CN108310373A - 猪大肠杆菌菌影的制备及其免疫效力分析 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了提供一种猪大肠杆菌菌影的制备及其免疫效力分析的方法，从而成功制备出可以稳定遗传的产肠毒素性大肠杆菌菌影，并且还发现添加了佐剂的菌影疫苗可激发小鼠产生特异性细胞免疫和体液免疫，为进一步研制和开发大肠杆菌新型疫苗及新型佐剂进行前期的探索。本试验对更深入的研究猪ETEC菌影疫苗提供了一个较好的平台。

Description

猪大肠杆菌菌影的制备及其免疫效力分析
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种猪大肠杆菌菌影的制备及其免疫效力分析方法
背景技术
产肠毒素性大肠杆菌(enterotoxigenic E.coli，ETEC)是引起人和幼畜肠道发生腹泻的主要病原体之一。初生仔猪感染产肠毒素性大肠杆菌后发病率和死亡率都很高。迄今为止，预防该病的疫苗主要包括传统的黏附素疫苗、肠毒素类疫苗和基因工程疫苗等，由于其免疫效果差或毒性反噬的存在，不能有效的控制该病。
菌影(bacterial ghosts)又称菌蜕，是一种新型的疫苗及佐剂形式，是无繁殖能力、缺乏细胞浆和核酸的细菌空壳，通过噬菌体PhiX174的裂解基因E在革兰氏阴性菌内表达而形成。裂解基因E表达后，细菌的内外膜融合形成跨膜孔道，在渗透压的作用下，细菌基因组和胞浆等内容物通过跨膜孔道排出，留下细菌空壳，即形成一种空的“菌影”。相对于传统灭活疫苗来说，它的表面抗原结构得到最大程度的保留，免疫原性高，并可在其内部及外膜上负载外源抗原，成为优良的抗原递送载体，同时为联合疫苗的研究提供研究平台；在致病性微生物越来越难以控制的今天，菌影系统开始受到国内外研究者的关注。
细菌菌影作为新型疫苗，因其保留了细菌天然的表面抗原和结构，可诱导机体产生较强的细胞免疫、体液免疫及黏膜免疫；同时菌影疫苗安全性高，制备简单且保存方便，所以研制猪ETEC菌影疫苗成为防控该病的最佳选择。
发明内容
本发明针对现有疫苗技术的不足，目的在于提供一种猪大肠杆菌菌影的制备及其免疫效力分析的方法，从而成功制备出可以稳定遗传的产肠毒素性大肠杆菌菌影。并且还发现添加了佐剂的菌影疫苗可激发小鼠产生特异性细胞免疫和体液免疫。为进一步研制和开发大肠杆菌新型疫苗及新型佐剂进行前期的探索。
为实现上述发明目的，本发明采用的具体的技术方案为：
一种猪大肠杆菌菌影的制备及其免疫效力分析方法，具体包括：将含有噬菌体PhiX174的裂解基因E和CI857-PL-PR温控启动阻遏系统的表达载体pHH43，采用电击穿孔法转入ETEC中，成功构建重组的致病性ETEC。该重组菌37℃培养至OD600nm值为0.6时，升温至42℃进行细菌裂解基因的表达；利用平板计数法进行裂解前后的活菌计数，并计算裂解效率达99.93％。透射电子显微镜观察，可见裂解后细菌仍保留原有形态结构，细菌内容物被排出，内部呈空洞，即为细菌空壳，成功制得猪ETEC菌影。随后对制备的ETEC菌影疫苗进行免疫效力评价，对150只25g的雌性昆明系小鼠进行免疫试验，观察小鼠的免疫能力。
上述方案中，所述的猪大肠杆菌菌影的制备步骤如下：
(1)将含有噬菌体PhiX174的裂解基因E和CI857-PL-PR温控启动阻遏系统的表达载体pHH43，采用电击穿孔法转入ETEC中，成功构建重组的致病性ETEC。
(2)将步骤(1)制得的重组菌37℃培养至OD600nm值为0.6时，升温至42℃进行细菌裂解基因的表达，制备牛ETEC菌影。
(3)利用平板计数法进行裂解前后的活菌计数，并计算裂解效率达99.93％。
(4)透射电子显微镜观察，可见裂解后细菌仍保留原有形态结构，细菌内容物被排出，内部呈空洞，即为细菌空壳。
上述方案中，所述制备菌影的方法具体包括如下步骤：
(1)猪大肠杆菌感受态的制备
取冻干的猪大肠杆菌菌用PBS稀释后涂到LB平板上，37℃培养，挑取单个菌落在3mL的LB液体培养基中，37℃200rpm过夜震荡培养；过夜培养物取出2mL接种于100mL的LB液体培养基中，37℃摇床中培养至OD600nm为0.4左右；冰浴30min后，4℃，4000rpm，离心10min，弃上清液；用提前预冷的灭菌的去离子水沉淀洗涤，4000rpm，4℃，离心10min，弃上清液；重复操作一次；再用提前预冷的10％的灭菌甘油洗涤菌体2次，4000rpm，4℃，离心10min，弃上清；用10％的预冷无菌甘油重悬菌体至最终体积为2～3mL，混匀后分装200μL/管，-80℃冰箱备用保存。
(2)裂解质粒pHH43的电转化和鉴定
将步骤(1)制得的ETEC感受态细胞取出冰上融化，取1uL裂解质粒pHH43加入到细胞中，立即倒入预冷的电转杯，冰浴10min；设置电转仪电击参数，电击后取出电转杯，迅速加入提前预热的800μL无抗性LB液体培养基，180rpm，37℃摇动培养1h；室温下4000rpm离心5min，并弃掉900μL上清，剩下的100μL液体将细菌沉淀悬起，然后涂在含有34μg/mL氯霉素的LB固体平板上，37℃过夜培养。挑出单菌落于37℃摇床中摇至混浊，对菌液PCR鉴定，鉴定出正确的阳性菌株，即就证明裂解质粒pHH43成功电转入猪大肠杆菌中。
(3)裂解条件的优化
将含有裂解质粒pHH43的猪大肠杆菌菌株37℃震荡培养10h(200rpm)，随后转接到含34μg/mL氯霉素的LB液体培养基，37℃摇床中震荡培养(220rpm)，使其初始浓度分别为0.4、0.6、0.8、1.0和1.2，同时对培养基的不同含量(2/3、3/4、4/5和正常含量)进行筛选。42℃升温诱导后，每15min取出1mL菌液，进行OD值的测定，并稀释涂LB平板进行菌落计数，计算出诱导前和诱导后的活菌数。
(4)裂解率的计算
将诱导前、后的菌液分别用无菌PBS或培养液进行适当倍数稀释，然后均匀的涂在含有34μg/mL氯霉素的LB固体培养基上，每个固体平板涂抹100μL菌液，37℃恒温箱过夜培养后，算出裂解前后的细菌数。裂解效率＝(1－诱导之后CFU/诱导之前CFU)×100％。
(5)猪大肠杆菌菌影透射电镜观察
取出100mL裂解后的菌液，4000rpm，4℃下离心10min，用2.5％的戊二醛固定，4℃条件下放置2h，然后用0.01mol/L的PBS洗涤，4000rpm，离心10min，再用四氧化锇固定，最后将其脱水和包埋，处理后在透射电镜下观察。
上述方案中，所述的制备猪大肠杆菌菌影疫苗的方法如下：
(1)灭活疫苗的制备：将猪大肠杆菌菌液提前制备所需要的数量，然后将菌液常温下5000g离心10min后，去上清，用移液器吸取20mL的无菌PBS溶液加入其中后，再次重悬菌体，最后再进行离心，去上清，清洗菌体后加入适当的无菌PBS溶液至培养物浓度为1×1010CFU/mL，最后按照提及的比例，向其加入0.3％体积的甲醛，37℃恒温箱中过夜灭活。经鉴定完全灭活后，将灭活后的疫苗与等体积的206佐剂混合，利用三通将两种试剂充分混匀，直到加入水中1min内不扩散即可定为混合均匀。
(2)菌影疫苗的制备：将提前制备出的猪大肠杆菌菌液放置42℃的摇床内诱导培养2h后(诱导前后各取少量菌液进行活菌计数)，4000g离心10min，弃上清。用无菌去离子水离心洗涤后冻干保存，使用时取20mL灭菌的PBS溶液，将菌影溶解吹打重悬，最后将菌体沉淀用灭菌的PBS稀释到5×109CFU/mL，而另一半则用无菌PBS稀释到1×1010CFU/mL，最后再用与制备灭活苗相同的方法，把浓度为1×1010CFU/mL的菌影原液与206佐剂进行乳化后，放置于4℃保存备用。
上述方案中，所述的对制备的猪大肠杆菌菌影疫苗进行免疫效力分析方法如下：
(1)将150只25g的雌性昆明系小鼠随机分成10组，每组15只，每次免疫间隔14天，连续免疫两次，一免后每隔一周对小鼠进行唾液、粪便和血清的样品收集；
(2)利用间接ELISA方法对唾液和粪便样品进行sIgA的检测，结果表明小鼠唾液中产生的抗体水平较低，但粪便中的抗体水平高于唾液中，且组间差异(P<0.05)显著，且菌影+佐剂组最高；
(3)利用间接ELISA方法对血清样品进行IgG检测，结果表明菌影+佐剂组抗体水平较高，菌影+佐剂组三组和菌影组四组之间差异不显著，但是与其它三组之间相比较都是差异显著(P<0.05)；
(3)血清TNF-α、IFN-γ和IL-4测定结果表明，三种细胞因子的含量均是菌影+佐剂组含量相对较高，与其它几组之间相较差异极显著(P<0.01)；而菌影组与灭活苗组之间也是差异极显著(P<0.01)，说明佐剂能够增强菌影疫苗的免疫效果。
(4)初免两周和二免两周后取脾脏分离淋巴细胞，用流式细胞仪来检测脾脏中CD8+和CD4+细胞动态变化，结果表明：注射菌影+佐剂疫苗后的小鼠脾脏中CD4+和CD8+ T细胞亚群占总淋巴细胞的百分比相较与其它几组差异显著(P<0.05)，其有增强免疫效果的能力。
(5)小鼠腹腔攻毒保护试验结果表明，菌影+佐剂疫苗组保护效率达100％，而菌影组达80％。这说明添加佐剂的菌影疫苗对小鼠机体产生更好的保护力。
(6)对小鼠特异性抗体的持续期进行检测，发现在免疫后第七周抗体效价达到最高，第八周后开始下降。
本发明有益效果在于：
本试验成功制备出可以稳定遗传的产肠毒素性大肠杆菌菌影；其中添加了206佐剂的菌影疫苗保护效果为100％，且可激发小鼠产生特异性细胞免疫和体液免疫，能有效的保护小鼠免受ETEC的攻击。本试验对更深入的研究猪ETEC菌影疫苗提供了一个较好的平台。因此是预防猪的产肠毒素性大肠杆菌的最佳选择。
附图说明：
图1为裂解质粒pHH43转入猪大肠杆菌的PCR鉴定结果；
其中1：裂解质粒pHH43的PCR结果；2：阴性对照组；M：DL 2000DNA Marker；
图2为不同初始浓度和不同培养基含量诱导下的裂解情况；
其中A：培养基含量为正常量的2/3，B：培养基含量为正常量的3/4，C：培养基含量为正常量的4/5，D：培养基含量为正常量；
图3为裂解曲线的绘制结果；
图4为含裂解质粒pHH43的猪大肠杆菌的裂解曲线；
图5为含有裂解质粒的菌液的不同代次的PCR扩增结果；
其中1：原代；2:10代；3:20代；4:30代5：阴性对照M：DL 5000DNA Marker；
图6为菌影透射电镜照片；
其中A:正常的猪大肠杆菌；B:裂解后的猪大肠杆菌；
图7为免疫小鼠脾脏中CD8+细胞亚群在总淋巴细胞中的百分比；
图8为免疫小鼠脾脏中CD4+细胞亚群在总淋巴细胞中的百分比；
图9为TNF-α的检测结果；
图10为IFN-γ的检测结果；
图11为IL-4的检测结果；
图12为攻毒后肺脏、肝脏和小肠荷菌数。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面将结合实施例对本发明的实施方案作进一步详细的说明，但本发明内容不仅仅局限于下面的实施例。在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或变化都将落入本发明的权利要求范围之内。
实施例一：猪大肠杆菌菌影的制备
(一)材料
1.菌株、质粒和试验动物：
猪大肠杆菌菌株由506实验室分离保存，pHH43裂解质粒，是哈尔滨兽医研究所惠赠。体重为25g左右的雌性昆明系小鼠150只，购自长春生物制品研究所。
2.主要药品及试剂：
DNA2000Marker均购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒购自AXYGEN公司；氯霉素购自上海生物工程公司；小鼠TNF-α细胞因子检测试剂盒、小鼠IL-4细胞因子/IFN-γ细胞因子检测试剂盒均购自AXYGEN公司；小鼠Rat IgG2b R-PE/IgG2a FITC Conjugate、Mouse CD8aR-PE/CD4 FITC Conjuga均购自深圳欣博盛生物科技有限公司；TMB购自AMRESCO公司；羊抗鼠IgG/IgA/HRP，购自SIGMA公司；酶标板，购自加拿大JET公司。
(二)猪大肠杆菌菌影的制备方法
1.猪大肠杆菌感受态的制备
(1)将冻干的猪大肠杆菌菌株从-80℃冰箱取出，用灭菌的PBS稀释后涂到LB平板上，37℃培养。
(2)用小枪头挑取平板上长出的单个菌落，并将其接种3mL的LB液体培养基中，37℃摇床中震荡放置10h，200rpm。
(3)将3mL过夜培养物取出2mL接种于100mL的LB液体培养基的锥形瓶中，37℃摇床中培养至OD600nm为0.4左右。
(4)将上步骤(3)中培养好的100mL液体培养基菌液放入制的冰上，30min后取出，加入到离心管中，4℃，4000rpm，离心10min，弃上清液。
(5)将试验(4)中离心后剩下的沉淀洗涤，将灭菌的去离子水提前制冷，吸取适当的量后将沉淀悬浮，4000rpm，4℃，离心10min，弃上清液。
(6)重复上一步骤。
(7)将提前预冷的10％的灭菌甘油取出20mL来洗涤菌体2次，然后进行4000rpm，4℃，离心10min，弃上清。
(8)最后用10％的预冷无菌甘油重悬菌体至最终体积为2～3mL。
(9)将上一步重悬的菌体混匀，并均匀的分装到相应的EP管中，200μL/管，-80℃冰箱备用保存。
2.裂解质粒pHH43的电转化和鉴定
(1)从-80℃冰箱中取出1步骤中提前准备好的感受态细胞，并将其放到冰上待其融化，然后用10uL的移液枪取1uL裂解质粒pHH43加入ETEC感受态中，立即加入到提前在冰箱制冷的电转杯中，然后再制得冰上制冷10min。
(2)设置电转仪的点击参数，电压2.5KV，电阻200Ω，电容25μL，4.9ms。
(3)将电转杯正确的放入电转仪中，按一下开始键，瞬间电击后，取出电转杯，迅速向其加入提前预热的800μL无抗性LB液体培养基，180rpm，37℃摇动培养1h。
(4)将摇床中的EP管取出，室温下4000rpm离心5min，并弃掉900μL上清，用剩下的100μL液体将细菌沉淀悬起，然后均匀的涂在含有34μg/mL氯霉素的LB固体平板上，37℃过夜培养。
(5)第二天，将温箱中的氯霉素平板取出，任意挑取平板长出的单菌落，37℃摇床中摇至混浊。
(6)将摇起的菌液分别进行菌液PCR鉴定，鉴定出正确的阳性菌株，即就证明裂解质粒pHH43成功电转入猪大肠杆菌中。
3.裂解条件的优化
在3mL含34μg/mL氯霉素的LB液体培养基中接种含有裂解质粒pHH43的猪大肠杆菌菌株，37℃震荡培养10h(200rpm/min)。取1瓶50mL含34μg/mL氯霉素的LB液体培养基，并向其中转接1mL，37℃摇床中震荡培养，每分钟220rpm，使其初始浓度分别为0.4、0.6、0.8、1.0和1.2，同时对培养基的不同含量(2/3、3/4、4/5和正常含量)进行筛选。分别从每组试管中取出100μL菌液，然后用无菌PBS进行稀释，同时将上述初始浓度分别进行转接培养，42℃升温诱导后，每15min取出1mL菌液，进行OD值的测量，并稀释涂LB平板进行菌落计数，计算出诱导前和诱导后的活菌数。
4.裂解率的计算
将诱导前和诱导后的菌液分别用无菌PBS或培养液进行适当倍数稀释，然后均匀的涂在含有34μg/mL氯霉素的LB固体培养基上，每个固体平板涂抹100μL菌液，37℃恒温箱过夜培养后，算出裂解前后的细菌数。裂解效率＝(1－诱导之后CFU/诱导之前CFU)×100％。
5.猪大肠杆菌菌影透射电镜观察
取出100mL裂解后的菌液，4000rpm，4℃条件下，离心10min，用2.5％的戊二醛固定，4℃条件下放置2h，然后用0.01mol/L的PBS洗涤，4000rpm，离心10min，再用四氧化锇固定，最后将其脱水和包埋，处理后在透射电镜下观察。
实施例二：猪大肠杆菌菌影疫苗的制备
(1)灭活疫苗的制备：
将猪大肠杆菌菌液提前制备所需要的数量，然后将菌液常温下5,000g离心10min后，去上清，用移液器吸取20mL的无菌PBS溶液加入其中后，再次重悬菌体，最后再进行离心，去上清，清洗菌体后加入适当的无菌PBS溶液至培养物浓度为1×1010CFU/mL，最后按照提及的比例，向其加入0.3％体积的甲醛，37℃恒温箱中过夜灭活。将灭活后的疫苗与等体积的206佐剂混合，利用三通将两种试剂充分混匀，直到加入水中1min内不扩散即可定为混合均匀。
(2)菌蜕疫苗的制备：
将提前制备出的猪大肠杆菌菌液放置42℃的摇床内诱导培养2h后(诱导前后各取少量菌液进行活菌计数)，4000g离心10min，弃上清。用无菌去离子水离心洗涤后冻干保存，使用时取20mL灭菌的PBS溶液，将菌影溶解吹打重悬，5000g离心10min，弃上清，最后将菌体沉淀用灭菌后的PBS水稀释到5×109CFU/mL，而另一半则用无菌PBS稀释到1×1010CFU/mL，最后再用与制备灭活苗相同的方法，把浓度为1×1010CFU/mL的菌影原液与206佐剂进行乳化后，放置于4℃保存备用。
(3)安全性试验
将制备好的猪大肠杆菌菌影疫苗和甲醛灭活疫苗分别取出100μL，并分别将它们接种在含有34μg/mL氯霉素的LB平板和无任何抗性的LB固体平板上，然后将它们放入37℃恒温箱中培养2-3天，每天仔细观察平板中是否有细菌生长。
试验例一：对制备的猪大肠杆菌菌影疫苗进行免疫效力分析
(一)试验方法
1.动物免疫
1.1免疫程序及分组
取150只5周龄的雌性昆明系小鼠，将其随机分成10个小组，做好标记，接种时，每次间隔两周，其中口服免疫前禁饲4～6h，期间保证充足饮水。
表1免疫试验分组
*口服不加佐剂
1.2半数致死量(LD50)的测定
取6周龄的雌性昆明系小鼠50只，将其随机分成五组，每组10只，攻猪大肠杆菌菌液。攻毒的计量分别为1×106CFU、1×107CFU、1×108CFU、1×109CFU和1×1010CFU，根据寇氏法计算LD50。
2.小鼠血清、唾液和粪便中特异性抗体的检测
2.1猪大肠杆菌超声抗原的制备
将猪大肠杆菌菌液活化2mL后，全部转接到100mL LB液体培养基锥形瓶中，放到摇床中37℃不停地摇动培养12h左右，然后在4℃离心机中4000rpm离心30min后，弃掉上清液，最后提取沉淀，用PBS洗涤后，并用其调整菌体浓度为1×1010CFU/mL。最后再冰浴过程超声破碎30min。
2.2间接ELISA方法检测小鼠黏膜样品唾液与粪便中抗体sIgA的检测
(1)唾液的采集和处理：用眼科镊夹取高温湿热灭菌后并烘干的脱脂棉球在小鼠的口腔中旋转若干次，放入含200μL PBS和20μg/mL抑肽酶的1.5mL EP管中，在室温下10000rpm离心10min，用移液枪吸出上清后，将其转至新灭菌消毒后烘干的2mL EP管中，置-80℃保存备用。
(2)粪便的采集与处理：用镊子夹取粪便放入含有0.05mol/L的EDTA-Na2的PBS粪便提取液中(每500μL粪便提取液加入0.1g粪便)，置于4℃冰箱12h。再将样品12,000r/min离心10min，收集上清。
(3)将阴性对照组的唾液与粪便采集并分离，然后第一次接种免疫14天后、第二次接种免疫14天后分离唾液和粪便检测小鼠中sIgA抗体的水平。具体步骤如下：
a.包被：用包被液将所用抗原进行适当的倍数稀释后，逐一加入酶标板反应孔中，100μL/孔，然后4℃过夜包被酶标反应板，第二天取出甩干后洗涤，每孔加入200μL洗涤液，每次震荡清洗5min，然后用力甩净酶标板中的液体，此过程需要重复3次。
b.封闭：用移液枪吸取封闭液，向酶标板中每孔加入200μL，然后放入37℃恒温箱中封闭2h，用力甩干，再向每孔中加入200μL洗涤液进行洗涤，重复三次，每次震荡5min。
c.加样品：将样品用PBST稀释液稀释，按照一定倍数稀释后，100μL/孔，在37℃恒温箱中反应最适时间，然后用力甩干。然后每孔加200μL洗涤液进行洗涤，每次震荡5min，用力甩净酶标板中的液体，重复3次。
d.加酶标二抗：用PBST稀释酶标二抗，然后每孔加入100μL，37℃孵育1h，然后用洗涤液洗涤，重复三次，每次震荡洗涤5min。
e.加显色液：每孔加TMB50μL，37℃避光反应一定时间。
f.终止：每孔加入50μL终止液终止反应。
g.测值：用酶标仪450nm波长下测量OD值。
2.3间接ELISA方法小鼠血清中抗体IgG的检测
(1)小鼠血清的采集：将小鼠断尾后采集血200μL于1.5mL EP管中，将所采的血液放到37℃温箱中1h，然后放入4℃冰箱静置过夜，3000r/min离心10min，之后继续以10000r/min离心2min，用移液枪慢慢的吸取EP管中的透明血清，然后放置于-80℃冰箱中保存备用。
(2)将阴性对照组血清提前采集，分别在第一次和第二次免疫7天、14天后，断尾收集小鼠血清，并进行抗体检测，从第二次免疫14天后，连续不间断的断尾采血至第八周，检测免疫效果的持续性。方法同2.2。
3.CD4+和CD8+ T淋巴细胞的检测
将一免和二免后两周的小鼠每组处死5只，取剪刀和镊子挑取小鼠脾脏，将其研磨后分离淋巴细胞，进行CD4+和CD8+ T淋巴细胞的检测，并观察其变化：
(1)在试验前提前准备将试验所需的剪刀、镊子、200目铜网等试验器械进行干热灭菌，然后将试验用品提前放入到超净台内紫外线照射30min。
(2)用灭菌的镊子将小白鼠眼球摘除后，采血处死，置于75％酒精中浸泡5min灭菌。
(3)在超净台内解剖小白鼠，需无菌操作采集脾脏，然后将脾脏放置在铜网上，滴加2mL Hank’s液，用注射器活塞将脾脏研碎，然后在逐渐加入5mL Hank’s液将脾脏充分研磨碎。
(4)向离心管中加入3-5mL小鼠脾脏淋巴细胞分离液，慢慢的将3mL脾细胞悬液加入到淋巴细胞分离液的表面，在室温下1500rpm水平离心30min。
(5)离心后，慢慢将最上层液体吸取弃掉，直至2～3mL含有淋巴细胞白色不透明层。
(6)吸取淋巴细胞层，将淋巴细胞层转移到一个新的离心管中。
(7)将10mL等渗的PBS缓冲液加入离心管中，翻转离心管充分混匀。
(8)在室温状态下1000rpm离心10min，弃上清液。
(9)加入1mL等渗的PBS缓冲液将淋巴细胞重新悬起，然后再加入4mL等渗的PBS缓冲液，在室温下1000rpm离心10min，弃上清。
(10)重复上一步。
(11)向离心管中加入500μL等渗的PBS缓冲液将细胞沉淀重新悬起。
(12)取10μL淋巴细胞悬液，滴到细胞计数板上，在细胞计数仪器上进行淋巴细胞计数。
(13)用PBS缓冲液将淋巴细胞充分悬起，放到细胞技术仪器上测量，使悬液浓度为5×106个/mL。
(14)取CD4+抗体和CD8+抗体各10μL分别加入到淋巴细胞悬液中，4℃冰箱避光30min。
(15)用等渗的PBS缓冲液洗两遍，室温下3500rpm离心10min，弃掉上清液，用500μL等渗PBS缓冲液将沉淀充分悬起。
(16)使用流式细胞仪器检测样品，并分析结果。
4.血清中细胞因子的检测
4.1血清中肿瘤坏死因子(TNF-α)的检测在二免2周后进行采血，然后分离血清，使用细胞因子检测试剂盒对小鼠血清中细胞因子的含量进行定量检测，使用小鼠(Mouse)肿瘤坏死因子(TNF-α)ELISA检测试剂盒检测小鼠血清中TNF-α的含量，具体步骤如下：
(1)在试验开始前30min将试剂盒取出，放置实验台。
(2)在每个反应孔中加入稀释后捕获抗体溶液，每孔100μL，封板，置于4℃中过夜孵育中。
(3)洗板4次，每次震荡洗涤1min，每孔加200μL封闭液，封板，放在振动器上室温震动孵育1h。
(4)洗板4次，每次震荡洗涤1min，加入100μL标准品和检测样品在相应的孔中，封板，放在震动器上室温震动孵育2h。
(5)洗板4次，每次震荡洗涤1min，每孔加入100μL稀释后的检测抗体溶液，封板，放在震动器上室温震动孵育1h。
(6)洗板4次，每次震荡洗涤1min，每孔中加入100μL稀释后的标记亲和素溶液，封板，放在震动器上室温震动孵育30min。
(7)洗板5次，每次震荡洗涤1min，每孔中加入100μLTMB溶液，避光孵育15～30min，或者直到变为想要的颜色。
(8)在每孔中加入100μL终止液，在15min内读取波长为450nm和波长为570nm时吸光度值。570nm的吸光度值能够被从450nm吸光度值中减去。
4.2血清中γ-干扰素(IFN-γ)的检测方法：同(TNF-α)的检测
4.3血清中白细胞介素4(IL-4)的检测方法：同(TNF-α)的检测
5.攻毒试验
用灭菌的0.05mol/L PBS将猪大肠杆菌稀释至10LD50/100μL。二免两周后进行攻毒试验，每天观察小鼠的状态变化和死亡时间与数量，未死亡的小鼠要进行剖检，看其内脏器官的病理变化。
6.攻毒后各脏器荷菌数的检测试验
将各组中攻毒7天后未死亡的小白鼠，在无菌条件下进行解剖，分别剪取一小块小肠、脾脏、肺脏和肝脏并称量其重量，将剪取的组织分别放于灭菌的研磨器中，加入1mL灭菌的PBS进行研磨。将研磨液用灭菌的PBS分别稀释至适当倍数后，均匀涂布于无抗性的LB固体培养基上，每个稀释度都需要进行3个重复试验，37℃恒温箱中培养16h，第二天，计算出单位重量的器官菌落数。
(二)试验结果分析
数据统计分析用SPSS Version 17.0.软件进行数据的方差分析，以P值小于0.05为差异显著。
1.裂解质粒pHH43成功转入猪大肠杆菌的PCR鉴定结果
将裂解质粒pHH43电转入猪大肠杆菌中，菌液PCR成功扩增出大小约为1429bp片段(如图1)，表明裂解质粒pHH43成功转入到猪大肠杆菌中。
2.细菌裂解率影响条件的筛选
在不同初始浓度和不同培养基含量的条件下，42℃诱导表达2h后，观察结果如图2所示(从左至右依次为对照、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2)。当培养基的含量为3/4，诱导后2h后溶液比较澄清，且有明显的白色絮状物。
不同起始浓度的猪大肠杆菌在42℃下诱导，不同时间内，裂解率见表2：当初始浓度是0.4或0.6时，裂解2h后，裂解效率可达到最高；当初始浓度为0.8、1.0和1.2时，裂解率明显较前者低，而起始浓度为0.6，裂解时间为2h时，裂解效率最好，也最高。
表2不同起始浓度和不同诱导时间菌液的裂解情况
注：+裂解率极低；++裂解率较低；+++裂解率较高；++++裂解率极高
对培养基的含量为3/4，起始浓度分别为0.4和0.6时绘制裂解曲线分析，结果见图3，当培养基的初始浓度为0.6时，此时裂解曲线比较平稳，并且OD600nm值也比较低，相应的菌落数也较少，因此起始浓度为0.6时为最佳起始浓度。
3.含有裂解质粒菌液的裂解生长曲线
将重组的猪大肠杆菌与正常猪大肠杆菌37℃培养，OD600nm值0.6时，将正常猪大肠杆菌分成两部分，对照1是继续在37℃培养，对照2是在42℃进行诱导；同时将重组的猪大肠杆菌的也分为两组，一组37℃培养，即对照3，一组42℃诱导。试验结果表明，重组的猪大肠杆菌在42℃升温诱导15min后，OD600nm值达最高，之后2h内逐渐下降，趋于平稳。对照3一直呈上升趋势。对照组1、对照组2和对照组3相似，均呈现上升趋势，表明裂解质粒的转入未影响ETEC的增殖。(如图4)
4.裂解效率的计算结果
将诱导前和升温诱导后的菌液分别用无菌PBS进行稀释，相应的稀释倍数分别为105和103倍，然后放入37℃恒温箱中过夜培养，并计算出菌落总数，进行重复三次试验后取平均值，即裂解率＝1-4.8×103/7.0×106＝99.93％。
5.含有裂解质粒pHH43菌液的稳定性结果
本试验将重组的猪大肠杆菌进行连续传代30代，运用PCR扩增CI857-PL-PR-E裂解盒，如图5所示，不同代次的菌液PCR扩增后，得到了与原代大小相同的目的片段。
6.菌影的透射电镜结果
比较裂解前的正常猪大肠杆菌和裂解后猪大肠杆菌菌影的透射电镜结果，如图6所示，裂解后的猪大肠杆菌可看到细菌内部几乎没有细胞核、细胞质等内容物，但仍保留了细菌的基本形态。
7.无菌检测结果
将制备的猪大肠杆菌菌影疫苗和甲醛灭活疫苗各取100μL，分别进行活菌计数试验，试验需要做3个重复，然后将平板放于37℃恒培养箱中培养48～72h后，结果发现两种疫苗都没有细菌长出。
8.LD50测定结果
LD50测定结果如表3所示，按照改良寇氏法的计算公式计算得到，LD50为1×108CFU，LD50的95％可信限为108.65，本试验采用10LD50，即1×109CFU进行攻毒。
表3 ETEC的攻毒结果
攻毒剂量/只 死亡数量 存活数量 死亡率
1×106CFU 0 10 0
1×107CFU 3 7 30％
1×108CFU 6 4 60％
1×109CFU 8 2 80％
1×1010CFU 10 0 100％
9.小鼠血清中特异性抗体IgG的检测结果
通过方阵滴定法确定全菌超声破碎抗原的最佳包被浓度为1x108CFU/mL，一抗最佳稀释倍数为1:100，山羊抗鼠IgG的稀释倍数为1:5000。根据上述方法对免疫后的小鼠进行血清中IgG水平的检测。ELISA检测结果如表4-1和4-2所示，与对照组相比，免疫组的小鼠IgG抗体水平明显升高，且差异显著(P<0.05)，均在二免后第7周达最高峰，第8周后略下降；菌影+佐剂组与其它几组差异极显著(P<0.01)，菌影+佐剂组三组之间和菌影组四组之间差异均不明显(P>0.05)。
表4-1小鼠血清中特异性抗体ELISA检测结果(OD450nm值)
注：同列数据不相同表示差异显著(P<0.05),大写字母不相同表示差异极显著(P<0.01)
表4-2小鼠血清中特异性抗体ELISA检测结果(OD450nm值)
注：同列数据不相同表示差异显著(P<0.05),大写字母不相同表示差异极显著(P<0.01)
10.小鼠黏膜样品唾液与粪便中抗体sIgA的检测结果
首免和二免两周后采取唾液和粪便样品，sIgA检测结果见表5和6，二免后样品中sIgA含量均升高。唾液中sIgA含量均较少，但菌影+佐剂组与菌影组明显高于其它组，差异显著(P<0.05)；粪便中sIgA的含量较高，菌影+佐剂组与其它各组差异显著(P<0.05)。
表5小鼠唾液中sIgA抗体检测
组别 一免2周后 二免2周后
菌影+佐剂组 0.471±0.013A 0.812±0.019A
菌影组 0.337±0.014B 0.681±0.020B
灭活苗组 0.296±0.011C 0.495±0.019C
佐剂组 0.122±0.013D 0.134±0.020D
空白对照组 0.091±0.015D 0.092±0.022D
表6小鼠粪便中sIgA抗体检测
组别 一免2周后 二免2周后
菌影+佐剂组 1.474±0.026A 1.819±0.018A
菌影组 1.213±0.024B 1.688±0.016B
灭活苗组 1.069±0.021C 1.490±0.018C
佐剂组 0.321±0.027D 0.314±0.020D
空白对照组 0.293±0.025D 0.299±0.020D
11.小鼠脾脏淋巴细胞中CD8+和CD4+ T细胞的动态变化
(1)脾脏中CD8+ T细胞亚群占总淋巴细胞百分比的动态变化
如表7和图7，各组小鼠脾脏中CD8+所占总细胞的百分比与对照相比均上升，且两次免疫接种后各试验组间差异均极显著(P<0.01)，但空白组与佐剂组之间差异不显著(P>0.05)。
表7免疫小鼠脾脏中CD8+T细胞亚群在总淋巴细胞中的百分比
组别 一免2周后 二免2周后
菌影+佐剂组 35.47±0.39A 49.41±1.06A
菌影组 31.13±0.43B 42.58±1.07B
灭活苗组 27.69±0.39C 35.49±1.06C
佐剂组 23.52±0.43D 23.63±1.18D
空白对照组 22.86±0.34D 22.83±1.08D
注：同列数据标注不相同即为差异显著(P<0.05)，大写字母不同即为差异极显著(P<0.01)
(2)脾脏中CD4+T细胞亚群占总淋巴细胞百分比的动态变化
如图8与表8所示，各组小鼠脾脏中CD4+所占总细胞的百分比与对照相比均上升，且两次免疫接种后各试验组间差异均极显著(P<0.01)。
表8免疫小鼠脾脏中CD4+T细胞亚群在总淋巴细胞中的百分比
注：同列数据标注不相同即为差异显著(P<0.05)，大写字母不同即为差异极显著(P<0.01)
12.血清中细胞因子的检测
(1)血清中TNF-α含量的检测结果
二免两周后，TNF-α的含量测定结果如图9所示，与对照组相比菌影+佐剂组、菌影组、灭活苗组血清TNF-α含量均升高，且三组之间差异极显著(P<0.01)，但佐剂组与空白对照组之间差异不显著(P>0.05)。
(2)血清中IFN-γ含量的检测结果
二免两周后，血清IFN-γ含量测定结果如图10所示，与对照组相比菌影+佐剂组、菌影组和灭活苗组IFN-γ的含量均明显的升高，IFN-γ的含量从高至低依次为菌影+佐剂组、菌影组、灭活苗组、佐剂组和空白对照组，各组间IFN-γ的含量差异极显著(P<0.01)，但佐剂组与空白对照组之间差异不显著(P>0.05)。
(3)血清中IL-4含量的检测结果
二免两周后，IL-4水平如图11所示，与对照组相比，菌影+佐剂组、菌影组和灭活苗组血清IL-4含量均明显升高，IL-4的含量从高至到低依次为菌影+佐剂组、菌影组、灭活苗组、佐剂组和空白对照组，各组间IL-4的含量差异极显著(P<0.01)，但佐剂组和空白对照组之间差异不显著(P>0.05)。
13.攻毒保护性试验
各试验组攻毒后，空白组攻毒后小鼠陆续在24～72h内陆续死亡，其它几个试验组，最初表现精神不振，食欲减退，大多数在三天后恢复正常，结果如表9所示：
表9攻毒后各试验组的保护率
分组 免疫途径(一免) 免疫途径(二免) 攻毒保护率(％)
菌影+佐剂 皮下 皮下 100％(5/5)
菌影+(佐剂) 皮下 口服 100％(5/5)
菌影+(佐剂) 口服 皮下 100％(5/5)
菌影 皮下 皮下 80％(4/5)
菌影 口服 皮下 80％(4/5)
菌影 皮下 口服 80％(4/5)
菌影 口服 口服 80％(4/5)
灭活苗 皮下 皮下 60％(3/5)
佐剂 皮下 皮下 20％(1/5)
空白对照 — — 0(0/5)
14.攻毒后脏器荷菌数检测结果
各组小鼠单位重量各脏器中的活菌数结果见图12：在小肠中，菌影+佐剂组、菌影组、灭活苗组、佐剂组与空白对照组之间差异极显著(P<0.01)，但佐剂组与空白组之间差异不明显(P>0.05)；在肝脏中菌影组与其它四组之间差异极显著(P<0.01)，菌影与灭活苗组之间差异显著(P<0.05)；而在肺脏中五个试验组间差异均显著(P<0.05)。
综上所述，本试验成功制备出可以稳定遗传的产肠毒素性大肠杆菌菌影；其中添加了206佐剂的菌影疫苗保护效果为100％，且可激发小鼠产生特异性细胞免疫和体液免疫。

Claims (6)

1.一种猪大肠杆菌菌影疫苗的制备方法，其特征在于：菌液置42℃诱导后，离心收集沉淀后，用灭菌的PBS溶液重悬菌影沉淀。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：将重悬的菌影沉淀，离心弃上清后，将菌体沉淀用灭菌后的PBS溶液稀释到5×109CFU/mL。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：将重悬的菌体沉淀，离心弃上清后，将菌体沉淀用灭菌后的PBS溶液稀释到1×1010CFU/mL，加入0.3％体积的甲醛，37℃恒温箱中灭活。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：将灭活后的疫苗与等体积的206佐剂混合均匀。
5.一种猪大肠杆菌菌影疫苗的免疫效力分析方法，其特征在于，所述方法具有如下步骤：将25g的雌性昆明系小鼠，间隔14天连续免疫两次，一免后每隔一周对小鼠进行唾液、粪便和血清的样品收集，利用间接ELISA方法对唾液和粪便样品进行sIgA的检测；利用间接ELISA方法对血清样品进行IgG检测；初免两周和二免两周后取脾脏分离淋巴细胞，用流式细胞仪来检测脾脏中CD8+和CD4+细胞动态变化，对小鼠腹腔进行攻毒保护试验，以及对小鼠特异性抗体的持续期进行检测。
6.如权利要求1所述的猪大肠杆菌菌影疫苗在预防猪产肠毒素性大肠杆菌的应用。
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