CN108578687A - 多杀性巴氏杆菌菌影疫苗的制备及其免疫效力分析 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多杀性巴氏杆菌菌影疫苗的制备及其免疫效力分析方法，制备多杀性巴氏杆菌菌影，对菌影裂解率最高时的诱导时间和起始诱导浓度进行诱导，将诱导后的菌液离心收集菌体沉淀。然后用无菌PBS重悬菌体制得菌影疫苗及灭活疫苗；最后应用制备的菌影疫苗对小鼠进行免疫接种。结果显示，制备的菌影疫苗可诱导小鼠产生较高水平的体液免疫和细胞免疫，可为小鼠抵抗多杀性巴氏杆菌的攻击提供较高的保护力。本发明为进一步研究动物巴氏杆菌菌影疫苗奠定了基础。

Description

多杀性巴氏杆菌菌影疫苗的制备及其免疫效力分析
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种多杀性巴氏杆菌菌影疫苗的制备及其免疫效力分析方法。
背景技术
动物的巴氏杆菌病是由巴氏杆菌感染引起的一种急性传染病。目前该病的预防主要靠疫苗接种，其疫苗主要包括灭活菌苗，弱毒活菌疫苗和亚单位疫苗。由于传统灭活疫苗的免疫效果不理想，不能提供较强的保护力，弱毒活菌疫苗存在毒力返强的风险，因此研制一种安全有效的疫苗对控制动物巴氏杆菌病具有重要意义。
细菌菌影技术是近年来兴起的一种新型疫苗技术，适用于大部分的革兰氏阴性菌。它是利用噬菌体phi X174裂解基因在细胞膜上形成特异性跨膜孔道，并通过渗透压作用排出胞质内含物，从而形成的完整细菌空壳。它完整的保留了细菌表面抗原的天然结构，可以有效诱导机体产生较强的免疫反应，同时由于其不含有任何的胞质内容物和核酸，因此比弱毒疫苗和灭活疫苗更安全可靠。目前的研究已经表明，菌影既可以诱导机体产生体液免疫，又可以产生细胞免疫，因此是一种非常理想的新型细菌疫苗。
发明内容
本发明针对现有疫苗技术的不足，目的在于提供一种多杀性巴氏杆菌菌影疫苗的制备及其免疫效力分析方法，从而成功构建了裂解质粒pPBA1100-E，并获得多杀性巴氏杆菌菌影疫苗，可为小白鼠提供良好的免疫保护，为进一步研究动物用多杀性巴氏杆菌菌影疫苗奠定基础。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种多杀性巴氏杆菌菌影疫苗的制备及其免疫效力分析方法，包括以下内容：首先以pHH43质粒为模板，通过PCR扩增含噬菌体PhiX174的裂解基因E和CI857-PL-PR启动阻遏系统组成的温敏裂解盒
CI857-PL-PR-E，再将裂解盒插入到pPBA1100载体中，构建裂解质粒pPBA1100-E。利用电转化的方法将其转入多杀性巴氏杆菌中，将含有裂解质粒的多杀性巴氏杆菌在37℃条件下培养至OD600nm值约为0.4时，再将培养温度升至42℃进行诱导，制备多杀性巴氏杆菌菌影；其次应用制备的菌影疫苗对80只25g左右的雌性昆明系小白鼠进行免疫接种，分析菌影疫苗对小鼠的免疫效力。
上述方案中，所述的多杀性巴氏杆菌菌影制备步骤如下：
(1)以pHH43质粒为模板，通过PCR扩增含噬菌体PhiX174的裂解基因E和CI857-PL-PR启动阻遏系统组成的温敏裂解盒CI857-PL-PR-E；
(2)将步骤(1)制得的温敏裂解盒CI857-PL-PR-E插入到pPBA1100载体中，构建裂解质粒pPBA1100-E；
(3)将步骤(2)制得的裂解质粒pPBA1100-E利用电转化的方法将其转入多杀性巴氏杆菌中；
(4)步骤(3)制得的含有裂解质粒的多杀性巴氏杆菌在37℃条件下培养至OD600nm值约为0.4时，将培养温度升至42℃进行诱导，制备多杀性巴氏杆菌菌影，菌影冻干保存。
上述方案中，所述的裂解质粒pPBA1100-E的构建方法如下：
(1)以pHH43质粒为模板扩增裂解盒：
根据pHH43质粒的测序结果设计引物扩增裂解盒，即温控原件和裂解基因E。
上游引物CI857-UP：CC GAGCTC TCA GCC AAA CGT CTC TTC AGG，
下游引物CI857-DN：CG GGATCC TCA CTC CTT CCG CAC GTA ATT
引物由Invitrogen(上海)公司合成，在上、下游引物5'端分别引入了SacⅠ和BamHⅠ限制性内切酶位点。
以pHH43质粒为模板，用设计好的引物扩增裂解盒，PCR运行参数为：1)96℃预变性5min；2)94℃热变性30s，60℃退火30s，72℃延伸90s，循环30次；3)72℃延伸10min；
(2)回收PCR扩增产物：将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒回收目的片段；
(3)PCR产物与pPBA1100载体的连接：用限制性内切酶SacⅠ和BamHⅠ利用双酶切方法对胶回收PCR产物进行酶切，然后将其与经过相同酶切处理后的pPBA1100载体相连接；
(4)DH5α感受态细胞的制备(TSS法)：前一天晚上挑取单个菌落接种于30mL LB液体培养基中过夜培养(12～16h)，按照1:100的比例将过夜培养物(500μL)加入到新鲜的50mL LB培养基中，于37℃振荡培养至OD600nm约为0.4(培养时间2h40min～2h50min)。冰水混合物中放置30min后4℃1000g离心10min，弃掉上清，收获细菌。再加入原体积十分之一的预冷过的1×TSS液悬浮细菌，然后将其分装成小份(100μL/份)，放置于-80℃保存；
(5)转化：将10μL的连接产物加入至100μL DH5α感受态细胞中，冰水混合物中放置30min。42℃水浴放置90s，立即冰上放置5min，然后加入800μL LB液体培养基，置于37℃摇床中120rpm摇菌1h，然后将菌液3000g离心5min，弃掉800μL上清，用剩余的100μL液体将细菌沉淀悬起，均匀涂布于含有100ug/mL卡那霉素的LB固体培养基上，放置37℃温箱培养12h。
(6)重组质粒pPBA1100-E的鉴定：
随机挑取LB平板上的6个菌落，分别接种于5mL含有100ug/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇菌12h，使用质粒DNA提取试剂盒提取质粒DNA，将提取的质粒DNA分别进行PCR鉴定和酶切鉴定。鉴定正确的重组质粒送至哈尔滨博仕生物有限公司进行序列的测定，将测序正确的质粒命名为pPBA1100-E。
上述方案中，所述的多杀性巴氏杆菌菌影的制备方法如下：
(1)多杀性巴氏杆菌电转化感受态细胞的制备：
将冻干的多杀性巴氏杆菌B:2血清型菌株稀释后接种于LB平板37℃培养12h；挑取单个菌落，在5mL LB液体培养基中37℃，220rpm，震荡培养12h；随后将培养物接种在200mLLB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600nm吸光度值为0.4左右；冰浴20～30min，4℃，4000rmp下离心10min，无菌条件下弃上清液；加入预冷的灭菌去离子水悬浮，同样条件下离心10min，重复2次；用20mL预冷的10％的灭菌甘油洗涤2次，4℃，4000rmp离心10min；最后用10％的预冷无菌甘油重悬菌体至最终体积为2～3mL；分装成100μL/管，-80℃保存备用，所有操作均在冰上。
(2)重组质粒pPBA1100-E的电转化及鉴定：
取2μL重组质粒pPBA1100-E和步骤(1)制得的电转化感受态细胞，加入预冷的电转杯内，设置好电击参数，电击后加入预热的无抗性LB培养基，37℃，160rpm培养1h，4000rpm离心5min，弃部分上清，用剩余100μL悬起沉淀，涂在100μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃放置24h。
通过菌落PCR分别扩增裂解盒CI857-PL-PR-E基因和多杀性巴氏杆菌的KMT基因，鉴定结果正确的阳性菌株，即为含裂解质粒pPBA1100-E的重组多杀性巴氏杆菌B:2血清型菌株。
(3)细菌裂解条件的优化：
制得的含有裂解质粒的多杀性巴氏杆菌在37℃条件下分别培养至OD600nm值为0.2、0.4、0.6、0.8左右，将培养温度升至42℃进行诱导，直至培养物的OD600nm值基本恒定为止。然后计算诱导后活菌数。
(4)菌体裂解率的计算：
分别计算诱导前和诱导后细菌数。裂解效率＝(1－诱导之后CFU/诱导之前CFU)×100％。
(5)重组质粒pPBA1100-E的遗传稳定性试验：
将制得的杆菌连续传代25代，通过PCR扩增裂解盒和升温诱导绘制裂解曲线两种方法检测原代、5代、10代、15代、20代、25代菌株中重组质粒pPBA1100-E稳定性。
(6)电镜观察多杀性巴氏杆菌菌影：
将诱导后的新鲜菌液离心后加入戊二醛溶液固定细菌沉淀，4℃放置2h，使用PBS缓冲液洗涤三次，离心后用四氧化锇固定，然后乙醇脱水和包埋剂包埋后，电境下观察菌影。
上述方案中，所述的多杀性巴氏杆菌菌影疫苗的制备方法如下：
(1)灭活疫苗制备：将培养好的多杀性巴氏杆菌菌液6000g离心10min后弃上清，用PBS溶液重悬菌体至培养物浓度为2×109CFU/mL，然后加入0.3％体积的甲醛，37℃过夜灭活。使用三通将灭活后的菌液与等体积的ISA 206佐剂充分乳化混匀。
(2)菌影疫苗制备：选择菌影裂解率最高时的诱导时间和起始诱导浓度进行诱导，将诱导后的菌液离心收集菌体沉淀。然后用无菌PBS重悬菌体，将菌体沉淀的一半用无菌PBS溶液稀释至浓度为1×109
CFU/mL，另一半用无菌PBS稀释至浓度为2×109CFU/mL。浓度为2×109CFU/mL的菌影原液用与制备灭活疫苗同样的方法进行乳化备用。
上述方案中，所述制备的多杀性巴氏杆菌菌影免疫效力分析方法如下：
(1)将80只25g的雌性昆明系小白鼠，随机分成4组：菌影组、菌影+佐剂组、灭活苗组和PBS对照组，每组20只，实验室适应1周后，间隔两周连续接种两次。
(2)在免疫前采血分离血清做阴性血清，在一免2周后，二免2周后采血分离血清利用间接ELISA方法检测小鼠血清中IgG抗体的水平，同时使用细胞因子检测试剂盒检测二免两周后各组小鼠血清中IL-4、和IFN-γ的含量；
(3)然后从二免后3周开始连续数周采集血液，每次间隔一周，检测小鼠血清中IgG抗体的消长趋势。
(4)每次免疫两周后每组处死5只小白鼠，无菌取出脾脏，从脾脏中分离淋巴细胞，检测免疫后CD4+和CD8+T淋巴细胞的动态变化。
(5)在二免2周后用多杀性巴氏杆菌对小鼠进行攻毒，攻毒后记录小鼠的存活率。
本发明的有益效果在于：
本发明采用pHH43质粒为模板，通过PCR扩增含噬菌体PhiX174的裂解基因E和CI857-PL-PR启动阻遏系统组成的温敏裂解盒CI857-PL-PR-E，再将裂解盒插入到pPBA1100载体中，成功构建了裂解质粒pPBA1100-E，裂解效率可达99.997％；从而使制得的多杀性巴氏杆菌菌影疫苗可诱导小鼠产生较高水平的体液免疫和细胞免疫，可为小鼠抵抗多杀性巴氏杆菌的攻击提供较高的保护力。本试验为进一步研究多杀性巴氏杆菌菌影疫苗奠定了基础。
附图说明：
图1为裂解盒的PCR扩增结果；
其中1：裂解盒CI857-PL-PR-E；2：阴性对照；M：DL5000DNA Marker；
图2为裂解质粒pPBA1100-E的PCR和双酶切鉴定结果；
其中1：裂解质粒pPBA1100-E的PCR鉴定结果；2：裂解质粒pPBA1100-E的双酶切鉴定结果；M：DL5000DNA Marker；
图3为裂解盒CI857-PL-PR-E的PCR鉴定结果；
其中1：裂解盒CI857-PL-PR-E的PCR扩增结果；2：阴性对照；M:DL5000DNA Marker
图4为多杀性巴氏杆菌的PCR鉴定结果；
其中1：多杀性巴氏杆菌的PCR扩增结果；2：阴性对照；M：DL2000DNA Marker
图5为含裂解质粒pPBA1100-E的多杀性巴氏杆菌的裂解曲线；
图6为不同代次菌株中裂解盒CI857-PL-PR-E的PCR扩增结果；
其中1：原代；2:5代；3:10代；4:15代；5:20代；6:25代；M:DL5000DNA Marker
图7为不同代次含重组质粒pPBA1100-E的多杀性巴氏杆菌裂解曲线；
图8为菌影的扫描电镜照片；
其中A:正常多杀性巴氏杆菌；B:裂解后的多杀性巴氏杆菌；
图9为攻毒多杀性巴氏杆菌后内脏器官中肺脏、肝脏和脾脏荷菌数；
图10为各组免疫小鼠血清中特异性抗体的变化趋势；
图11为免疫小鼠脾脏中CD4+细胞亚群在总淋巴细胞中的百分比；
图12为免疫小鼠脾脏中CD8+细胞亚群在总淋巴细胞中的百分比；
图13为TNF-α的检测结果；
图14为IFN-γ的检测结果；
图15为IL-4的检测结果；
图16为IL-10的检测结果。
具体实施方式：
为了更好的理解本发明，下面将结合实施例对本发明的实施方案作进一步详细的说明，但本发明内容不仅仅局限于下面的实施例。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
试验材料如下：
1.菌种、质粒及试验动物
大肠埃希菌E.coli DH5α购自BM公司，多杀性巴氏杆菌B:2血清型菌株购自中国微生物兽医菌种保藏管理中心，多杀性巴氏杆菌分离株由本实验室分离保存，pHH43质粒和pPBA1100质粒由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所惠赠。体重25g左右的健康清洁级昆明系雌性小白鼠80只，购自长春生物制品研究所。
2.主要药品及试剂
Taq DNA聚合酶、DNA5000Marker、DL 2000Marker均购自TaKaRa公司；BamH I、SacI限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶均购自thermo Scientific公司；质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒均购自AXYGEN公司；卡那霉素购自BIOSHAR公司；小鼠脾脏淋巴细胞分离液购自美国Sigma公司；小鼠IL-4检测试剂盒、小鼠IL-10检测试剂盒、小鼠TNF-α检测试剂盒、小鼠IFN-γ检测试剂盒均购自美国Biolegend公司；小鼠Rat IgG2b R-PE Conjugate、RatIgG2a FITC Conjugate、Mouse CD8a R-PE Conjuga、Mouse CD4FITC Conjuga均购自Life
technologies公司；TMB显色液购自Promega公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG二抗购买自北京博奥森生物技术有限公司；ELISA酶标板购自北京康贝源科技有限责任公司。
实施例一：裂解质粒pPBA1100-E的构建方法
1.以pHH43质粒为模板扩增裂解盒
根据pHH43质粒的测序结果设计引物扩增裂解盒，即温控原件和裂解基因E。
上游引物CI857-UP：CC GAGCTC TCA GCC AAA CGT CTC TTC AGG，
下游引物CI857-DN：CG GGATCC TCA CTC CTT CCG CAC GTA ATT
引物由Invitrogen(上海)公司合成，在上、下游引物5'端分别引入了SacⅠ和BamHⅠ限制性内切酶位点。以pHH43质粒为模板，用设计好的引物扩增裂解盒，PCR反应体系如表1-1：
表1-1PCR反应体系
DNApolymerasebuffer 5μL
上游引物(20mM) 1μL
下游引物(20mM) 1μL
dNTP混合物(2.5mM) 4μL
pHH43质粒 0.5μL(含12.5ngDNA)
MgCl2 4μL
TaqDNApolymerase 1μL
灭菌水 33.5μL
PCR运行参数为：1)96℃预变性5min；2)94℃热变性30s，60℃退火30s，72℃延伸90s，循环30次；3)72℃延伸10min。
2.回收PCR扩增产物
将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒回收目的片段，操作步骤如下：
(1)在紫外灯下用手术刀片将含有目的DNA的凝胶切下，用吸水纸将凝胶表面的液体吸干，将凝胶切碎置于1.5mL离心管中，称量凝胶重量，将该重量视为一个凝胶体积(例如100mg相当于100μL体积)
(2)加入3倍凝胶体积Buffer DE-A，放置于75℃水浴中，间隔2～3min上下颠倒混匀，直到凝胶全部融化。
(3)加入半个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，充分混匀。如果回收的DNA片段低于400bp时，还需加入与凝胶体积相等的异丙醇。
(4)将上一步的混合液，加入到DNA吸附柱中(将吸附柱置于2mL离心管中)，12000g离心1min。倒掉滤液。
(5)将吸附柱放入2mL离心管中，加入500μL的Buffer W1，12000g离心30s，倒掉滤液。
(6)将吸附柱放入2mL离心管中，加入700μL的Buffer W2，12000g离心30s，倒掉滤液。
(7)重复步骤(6)
(8)将吸附柱放入2mL离心管中，12000g空离1min。
将吸附柱放入一个新的1.5mL离心管中，在吸附柱膜中央加入30μL的去离子水，室温放置3min，12000g离心1min洗脱目的片段DNA。
3.PCR产物与pPBA1100载体的连接
用限制性内切酶SacⅠ和BamHⅠ利用双酶切方法对胶回收PCR产物进行酶切，然后将其与经过相同酶切处理后的pPBA1100载体相连接。酶切反应体系如表1-2：
表1-2酶切反应体系
将上述各酶切体系分别轻轻混匀后放入37℃水浴中6h，然后用1％的琼脂糖凝胶跑电泳，分别回收酶切片段。纯化后进行连接，连接体系如表1-3，反应的总体积为10μL，轻轻混匀、瞬离后，放于16℃连接仪中过夜连接。
表1-3连接反应体系
PCR产物 7μL
pPBA1100载体 1μL
T4DNA连接酶 1μL
10×T4DNA连接酶buffer 1μL
4.DH5α感受态细胞的制备(TSS法)
(1)1xTSS缓冲液的配制
1M的氯化镁溶液的配制：称取20.3g氯化镁(含6分子水结晶)定容于100mL去离子水中，封装保存，无需灭菌。取干净的100mL量筒和100mL烧杯，用量筒量取100mL去离子水，加入至烧杯中，取1g蛋白胨，0.5g氯化钠，0.5g酵母抽提物，10g PEG(MW＝3350),5mL的1M氯化镁，5mL DMSO，溶解后用HCL或者NaOH调整pH为6.5，混和均匀后用0.22um滤器进行过滤除菌。4℃保存，保质期约为6个月[83]。
(2)感受态细胞制备程序
前一天晚上挑取单个菌落接种于30Ml LB液体培养基中过夜培养(12～16h)，按照1:100的比例将过夜培养物(500μL)加入到新鲜的50Ml LB培养基中，于37℃振荡培养至OD600nm约为0.4(培养时间2h40min～50min)。冰水混合物中放置30min后4℃1000g离心10min，弃掉上清，收获细菌。再加入原体积十分之一的预冷过的1×TSS液悬浮细菌，然后将其分装成小份(100μL/份)，放置于-80℃保存，整个过程均在冰上操作，-80℃保存。
5.转化
将10μL的连接产物加入至100μL DH5α感受态细胞中，冰水混合物中放置30min。42℃水浴放置90s，立即冰上放置5min，然后加入800μL LB液体培养基，置于37℃摇床中120rpm摇菌1h，然后将菌液3000g离心5min，弃掉800μL上清，用剩余的100μL液体将细菌沉淀悬起，均匀涂布于含有100ug/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃放置12h。
6.重组质粒pPBA1100-E的鉴定
随机挑取LB平板上的6个菌落，分别接种于5mL含有100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇菌12h，使用质粒DNA提取试剂盒提取质粒DNA，操作过程如下：
(1)取3mL菌液分两次加入到1.5mL离心管中，12000g离心1min，充分弃尽上清液。
(2)向离心管中加入250μL Buffer S1将细菌沉淀重新悬起，细菌沉淀需彻底混匀。
(3)加入250μL的Buffer S2，轻柔地上下翻转混匀，充分裂解菌体，直到溶液变得清亮。
(4)加入350μL的Buffer S3，轻柔地上下翻转8次，12000g离心10min。
(5)将上一步的上清液转移到吸附柱中(吸附柱置于2mL离心管中)，12000g离心1min，倒掉滤液。
(6)将吸附柱放回离心管中，加入500μL的BufferW1溶液，12000g离心1min，倒掉滤液。
(7)将吸附柱放回离心管中，加入700μL的BufferW2溶液，12000g离心1min，倒掉滤液。
(8)重复步骤(7)
(9)将吸附柱放回离心管中，12000g空离1min。
(10)将吸附柱放入一个新的1.5mL离心管中，在吸附柱膜中央加入40μL的去离子水，室温放置3min，12000g离心1min。
将提取的质粒DNA分别进行PCR鉴定和酶切鉴定。PCR扩增体系如表1-4：
表1-4 PCR扩增体系
DNApolymerasebuffer 5μL
上游引物(20mM) 1μL
下游引物(20mM) 1μL
dNTP混合物(2.5mM) 4μL
质粒 0.5μL(含12.5ngDNA)
MgCl2 4μL
TaqDNApolymerase 1μL
灭菌水 34.5μL
PCR运行参数为：1)96℃预变性5min；2)94℃热变性30s，60℃退火30s，72℃延伸90s，循环20次；3)72℃延伸10min。
酶切鉴定体系如表1-5：
表1-5酶切鉴定体系
质粒 6μL
SacⅠ 2μL
BamHⅠ 1μL
BamHⅠbuffer 2μL
灭菌去离子水 9μL
鉴定正确的重组质粒送至哈尔滨博仕生物有限公司进行序列的测定，将测序正确的质粒命名为pPBA1100-E。
实施例二：多杀性巴氏杆菌菌影的制备方法
1.多杀性巴氏杆菌电转化感受态细胞的制备
(1)将冻干的多杀性巴氏杆菌B:2血清型菌株用灭菌的生理盐水或者培养液稀释后用接种环接种于LB琼脂平板培养基上，在37℃下培养12h。
(2)挑取单个菌落接种在5mL的LB液体培养基中，放置于摇床中37℃，220rpm，震荡培养12h。
(3)将5mL过夜培养物接种于200mL的LB液体培养基中，37℃条件下震荡培养至OD600nm吸光度值为0.4左右。
(4)将菌液在冰浴中预冷20～30min随后将菌液分装到4个预冷的50mL离心管中，4℃，4000rmp下离心10min，无菌条件下弃上清液。
(5)菌体沉淀先用少量冰预冷的灭菌去离子水悬浮(操作过程需在冰上进行)，然后继续加入灭菌去离子水至离心管的大约2/3体积。4℃，4000rmp下离心10min，无菌条件下弃上清液。
(6)重复上一步骤。
(7)用20mL预冷的10％的灭菌甘油洗涤浮菌体2次，每次都是4℃，4000rmp离心10min。
(8)用10％的预冷无菌甘油重悬菌体至最终体积为2～3mL。
(9)将菌液分装于1.5mL的EP管中，100μL/管，-80℃冰箱中保存备用。
2.重组质粒pPBA1100-E的电转化及鉴定
(1)从-80℃冰箱中取出上述方法制备的电转化感受态细胞，置于冰上待融化，取2μL重组质粒pPBA1100-E加入感受态细胞中混匀。然后迅速加入经预冷过的0.2cm的电转杯内，冰上放置10min。
(2)设置电转仪的点击参数，电压2.5KV,电阻200Ω，电容25μF。
(3)将电转杯放入电转仪中，电击后，取出电转杯，迅速加入经预热到37℃的800μL无抗性LB液体培养基，160rpm，37℃摇动培养1h。
(4)4000rpm离心5min，弃掉800μL上清，用剩余的100μL液体将细菌沉淀悬起，均匀涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃放置24h。
通过菌落PCR分别扩增裂解盒CI857-PL-PR-E基因和多杀性巴氏杆菌的KMT基因，鉴定结果正确的阳性菌株，即为含裂解质粒pPBA1100-E的重组多杀性巴氏杆菌B:2血清型菌株。
3.细菌裂解条件的优化
在10mL含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中接种含有裂解质粒pPBA1100-E的重组B:2血清型菌株，37℃震荡培养12h(220rpm/min)。在4瓶200mL含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中转接2mL上述培养物，37℃震荡培养(220rpm/min)，分别培养到OD600nm值为0.2、0.4、0.6、0.8左右。分别从每管中取出100μL菌液，用无菌PBS进行适当倍数稀释后涂板计数，每板100μL，计算诱导前菌液浓度。然后将每瓶菌液分装到试管中，每管5mL，将培养温度升至42℃继续培养以诱导裂解基因的表达。每隔30min分别取出一管不同起始诱导浓度的菌液检测各培养物中OD600nm值，直至培养物的OD600nm值基本恒定为止。分别从每管中取出100μL菌液，用无菌PBS进行适当倍数稀释后涂板计数，每板100μL，计算诱导后活菌数。
4.菌体裂解率的计算
将升温诱导之前和诱导结束后的菌液分别用无菌PBS进行适当倍数稀释，均匀涂布于含有100ug/mL卡那霉素的LB固体培养基上，每板100μL，重复涂3个平板，37℃恒温箱培养24h，分别计算诱导前细菌数和诱导后细菌数。裂解效率＝(1－诱导之后CFU/诱导之前CFU)×100％。
5.重组质粒pPBA1100-E的遗传稳定性试验
将含有重组质粒pPBA1100-E的多杀性巴氏杆菌连续传代25代，通过PCR扩增裂解盒和升温诱导绘制裂解曲线两种方法检测原代、5代、10代、15代、20代、25代菌株中重组多杀性巴氏杆菌的遗传稳定性。
6.电镜观察多杀性巴氏杆菌菌影
将50mL诱导后的新鲜菌液4000rpm离心10min，加入2.5％的戊二醛溶液固定细菌沉淀，4℃放置2h，使用0.01mol/L PBS缓冲液洗涤三次，4000rpm离心10min后，再用四氧化锇固定，然后使用乙醇脱水和包埋剂包埋，经过上述步骤处理后，在扫描电子显微境下观察菌影。
实施例三：多杀性巴氏杆菌菌影疫苗的制备方法
(1)多杀性巴氏杆菌灭活疫苗的制备
将培养好的多杀性巴氏杆菌菌液6000g离心10min后弃上清，用PBS溶液重悬菌体至培养物浓度为2×109CFU/mL，然后加入0.3％体积的甲醛，37℃过夜灭活。使用三通将灭活后的菌液与等体积的ISA 206佐剂充分乳化混匀。
(2)多杀性巴氏杆菌菌影疫苗的制备
依据实施例二3和4的试验结果，选择裂解率最高时的诱导时间和起始诱导浓度进行诱导，将诱导后的菌液离心收集菌体沉淀。然后用无菌PBS重悬菌体，将菌体沉淀的一半用无菌PBS溶液稀释至浓度为1×109CFU/mL，另一半用无菌PBS稀释至浓度为2×109CFU/mL。浓度为2×109CFU/mL的菌影原液用与制备灭活疫苗同样的方法进行乳化备用。
(3)安全性试验
将制备的多杀性巴氏杆菌菌影疫苗和甲醛灭活疫苗各取100μL，分别接种在含有100μg/mL卡那霉素的LB固体平板和无抗性的LB固体平板上，置于37℃培养箱中培养48h，观察是否有细菌生长。
试验例一：多杀性巴氏杆菌菌影疫苗的免疫效力分析
(一)试验内容
1.免疫动物及攻毒试验
(1)免疫策略
取80只25g的昆明系小白鼠，随机分成4组，间隔两周连续接种两次，分组及免疫情况见表1。
表1免疫试验分组
(2)半数致死量(LD50)的测定
取25g龄的雌性昆明系小鼠40只分为4组，每组10只，攻多杀性巴氏杆菌分离菌株。共设4个稀释度1×105CFU、1×106CFU、1×107CFU、1×108CFU，腹腔注射攻毒，按照改良寇氏法算出LD50。
(3)攻毒试验
在第二次免疫14d后，用10倍LD50剂量的多杀性巴氏杆菌分离菌株对每个免疫组的10只小白鼠进行腹腔注射攻毒，攻毒后记录小白鼠的临床症状和死亡数量。攻毒7天后剖杀未死亡小鼠，并记录其病理变化。
(4)攻毒后脏器荷菌数的检测
将各组中攻毒7天后未死亡的小白鼠，在无菌条件下进行解剖，分别剪取一小块肝脏、脾脏和肺脏并称量其重量，将剪取的组织分别放于灭菌的研磨器中，加入1mL灭菌的PBS进行充分研磨。将研磨液用灭菌的PBS分别稀释至适当倍数后，均匀涂布于无抗性的LB固体培养基上，每个稀释度进行3个重复，置于37℃温箱中培养12～16h，计算单位重量各脏器中的活菌数。
2.小鼠血清中特异性抗体的检测
(1)多杀性巴氏杆菌超声破碎抗原的制备
将多杀性巴氏杆菌单个菌落接种于3mL LB液体培养基中，置于摇床中37℃摇动培养12h，取1mL培养物转接到100mL LB液体培养基中，置于摇床中37℃摇动培养12h，4000rpm离心30min后弃掉上清液，收集细菌沉淀，再用灭菌PBS将菌体清洗三遍，最后加入适量灭菌PBS缓冲液将菌体浓度调整至1×1010CFU/mL。再将制备好的浓缩抗原放置于冰浴中使用160W超声波间歇破碎30min。
(2)间接ELISA方法检测小鼠血清中IgG抗体的效价
a.在免疫前采血分离血清做阴性血清，在一免2周后，二免2周后采血分离血清检测小鼠血清中IgG抗体的水平，然后从二免后3周开始连续数周采集血液，每次间隔一周，检测小鼠血清中IgG抗体的消长趋势。本试验通过方阵滴定法筛选最佳的抗原包被浓度、最佳的血清稀释倍数等条件，具体步骤如下：
b.包被：用包被液将抗原进行适当倍数稀释后，加入酶标板反应孔中，100μL/孔，4℃包被酶标反应板12～16h，甩干后洗涤，每孔加入200μL洗涤液，每次洗3min，用力甩净酶标板中的液体，重复3次。
c.封闭：每孔加入200μL封闭液，37℃封闭2h，用力甩干，每孔加200μL洗涤液进行洗涤，每次洗3min，用力甩净酶标板中的液体，重复3次。
d.加血清样品：将血清用PBST稀释液按照一定倍数稀释后，100μL/孔，37℃反应最适时间、甩干。每孔加200μL洗涤液进行洗涤，每次3min，用力甩净酶标板中的液体，重复3次。
e.加酶标二抗：每孔加100μL经PBST稀释的酶标二抗，37℃作用1h，用力甩干。每孔加200μL洗涤液进行洗涤，每次3min，用力甩净酶标板中的液体，重复3次。
f.加显色液：每孔加TMB 50μL，37℃避光反应一定时间。
g.终止：每孔加入50μL终止液终止反应。
h.测值：用酶标仪450nm波长下测量OD值。
3.CD4+和CD8+T淋巴细胞的检测
每次免疫两周后每组处死5只小白鼠，取出脾脏，从脾脏中分离淋巴细胞，检测免疫后CD4+和CD8+T淋巴细胞的变化，淋巴细胞的分离步骤如下：
(1)将试验所需的剪刀、镊子、200目铜网等实验器械进行干热灭菌，在开始试验之前将所需试验用品放入超净工作台内紫外线照射30min。
(2)将小白鼠眼球摘除采血处死，置于75％酒精中灭菌5min。
(3)在超净工作台内解剖小白鼠，无菌操作采集脾脏，将脾脏放置在铜网上，先滴加2mL Hank，s液，使用注射器活塞将脾脏研碎，然后在逐渐加入5mL Hank，s液将脾脏充分研磨碎。
(4)先向15mL离心管中加入3mL淋巴细胞分离液，小心将3mL脾细胞悬液加在淋巴细胞分离液的表面，在室温下1500rpm水平离心30min。
(5)在离心完成后，小心将最上层液体吸取弃掉，直至2-3mm含有淋巴细胞白色不透明层。
(6)使用吸管吸取淋巴细胞层，将淋巴细胞层转移到一个新的15mL离心管中。
(7)向离心管中加入10mL等渗的PBS缓冲液，翻转离心管充分混匀。
(8)在室温下1000rpm离心10min，将上清液弃掉。
(9)加入1mL等渗的PBS缓冲液将淋巴细胞重新悬起，然后再加入4mL等渗的PBS缓冲液，在室温条件下1000rpm离心10min，弃掉上清液。
(10)重复步骤(9)
(11)向离心管中加入0.5mL等渗的PBS缓冲液将细胞沉淀重新悬起。
(12)取10μL淋巴细胞悬液，与等量的0.4％的台盼蓝混合染色，在显微镜下进行淋巴细胞计数。
(13)使用等渗的PBS缓冲液将淋巴细胞悬液浓度调整为5×106个/mL。
(14)取CD4+和CD8+抗体各6μL分别加入到100μL淋巴细胞悬液内，放置在4℃避光反应30min。
(15)用等渗的PBS缓冲液洗两遍，室温下3500rpm离心10min，弃掉上清液，用300μL等渗PBS缓冲液将沉淀充分悬起。
(16)使用流式细胞仪检测样品，cell quest软件分析结果。
4.血清中细胞因子的检测
(1)血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)检测
在二免2周后采血，分离血清，用小鼠细胞因子检测试剂盒对小鼠血清中细胞因子的含量进行定量检测，使用小鼠(Mouse)肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA检测试剂盒检测小鼠血清中TNF-α的含量，具体步骤如下：
a.在进行试验前30min取出试剂盒中的所有试剂，使其恢复至室温。
b.在每个反应孔中加入稀释后捕获抗体溶液，每孔100μL，封板，置于4℃中过夜孵育。
c.洗板4次，每次1min，每孔加200μL封闭液，封板，放在震动器上室温震动孵育1h。
d.洗板4次，每次1min，加入100μL标准品和检测样品在相应的孔中，封板，放在震动器上室温震动孵育2h。
e.洗板4次，每次1min，每孔加入100μL稀释后的检测抗体溶液，封板，放在震动器上室温震动孵育1h。
f.洗板4次，每次1min，每孔中加入100μL稀释后的标记亲和素溶液，封板，放在震动器上室温震动孵育30min。
g.洗板5次，每次0.5-1min，每孔中加入100μLTMB溶液，避光孵育15-30min，或者
直到变为想要的颜色。
h.在每孔中加入100μL终止液，在15min内读取波长为450nm和波长为570nm时吸光度值。570nm的吸光度值能够被从450nm吸光度值中减去。
(2)血清中γ-干扰素(IFN-γ)的检测：方法同(1)。
(3)血清中白细胞介素4(IL-4)的检测：方法同(1)。
(4)血清中白细胞介素10(IL-10)的检测：方法同(1)。
5.数据处理
应用SPSS(17.0)软件，通过Duncan形式对试验数据进行统计学分析。
(二)试验结果分析
1.裂解质粒pPBA1100-E的构建
(1)裂解盒CI857-PL-PR-E的扩增：以pHH43质粒为模板，扩增裂解盒的结果如图1，在1429bp处有一特异性条带出现，与目的片段大小相符。
(2)裂解质粒pPBA1100-E的PCR和双酶切鉴定：PCR扩增和酶切鉴定结果如图2，结果说明裂解盒CI857-PL-PR-E成功插入pPBA1100质粒。
(3)含有裂解质粒的重组多杀性巴氏杆菌的PCR鉴定结果：从转化后的多杀性巴氏杆菌中扩增得到约1429bp的裂解盒(如图3)和约457bp的多杀性巴氏杆菌KMT基因特异性片段(如图4)。结果证明成功构建了含有裂解质粒pPBA1100-E的重组多杀性巴氏杆菌菌株。
2.细菌裂解率影响因素的筛选
不同起始浓度的重组多杀性巴氏杆菌，42℃诱导不同时间，裂解效率如表3-1所示。结果表明当起始诱导浓度为0.2或0.4时，经诱导10h时裂解效率达到最高；随着起始浓度的升高裂解效率逐渐降低，当起始浓度为0.6到0.8时的裂解效率明显低于起始浓度为0.4时的裂解效率。
表1不同起始浓度和不同诱导时间菌液的裂解情况
注：+代表裂解率极低；++代表裂解率较低；+++代表裂解率较高；++++代表裂解率极高
3.裂解质粒的裂解水平检测
将含有裂解质粒pPBA1100-E的多杀性巴氏杆菌和不含有裂解质粒的多杀性巴氏杆菌分别在37℃培养至OD600nm值约为0.4左右，然后将含有裂解质粒的多杀性巴氏杆菌菌液分为两组，一组继续留在37℃中培养，作为对照组1，另一组将培养温度升至42℃进行诱导；将不含裂解质粒的多杀性巴氏杆菌的培养温度也升至42℃，作为对照组2。结果含裂解质粒pPBA1100-E的多杀性巴氏杆菌在42℃条件下诱导2h后，菌液OD600nm值达到最高，随后逐渐降低；对照组1菌液OD600nm值初期呈上升趋势，后期趋于平稳；对照组2菌液OD600nm值初期呈上升趋势，后期略有下降。结果如图5所示。试验结果表明本试验构建的裂解质粒pPBA1100-E对多杀性巴氏杆菌菌株具有较高的裂解水平。
4.裂解效率计算结果
将升温诱导之前和诱导结束后的菌液分别用无菌PBS进行105和102倍稀释，37℃恒温箱培养24h，分别计算诱导前细菌数和诱导后细菌数。裂解效率＝(1－6×102CFU/2.17×107CFU)×100％＝99.997％，即菌液经42℃诱导后有99.997％的细菌成功的被裂解。
5.重组质粒pPBA1100-E的稳定性试验结果
将含有重组质粒pPBA1100-E的多杀性巴氏杆菌连续传代25代，通过PCR方法扩增裂解盒，结果如图6所示，从不同代次的菌株中均扩增出特异性的条带，大小与目的片段相符。
分别将原代、5代、10代、15代、20代、25代含有质粒pPBA1100-E的重组多杀性巴氏杆菌菌株进行升温诱导绘制裂解曲线，结果如图7所示，不同代次菌株的裂解曲线基本相似，说明重组质粒pPBA1100-E能够稳定的存在于重组多杀性巴氏杆菌中。
6.菌影的扫描电镜观察结果
比较裂解前的正常多杀性巴氏杆菌和裂解后多杀性巴氏杆菌菌影的扫描电镜照片，如图8A和8B所示，裂解后的细菌保留了细菌的基本形态结构，在菌体中央可见明显的孔洞。
7.无菌检验
将制备的多杀性巴氏杆菌菌影疫苗和甲醛灭活疫苗各取100μL，分别进行活菌计数试验，置于37℃培养箱中培养48h后，二者均无细菌生长。
8.LD50的测定结果
用不同浓度多杀性巴氏杆菌分离菌株对雌性昆明系小鼠进行腹腔注射攻毒的结果如表2所示。
表2多杀性巴氏杆菌的攻毒结果
攻毒剂量/只 死亡数量 存活数量 死亡率
1×105CFU 3 7 30％
1×106CFU 4 6 40％
1×107CFU 8 2 80％
1×108CFU 10 0 100％
按照改良寇氏法的计算公式计算得到，LD50为1×106CFU，LD50的95％可信限为106.48，本试验采用10LD50，即1×107CFU进行攻毒。
9.攻毒保护性试验结果
PBS对照组攻毒后小鼠精神萎靡，食欲不振，行动迟缓，24～72h内陆续死亡，仅有2只存活。其他各试验组小鼠攻毒后也表现精神沉郁，食欲不振，多数3天后恢复正常，其中菌影组死亡2只，菌影加佐剂组未发生死亡，灭活苗组死亡3只。(如表3)
表3攻多杀性巴氏杆菌毒后各试验组的保护情况
组别 攻毒保护率％
菌影 80％(8/10)
菌影+佐剂 100％(10/10)
灭活苗 70％(7/10)
PBS对照组 20％(2/10)
10.攻毒后脏器荷菌数的检测结果
计算各组小鼠单位重量各脏器中的活菌数通过统计分析后得出：在肺脏中菌影组、菌影+佐剂组、灭活苗组与PBS对照组差异均极显著，菌影+佐剂组与菌影组和灭活苗组差异极显著，菌影组与灭活苗组差异不显著；在肝脏中四个试验组间差异均极显著；在脾脏中四个试验组间差异也极显著如图9所示。
11.小鼠血清中特异性抗体的检测结果
通过方阵滴定法确定全菌体超声破碎抗原的最佳包被浓度为1×107CFU/mL，最佳一抗稀释倍数为1:100，山羊抗鼠IgG的稀释倍数为1:3000。按照上述条件对免疫小鼠血清中IgG抗体水平进行检测。ELISA检测结果如表4-1，4-2所示，从ELISA检测结果可以看出与对照组相比，免疫组小鼠IgG抗体水平都明显升高，均在2免后第7周达到最高峰，之后略有下降；免疫效果从高到低排列依次为菌影+佐剂组、菌影组、灭活苗组、PBS对照组。从首免2周后至二免10周后经SPSS软件分析显示各组间差异均极显著。
表4-1小鼠血清中特异性抗体ELISA检测结果(OD450nm值)
注：同列数据标注不相同表示差异显著，小写字母不相同表示差异显著(P<0.05)，大写字母不相同表示差异极显著(P<0.01)
表4-2小鼠血清中特异性抗体ELISA检测结果(OD450nm值)
注：同列数据标注不相同表示差异显著，小写字母不相同表示差异显著(P<0.05)，大写字母不相同表示差异极显著(P<0.01)
12.小鼠脾脏淋巴细胞中CD4+和CD8+T细胞的动态变化
(1)脾脏中CD4+T细胞亚群占总淋巴细胞百分比的动态变化
由表5和图3-11可知，免疫后各试验组小鼠脾脏中CD4+T细胞亚群占总淋巴细胞百分比与对照组相比均呈上升趋势，在一免2周后和二免2周后各试验组间差异均极显著。
表5免疫小鼠脾脏中CD4+细胞亚群在总淋巴细胞中的百分比(±SD)
组别 一免2周后 二免2周后
菌影组 30.47±0.59A 39.41±0.73A
菌影+佐剂 32.13±0.48B 43.28±0.89B
灭活苗组 28.39±0.91C 35.74±0.73C
PBS对照组 23.52±0.43D 23.93±0.82D
注：同列数据标注不相同代表差异显著，小写字母不相同代表差异显著(P<0.05)，大写字母不同代表差异极显著(P<0.01)
(2)脾脏中CD8+T细胞亚群占总淋巴细胞百分比的动态变化
由表6和图12可知，免疫后各试验组小鼠脾脏中CD8+T细胞亚群占总淋巴细胞百分比与对照组相比略有上升趋势，在一免2周后和二免2周后各试验组间差异均极显著。
表6免疫小鼠脾脏中CD8+细胞亚群在总淋巴细胞中的百分比(±SD)
组别 一免2周后 二免2周后
菌影组 16.89±0.87A 17.83±0.94A
菌影+佐剂 17.34±0.63B 18.12±0.58B
灭活苗组 16.53±0.91C 17.57±0.42C
PBS对照组 15.89±0.77D 15.63±0.69D
注：同列数据标注不相同表示差异显著，小写字母不相同表示差异显著(P<0.05)，大写字母不同表示差异极显著(P<0.01)
13.血清中细胞因子的检测
(1)血清中TNF-α含量的测定
在二免两周后采集小鼠血液，分离血清，使用小鼠(Mouse)TNF-αELISA检测试剂盒检测小鼠血清中TNF-α的含量，结果如图13所示，与对照组相比菌影组、菌影+佐剂组和灭活苗组小鼠血清中TNF-α的含量均有明显的升高，TNF-α的含量从高至到低排列依次为菌影组、菌影+佐剂组、灭活苗组和对照组，各组间小鼠血清中TNF-α的含量差异极显著。
(2)血清中IFN-γ含量的测定
二免两周后，小鼠血清中IFN-γ含量测定结果如图14所示，与对照组相比菌影组、菌影+佐剂组和灭活苗组小鼠血清中TNF-α的含量均有明显的升高，IFN-γ的含量从高至到低排列依次为灭活苗组、菌影组、菌影+佐剂组和对照组，各组间小鼠血清中IFN-γ的含量差异极显著。
(3)血清中IL-4含量的测定
二免两周后，IL-4水平结果如图15所示，与对照组相比菌影组、菌影+佐剂组和灭活苗组小鼠血清中IL-4的含量均有明显的升高，IL-4的含量从高至到低排列依次为菌影+佐剂组、菌影组、灭活苗组和对照组，各组间小鼠血清中IL-4的含量差异极显著。
(4)血清中IL-10含量的测定
二免两周后，小鼠血清中IL-10的含量如图16所示，与对照组相比只有菌影+佐剂组小鼠血清中IL-10的含量有明显的升高，菌影组和灭活苗组小鼠血清中IL-10的含量均低于对照组，IL-10的含量从高至到低排列依次为菌影+佐剂组、对照组、菌影组和灭活苗组，各组间小鼠血清中IL-10的含量差异极显著。
综上所述，本试验成功构建了裂解质粒pPBA1100-E，该质粒能够高效裂解多杀性巴氏杆菌。同时制备的多杀性巴氏杆菌菌影可为试验小白鼠提供良好的免疫保护，为进一步研制多杀性巴氏杆菌菌影疫苗奠定了基础。

Claims (6)

1.一种多杀性巴氏杆菌菌影疫苗的制备方法，其特征在于：选择裂解率最高时的诱导时间和起始诱导浓度进行诱导，将诱导后的菌液离心收集菌体沉淀，然后用无菌PBS重悬菌体。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：将重悬的菌体沉淀用无菌PBS溶液稀释至浓度为1×109 CFU/mL。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：将重悬的菌体沉淀用无菌PBS稀释至浓度为2×109 CFU/mL，加入0.3 %体积的甲醛，37 ℃过夜灭活。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：将灭活后的菌液与等体积的ISA 206佐剂充分乳化混匀。
5.一种多杀性巴氏杆菌菌影疫苗的免疫效力分析方法，其特征在于，所述方法具有如下步骤：将25 g的雌性昆明系小白鼠，间隔两周连续接种两次；在免疫前采血分离血清做阴性血清，在一免2周后，二免2周后采血分离血清利用间接ELISA方法检测小鼠血清中IgG抗体的水平，同时使用细胞因子检测试剂盒检测二免两周后各组小鼠血清中IL-4、和IFN-γ的含量；然后从二免后3周开始连续数周采集血液，每次间隔一周，检测小鼠血清中IgG抗体的消长趋势；每次免疫两周后每组处死5只小白鼠，无菌取出脾脏，从脾脏中分离淋巴细胞，检测免疫后CD4+和CD8+ T淋巴细胞的动态变化；在二免2周后用多杀性巴氏杆菌对试验小白鼠进行攻毒，攻毒后记录其的存活率。
6.如权利要求1所述的一种多杀性巴氏杆菌菌影疫苗在预防动物巴氏杆菌病方面的应用。
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