件下处理96h后其效价均无显著变化；经紫外辐射8h后，效价降低不超过1个数量级；
8、本申请的嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophila phage AH-P1)，可用于制备组合物、试剂或试剂盒，应用于嗜水气单胞菌的快速检测，包括但不限于以试纸、试剂盒等形式对目标样本中的嗜水气单胞菌进行检测，或对临床样本中的目标致病菌进行筛选，有效确保检测的灵敏度。
9、本申请的嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophila phage AH-P1)，可以有效杀灭鱼肉表面的嗜水气单胞菌并防治鱼肉在保存过程中嗜水气单胞菌的污染；嗜水气单胞菌AH-P1的组合物可以有效杀灭鱼肉表面的嗜水气单胞菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌，并防治鱼肉等肉类在保存过程中嗜水气单胞菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌的污染。可作为食品防护的各种产品的有效成分。本发明包括但不限于以液体浸泡、喷洒、与合成组分联合使用等形式对由嗜水气单胞菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌侵染所导致的食品腐坏进行预防，尤其适用于熟食或不宜灭菌的食品。所述液体浸泡、喷洒形式包括但不限于食品除菌剂、食品消毒剂、食品防腐剂等；本发明中合成组分包括但不限于苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾、丙酸钙等。
10、本发明的嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophila phage AH-P1)可以单独或混合使用，用作为生物杀菌剂，饲料添加剂，或因嗜水气单胞菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌引起的细菌感染的治疗药物、保健品及医疗器械；嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1及其组合物可应用于治疗或预防由嗜水气单胞菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌引起的感染性疾病；可被嗜水气单胞菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌感染的寄主包括人类、哺乳动物(貂、野兔、牛)、水禽、鳄鱼以及各种水生生物(鱼类、虾类、贝类、蛙类)等。
11、本发明的嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophila phage AH-P1)及其组合物可以由本领域技术人员根据本申请的记载和本领域常识制备成可应用于防治由嗜水气单胞菌、且不限于由嗜水气单胞菌引起的病害的生物药剂。
附图说明
图1是嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1噬菌斑形态照片。
图2是透射电子显微镜下嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1形态结构示意图。
具体实施方式
以下结合附图1～2和实施例对本申请作进一步详细说明。
以下实例中，所涉及菌株代号均为本公司的命名方式编号。
嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophila phage AH-P1)，保藏编号为CCTCC NO:M 2020251，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2020年06月30日。
副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phage VP46)，保藏编号为CCTCC NO:M 2016290，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2016年5月26日。
副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)，保藏编号为CCTCC NO:M 2016289，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2016年5月26日。
溶藻弧菌噬菌体VAP7(Vibrio alginolyticus phageVAP7)，保藏编号为CCTCCNO:M 2018767，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2018年11月09日。
溶藻弧菌噬菌体VAP21(Vibrio alginolyticus phageVAP21)，保藏编号为CCTCCNO:M 2018768，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2018年11月09日。
副溶血性弧菌ATCC17802通过联系保藏单位购买获得。
嗜水气单胞菌ATCC 23213通过联系保藏单位购买获得。
溶藻弧菌ATCC33840通过联系保藏单位购买获得。
以下实例中，
TSB液体培养基的配方为：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL；
TSA固体培养基的配方为：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL；
TSB半固体琼脂培养基配方为：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，琼脂7g，蒸馏水1000mL；
SM液配方为：氯化钠5.8，硫酸镁2g，1mol/L Tris-HCl 50mL，明胶0.25g，蒸馏水1000mL。
嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophila phage AH-P1)、副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phage VP46)、副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrioparahaemolyticus phage VP7)、溶藻弧菌噬菌体VAP7(Vibrio alginolyticusphageVAP7)和溶藻弧菌噬菌体VAP21(Vibrio alginolyticus phageVAP21)的组合物XX～组合物XX均依实施例XX所述方法制备。
实施例1：噬菌体的分离制备及纯化培养本申请中嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1的来源样品采集于江苏省南京市江宁区生活污水，经双层滤纸过滤后常温5000r/min离心10min，过0.22μm滤膜收集上清。
1、嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1的分离：
(1)取10mL过滤后的上清液，加入10mL 2倍TSB液体培养基中，同时加入1mL宿主菌AH-1对数期菌液，放置于30℃条件下培养6h；
(2)取上述培养物在8000rpm条件下离心10min，用0.22μm滤膜过滤上清，备用；
(3)取0.5mL噬菌体宿主菌AH-1对数期菌液，加入5mL 40℃半固体TSB培养基中混匀，倾倒于TSA固体培养基上，制备成含有宿主菌AH-1的双层平板；
(4)取步骤(2)中过滤后的上清液10μL，点滴于已凝固的双层平板上，在无菌条件下风干后，放置于30℃培养8h，观察是否形成噬菌体点滴斑。
2、嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1的纯化：
用牙签挑取噬菌体点滴斑至1mL SM液中，150rpm震荡15min，进行10倍梯度稀释，向各梯度稀释液中分别加入5mL含有宿主菌对数期菌液的TSB半固体培养基并混合均匀；将其倾倒于盛有TSA固体培养基的培养皿上，待半固体培养基凝固后，30℃过夜培养。重复该步骤3～5次，得到噬菌体单克隆样品，命名为嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonashydrophila phage AH-P1)，保藏编号为CCTCC NO:M 2020251。嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophila phage AH-P1)噬菌斑形态如图1所示。
实施例2：嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1的电镜观察
取实施例1制得的纯化噬菌体溶液作电镜观察：取20μL样本滴于铜网上，待其自然沉淀15min，用滤纸从侧面吸收多余液体，加1滴2％磷钨酸于铜网上，染色10min，用滤纸从侧面吸去染液，干燥后做电镜观察：
结果如图2所示，嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1有一呈正多面体的头部和可伸缩的尾部，头部直径为50～60nm，尾部长为150～200nm，尾部直径为7～10nm。本图中噬菌体AH-P1头部直径56nm，尾长180nm，尾部直径8nm。
实施例3：嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1基因组的提取与测序
(1)取实施例1制得的纯化噬菌体溶液100mL，分别加入浓度为5mg/mL的DNaseI 20μL、RNaseA 20μL至终浓度1μg/mL，37℃条件孵育60min后加入5.84g NaCl，溶解后置于冰浴中1h；
(2)4℃条件下，11000rpm离心10min，将离心后的上清液转移至新的离心管中，加入固体PEG8000至终浓度为10％(w/v)，待其完全溶解后冰浴1h；
(3)4℃条件下，11000rpm离心20min，加入1mL SM液重悬沉淀，即获得噬菌体颗粒浓缩液，4℃保存待用；
(4)采用λ噬菌体基因组DNA试剂盒提取噬菌体核酸并进行测序。经过核苷酸测序，所述嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophila phage AH-P1)，具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
将嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophila phage AH-P1)的序列在NCBI网站上比对并结合透射电镜观察结果可得该噬菌体属于Autographiviridae科噬菌体。
实施例4：嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1的毒力基因或不良基因缺失检测试验本实施例选取103种经鉴定源自病原细菌体内溶源性噬菌体的毒力基因如表1所示，通过测定嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophila phage AH-P1)的全基因组并对其进行生物信息学分析，以确定其是否含有上述毒力基因。结果显示，本申请的供试噬菌体不含有下列毒力基因。嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1无法编码可能引起潜在健康风险的蛋白，因此不会对人或动物体的健康造成影响。
表1病原细菌体内溶源性噬菌体的主要已知毒性基因
Figure BDA0002869146820000081
Figure BDA0002869146820000091
Figure BDA0002869146820000101
Figure BDA0002869146820000111
实施例5：嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1效价的测定
用SM液做稀释液，将嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(由实施例1制得)的原液10倍梯度逐级稀释至l08倍。分别取l05、l06、l07及l08稀释度的噬菌体培养液lmL与其宿主菌菌液300μL均匀混合，静置15min使其与细菌表面的受体充分结合。将上述混合液加入5mL冷却至40℃的半固体琼脂培养基中，混匀后立即铺于已凝固的固体琼脂平板上，待琼脂凝固后于30℃倒置培养6～8h。每个稀释度需做三个平行样，计数时取此稀释度的三个平行样的平均数。其中，噬菌体效价(PFU/mL)＝平均噬菌斑数×稀释倍数
实施例6：嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1对嗜水气单胞菌最佳感染复数(MOI)的测定挑取宿主菌AH-1单个菌落，接种到盛有3mL TSB液体培养基的试管中，30℃下160rpm振荡培养12h，得到宿主菌AH-1菌悬液。将宿主菌AH-1菌悬液以1:100比例转接到10mL TSB液体培养基，30℃下160rpm振荡培养至对数前期。按照MOI分别为10、1、0.1、0.01、0.001和0.0001的比例分别加入噬菌体AH-P1纯化液(由实施例1制得)和噬菌体宿主菌(MOI＝纯化噬菌体溶液效价/噬菌体宿主菌浓度)，加入TSB液体培养基使各管总体积相同。30℃下160rpm振荡培养8h。培养完毕后10000g离心10min并收集上清培养液，采用双层平板法测定各处理噬菌体效价(方法见实施例5)。各点均作双份复管培养取平均值，以产生最高噬菌体效价的MOI为最佳感染复数。实验重复3次。
结果如表2所示，培养8h条件下，噬菌体AH-P1效价达到最高(4.1×1010PFU/mL)时，其MOI＝0.001。说明嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1所需初始投入量少，其繁殖速度快，可应用于工业生产中。
表2嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1的MOI值
Figure BDA0002869146820000121
实施例7：毒理实验
7-1经口服毒理实验
实验小鼠20只，雌雄各半，适应性饲养三天后，随机分为两组(噬菌体组、对照组)，每组10只(雌雄各5只)，噬菌体组给予剂量为1010PFU/kg的嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(实施例6制得)，对照组给予等量生理盐水，连续给药15d，将实验鼠断颈处死，检查内脏情况。
实验结果显示，此剂量的嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1对小鼠日常行为没有影响。解剖检查内脏未见异常。
7-2浸泡毒理实验
选取体重1g左右的健康凡纳滨对虾200尾，适应性饲养三天后，随机分为两组(噬菌体组、对照组)，每组100只，养殖密度20尾/50L。向噬菌体组内加入嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(实施例6制得)，使其终浓度为106PFU/mL，对照组内加入等量生理盐水。每天换水量约为20％～50％，换水后及时添加供试噬菌体或生理盐水以保证其终浓度。于上述条件下连续喂养15d，观察凡纳滨对虾健康及存活情况。
选取体重10g左右的健康白鲫100尾，适应性饲养三天后，随机分为两组(噬菌体组、对照组)，每组50只，养殖密度10尾/50L。向噬菌体组内加入嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(实施例6制得)，使其终浓度为106PFU/mL，对照组内加入等量生理盐水。每天换水量约为20％～50％，换水后及时添加供试噬菌体或生理盐水以保证其终浓度。于上述条件下连续喂养15d，观察白鲫健康及存活情况。
实验结果显示，各处理中凡纳滨对虾与白鲫均无发病现象，且无死亡情况发生。因此此剂量的嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1对凡纳滨对虾与白鲫健康及存活均无影响。
本申请的嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophila phage AH-P1)具有生物安全性，可应用于饲料添加剂、环境杀菌剂、水质改良剂等。同时，嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1也可以作为保健品或药剂去应用，在本毒理验中也证明其是安全的。
实施例8：嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1的pH和温度稳定性的测定
8-1：不同pH条件下噬菌体AH-P1的稳定性
将4mL效价为1×108PFU/mL的噬菌体AH-P1(实施例6制得)各7份分别置于4mLpH＝1～14的TSB液体培养基中，制成效价为5×107PFU/mL的噬菌体溶液，25℃下静置。分别于反应1h、4h、8h、24h及96h时进行取样，将各处理样本进行适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价。实验重复3次。效价测定方法见实施例5。
表3噬菌体AH-P1在不同pH条件下的稳定性
Figure BDA0002869146820000131
结果如表3所示，在pH＝4～10之间，噬菌体AH-P1的效价均无显著变化，表明其在中性、酸性和微碱性条件下具有良好的稳定性。
在pH＝3的酸性条件下，处理1h后噬菌体AH-P1效价略微下降，但其数量级未发生改变；处理96h后，噬菌体AH-P1效价有一定程度的下降，但是与pH＝7条件下相比，效价仍未下降超过3个数量级，表明噬菌体AH-P1在酸性条件下耐受性良好。
在pH＝12的碱性条件下，处理1h后噬菌体AH-P1效价略微下降，但其数量级未发生改变；处理96h后，噬菌体AH-P1效价下降，但仍具103PFU/mL的效价，说明噬菌体AH-P1对碱性条件具有一定耐受性。
在pH＝2的极酸性条件下和pH＝14的极碱性条件下，噬菌体AH-P1效价1个小时内均下降为0。
8-2：不同温度条件下噬菌体AH-P1的稳定性
将效价为1.0×108PFU/mL的噬菌体AH-P1(实施例6制得)，分别置于4℃，25℃以及30℃条件下，定期取样检测其效价。实验重复3次。效价测定方法见实施例5。
表4噬菌体AH-P1在4℃条件下的稳定性
Figure BDA0002869146820000141
表5噬菌体AH-P1在25℃条件下的稳定性
Figure BDA0002869146820000142
表6噬菌体AH-P1在30℃条件下的稳定性
Figure BDA0002869146820000143
由表4～表6可知，在4℃条件下，噬菌体AH-P1具有较好的稳定性，存放3个月后，效价无明显下降，存放12个月后，其效价下降依然未超过20％；在25℃条件下，噬菌体AH-P1在2周之内效价无明显下降，4周后，效价大约下降34％；在30℃条件下，噬菌体AH-P1在24小时内效价无显著下降，72小时后，效价数量级未发生改变。由此表明，在上述不同温度条件下噬菌体AH-P1均具有较好的稳定性。
实施例9：嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1对紫外线的耐受能力测试取10mL效价为9.6×109PFU/mL的噬菌体AH-P1(由实施例6制得)平铺于90mm的无菌培养皿中，将其放入灭过菌的超净工作台内，使培养皿离紫外灯(20w)20cm的距离进行照射。分别在0min，20min，40min，60min，2h，3h，4h，5h，6h，7h，8h时取样并于室温下将其置于暗处30min后采用双层平板法测定噬菌体效价。实验重复3次。效价测定方法见实施例5。
表7噬菌体AH-P1在紫外线照射下的稳定性
Figure BDA0002869146820000151
结果如表7所示，噬菌体AH-P1的活性在紫外线处理的前40min内下降了1个数量级；至处理8h时，供试噬菌体仍具有为7.9×103PFU/mL的效价。说明噬菌体AH-P1对紫外线的耐受能力较强，经紫外线照射8h后仍然具有较强的裂解能力。
实施例10：嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1对不同来源地的鱼源耐药性嗜水气单胞菌的裂解能力
采用双层平板点滴法来测定噬菌体AH-P1的裂解谱。分别挑取从江苏，安徽、四川，福建，广东和海南等6省分离所得的50株鱼源耐药性嗜水气单胞菌的单菌落，将其接种于盛有3mL TSB液体培养基的试管中，30℃下160rpm振荡培养6h，制得各株细菌菌液。取300μL菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上，取5μL噬菌体AH-P1(由实施例6制得)分别滴于各平板上，待自然风干后30℃培养6～8h，观察结果。
表8噬菌体AH-P1对不同来源地的鱼源耐药性嗜水气单胞菌的裂解结果
Figure BDA0002869146820000152
Figure BDA0002869146820000161
Figure BDA0002869146820000171
注：“+++”完全透亮，“++”中等透亮，“+”轻微透亮，不裂解的为“-”
结果如表8所示，噬菌体AH-P1对不同来源地的鱼源耐药性嗜水气单胞菌具有较宽的宿主范围，其裂解率分别可达94％。
实施例11：嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1对非宿主性致病性细菌的裂解试验挑取34株非宿主性病原细菌单菌落，包括无乳链球菌4株，停乳链球菌4株，铜绿假单胞杆菌5株，肺炎克雷伯菌4株，鲍曼不动杆菌3株，大肠杆菌6株，沙门氏菌5株，李斯特氏菌3株。分别接种于盛有3mL TSB的试管中，37℃下160rpm振荡培养8h，制得各株细菌菌液。取300μL菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上。取5μL噬菌体AH-P1培养液(由实施例6制得)分别滴于各平板上。待自然风干后37℃培养6～8h，观察结果。
表9噬菌体AH-P1对非宿主性致病性细菌的裂解试验
Figure BDA0002869146820000172
Figure BDA0002869146820000181
注：“+++”完全透亮，“++”中等透亮，“+”轻微透亮，不裂解的为“-”
结果如表9所示，噬菌体AH-P1无法识别34株供试非宿主性致病性细菌中的任何一株。说明供试噬菌体具有极强的特异性，且对微生物群落无损伤作用。
实施例12：嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1的发酵制备
挑取嗜水气单胞菌AH-1单菌落，接种到盛有3mL TSB培养液的试管中，30℃下150rpm振荡培养12h，得到宿主菌菌悬液。将菌悬液以1:100比例转接到500mL TSB培养液，30℃150rpm振荡培养至对数前期并测定其菌悬液浓度。嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1发酵制备的体系为10L，发酵培养基为TSB培养基。发酵培养基的初始pH值均为7。采用火焰接种法接种，以其相应的最佳感染复数比例向发酵培养基中分别接入50mL的噬菌体(105PFU/mL，由实施例6制得)和对数期宿主菌液(107CFU/mL)。发酵过程中通入无菌空气，并加入3‰消泡剂，发酵制备时间为12h。自发酵开始起每2h自取样口取20mL噬菌体与宿主菌的混合液于无菌容器中，5000rpm离心10min，取上清液过0.22μm微孔滤膜获得含有噬菌体的滤液并测定其效价，效价测定方法参照实施例5。
表10嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1的发酵动态
Figure BDA0002869146820000191
由表10可知，嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1于发酵12h时效价达最高，为4.9x1010PFU/mL。12h发酵结束后噬菌体效价由初始的104PFU/mL升高至1010PFU/mL及以上，提高了6个数量级。因此，利用发酵法进行噬菌体的大规模工业制备是切实可行的。
实施例13：嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1对过氧乙酸的耐受性将过氧乙酸用TSB液体培养基进行稀释，制成质量浓度为6mg/L的过氧乙酸溶液，随后取上述浓度的过氧乙酸溶液900μL置于无菌EP管中，分别向其中加入噬菌体滤液(实施例6制得)100μL；取SM液900μL置于无菌EP管中，分别向其中加入噬菌体滤液100μL作为对照，将上述各处理组充分混匀后室温静置，每0.5h取样测定各处理组中噬菌体的效价直至6h。实验重复3次。效价测定方法参照实施例5。
表11嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1对过氧乙酸的耐受性
Figure BDA0002869146820000192
由表11可知，嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1在6mg/L过氧乙酸中浸泡6h后仍具有50％以上的存活率，说明供试噬菌体对低浓度过氧乙酸具有良好的耐受性。
实施例12：嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1组合物的制备
将终浓度为1x108PFU/mL嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophilaphage AH-P1)和终浓度为6mg/L的过氧乙酸，将二者等体积均匀混合制成1:1的组合物1。
将终浓度为1x108PFU/mL 嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophilaphage AH-P1)、副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phage VP46)和副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)的原液等体积均匀混合制成1:1:1组合物2。
将终浓度为1x108PFU/mL嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophilaphage AH-P1)、溶藻弧菌噬菌体VAP7(Vibrio alginolyticus phageVAP7)和溶藻弧菌噬菌体VAP21(Vibrio alginolyticus phageVAP21)的原液等体积均匀混合制成1:1:1的组合物3。
将终浓度为1x108PFU/mL嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophilaphage AH-P1)、副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phage VP46)、副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)、溶藻弧菌噬菌体VAP7(Vibrio alginolyticus phageVAP7)和溶藻弧菌噬菌体VAP21(Vibrio alginolyticusphageVAP21)的原液等体积均匀混合制成1:1:1:1:1的组合物4。
将终浓度为1x108PFU/mL嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophilaphage AH-P1)、副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phage VP46)、副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)、溶藻弧菌噬菌体VAP7(Vibrio alginolyticus phageVAP7)、溶藻弧菌噬菌体VAP21(Vibrio alginolyticusphageVAP21)的原液和终浓度为6mg/L的过氧乙酸等体积均匀混合制成1:1:1:1:1:1的组合物5。
实施例13：嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1及其组合物在液体中的杀菌效果
13-1不同浓度嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1在液体中的杀菌效果
培养嗜水气单胞菌AH-1至对数生长期，分装进不同试管中，用等体积的TSB液体培养基稀释菌液至嗜水气单胞菌AH-1的终浓度为1×103cfu/mL。向其中分别接入终浓度为1×102PFU/mL、1×103PFU/mL，1×104PFU/mL、1×105PFU/mL、1×106PFU/mL的嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(实施例6制得)。同时设置对照组和空白组，对照组给予终浓度1x103cfu/mL的嗜水气单胞菌AH-1；空白组给予等量生理盐水。将各处理于30℃下150rpm振荡培养，4h后检测嗜水气单胞菌的残留量。检测方法为：将各处理样本以无菌水进行稀释后，取100μL稀释液于TSA固体平板上涂布，30℃培养24h后统计平板上菌落数量。嗜水气单胞菌数量＝TSA平板上菌落数量×稀释倍数×10。
表12不同浓度嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1在液体中的杀菌效果
Figure BDA0002869146820000211
由表12可知，嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1在其终浓度为1×102PFU/mL时，即可良好地控制嗜水气单胞菌AH-1在液体培养基中的生长；当嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1终浓度≥1×104PFU/mL时，其对嗜水气单胞菌杀灭率可达99％以上。
13-2高浓度嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1组合物在液体中的杀菌效果培养嗜水气单胞菌AH-1至对数生长期，分装进不同试管中，用等体积的TSB液体培养基稀释菌液至嗜水气单胞菌AH-1的终浓度为1×103cfu/mL，向其中分别接入实施例13制备的终浓度为1x106PFU/mL的嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1的组合物1～5，同时设置对照组和空白组，对照组给予终浓度1×103cfu/mL的嗜水气单胞菌AH-1；空白组给予等量生理盐水。将各处理于30℃下150rpm振荡培养，4h后检测嗜水气单胞菌AH-1的残留量，检测方法见实施例12。
表13高浓度嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1组合物在液体中的杀菌效果
Figure BDA0002869146820000212
结果如表13所示：嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1浓度为高浓度1x106PFU/mL时，其组合物不仅杀菌效果好，而且对其它组合成分无拮抗作用，同时可以和化学杀菌物质进行联用。嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1的组合物具有应用为生物杀菌剂的潜力。
实施例14：嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1及其组合物对鱼肉样品保存过程中嗜水气单胞菌污染的防治
1.嗜水气单胞菌计数方法：同实施例13所述方法。
2.嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1组合物2～组合物4的制备方法参见实施例12。
4.将经高压蒸汽灭菌的三文鱼肉切成1cm见方的小方块150块，分为10组，每组15块，置于无菌平皿中。实验组每块接种1x105cfu嗜水气单胞菌和剂量为1x108PFU/kg的供试噬菌体；对照组每块接种1x105cfu嗜水气单胞菌和等量无菌水；空白组给与等量无菌生理盐水。将各处理置于30℃培养箱中培养。每2h取一块三文鱼肉置于10mL无菌水中，充分震荡，测定该液体中嗜水气单胞菌含量，实验重复三次。结果参见表14。
表14嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1及其组合物对三文鱼肉样品保存过程中嗜水气单胞菌污染的防治结果
Figure BDA0002869146820000221
表14结果显示：8h后对照组的三文鱼肉表面生长了大量的嗜水气单胞菌；噬菌体VP46组、噬菌体VP7组、噬菌体VAP7组及噬菌体VAP21组对嗜水气单胞菌的抑制效果较弱，接种8h后三文鱼肉表面仍有103cfu/mL嗜水气单胞菌；噬菌体AH-P1组对嗜水气单胞菌的抑制效果较好；而组合物2～组合物4的添加，使得三文鱼肉表面的嗜水气单胞菌始终控制在极低的水平。嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1及其组合物可以用作为生物杀菌剂，有效杀灭鱼肉表面的嗜水气单胞菌并防治鱼肉在保存过程中嗜水气单胞菌的污染。
实施例15：嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1及其组合物对虾肉样品保存过程中副溶血性弧菌污染的防治
嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1组合物2～组合物4的制备方法参见实施例12。
将经高压蒸汽灭菌的凡纳滨对虾肉切成1cm见方的小方块150块，分为10组，每组15块，置于无菌平皿中。实验组每块接种1x105cfu副溶血性弧菌ATCC17802和剂量为1x108PFU/kg的供试噬菌体；对照组每块接种1x105cfu副溶血性弧菌ATCC17802和等量无菌水；空白组给与等量无菌生理盐水。将各处理置于30℃培养箱中培养。每2h取一块凡纳滨对虾肉置于10mL无菌水中，充分震荡，测定该液体中副溶血性弧菌含量，结果参见表15。
表15嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1及其组合物对虾肉样品保存过程中副溶血性弧菌污染的防治结果
Figure BDA0002869146820000222
Figure BDA0002869146820000231
表15结果显示：8h后对照组的凡纳滨对虾肉表面生长了大量的副溶血性弧菌；噬菌体AH-P1组、噬菌体VAP7组及噬菌体VAP21组对副溶血性弧菌的抑制效果较弱，接种8h后凡纳滨对虾肉表面仍有103cfu/mL副溶血性弧菌；噬菌体VP46组与噬菌体VP7组对副溶血性弧菌的抑制效果较好；而组合物2～组合物4的添加，使得凡纳滨对虾肉表面的副溶血性弧菌始终控制在极低的水平。嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1及其组合物可以用作为生物杀菌剂，有效杀灭虾肉表面的副溶血性弧菌并防治虾肉在保存过程中副溶血性弧菌的污染。
实施例16：嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1及其组合物对贝肉样品保存过程中溶藻弧菌污染的防治
嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1组合物2～组合物4的制备方法参见实施例12。
将经高压蒸汽灭菌的生蚝肉切成1cm见方的小方块150块，分为10组，每组15块，置于无菌平皿中。实验组每块接种1x105cfu溶藻弧菌ATCC33840和剂量为1x108PFU/kg的供试噬菌体；对照组每块接种1x105cfu溶藻弧菌ATCC33840和等量无菌水；空白组给与等量无菌生理盐水。将各处理置于30℃培养箱中培养。每2h取一块生蚝肉置于10mL无菌水中，充分震荡，测定该液体中溶藻弧菌含量，结果参见表16。
表16嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1及其组合物对生蚝肉样品保存过程中溶藻弧菌污染的防治结果
Figure BDA0002869146820000232
Figure BDA0002869146820000241
表16结果显示：8h后对照组的生蚝肉表面生长了大量的溶藻弧菌；噬菌体AH-P1组、噬菌体VP46组、噬菌体VP7组及组合物2对溶藻弧菌的抑制效果较弱，接种8h后生蚝肉表面仍有103cfu/mL溶藻弧菌；噬菌体VAP7组与噬菌体VAP21组对溶藻弧菌的抑制效果较好；而组合物3与组合物4的添加，使得生蚝肉表面的溶藻弧菌始终控制在极低的水平。嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1及其组合物可以用作为生物杀菌剂，有效杀灭贝肉表面的溶藻弧菌并防治贝肉在保存过程中溶藻弧菌的污染。
上述实验表明所述嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1及其组合物可以有效防治水产动物肉类在保存过程中受嗜水气单胞菌与弧菌的污染，在食品消毒方面具有极大的应用潜力。
实施例17：嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1及其组合物对淡水鱼养殖过程中嗜水气单胞菌感染的防治
嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1组合物1～组合物5的制备方法参见实施例12。
选取体重10g左右的健康白鲫100尾，适应性饲养3天后，随机分为8组，每组50只，养殖密度10尾/50L。各处理实验组给予终浓度为1x106PFU/mL的供试噬菌体和1x106PFU/mL的嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila ATCC 23213；对照组给予终浓度为1x106PFU/mL的嗜水气单胞菌；空白组给予等量生理盐水。每天换水量约为20％～50％，换水后及时添加供试噬菌体或生理盐水以保证其终浓度。于上述条件下连续给药15d。统计白鲫日常生长情况及存活率，结果参见表17。
表17嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1及其组合物对白鲫存活率的影响
Figure BDA0002869146820000242
Figure BDA0002869146820000251
结果如表17所示：对照组白鲫在第9天全部死亡；空白组存活率97％；单嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1组白鲫成活率83％；嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1组合物5白鲫成活率为96％，其它组合物处理下的白鲫成活率也均为90％以上，表明嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1可与其它组分协同使用，并不影响其性能。该试验也表明嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1及其组合物可以用作为生物杀菌剂或饲料添加剂，可有效防治白鲫等其他淡水鱼养殖过程中嗜水气单胞菌的感染。
实施例18：嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1及其组合物对凡纳滨对虾养殖过程中弧菌性病害的防治
18-1嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1及其组合物对凡纳滨对虾养殖过程中副溶血性弧菌病害的防治
嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1组合物1～组合物5的制备方法参见实施例12。
选取体重1g左右的健康凡纳滨对虾200尾，适应性饲养3天后，随机分为8组，每组100只，养殖密度20尾/50L。各处理实验组给予终浓度为1x106PFU/mL的供试噬菌体和1x106PFU/mL的副溶血性弧菌ATCC17802；对照组给予终浓度为1x106PFU/mL的副溶血性弧菌ATCC17802；空白组给予等量生理盐水。每天换水量约为20％～50％，换水后及时添加供试噬菌体或生理盐水以保证其终浓度。于上述条件下连续喂养15d，观察凡纳滨对虾健康及存活情况。结果参见表16。
表18嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1及其组合物对凡纳滨对虾存活率的影响
Figure BDA0002869146820000252
Figure BDA0002869146820000261
结果如表18所示：对照组凡纳滨对虾在第10天全部死亡；空白组存活率98％；单嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1组凡纳滨对虾在第11天全部死亡；嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1组合物5凡纳滨对虾成活率为96％，其它组合物处理下的凡纳滨对虾成活率也均为80％以上，表明嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1可与其它组分协同使用，并不影响其性能，同时还可增强其对副溶血性弧菌病害防治的效果。
18-2嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1及其组合物对凡纳滨对虾养殖过程中溶藻弧菌病害的防治
嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1组合物1～组合物5的制备方法参见实施例12。
选取体重1g左右的健康凡纳滨对虾200尾，适应性饲养3天后，随机分为8组，每组100只，养殖密度20尾/50L。各处理实验组给予终浓度为1x106PFU/mL的供试噬菌体和1x106PFU/mL的溶藻弧菌ATCC33840；对照组给予终浓度为1x106PFU/mL的溶藻弧菌ATCC33840；空白组给予等量生理盐水。每天换水量约为20％～50％，换水后及时添加供试噬菌体或生理盐水以保证其终浓度。于上述条件下连续喂养15d，观察凡纳滨对虾健康及存活情况。结果参见表19。
表19嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1及其组合物对凡纳滨对虾存活率的影响
Figure BDA0002869146820000262
Figure BDA0002869146820000271
结果如表19所示：对照组与单嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1组凡纳滨对虾均在第10天全部死亡；空白组存活率98％；嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1组合物5凡纳滨对虾成活率为95％，其它组合物处理下的凡纳滨对虾成活率也均为90％以上，表明嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1可与其它组分协同使用，并不影响其性能，同时还可增强其对溶藻弧菌病害防治的效果。
该试验也表明嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1及其组合物可以用作为生物杀菌剂或饲料添加剂，可有效防治凡纳滨对虾等其他水产动物养殖过程中的各类弧菌性病害。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
序列表
<110> 菲吉乐科（南京）生物科技有限公司
<120> 一种新型嗜水气单胞菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 44100
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
tctttcccta cacgtagctc ttccgatctg gtgcgcagag ccccgagctt tgagaaattc 60
tggatcggct catatcgccc taaaggttgt ttataatcaa cgacttagcg gtttggtggg 120
gttcgacgat cggcgttctg gcggggtggc tgcaatgaaa agtgcaacgt tactataatc 180
gagcggcctt tctgcgatta ttgcagtttt gtaagtcact gattacacat gcaatattac 240
taagatctac tataaaacta taaaactata tagatatgta tgatctacgc gcatgtgcgt 300
gtgtgcgtgt gtgcgctagg ttttcgatcc tatgattatg gtaattatag tagatttcgg 360
ggatttcttt agacagatca gcgtgttaca aaaactgcaa taatcgagcg atcattgcag 420
ttttggcccg caatcattgc aacaacccac tggcgtcata aattttgccg atctggcctc 480
ataccgcccg atagagatcc gcaccgatct gtagattcgc tttgtcgatt tttccgatcg 540
ggagcgatct gcgcgacttt cgcaggtgcc ggctgcaacc ccactggccg gtcaactttc 600
agcctggaaa gcgagtggca ggcgccaaac atccgtcaca gatcagcggt ttacaccgtt 660
gacactacca aggatctagc ctaatctgcc agctcaaaga acaggagcag ggtatggaac 720
tggaaaaact ccccctcgaa caacgggttg agcagatgaa gcacacccgc ctacgcccca 780
aggacgctgc tgccctcttc cgggtgacac ggcaggcgtt gtataagtgg atgaaggatc 840
cggacatggc cttcccacgg ccccagaagg taaataagaa ctacgcattc tggattgagt 900
atgacctccg aacctgggca gaaaccaaag gcatcgacct gaccggtccg actaaataac 960
tagaagaccg gagacaagat gcgaaattgg atgaaggagc acgggctcca actcgtcgat 1020
aatggttatc agattgtccc gataatcccg ttcgacgctg accatgccgt ggcaggcaag 1080
gcaccggcgg ttaaggactg gcgcaccatc aaggccgacg ccaagaaggt gaacaactgg 1140
gccgcccgca agccgaaagc cggtatcggg atcaacacaa ccaccaaccc cgccgtggac 1200
atcgactccg tggacgagga agcggtggcc ttcatgcagc agtggatcac cgagaacatc 1260
ggtctggccc ctgttcgcgt gggcaacgcg ccgaaaacgc tgctgatgtt cagggcagac 1320
gccccgttca ctaaggtgaa gtcgtctcag tggattgacc cggacaacga gaagaagccc 1380
aatggcaaaa agctgctgca ggccgtcgag attctggcgg aaggcgagca gttcgtggcc 1440
tacggcatcc acccggacac gctgaaaccc tatgaatgga tcggggtgga caacccttgc 1500
aaccttcaca gcgaactcga cctcgacaac atcaccctga ccgacgcccg cgtcatttgt 1560
gaccagtttg accgctgggt catggagaac cggcccacct ggataaaggc ggcccgcccc 1620
atgcgcggca tgatggtctc cggcgccact cccggctggg aggaggaaga ggaagacggc 1680
gagttcatgg atgagcaaga cctcgaagac cttgctggcc tcaaatggga gcgttctacc 1740
gaagaactca tcgacttctt ggcggactac ccgaacgacg gcgggtatga cgactggatc 1800
agggtcattg cggcggtaaa agcggccgaa cacaagcctg acgacttcaa agagatcgcc 1860
agggagtggt cacagaagtc cgagctccat gatgacgact atttcgagca gaagtgggag 1920
aaaggccagt tccgccgcca gctgggggag gtagccaacc tcaaccgcat cgtggccaac 1980
gccgaacggg agcagatccg caagaaagcc gacaaagagg tgaaggatga catcatcccc 2040
gccttcaagg aggccagaac catcgaggag tggcaggacg ccgccgacaa gatgcgggca 2100
gcgcagacat tcggtatcca gcgcgacgcg gccggtaaaa tcgccatcga ggcgttcaac 2160
cggatctccg aggtcaagct gtcagcgaag gagatcctga aatatctggc attcgactgg 2220
tctacggcgc cggtaccgca ttggttgagc ccgtgggtct acatcggcaa catcaacgtg 2280
atgtataacc ggaaaaacgg tgcccgccgg tctccgcagg ctttcgacct cgaatttgcg 2340
cctgaaacgg cccatatcgg gacgactccg atgatttttg cgcggaaaat gcggccggta 2400
ccggcagttc aggacatcgt ttaccgcccg ctgcagcacg gtggcctcga aggaaacatc 2460
cgcgagatga ccaccatgac cgacgatccc gacatgttcg aggaccgtgg ccagctctac 2520
ctgaacacat tcgaccccaa atccatcgtc gaggtgcccg aagaggtcac caaaggcggg 2580
caaaaggcca tgcggattgt cgaggagttc tttagggtgc agatcccgga tgaaaacgag 2640
cgccaccacc tgctggactg gatctcttac atcgtctcga agcccggaca tcgggttaac 2700
tatgctccgc tcatcctcgg tggcgagggg tcgggtaagt ccatcgtcaa gaagatgttc 2760
gagcacatct tgggcccgga taacgtcggt accgtgtcga acgaggtaat ccacaagtcg 2820
ttcaactact gggcggaagg caacatcctg aaaatcatcg aggagatcag cgcggcggac 2880
ggcagcggcg ggtatgacct gctgaacaag ctgaaagagc cgatcaccaa cgagcggttg 2940
cagaccgaac ggaaaggcaa ggacgcgatg acggtggtga acaccgccag ctggatggcc 3000
tacaccaacg acccggcggc cctgcccatg ggtaaagacg cgagccggta catggtcgtg 3060
gcgtcccgct tccgctccaa agacgaggtg aacaagtacc tggaagacca cccagacttt 3120
ttcacgaatt tcgagaaggc gttcaccaag tacccaggcg ccgtccggaa gttcttcatg 3180
tcgtgggagc gttcgccgaa gtttgacccg atccgccgtg cgccggagac cactgcgacc 3240
aaacagatgc aagtggccac tcaaaccgag ttcggggcag ccatccaaga cgcgatcgat 3300
aactgcaccg acgctggtgt gaccccagag ctgatcaacc tcggctatct ggcgaccatc 3360
gccctggact gcggcctgcc gcgaccggcc ccgcgccgga ttgcccggat catgtcgcag 3420
atggggtatt acccgattat tccgggcacc ccgacccaga tcagcaccaa cggggtgcga 3480
ggagtggtct acgctcggga accggagaag tggcgggacg gggacatggt gaacttccag 3540
cacatccggc gacacttcaa ggcccacatg aagaaagtgg aggccaacag ccaggagtgg 3600
gacgatgatg tcgaggaaga ggaggaagac gaggagctgt aaagagagac ccgccggttg 3660
gcgggtcttt tctatttcgg ttggagtaaa tcgagttcac taatcccagt gcccggcacc 3720
gcttccacca gcgccaaagc gacgttccgg ctgcagtacc cccgttttat cgagtccaac 3780
agcgtggttt tacccacgtt gcaggattta gccaggacag acagtgaacc ggatgggttg 3840
tggtggacag ccaaggtgag caggtagaac cgcaaccgct cactcgggcc cgccttcgcc 3900
cactcaggaa cacaaatcgg cataaagcct cccaaatgac cgcaaagagc acggcattga 3960
ccggaaatat actcagatct gccggtttac acaatacacc gataccagat cagaccattt 4020
gcacgaaaaa ccgctcaaaa taatgttgac acgaccccca gccgctagta aattgagccc 4080
tgtcaacgag acaaacccat ttcaacaagt gataggagtc cgccatggac aacccgtatg 4140
agattattgt gagcaaccaa gaacgcatca tcgccctgct cgagcagatc gctggtggtt 4200
ctggtgaaga agtgaaggct ccggccaaac gcactccggc caagaaagcc gctgcagcga 4260
aagaaccggc tatcaccaag ggtcaggcca ccgacgcggt gaacaaggtc aagaccgagc 4320
tgggtacccc tgcagccaag aagatcatga ccgaccacaa ggtcgccaag ctggctgaca 4380
tgaccgacga gcagatcgag ccggtctaca aagcggcgct ggctgccctg gccaaagctg 4440
ctgatgaaga agaggaagag gaagaagagg atctgtgatc cagctcgacc tcagtgtgcg 4500
ccggggggac atcctcccgg cctcatctta cgaagactac ctgatcgcct tagccgagga 4560
gatcaacaag agcggtcact ccgctttctc accgtccggt tcagggatgt ggctatactg 4620
cgctggcagc ctcatcccga acatgatggc ccccgactcg agcagctttg aggctgcaga 4680
aggcacggtc gctcacgaac tcggtgagga ctggctgaaa acgggaatca agcccctcca 4740
ccgtatcggt gaggtggtca ccgtcaacga atccgatggc aagtcatacg agatcaccat 4800
cacacgggtg atgatcgact acgtcgagga gtacgttaac tggtgccggt tcctgcccgg 4860
tgaccattat gtcgaaaccc gagtctattt cagcgagtac accccgctgg caaaccaaag 4920
cggtaccgca gaccatgcgg cctgcatgcc gaagcggttg gtcatcaccg acctgaaata 4980
cgggaaaggg attcaagttt tcgcctatga aaacagccaa gccctgatat acgccctggc 5040
gttcttcaac aagtgggact ggaaatacca cttcgaggag atcgaaatcc ggatatgcca 5100
gccaaggctt gagcacttcg acacttgggt gatagatcgt gagtacctgc tgcagttcgg 5160
cgagttcttg cgggagcgca ccgcggagtg ctggaaggtt gacgcgccgc gccgcccttc 5220
cgacaaggct tgccagtggt gccgggtcaa atcgacctgt accgccctgg cccgtctgca 5280
gaacgacctg ctggccggta atttcagctc gatcggtagg gagtacagcc acgatgagct 5340
ggaagcgttc caggagagtt tgaccgaggg gacatacaga ttgaaggccg tagacattca 5400
cagcctcacc accgagcagc tggtggccct gatgaagttc cgccgtgtca tggagcactg 5460
gtggaagtcg gtggaaaaga cgctcgaggc ccgcgccctg gacggggaga aggtgccaga 5520
gcgaaaactg gtggagtcca gaaccaaccg ggagttctcc aagcgggatg aagccgtgga 5580
gtggttggag atggtcggcc ttgaccagtc tcagatattc gagacggaca tgcgctcacc 5640
ggcacagatt gaagagatac ttcgcaatga gctggggtat ccaaagcgtt tggcggcaga 5700
gctcatccag agctttgtgt caaaaccgtc aggcaggccc acgctggtgg cattgaccga 5760
caaacggccc gagataaatt cgttcgaggc cgaactgtgg gatgatgacg acgccgacat 5820
gtgggatgat gacgatgaag acctgtagat cgtaaacccg taatcacgta aggacagtaa 5880
aatggcaaag ccaaagctca tcttaaaagg gaaaaacatc tctcagtatg agggattcgt 5940
tttcaagatc accggcgttc gtgcgtccta tcctcacctg gataaacctt acgccggcga 6000
tgacggtggc gagccgaaat tctccctgac cggcctcatg gacaagaaga cgcaccgcga 6060
ggcgttcaaa atcctgaaca agggcatcga ggacttcatc gcctcccaca aaacgaagat 6120
cgcatccgac aagcgttgct tgaaagatgg cgacgacacc gacaaagatg agaaccaagg 6180
caactggatc gtctctgccc gtgaaaccaa acgcccgtct gttcgtgatg ccgacggcga 6240
gaccatcgac aaggacgacg tagcggaggc cgtatacggt ggctgctact gcgacatgat 6300
gatcaagctg tggtaccaga agaaccagta cggcaagcgc atcaacgcga acctgatcgc 6360
ggtcaagttc aatcgtgatg gtgaagcgtt cggggaaggc cgcatcgacg acgaagagat 6420
gtgggatgac gacgatgacg acaccccatc agctcgcggc aagggtaaaa accaagtcga 6480
tgatgacgat gactgggacg acgaggagct gtaataactc ccggctaccc gcacaagccc 6540
acttaaccgt gggctttttt gtcatacaag aggcaaccca tgtcccgaga cttcctacat 6600
atcgacctcg agagccggtc tgaggtcgac cttgtcaaaa tcggcctaga ccgatacgtc 6660
actgacagct ccaccgagat cttgatgggc gcctggcagt tcaacgagaa ccccatccaa 6720
cagtgggact tgtccaccgg cagaagccca gaccgcgacc tcatcgaggc gctgcgggat 6780
cccaacatca tcaagtgggc gttcaacgcg cagttcgagc gccgcatgct ggaagagtgc 6840
tgggggatca agtctgacta ccgcagctgg cgctgcacaa tggtgctggc ctacatgctc 6900
gggttctgcg gaacgctggg gcagatcgga cgcgctgctg gctttaaaag cgacaagatg 6960
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gcccagacca accgctggcg tgactgggag accgaccccg acaagtggga ggagttcctt 7080
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ccgatacccg aagtggagtg ggactactac gcgatcgacc agatgatcaa tgaccgcggc 7200
gtgatgatta accgtcagca ggcccaggcg gcgatctatc tcggcgagca gcgcaagccc 7260
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tcctcctgcg gacacgatgg ccggttccgc tacagcctgc agttctatgg tgcccagcga 7560
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ttcatccccg gagaaggcaa gaagttttgc gtctctgacc tgtcatccat cgaatcggtg 7800
gtgatcggct ggttgaccaa ctgcaaatgg ttcttggaca ccctgcgggc tgggcgtgac 7860
ctgtaccggt cctttgctgc cgagtggctg gacatcccat atgaggacac caagccgcac 7920
cgctcgaaag ccaaacccgc taccctcggc gccggttacc ggctgggcgg cggtgagctc 7980
ctgcctgatg gcaagaaaac ggggctctgg gcctacggcg agaacatgca ggtgtttatg 8040
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cagtcttggt atgccttgga gaaagcggtc gagcgttgca tcaagaccca gagcgatgtg 8160
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aatttctgct acatgggcaa accatcgcag gggcagggct gggtaaaact gctgtcccat 8400
ggcggcaagc tgatcgagaa catcgtgcaa gcgatcgctc gggatgtgct ggccgcgggc 8460
atgatgcggg tcgagaagtt cggtaccaag ttcacccacc tcccgttcat catggaggtc 8520
gtgatgcacg tacacgatga gctggtcacc gagatcgacg cggacgctga cgaggagctg 8580
gccctcaact tcttgaagcg gtgcatgacg aagccggtga agtgggcgcc agacctaccc 8640
ctcggggcgg ctggattctg cggcacgttc tacaggaaag actgacatgg cagcagagag 8700
tcaactcgag aaaaagtgcc gggagtgggc cgaggccagt gggtggtttc agtccaagta 8760
tgtcgccccc ggcaaaaagt cggtaccgga ccgcatcttc atcaagaacg gcgttgtaat 8820
tttcggcgaa ataaaagcac cgggggagcg gccaacgcgc cagcaagaac tccggcacaa 8880
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ctgatgacat gcacgactat cagaacatgg ccaagcagtt catcctcgac accccatggt 9060
gcgctctgtt cattggcctg ggcctgggta aaaccgtaat ctcggcgagc gcggcgatag 9120
aactgctgtt tgacgatgtg gtaaagcgtg tgctcgttat cgccccattg aaagtcgcaa 9180
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tgcttaccgg cgatgagctg cagcggaagc gggccatgcg gtctcgggcg ccggttcaca 9300
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cgttgaagaa tgtccgccgc tacatcaagc ggatggtgca gctgaccgcc acaccggtga 9480
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tcatggagtc gaaggactac ctcgacatga aggaggccaa gatcatggac atccctgtcc 9720
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tgatactcga gaacgggggc agcaccatca tagaggccga gacggcggcg gccctcaccg 9840
gcaagctgtt gcagatggcg agcgggttta tctatgagac gaccaagcgg ctggtggaga 9900
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ggctgcgcgg taccgctgcg gcattcgtga gctggacgaa gctggtgaac gtttacctcg 12060
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cgttctatcg ccgcctcatg cggatggggc tggcccagtt cttcatcctg atcaagggtg 12600
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gggctgccga gtgggatgaa aacaccacca tctcgacccc agtggtaaat gacgaaggcg 13020
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cgatccggtt tacactggct tcggatatta cccaacctgg aaggtgacaa gatgcaacaa 19680
aatgacacca aattttatac ccttggccgg ggtaagctgt ttctggactt gttcctgcct 19740
ggcagtaacg tcggcaccgg tgagcgttat ctcggtaaca cgccggaagt gggcctgacc 19800
accagctccg aaaagctgga tcacttctac agtgacgcgg gcatgcgtga gaaggacttg 19860
accgtattgc tggaaaccag cagcggcggc tctttcgtca ccgatgtgat cagccccgag 19920
aacatggcgc tgttcttcat gggtggtgtt cacactgcta cccacttgga gcagcaaggc 19980
ttccgcgaag cattcgtcaa ctgggcccgt ggccgcaccc tgcagatcgg taccactgat 20040
gatgtgccga ccggcgcccg caacatcgac agcgtgaaga tgttcaaggc tgccaagaac 20100
gccactgtcg acttgaccaa gactctggtg ggtcaagccg gtgttaccga agttccgatg 20160
gacgggaact gggatgtgga tctggccttg ggccgcgtct atatcgaagg cggcagtgcc 20220
gagttcaccg gtgacatcaa gctgctggtg gaatgcgaca tcaaggcgca gacccgtaaa 20280
accatcatct ccggcaacga tatgctgtac ggcgccctgc gctatatcgc tgacaacccg 20340
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ggcccaactg gcggccgaga ttgcccagac cgagaaggtc accaagaagc aggagaagac 22020
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gtctctcgct cgcacccgcc aagagctggc ccgatatggg gtggacgcgg cgacggcggc 22140
cggtagccag aagcacctcg ccgagcaggt gaaccgtgcg aacgaggcgc tgaaacggca 22200
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gggtattatg gccacaccac tcgcggccac tggtcgcaac cgataaacga tcaggagatt 33060
agatatgccg ttagtgacgc ttaaatggga cgacgataac tccgacctca ctggattcga 33120
ggttcgcggg tctacccaag tgcaatggtt tcaggacatg gcggttaagg cgactttaga 33180
ccctaccgtc aaagagtatt ccgaagaccg gcagaccaat gagccgtatt tcctgcaagt 33240
agccgcacag cggaacgggc agaatatggt atccgagcag actgcgctga cctacccaac 33300
ccaagttctg ccgaatgatg ccttgtcgct gatcaccaag acgatccgcg ggtctcgtct 33360
ggccggtgcg atgttgggtg acggtactaa ccgggaaatc cacggcggcc caggcatgac 33420
cgataagtgt ctggtgacgc gagacgggaa gttcttggtg atcaccaaca acgaagtccg 33480
ccagttcgag atgtcgacgg accaatacac cgtgctgtcc aacgagcctt tgccgggtac 33540
cgtgcggtgg gctggcttgg atagccgagg cggcatctac ctgctggtgc agggcacccc 33600
gtacacgctg cacaagttca acccggcaac cggcctatgc acactggtgt ttaccttccc 33660
cgccagtgag acttggtcga acgctatggt gagcccgtac tccggccaaa ctggcgccct 33720
gatcctgttc ggttcggact tggtgggcgg gaagatgccg atcggtgtgc tcgacctgac 33780
cagtgcgcag tatcaagtcg tgatgagccc tgctgtggat ccgtcggtga ccaacgccta 33840
cggcgggtgg gttggccatg cggtggataa cagcgtgggc gatgtgatga tctactggcc 33900
gcagtcatcg gcgtatgcgg ttaagtttgt ggtgcgtgat atggcggcca ccctgcacaa 33960
catgcaggag gctttcccga ccaacacctt gaccccgcgt aacggtgttc tgcacaccgc 34020
ggatgacggc accaccctga ccttcaagtt tgtaggcggc gggacgatct actcgctgaa 34080
cgttgcaacg atggcgctgg gtaaagcgca ggtgaacgcg accctgacca acatgatgac 34140
cgggtctggg tttgtcacct tcaccgagtc gcctaccgtg gccaactacc tgcctaacgg 34200
ggattacatc ttcatgggcc aaggtctggc cagcgccctg atcgtatcga gcgactggtc 34260
tggcggctac accatccaga ccgccaacgg cgggatcggc cacttggttg tcaacgcggg 34320
tgtggtgcgt gggttcggcc agaccgtctg ctgggacatc gcgtgggggt cgttgccggg 34380
catggtggtt ccggactcct actacgcggg ctgttcggtg cgggccaacg gcgtcgcagt 34440
aaactgataa caatcgggcc cgccatgtgc gggtccactt ttcacgggag atagacatgg 34500
ccaaacagca gccgagaggc atcagacgca acaatccggg gaacatcgag tggggatccc 34560
cgtggcaggg gcttgccaag ccggaagact atccggcgga tcgcttcgcc gcattcatct 34620
cgccggtctg gggtatccgg gcactggccc gcaccctgat cacctattac gacaagcgga 34680
aggccaacga tggcagcaag atcgatagcc tgcgcgaaat cgtcgagcgg tgggcaccgg 34740
ccagcgataa caacgatgtg ggcgcctacg cccgccagtt ggctcgactg ctgccgggca 34800
tcgggccgga cgatgagacc ctgaacctgc acgaccctgt ccagctgcgg gcggtggtag 34860
aggggatcat ctgccatgag aatggccgcg ggccgctcaa gaccccgaat acttggtatc 34920
cggctgatgt gatcgacgag gccctgcgcc tggccggtgt cgtggccaaa ccgactgcga 34980
ccaaggaagc gaccaaagcg gtaccggcgg tggccgttgg tgcggtgggc atcgagcagc 35040
tgtcccaggt aatccctgac gccatcaacg cgctcgagaa gtccaaggtg gacttgacca 35100
gtggcaacat cctgcagatg gtcttgggtg gcaccgtact ggcgctgtcc ttggtgctga 35160
tctacaagca gtaccgccag tggaagctcg gggtggggga gtgagctggt gggtcagggc 35220
ccggctatgg ctgctcacgg ccgcgctggg cctgctggcg cttctggcag cgtgggcaaa 35280
gggtagacaa gggggcaagg ctgcggcgcg tcaggaagcg caggcagacg ctatggacaa 35340
ggcaaccgag acgaacacga tcgttcagga ggtaaaggat gaagtcaggg ctatgcctgc 35400
tggggcttct gctgctcggc tcaagcgtga ctgggtgcgc aagccgaaat agccccccgc 35460
cggagttctg tgcggtggcc gtggcgatct acgttggtga ggaggatgtg ttatcggaca 35520
agaccgcaga ccagatcctc gagcacaaca tggtcggcaa gcggttatgc cactgggggg 35580
aataaagtta agcggccttt cggccgcttc gttttacgac tcagaccgct tcgacttcat 35640
ccggtcatag agtgagaacc cgatgtccag agtcagctta acggcccata gtgcgctgac 35700
gactacaggc agcagcacgg ccagctcggg gatggatggg agagtgattt caaacatgcg 35760
gttagcgacc tccttggcgc ccagtgcaac ggttgcgacc ttgccgcctg tctcaaccgc 35820
cccgcctgtc gctgcgagca ttcttccgat catctcccct ccttacgagc ttgaaacatc 35880
gccacacgcc ccagccgcat aaagcaatga ctaggattga aatccaaggc attggtcccc 35940
ctatcaagga atgcgctggt ggctatcagg atgtgaagaa gtaataccac atagccttgg 36000
tacggcctca ccgggtctcc ccatgcacct tccatcaccc atccgtagat gagcgcatag 36060
atggacatga acaagaacca gctcgccatg atcgcaattg ccctgatggc cttcggggag 36120
gcacttattg aggcggcgat cgcccagccg aatgttacga cgaccaggat gcagtaccag 36180
agccatgcag taccgccggt gaactcggga agcagataaa cgtccagcat gttcccaaga 36240
ccgacagcca agatggacac aaggccaatc caacttctcg acttgtaccg gctaaacagc 36300
accggcaaat agatcgcggc aaatgtccaa gtgtccatgg tggtcactcc ttcggttgtg 36360
gctctgtcgc gtctgagtta ttcggttcat cttgacgttc cagctcctta gtgtccgccg 36420
gcgcatcgct ctggtggcga agtcccggcc cttttccgct aggcatagtg atctcccgtg 36480
ataaaaagac ggcccgaaat ggagccgcct tagagtgtat cgcatcgggg atcagcggga 36540
aagccgaggt cgcggcatga gctgcagggc tttcggtggt tcggggttcg ggatggccag 36600
cgcgacggct ggtttcgggg tgtattcgac ccgcttcttg gccacgtagc cgacccgctt 36660
aaccggtttc acttcggtga ccttcaccgc tggggtctca cctggcttgt gcgcctgcga 36720
ggcggtgtag atgcggcttg tccggatgat agcgcggatc cgtgcggtgg cctcattggg 36780
cgtgaggtca aactggtcgg cgatctggtt ggcgtctgcc gtgttatccg gttgggccat 36840
aacccacatt gctacttttc gcataaggct gttggcggcc atgcggtatt cctccattcc 36900
tctatcaagt catcatcgca gccccactca cgatggagca attcatattc ccggtcatct 36960
tcggtgatgt gctccacccc tgggacaggt ggcgcacctt gggccccgca actgtggagc 37020
agggacttcc cttttggcga tcgatagaag aggcgccacc ccttctctgt ctctcgccat 37080
cggaggttgt cagccccaca cctgttgcag gtaatccgat acatcgggtg ggacatggtg 37140
gccgttactc ctcgcccagc tcgcggtcat agatctcgag gaactgccgg gctttattcc 37200
agctccccag tggcaacggg cctttgatga actcgtcgag gcgggtggcc acctcggggt 37260
cgagcgcatc gccttgggcc attctgaccc agaacaccag ccagcggtta ggccgtgggc 37320
ctttgaactc gcgcaccttc ttgtcgatgt cccggattat accggccagc tgatccatcg 37380
ccagtttgcg cctctcaagg ctgcggtttc ggtgctggaa cgggtttacc gcgtccagac 37440
ccagcaggcg catggtcggg ctggacagtt gcatgcgtcg ccccgccatc gggctaccaa 37500
cgaggatcat ggtctcgtca tggagctcga tggtctggtg gtggttgcgc agggctttga 37560
cgacgctatc ctccccgtcc agcatgaccc ctcggcggct gaactcccgt atccgttggg 37620
cggccaaggt ggggtttccc ccgtctgatt cgatgtcgat gatgagttga tcgccgtcca 37680
ctgcggcggt gataccggca tcgttcagct gcgccgctaa ctgcttcgcc tgctgtttga 37740
gattttcgtt tgtcatgggt gggtcctcac cgttattcgt gacgggcgat gatgtcttcc 37800
acgatgtcga gtgcagcgga tagaccggcg caccccatgg tgaccttctc ctcggcttcc 37860
tgcagtcggg ctttcagctg ggcacggatc tgttcgtgca gcgggacagg ggcagggttg 37920
gccagcaggg tgacgccacc atccggttgt ggcgcggcgt ccatcatgtt gcgccagaac 37980
tcatcacatg gcgatccgaa cccgccctcg aagtattcca gctcctcacc ggctttcagc 38040
atggcttcgg tgggctccac cggcacccag cgccacttga tggttgggtt cccgctttcg 38100
tctgggcctg cgccgtaggg ggcggcgaat accggcgaca tggatgtgct gcgcggcttg 38160
atggcgggct tggccgtgga ggcggctacc agagcggcaa acttgtcata gtcttcctgg 38220
ctgacgttga ccacgccttc ggtgacttgg ctccacatcg cggcgcaccc cgagaacggg 38280
gaaacatgca cgacgctatc aaccagctcg cggcactcct tgatcgtccg gatgttgtcc 38340
tcgatcagca caacgcggca gtcctcgcca tgctgctggc ggaaggcggt aagccagtca 38400
cgcttgaact ccatggcggt tcgggtgtca ccaggctggc gcatgtgcag cacttcgctg 38460
atgccgtcga tgaatgacgg gtacccgccg tccggccagc ggcccgcgtc ccagccaagg 38520
ctgaccatcc aagcattggc gatcgactct tgggtggcgt cgcggcaagg ctccccgcgg 38580
aaggtcaggt aatggatccg gcagtccagc aggcgcagct cgttgataag gctgaacaca 38640
tggcggatcg gctcgtcggc gccgcatgcc gcgttgaagg tgtcccacat ctcctccggg 38700
gcattcggtt gcatcggcag aaggtgggcc cgctgggagt tgtcgaagag tgcgccgtcg 38760
aggtcgcaaa tcagatgggt gatcatctcg gtttcctgtt aagtgggttc ataggtattg 38820
tgtcggtatg cgatgtgcat gtcaaactat ttcctgctga taaagaaaag cccgccaaac 38880
ggcgggccgg tattacgtta ttacaggaag tcgggggtct gcggcactac agctcgggcg 38940
acacaagacg cacacaagcc ggtggtgctg gacacggcca cgccatcccg gtgacaacga 39000
cggcaggtac agcccgcttt gtccgacttg gccttctggc cggtcttgtc gaggcgcggg 39060
atgttggcca tgcctggcat ttggtcgatc atgctttctc cttctcggcg tcaacaaccg 39120
gtaacagcat ggccttcgcc tgatcagtgg tcaagcacag gatacccagc tcctcggcct 39180
tggccagttt gctgcccggt gcctcgccga cgatcaggat gtcggtatcg ctggtgaccg 39240
agccgtacac cttgccgcca ctggcgacga tggcgagttt gatcgatgcg cggttggccc 39300
aggcgtgggt accggtgatg acgacccgct taccctcgaa cagcttgttg gtgcgcagtt 39360
tcgggccgcg ttgacccatc acatcgttgg agaaggattt caggcgcgac cgcagctggt 39420
tgatcagctg gtggacttca cccggctcgt cttcctgcag gcgggacaac tccatgatca 39480
ggtggtcgta tgccactttc acccgctcgg tctgctcgga cttggtcggc gtcggctgcg 39540
ggttcttctt gccccactcg ctcaccggga tgacatgctc gtcgaactgg tctttgacgt 39600
tgcagataac accgttgcgc atggtctcct gctcgatcgg gttgccgcac tcgccgcaca 39660
ccactttgtt cgggatgcag gtacttgcca cggccagcag cgggcctttg atgccgctgt 39720
gcagcaggga ccggcagtgc gggcaggtga tccgccagaa ggcgtcgccg tatttatcgc 39780
gggtcgggtc gacaatcttg tccaggacgc ggcggataac atcatgcttg ttttccaagg 39840
tgtggcggag gatagacagc gggatcgcct cgccgggttt ggtgtcagcc atgtggccga 39900
ccatgccgac ataacgcgga tggttcatgc ggttgaacag atccagcagt tggcggtcga 39960
tacctgggat ggccgatttg aacgcgatgt tgcggcaggt tatcgccaga tcacgatagg 40020
ggcagccggt cttctcttcc gcgtgggcct gtttggcttt gtgcagctcg agcgccttgg 40080
cggcggacag gtggatctcc tcgagatcgg tggtcaagtc cttgctgcca cgctggccag 40140
cggccaacgc tttcttggtc aggtgggcca gcgcagggtc ggcgaccttg aatgcgtcca 40200
gcacccggta aacgtcgacc tcgatggcgg cgggcttgtc ggtaccgata gtccagccgt 40260
ggatcacgcg gagatacttg gagttgttat ccggtttgtt gctcataatg tgggtctcat 40320
aacggggttg atttgaacaa ggcgtggcaa tcgccagcct cggctagtct gcgggccact 40380
tcactggcga cagtgccgcg ggccgcgagg tctctcatgt tgcgctccat ggccgctcta 40440
ccggcttcgg tcagcgaccg gcgggtggag tccggcgcga tgaagtcaac gtcggtgatc 40500
gggcagatgg cgtatccact gcgaacgtgg gtcaggtacc actgctttga ctgcatgcgg 40560
atgtgggcga cgaactcatg ctcaaccccg ttcaccgcga aggtgaagac agggccgatc 40620
actttgccga tgccgacgac cgagccgtca ggccgctggt atttggggcc gttgtagtcg 40680
ccattcgggc tgaccagaac aaaaacctcc ttcatgtcac agctcctcat cctcgttgcg 40740
gatccgctcc atctcttcct cgcccatccg tttaagcgcg gcgcgggtga tgtagaagtc 40800
gcccctctcg ctttccggca ggttgcggtc gaagacaaac agcgcggcgc caaaacctgc 40860
ggaactggcc tttggggtct taggcccagg ccggaaccag agcgggcgct cgaaaccgat 40920
gcggcccttg atgtagatca ctttgtccgc cttcgggata gacgggtctt gtgtttcgtc 40980
gataccaatg cgtggccacc agacttctga cggagatgct ttcaccagat gcacctgggg 41040
cgccccgtag ttgcgctcct cccacgcctt ggcggtgatg tggcgcatgc cggtcaacgg 41100
gtcaccatct tcggtcgagc tgatcgagta gggcggattg gcgaaagcca tgggctgctc 41160
gatgccggtt tccatctcga tgtcgaacag acgggacgac cagctctgca ccagggcgtt 41220
atcttccgcc gtgtagtagt gcgggcactt cgagttatcg ccgtcagtga acaagtccag 41280
ttggagacgg tggttgaaca gcacgttgat accgtggaac agccagtccg gcgtccgcca 41340
ttggtcgccg atctccttgt tctcatgtgt cgcctgttct ttcagggcgt tcagccggtc 41400
gacatacccg ccctgcagag cggcctgtcg aggcggcatt cggtttccca tcgtaaactc 41460
ccgtgtctat gtttgtgggg cggccttcaa tatcgacgca ccgttcgcat gccctgccga 41520
tcgtccggta ccgccgaggt gtcccctttg gcttggtggc ctcggctact cggtaggtgc 41580
atgcaagagg ggcaatatct tggccgcagt agaggcagag ggtcgagccc tctaccggct 41640
tactcaactc ccggttcctt gtccgcacgt tggatcgcat gggcgcaggt gaacacgccg 41700
tccggatagc ggcgagccag cttttcgata ttggcctctt tgatctgggt gcgggtcacc 41760
ccgatggagc gatagatctt gttcagcatg tccagcaggt ggtgaaggcg gatcggcacg 41820
aaacagagat tcttggggtt gtcgtaaatc gtccacttct tgacatcgtc cagcagatca 41880
ccggcgcaca gggtcatgtc gtcagcaagg acgagaaggt cataggtgga gtattggtgg 41940
caggggtggc gcatctggaa gctgtacttc acatccggct tcgggatgtc cttctggtcg 42000
aggcagaacc caaggaaatt cgggtcttgt gcgccgacga tgtagaactc gaggtcaccg 42060
cactcctcgc gcaggttggc gccgtcgtca ttcatcaagg cgcgtttcag ttcgatcgtc 42120
tcgcccatga tgccgaccgc catgtggagg atgtgcgcct tctggctggt cagatccatc 42180
aggatggaga cgccgggctt ggcgaggttg tccaccatgc ggcggaaatt ggtttcgacg 42240
atgtcgtctt tgcttacgtt ttcaatgctc atcgtgtggg tccttctcgg ttggtttggg 42300
taatgtagta cgatgccgat cgcatgtcaa agggtttcca gttcatcgct gatgtcgagg 42360
tggtagatgt gctgctggat gcggatcccg aggaagcgca tgacgttgac gcacatggag 42420
ttgccaaggg ctcggtaccg gtggctatcg gcaaccggct tcccgttata ggtaacgagg 42480
gtgtagtcgt cgcaaaaccc ctgcagccgc tcacactcga tcggcatgag gcggcgaaca 42540
gccatgtcgt atgacacggc gaccccttgg gcggtgtcca gggtgtggca gagctcgagc 42600
tggatgcccc agccgttgct actggtgttc gccgtccgga cgctgtagga cacggtgttc 42660
tcttgtcccc agttgcaccc gagcgtgtgg gcgagctcga cgttagtaat cgggtcttgg 42720
gtaccgtgga cagccatgat caaatccgtg gcgtccttgt agtcccgcgc cttcattgtg 42780
ctggcggtct cgtcgtcggt gtactccccg aaggccacca tgcggaagcc cttaacctcg 42840
gggatcaggt gtccggcttg tccttggttg tcgtcgacgc cacatgttcc aacgccattc 42900
gcagtaaggg cggcaactgg cgcttccttt tctctgaccg gttcagaatc ccggcgcatg 42960
ccgccgaact cgaataatac ttctgaggga tcgaatccct ctcgagcact tccgacaaga 43020
aagacacggc ggcgtcgttg ggccactccg aaaaattggg catcgaggac ccgccagccg 43080
actgcccttt ggggtccaac aacaacacca gcgaccggcc aacgcggtat gtgctgatgg 43140
gttttcttgt cccagcgcca gtgggcagag gaccgtcctt gttgaggtcg tgggccaggc 43200
tcaagggcac cgtcctcccc aacgaggccg ccaagaagat ggccgaaggc gttatctggc 43260
attgatagca ccccagtgac gttttcccac aagagcacac agggcgattt tccttgttcg 43320
tatcggacat catcgatctc attggcaagt ttgatgaact cgagggtgag ttggccgcgt 43380
gagtcggtca cccctccgcg cagaccggcg actgaaaagg cttggcacgg ggtaccggcc 43440
accagcacct ccggcgcgtc gccgtcgatc gcaacgtagg cgcgcactct ggtgaagtcc 43500
cccaggttgt tgacatgggg gtaacgctgc tcgagcaggg cggaagggaa gtccggccct 43560
ttcgagtaat catgctcggg gtcgaactgc gagaaccaca tgggggtgaa gcccagcccc 43620
tcccatgcag cactcgcagc ctcaataccg gagcaccctg acccgtaggt gatctcccgt 43680
cccattaatc ctccgcttcg tctcggctgg tgaggtctcg cagcgggccc gcgcagaacg 43740
ggcagacgtt gaggacgagg ccgcccttgt tgtcgctgtt ctggtagcgc acctgtttac 43800
ccaggctgac cccgctgttg aggtcgacga tagttgcggc caccagacct ttgacatagc 43860
gccgacccgg ccactctacg caccggctca aagcgtcgca atgggtggct gaatatccgc 43920
cggggtgggc ggtgcatctc acaggggcgt tactcatggg cggccccctt tggtgcggcg 43980
tttgtacggc tggcgctgtt tgaagtggcc gagcagctgg tggaggtgcg cctgggcctc 44040
aaacagcttg tcgtatgcct cctcgctgcc gtcacagccc tccattgctt cgaggtgggc 44100

Claims (10)

1.一种新型嗜水气单胞菌噬菌体，其特征在于，所述嗜水气单胞菌噬菌体为嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophila phage AH-P1)，保藏编号为CCTCC NO: M2020251。
2.根据权利要求1所述的一种新型嗜水气单胞菌噬菌体，其特征在于：所述嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophila phage AH-P1)为烈性噬菌体，有一呈多面体对称的头部和可伸缩的尾部，头部直径为56~60nm，尾部长为180nm。
3.根据权利要求1所述的一种新型嗜水气单胞菌噬菌体，其特征在于：所述嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(AeromonashydrophilaphageAH-P1)具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的一种新型嗜水气单胞菌噬菌体，其特征在于：所述嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophila phage AH-P1)在MOI=0.001条件下培养8h，效价为4.1×1010 PFU/mL。
5.根据权利要求1所述的一种新型嗜水气单胞菌噬菌体，其特征在于：所述嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophila phage AH-P1)最适pH为4~10，供试噬菌体在酸性条件下耐受性良好，同时对碱性条件具有一定耐受性；经紫外辐射8h后，噬菌体的效价下降一个数量级。
6.权利要求1所述的一种新型嗜水气单胞菌噬菌体的组合物，其特征在于：所述组合物中至少含有一株嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophila phage AH-P1)以及其它细菌噬菌体或化学性杀菌剂中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的一种新型嗜水气单胞菌噬菌体的组合物，其特征在于：所述其它细菌噬菌体为副溶血性弧菌噬菌体VP46（Vibrio parahaemolyticus phage VP46），保藏编号CCTCC M 2016290；副溶血性弧菌噬菌体VP7（Vibrio parahaemolyticus phage VP7），保藏编号为CCTCC NO：M2016289；溶藻弧菌噬菌体VAP7（Vibrio alginolyticus phageVAP7），保藏编号为CCTCC NO: M 2018767；或溶藻弧菌噬菌体VAP21（Vibrio alginolyticus phage VAP21），保藏编号为CCTCC NO: M 2018768中的一种。
8.根据权利要求6所述新型嗜水气单胞菌噬菌体的组合物，其特征在于：所述组合物包括化学性杀菌剂。
9.一种新型嗜水气单胞菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中带有权利要求1~5任意一项所述的新型嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophila phage AH-P1)或权利要求6~8任意一项所述的新型嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophila phageAH-P1)的组合物。
10.一种权利要求1～8任一项所述新型嗜水气单胞菌噬菌体及其组合物的应用，其特征在于：所述嗜水气单胞菌噬菌体AH-P1(Aeromonas hydrophila phage AH-P1)及其组合物用作于生物杀菌剂的有效成分，防治但不限于由嗜水气单胞菌引起的细菌性疾病。
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