CN118028207A - 一种菌影的制备方法、应用该菌影的组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种菌影的制备方法、应用该菌影的组合物及其制备方法，该菌影的制备方法包括：将pET29a‑E‑α3质粒与EcN/ΔtnaA::T7 RNAP感受态细胞混合后在28‑40℃下孵育0.5‑1小时，以将质粒转入到感受态细胞中，筛选得到重组菌株；将所述重组菌株于LB培养基中培养并加入IPTG诱导噬菌体α3裂解蛋白表达；收集培养后的所得溶液中的菌影加入冻干保存剂进行冻干保存，得到的大肠杆菌菌影。与现有技术相比，本发明利用特定方法制备大肠杆菌菌影作为免疫治疗的佐剂后与肿瘤抗原进行组合，使大肠杆菌菌影具有免疫活性成分和药物载体双重功能，可以携带和释放药物，同时还能够激活免疫系统，增强免疫治疗的效果，也即提高了基于大肠杆菌菌影作为佐剂用于免疫治疗时的应用效果。

Description

一种菌影的制备方法、应用该菌影的组合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及免疫药物的技术领域，尤其涉及一种菌影的制备方法、应用该菌影的组合物及其制备方法，具体涉及细菌菌影与肿瘤抗原的组合应用，属于微生物及肿瘤免疫调控领域。
背景技术
黑色素瘤是一种高度恶的皮肤肿瘤，其治疗一直是医学领域的挑战之一。传统的治疗方法包括手术切除、放射疗法和化学疗法，但这些方法存在着局限性，如手术可能无法完全切除病变组织，放疗和化疗则可能对正常组织造成严重的损伤，同时患者也可能出现耐药性。
免疫治疗作为一种新型的治疗手段，近年来备受关注。它通过激活患者自身的免疫系统来攻击和消灭肿瘤细胞，具有针对性强、副作用小等优点。然而，免疫治疗在黑色素瘤治疗中也存在一些挑战，如免疫耐受性、免疫逃逸等问题，限制了其临床应用。因此，现有技术方法中用于免疫治疗的免疫药物存在应用效果较差的问题。
发明内容
本发明实施例提供了一种菌影的制备方法、应用该菌影的组合物及其制备方法，旨在解决现有技术方法中用于免疫治疗的免疫药物存在应用效果较差的问题。
第一方面，本发明实施例提供了一种菌影的制备方法，其中，所述制备方法包括：
将pET29a-E-α3质粒与EcN/ΔtnaA::T7 RNAP感受态细胞混合后电击，并28-40℃下超声震荡0.5-1小时，以将质粒转入到感受态细胞中，筛选得到重组菌株；
将所述重组菌株于LB培养基中培养并加入IPTG诱导噬菌体α3裂解蛋白表达；
收集培养后的所得溶液中的菌影加入冻干保存剂进行冻干保存，得到的大肠杆菌菌影；
所述将pET29a-E-α3质粒与EcN/ΔtnaA::T7 RNAP感受态细胞混合后电击，并在28-40℃下超声震荡0.5-1小时，以将质粒转入到感受态细胞中，筛选得到重组菌株，包括：
质粒孵育：在50~200ul EcN/ΔtnaA::T7 RNAP 感受态细胞悬液中加入1~10ulpET29a- E-α3质粒并混合均匀，于冰上孵育 3~5 min；所述pET29a-E-α3质粒的浓度为50~200ng/ul；所述感受态的浓度为1*10^7cfu；
电转：使菌液均匀地分布于电击杯中，放入电转化仪的杯槽中，电脉冲条件：1.5KV、电阻 200 Ω、电容 25 μF；电击后迅速加入 1 mL 无抗 LB 液体培养基，轻轻吹打均匀；
复苏：28-40℃下，超声震荡培养0.5~1 h 进行复苏，并同时利用290nm～312nm紫外光间歇性照射，每次照射时长为2-4分钟，相邻两次照射的间隔时间为3-8分钟，4000 rpm离心 30 s，弃掉 800 μL的上清液，将剩余菌体沉淀重悬；
涂布：将菌体沉淀涂布于含卡那霉素的 LB 固体培养基，37℃过夜培养；
再次电转：取阳性克隆细胞继续培养两代后，将其再次制成感受态细胞，加入pLysS-OmpA-ATRAM质粒，再次进行电转的步骤，并涂布菌体沉淀于含卡那霉素及 氯霉素的LB 固体培养基中对转化细胞进行筛选，取阳性克隆细胞得到重组菌株；所述pLysS-OmpA-ATRAM质粒的浓度为50~200ng/ul。
第二方面，本申请实施例还提供了一种组合物，其中，所述组合物包括以质量比为2:1~30:1进行混合的大肠杆菌菌影及黑色素瘤相关抗原；所述大肠杆菌菌影应用如上述第一方面所述的制备方法制备得到。
第三方面，本申请实施例还提供了一种组合物的制备方法，所述制备方法用于制备如上述第二方面所述的组合物，制备方法包括：
将大肠杆菌菌影以及黑色素瘤相关抗原以质量比为2:1~30:1进行混合后，得到混合物；
将所述混合物于36-39℃溶于1×PBS溶液并于170-250rpm的摇床孵育0.6-1.5小时，得到对应的组合物。
本发明实施例提供了一种菌影的制备方法、应用该菌影的组合物及其制备方法，该菌影的制备方法包括：将pET29a-E-α3质粒与EcN/ΔtnaA::T7 RNAP感受态细胞混合后在28-40℃下孵育0.5-1小时，以将质粒转入到感受态细胞中，筛选得到重组菌株；将所述重组菌株于LB培养基中培养并加入IPTG诱导噬菌体α3裂解蛋白表达；收集培养后的所得溶液中的菌影加入冻干保存剂进行冻干保存，得到的大肠杆菌菌影。与现有技术相比，本发明在摇床作用下将质粒转入感受态细胞中并筛选得到重组菌株，通过培养并诱导噬菌体α3裂解蛋白表达后制备得到大肠杆菌菌影，该大肠杆菌菌影作为免疫治疗的佐剂与黑色素瘤相关抗原进行组合使用，使大肠杆菌菌影具有免疫活性成分和药物载体双重功能，可以携带和释放药物，同时还能够激活免疫系统，增强免疫治疗的效果，也即提高了基于大肠杆菌菌影作为佐剂用于免疫治疗时的应用效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的黑色素瘤免疫治疗的组合物的制备方法的方法流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
应当理解，当在本说明书和所附权利要求书中使用时，术语“包括”和“包含”指示所描述特征、整体、步骤、操作、元素和/或组件的存在，但并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素、组件和/或其集合的存在或添加。
还应当理解，在本发明说明书中所使用的术语仅仅是出于描述特定实施例的目的而并不意在限制本发明。如在本发明说明书和所附权利要求书中所使用的那样，除非上下文清楚地指明其它情况，否则单数形式的“一”、“一个”及“该”意在包括复数形式。
还应当进一步理解，在本发明说明书和所附权利要求书中使用的术语“和/ 或”是指相关联列出的项中的一个或多个的任何组合以及所有可能组合，并且包括这些组合。
实施例中各原料及设备介绍：
大肠杆菌 Nissle 1917（Escherichia coli Nissle 1917，EcN），来源于美国ATCC生物标准品资源中心；
小鼠黑色素瘤B16-OVA细胞，来源于美国ATCC生物标准品资源中心；
pLysS-OmpA-ATRAM质粒，由金唯智公司合成（中国专利CN 116162582 A已公开）；
pET29a-E-α3质粒，由金唯智公司合成（中国专利CN 114736273A已公开）；
酵母提取物，购自美国Thermo Fisher公司；
胰蛋白胨，购自美国Thermo Fisher公司；
Tris-HCl缓冲液，购自上海百赛生物技术股份有限公司；
PBS溶液，购自上海百赛生物技术股份有限公司；
氯霉素，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；
卡那霉素，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；
β-异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；
琼脂粉，购自天津致远化学试剂公司；
NaCl，购自天津致远化学试剂公司；
甘露醇，购自天津致远化学试剂公司；
磷酸钠，购自生工生物工程（上海）股份有限公司；
OVA（257-264）肽冻干粉，购自生工生物工程（上海）股份有限公司；
甘露醇，购自生工生物工程（上海）股份有限公司；
胎牛血清，购自Gibco公司；
RPMI1640培养基，购自Gibco公司；
Penicillin/Streptomycin，购自Gibco公司；
0.25％Trypsin-EDTA，购自Gibco公司；
恒温摇床，生产厂家为太仓市强乐实验设备有限公司，型号为HYL-X1；
超净工作台，生产厂家为苏州净化设备有限公司，型号为SW-CJ-1D；
电子分析天平，生产厂家为赛多利斯科学仪器有限公司，型号为BSA224S；
恒温生化培养箱，生产厂家为宁波江南仪器厂，型号为RXZ智能型；
电转仪，生产厂家为美国Bio-rad公司，型号为Gene Pulser Xcell TotalSystem；
紫外分光光度计，生产厂家为上海佑科仪器仪表有限公司，型号为UV755B；
冷冻离心机，生产厂家为德国Eppendorf公司，型号为5810R；
冷冻干燥机，生产厂家为美国LABCONCO公司，型号为FreeZone 4.5L。
在本实施例中，本发明实施例提供了一种菌影的制备方法，其中，所述制备方法包括步骤S110-步骤S130。
S110、将pET29a-E-α3质粒与EcN/ΔtnaA::T7 RNAP感受态细胞混合后在28-40℃下超声震荡0.5-1小时，以将质粒转入到感受态细胞中，筛选得到重组菌株；S120、将所述重组菌株于LB培养基中培养并加入IPTG诱导噬菌体α3裂解蛋白表达；S130、收集培养后的所得溶液中的菌影加入冻干保存剂进行冻干保存，得到的大肠杆菌菌影。
进一步的，所述将pET29a-E-α3质粒与EcN/ΔtnaA::T7 RNAP感受态细胞混合后电击，并在28-40℃下超声震荡0.5-1小时，以将质粒转入到感受态细胞中，筛选得到重组菌株，包括：质粒孵育：在50~200ul EcN/ΔtnaA::T7 RNAP 感受态细胞悬液中加入1~10ulpET29a- E-α3质粒并混合均匀，于冰上孵育 3~5 min；所述pET29a-E-α3质粒的浓度为50~200ng/ul；所述感受态的浓度为1*10^7cfu；电转：使菌液均匀地分布于电击杯中，放入电转化仪的杯槽中，电脉冲条件：1.5 KV、电阻 200 Ω、电容 25 μF；电击后迅速加入 1 mL 无抗 LB 液体培养基，轻轻吹打均匀；复苏：28-40℃下，超声震荡培养0.5~1 h 进行复苏，并同时利用290nm～312nm紫外光间歇性照射，每次照射时长为2-4分钟，相邻两次照射的间隔时间为3-8分钟，4000 rpm 离心 30 s，弃掉 800 μL的上清液，将剩余菌体沉淀重悬；涂布：将菌体沉淀涂布于含卡那霉素的 LB 固体培养基，37℃过夜培养；再次电转：取阳性克隆细胞继续培养两代后，将其再次制成感受态细胞，加入pLysS-OmpA-ATRAM质粒，再次进行电转的步骤，并涂布菌体沉淀于含卡那霉素及 氯霉素的 LB 固体培养基中对转化细胞进行筛选，取阳性克隆细胞得到重组菌株；所述pLysS-OmpA-ATRAM质粒的浓度为50~200ng/ul。
具体的，在50~200ul EcN/ΔtnaA::T7 RNAP 感受态细胞悬液中加入1~10ulpET29a- E-α3质粒并混合均匀，于冰上孵育 3~5 min，其中pET29a-E-α3质粒的浓度为50~200ng/ul、感受态的浓度为1*10^7cfu。优选实施例中可于冰上孵育5分钟，混合溶液中pET29a-E-α3质粒的浓度优选为160 ng/ul。
使菌液均匀地分布于电击杯中，将电击杯外侧的冷凝水擦干，放入电转化仪的杯槽中，电脉冲条件：为1.2-1.8KV、电阻 值200 Ω、电容 25 μF；电击后迅速加入 1 mL 无抗LB 液体培养基，轻轻吹打均匀；优选的，电击转化中的电压可设置为1.5KV。其中，电击杯在放入菌液之前可预先进行冷却，如将电击杯冷却至4℃后再放入菌液，可提高进行电击转化的效果。
复苏：28-40℃下，超声震荡培养0.5~1 h 进行复苏，并同时利用290nm～312nm紫外光间歇性照射，每次照射时长为2-4分钟，相邻两次照射的间隔时间为3-8分钟，4000 rpm离心 30 s，弃掉 800 μL的上清液，将剩余菌体沉淀重悬。具体的，可将投入式超声波震棒插入盛放菌液的三角瓶内，投入式超声波震棒的功率控制为8-12W，控制三角瓶内培养基的温度在28-40℃，进行超声震荡的同时利用紫外灯产生紫外光对菌液进行间歇性照射，以促进培养效果，可利用290nm～312nm紫外光间歇性照射，每次照射时长为2-4分钟，相邻两次照射的间隔时间为3-8分钟；优选的，可将三角瓶置于水浴环境下并保持在37℃，超声震荡培养的时间为0.8h，超声波震棒的功率控制为10W；紫外光照射过程中每次照射时长为3分钟，相邻两次照射的间隔时间为5分钟。
涂布：将菌体沉淀涂布于含卡那霉素的 LB 固体培养基，37℃过夜培养。再次电转：取阳性克隆细胞继续培养两代后，将其再次制成感受态细胞，加入pLysS-OmpA-ATRAM质粒并混合，再次重复上述质粒孵育、电转、复苏、涂布的步骤以再次进行转化，并涂布于含卡那霉素及氯霉素的 LB 固体培养基中对转化细胞进行筛选，取阳性克隆细胞得到重组菌株；其中，混合溶液中pLysS-OmpA-ATRAM质粒的浓度优选为160 ng/ul。
其中，所述将所述重组菌株于LB培养基中培养并加入IPTG诱导噬菌体α3裂解蛋白表达，包括：从平板上挑取EcN/ΔtnaA::T7 RNAP/ pET29a-E-α3+pLysS-OmpA-ATRAM单克隆菌落于对应的LB液体培养基中培养10-16小时；将培养得到的细菌转接至新的培养基中继续培养，当菌液OD600值培养至0.4-1.0时，加入1mM IPTG诱导噬菌体α3裂解蛋白E表达。
进一步的，从平板上挑取EcN/ΔtnaA::T7 RNAP/ pET29a-E-α3+pLysS-OmpA-ATRAM单克隆菌落于对应的LB液体培养基中，培养10-16小时，优选的，培养时间为12小时。将培养得到的细菌转接至新的培养基中继续培养，当菌液OD600值培养至0.4-1.0时，加入1mM IPTG诱导噬菌体α3裂解蛋白E表达，优选的，可在菌液OD600值培养至0.8时加入IPTG。
具体的，所述收集培养后的所得溶液中的菌影加入冻干保存剂进行冻干保存，得到大肠杆菌菌影，包括：裂解2h后，4000 rpm 离心 15 min收集菌体沉淀，以菌体沉淀与β-丙内酯的体积比为1:2000 加入β-丙内酯并置于4℃灭活细菌12h；将灭活的菌液于4000rpm 离心 15 min收集菌体沉淀，加入1×PBS清洗2次，最后加入甘露醇溶液；将样品放入-80℃冻干 24 h，-20℃保存备用，即可得到大肠杆菌菌影。
在加入IPTG诱导噬菌体α3裂解蛋白E表达2h后，4000 rpm 离心 15 min收集菌体沉淀，以菌体沉淀与β-丙内酯的体积比为1:2000 加入β-丙内酯并置于4℃灭活细菌12h。4000 rpm 离心 15 min收集菌体沉淀，加入1×PBS清洗2次，最后加入甘露醇溶液，甘露醇溶液中甘露醇的质量占超纯水体积的20%（如100ml超纯水则加入20克甘露醇），将样品放入-80℃并维持24小时后，置于-20℃下保存备用，即可得到大肠杆菌菌影。
具体实施例中，所述感受态细胞为表面修饰了酸触发的多肽的大肠杆菌进行感受态激活所得到的细胞，上述两种质粒转入后，大肠杆菌表面修饰了酸触发的多肽会随着细菌生长主动展示。
本申请实施例中还公开了一种组合物，其中，所述组合物包括以质量比为2:1~30:1进行混合的大肠杆菌菌影及黑色素瘤相关抗原，该大肠杆菌菌影可采用上述实施例中所述的制备方法制备得到。
使用大肠杆菌菌影与黑色素瘤相关抗原进行混合，其中两种物质的混合比例为2:1~30:1。可利用大肠杆菌菌影影（Bacterial ghosts，BGs）作为免疫治疗的佐剂，其中，大肠杆菌菌影是一种不含核酸和蛋白质等细胞质内容物的细菌空壳，其保留了天然细菌的完整形态和表面抗原成分，具有免疫活性成分和药物载体双重功能，可以携带和释放药物，同时还能够激活免疫系统，增强免疫治疗的效果。通过基因工程手段对细菌菌影进行编辑，可以实现其在体内的精准靶向和治疗效果的优化，从而提高黑色素瘤免疫治疗的疗效和安全性。因此，利用细菌菌影作为黑色素瘤免疫治疗的佐剂，具有较好的应用前景；本申请技术方法通过使用大肠杆菌菌影与黑色素瘤相关抗原进行组合，能够实现对肿瘤进行抑制，并提高基于大肠杆菌菌影作为佐剂用于免疫治疗时的应用效果。
在具体的实施例中，所述大肠杆菌菌影为大肠杆菌 Nissle 1917菌影和/或表面展示酸触发性理性膜肽的大肠杆菌Nissle 1917菌影。其中，所述黑色素瘤相关抗原为模式抗原OVA-257-264。
可选用大肠杆菌 Nissle 1917菌影或者表面展示酸触发性理性膜肽的大肠杆菌Nissle 1917菌影作为大肠杆菌菌影，还可以选择将大肠杆菌 Nissle 1917菌影与表面展示酸触发性理性膜肽的大肠杆菌Nissle 1917菌影进行组合，作为大肠杆菌菌影。黑色素瘤相关抗原可以是模式抗原OVA-257-264。
本发明实施例还提供了一种组合物的制备方法，该制备方法用于制备上述实施例中所述的组合物。如图1所示，该制备方法包括：将大肠杆菌菌影以及黑色素瘤相关抗原以质量比为2:1~30:1进行混合后，得到混合物。将所述混合物于36-39℃溶于1×PBS溶液并于170-250rpm的摇床孵育0.6-1.5小时，得到对应的组合物。
具体的，可先对大肠杆菌菌影以及黑色素瘤相关抗原以质量比为2:1~30:1进行混合，将所得混合物于36-39℃溶于1×PBS溶液并于170-250rpm的摇床孵育0.6-1.5小时。优选实施例中大肠杆菌菌影以及黑色素瘤相关抗原的质量比为25:1，以确保大肠杆菌菌影具有良好的载药效果，并提高组合物的抗肿瘤作用。
在具体的实施例中，所述混合物进行溶解的温度为37℃。优选实施例中，可选择在37℃对上述混合物进行溶解。优选的摇床孵育的转速为220rpm（转/分钟），孵育时长为1小时。
具体的，可将上述实施例中的组合物作为注射剂，并进行皮下注射使用；所述用于黑色素瘤免疫治疗的组合物包括大肠杆菌菌影及黑色素瘤相关抗原，所述大肠杆菌菌影为大肠杆菌 Nissle 1917菌影和/或表面展示酸触发性理性膜肽的大肠杆菌Nissle 1917菌影。
可使用上述用于黑色素瘤免疫治疗的组合物进行皮下注射，也即是将溶于1×PBS溶液并进行孵化后的混合物进行皮下注射，混合物包括大肠杆菌菌影及黑色素瘤相关抗原。可按受体重量确定用于黑色素瘤免疫治疗的组合物进行使用的剂量，具体的，可以每千克体重1.5-4mg黑色素瘤相关抗原的剂量确定用于黑色素瘤免疫治疗的组合物的注射量并进行注射使用。在最优的实施例中，可以每千克体重2mg黑色素瘤相关抗原的剂量确定用于黑色素瘤免疫治疗的组合物的注射量并进行注射使用，以取得最优的肿瘤抑制效果。
实施例1
在150ul EcN/ΔtnaA::T7 RNAP 感受态细胞中加入6ul pET29a- E-α3质粒并混合均匀，于冰上孵育5分钟，其中pET29a-E-α3质粒的浓度为120ng/ul、感受态的浓度为1*10^7cfu。使菌液均匀地分布于电击杯中，将电击杯外侧的冷凝水擦干，放入电转化仪的杯槽中，电脉冲条件：为1.5KV、电阻 值200 Ω、电容 25 μF；电击后迅速加入 1 mL 无抗 LB 液体培养基，轻轻吹打均匀。
复苏：在37℃下，超声震荡培养0.8h 进行复苏，超声波震棒的功率控制为10W，并同时利用305nm紫外光间歇性照射，每次照射时长为3分钟，相邻两次照射的间隔时间为5分钟，4000 rpm 离心 30 s，弃掉 800 μL的上清液，将剩余菌体沉淀重悬。
涂布：将菌体沉淀涂布于含卡那霉素的 LB 固体培养基，37℃过夜培养。再次电转：取阳性克隆细胞继续培养两代后，将其再次制成感受态细胞，加入pLysS-OmpA-ATRAM质粒并混合，混合溶液中pLysS-OmpA-ATRAM质粒的浓度优选为120 ng/ul；再次重复上述质粒孵育、电转、复苏、涂布的步骤以再次进行转化，并涂布于含卡那霉素及氯霉素的 LB 固体培养基中对转化细胞进行筛选，取阳性克隆细胞得到重组菌株。
进一步的，从平板上挑取EcN/ΔtnaA::T7 RNAP/ pET29a-E-α3+pLysS-OmpA-ATRAM单克隆菌落于对应的LB液体培养基中，培养12小时，将培养得到的细菌转接至新的培养基中继续培养，当菌液OD600值培养至0.8时，加入1mM IPTG诱导噬菌体α3裂解蛋白E表达。
在加入IPTG诱导噬菌体α3裂解蛋白E表达2h后，4000 rpm 离心 15 min收集菌体沉淀，以菌体沉淀与β-丙内酯的体积比为1:2000 加入β-丙内酯并置于4℃灭活细菌12h。4000 rpm 离心 15 min收集菌体沉淀，加入1×PBS清洗2次，最后加入20ml甘露醇溶液，甘露醇溶液中甘露醇的质量占超纯水体积的20%（如100ml超纯水则加入20克甘露醇），将样品放入-80℃并维持24小时后，置于-20℃下保存备用。
实施例2
在150ul EcN/ΔtnaA::T7 RNAP 感受态细胞中加入8ul pET29a- E-α3质粒并混合均匀，于冰上孵育5分钟，其中pET29a-E-α3质粒的浓度为160ng/ul、感受态的浓度为1*10^7cfu。
使菌液均匀地分布于电击杯中，将电击杯外侧的冷凝水擦干，放入电转化仪的杯槽中，电脉冲条件：为1.5KV、电阻值200 Ω、电容 25 μF；电击后迅速加入 1 mL 无抗 LB液体培养基，轻轻吹打均匀。
复苏：在37℃下，超声震荡培养0.8h 进行复苏，超声波震棒的功率控制为10W，并同时利用305nm紫外光间歇性照射，每次照射时长为3分钟，相邻两次照射的间隔时间为5分钟，4000 rpm 离心 30 s，弃掉 800 μL的上清液，将剩余菌体沉淀重悬。
涂布：将菌体沉淀涂布于含卡那霉素的 LB 固体培养基，37℃过夜培养。再次电转：取阳性克隆细胞继续培养两代后，将其再次制成感受态细胞，加入pLysS-OmpA-ATRAM质粒并混合，混合溶液中pLysS-OmpA-ATRAM质粒的浓度优选为160 ng/ul；再次重复上述质粒孵育、电转、复苏、涂布的步骤以再次进行转化，并涂布于含卡那霉素及氯霉素的 LB 固体培养基中对转化细胞进行筛选，取阳性克隆细胞得到重组菌株。
进一步的，从平板上挑取EcN/ΔtnaA::T7 RNAP/ pET29a-E-α3+pLysS-OmpA-ATRAM单克隆菌落于对应的LB液体培养基中，培养12小时，将培养得到的细菌转接至新的培养基中继续培养，当菌液OD600值培养至0.8时，加入1mM IPTG诱导噬菌体α3裂解蛋白E表达。
在加入IPTG诱导噬菌体α3裂解蛋白E表达2h后，4000 rpm 离心 15 min收集菌体沉淀，以菌体沉淀与β-丙内酯的体积比为1:2000 加入β-丙内酯并置于4℃灭活细菌12h。4000 rpm 离心 15 min收集菌体沉淀，加入1×PBS清洗2次，最后加入20ml甘露醇溶液，甘露醇溶液中甘露醇的质量占超纯水体积的20%（如100ml超纯水则加入20克甘露醇），将样品放入-80℃并维持24小时后，置于-20℃下保存备用。
实施例3
在150ul EcN/ΔtnaA::T7 RNAP 感受态细胞中加入10ul pET29a- E-α3质粒并混合均匀，于冰上孵育5分钟，其中pET29a-E-α3质粒的浓度为200ng/ul、感受态的浓度为1*10^7cfu。
使菌液均匀地分布于电击杯中，将电击杯外侧的冷凝水擦干，放入电转化仪的杯槽中，电脉冲条件：为1.5KV、电阻 值200 Ω、电容 25 μF；电击后迅速加入 1 mL 无抗 LB液体培养基，轻轻吹打均匀。
复苏：在37℃下，超声震荡培养0.8h 进行复苏，超声波震棒的功率控制为10W，并同时利用305nm紫外光间歇性照射，每次照射时长为3分钟，相邻两次照射的间隔时间为5分钟，4000 rpm 离心 30 s，弃掉 800 μL的上清液，将剩余菌体沉淀重悬。
涂布：将菌体沉淀涂布于含卡那霉素的 LB 固体培养基，37℃过夜培养。再次电转：取阳性克隆细胞继续培养两代后，将其再次制成感受态细胞，加入pLysS-OmpA-ATRAM质粒并混合，混合溶液中pLysS-OmpA-ATRAM质粒的浓度优选为200 ng/ul；再次重复上述质粒孵育、电转、复苏、涂布的步骤以再次进行转化，并涂布于含卡那霉素及氯霉素的 LB 固体培养基中对转化细胞进行筛选，取阳性克隆细胞得到重组菌株。
进一步的，从平板上挑取EcN/ΔtnaA::T7 RNAP/ pET29a-E-α3+pLysS-OmpA-ATRAM单克隆菌落于对应的LB液体培养基中，培养12小时，将培养得到的细菌转接至新的培养基中继续培养，当菌液OD600值培养至0.8时，加入1mM IPTG诱导噬菌体α3裂解蛋白E表达。
在加入IPTG诱导噬菌体α3裂解蛋白E表达2h后，4000 rpm 离心 15 min收集菌体沉淀，以菌体沉淀与β-丙内酯的体积比为1:2000 加入β-丙内酯并置于4℃灭活细菌12h。4000 rpm 离心 15 min收集菌体沉淀，加入1×PBS清洗2次，最后加入20ml甘露醇溶液，甘露醇溶液中甘露醇的质量占超纯水体积的20%（如100ml超纯水则加入20克甘露醇），将样品放入-80℃并维持24小时后，置于-20℃下保存备用。
对比例1
在150ul EcN/ΔtnaA::T7 RNAP 感受态细胞中加入8ul pET29a- E-α3质粒并混合均匀，于冰上孵育5分钟，其中pET29a-E-α3质粒的浓度为160ng/ul、感受态的浓度为1*10^7cfu。加入预冷的电击杯中，轻轻振动电击杯，使菌液均匀地分布于电击杯中，盖上盖子后将电击杯外侧的冷凝水擦干，放入电转化仪的杯槽中，电脉冲条件：为1.5KV、电阻 值200Ω、电容 25 μF；电击后迅速加入 1 mL 无抗 LB 液体培养基，轻轻吹打均匀。
复苏：在37℃下，超声震荡培养0.8h 进行复苏，超声波震棒的功率控制为10W，4000 rpm 离心 30 s，弃掉 800 μL的上清液，将剩余菌体沉淀重悬。
涂布：将菌体沉淀涂布于含卡那霉素的 LB 固体培养基，37℃过夜培养。再次电转：取阳性克隆细胞继续培养两代后，将其再次制成感受态细胞，加入pLysS-OmpA-ATRAM质粒并混合，混合溶液中pLysS-OmpA-ATRAM质粒的浓度优选为160ng/ul；再次重复上述质粒孵育、电转、复苏、涂布的步骤以再次进行转化，并涂布于含卡那霉素及氯霉素的 LB 固体培养基中对转化细胞进行筛选，取阳性克隆细胞得到重组菌株。
进一步的，从平板上挑取EcN/ΔtnaA::T7 RNAP/ pET29a-E-α3+pLysS-OmpA-ATRAM单克隆菌落于对应的LB液体培养基中，培养12小时，将培养得到的细菌转接至新的培养基中继续培养，当菌液OD600值培养至0.8时，加入1mM IPTG诱导噬菌体α3裂解蛋白E表达。
在加入IPTG诱导噬菌体α3裂解蛋白E表达2h后，4000 rpm 离心 15 min收集菌体沉淀，以菌体沉淀与β-丙内酯的体积比为1:2000 加入β-丙内酯并置于4℃灭活细菌12h。4000 rpm 离心 15 min收集菌体沉淀，加入1×PBS清洗2次，最后加入20ml甘露醇溶液，甘露醇溶液中甘露醇的质量占超纯水体积的20%（如100ml超纯水则加入20克甘露醇），将样品放入-80℃并维持24小时后，置于-20℃下保存备用。
对比例2
在150ul EcN/ΔtnaA::T7 RNAP 感受态细胞中加入8ul pET29a- E-α3质粒并混合均匀，于冰上孵育5分钟，其中pET29a-E-α3质粒的浓度为160ng/ul、感受态的浓度为1*10^7cfu。加入预冷的电击杯中，轻轻振动电击杯，使菌液均匀地分布于电击杯中，盖上盖子后将电击杯外侧的冷凝水擦干，放入电转化仪的杯槽中，电脉冲条件：为1.5KV、电阻 值200Ω、电容 25 μF；电击后迅速加入 1 mL 无抗 LB 液体培养基，轻轻吹打均匀。
复苏：在37℃下，摇床孵育0.8h 进行复苏，并同时利用305nm紫外光间歇性照射，每次照射时长为3分钟，相邻两次照射的间隔时间为5分钟，4000 rpm 离心 30 s，弃掉 800μL的上清液，将剩余菌体沉淀重悬。
涂布：将菌体沉淀涂布于含卡那霉素的 LB 固体培养基，37℃过夜培养。再次电转：取阳性克隆细胞继续培养两代后，将其再次制成感受态细胞，加入pLysS-OmpA-ATRAM质粒并混合，混合溶液中pLysS-OmpA-ATRAM质粒的浓度优选为160ng/ul；再次重复上述质粒孵育、电转、复苏、涂布的步骤以再次进行转化，并涂布于含卡那霉素及氯霉素的 LB 固体培养基中对转化细胞进行筛选，取阳性克隆细胞得到重组菌株。
进一步的，从平板上挑取EcN/ΔtnaA::T7 RNAP/ pET29a-E-α3+pLysS-OmpA-ATRAM单克隆菌落于对应的LB液体培养基中，培养12小时，将培养得到的细菌转接至新的培养基中继续培养，当菌液OD600值培养至0.8时，加入1mM IPTG诱导噬菌体α3裂解蛋白E表达。
在加入IPTG诱导噬菌体α3裂解蛋白E表达2h后，4000 rpm 离心 15 min收集菌体沉淀，以菌体沉淀与β-丙内酯的体积比为1:2000 加入β-丙内酯并置于4℃灭活细菌12h。4000 rpm 离心 15 min收集菌体沉淀，加入1×PBS清洗2次，最后加入20ml甘露醇溶液，甘露醇溶液中甘露醇的质量占超纯水体积的20%（如100ml超纯水则加入20克甘露醇），将样品放入-80℃并维持24小时后，置于-20℃下保存备用。
测试例1
大肠杆菌Nissle 1917菌影载药能力测试：取实施例1、实施例2、实施例3、对比例1及对比例2所得到的菌影各20mg重悬于10ml PBS中，4000rpm离心15min，弃去上清，将沉淀重悬于1ml PBS中，得到20mg/ml 菌影溶液（1000ug/50ul），梯度稀释，制得20/2/0.2 mg/mlBGs溶液，则所得到的BGs溶液中分别包含各实施例及各对比例所得到的大肠杆菌菌影。取2mg 模式抗原OVA冻干粉（OVA-257-264肽冻干粉）溶于1ml PBS中，得到2mg/ml OVA溶液（100ug/50ul），梯度稀释制得2000/200/20 ug/ml OVA溶液。
取上述各梯度BGs 混悬液50ul与各梯度OVA溶液50ul混合，37℃，220rpm摇床孵育1h。4000rpm离心15min收集上清，BCA试剂盒检测游离OVA浓度（A液：B液为1:50，200ul试剂+20ul样品 孵育1h），计算装载效率。其中装载效率的计算公式为：装载效率=100%×(装载前OVA浓度-上清中剩余OVA浓度)/装载前OVA浓度，每一测试条件进行五组平行测试，取装载效率的平均值得到相应的结果。
所得到的测试结果如表1所示，测试中分别由0.1mg/ml的BGs混悬液、1mg/ml的BGs混悬液及10mg/ml的BGs混悬液三个浓度梯度，与10ug/ml的OVA溶液、100ug/ml的OVA溶液、1000ug/ml的OVA溶液三个浓度梯队进行两两组合。根据表1结果可知，随着菌影浓度提高，抗原装载效率提高，且实施例中各组装载率明显优于对比例1及对比例2；
表1
测试例2
大肠杆菌Nissle 1917菌影结合模式抗原抑制黑色素瘤测试：将上述实施例1、实施例2、实施例3及对比例1及对比例2中的大肠杆菌Nissle 1917菌影与模式抗原OVA（冻干粉（OVA-257-264肽冻干粉）溶于1×PBS溶液，按比例混合，于37℃，220rpm摇床孵育1h，于4℃保存备用，每次注射前现制现用。
于雌性6 ~ 8周龄C57BL/6J小鼠右肩上注射3×105B16-OVA细胞进行植瘤，第4天、第8天及第12天分别进行皮下注射给药。观察记录肿瘤体积（两天一次），并记录得到如表3所示结果。
1.不同浓度菌影给药剂量下小鼠肿瘤体积变化，给药量如表2所示（每组4只小鼠）；
表2
记录不同组别小鼠的肿瘤体积大小，所得到的记录结果如表3所示。
从表3中可见，通过对各实施例、各对比例进行跨组分析可知，随着大肠杆菌菌影佐剂使用量提高，通过所得到的组合物对肿瘤生长进行抑制时肿瘤生长速度明显减缓；通过对各实施例、各对比例进行对比分析可知，实施例2中所得到的大肠杆菌菌影与模式抗原OVA进行结合的应用效果较佳，实施例1所得到的大肠杆菌菌影的应用效果略好于实施例3，对比例2所得到的大肠杆菌菌影的应用效果最差；对各实施例中大肠杆菌菌影（BGs）与模式抗原OVA（OVA）的质量配比进行组内分析可知，各实施例所对应的组合物中1.0mg BGs与40ug OVA进行配比的应用效果最佳，则对应大肠杆菌菌影（BGs）与模式抗原OVA（OVA）的质量为25：1；
表3
本发明公开了一种菌影的制备方法、应用该菌影的组合物及其制备方法，该菌影的制备方法包括：将pET29a-E-α3质粒与EcN/ΔtnaA::T7 RNAP感受态细胞混合后在28-40℃下孵育0.5-1小时，以将质粒转入到感受态细胞中，筛选得到重组菌株；将所述重组菌株于LB培养基中培养并加入IPTG诱导噬菌体α3裂解蛋白表达；收集培养后的所得溶液中的菌影加入冻干保存剂进行冻干保存，得到的大肠杆菌菌影。与现有技术相比，本发明在摇床震荡作用下将质粒转入感受态细胞中并筛选得到重组菌株，通过培养并诱导噬菌体α3裂解蛋白表达后制备得到大肠杆菌菌影，该大肠杆菌菌影作为免疫治疗的佐剂与黑色素瘤相关抗原进行组合使用，使大肠杆菌菌影具有免疫活性成分和药物载体双重功能，可以携带和释放药物，同时还能够激活免疫系统，增强免疫治疗的效果，也即提高了基于大肠杆菌菌影作为佐剂用于免疫治疗时的应用效果。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。

Claims (8)

1.一种菌影的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
将pET29a-E-α3质粒与EcN/ΔtnaA::T7 RNAP感受态细胞混合后电击，并28-40℃下超声震荡0.5-1小时，以将质粒转入到感受态细胞中，筛选得到重组菌株；
将所述重组菌株于LB培养基中培养并加入IPTG诱导噬菌体α3裂解蛋白表达；
收集培养后的所得溶液中的菌影加入冻干保存剂进行冻干保存，得到的大肠杆菌菌影；
所述将pET29a-E-α3质粒与EcN/ΔtnaA::T7 RNAP感受态细胞混合后电击，并在28-40℃下超声震荡0.5-1小时，以将质粒转入到感受态细胞中，筛选得到重组菌株，包括：
质粒孵育：在50~200ul EcN/ΔtnaA::T7 RNAP 感受态细胞悬液中加入1~10ulpET29a- E-α3质粒并混合均匀，于冰上孵育 3~5 min；所述pET29a-E-α3质粒的浓度为50~200ng/ul；所述感受态的浓度为1*10^7cfu；
电转：使菌液均匀地分布于电击杯中，放入电转化仪的杯槽中，电脉冲条件：1.5 KV、电阻 200 Ω、电容 25 μF；电击后迅速加入 1 mL 无抗 LB 液体培养基，轻轻吹打均匀；
复苏：28-40℃下，超声震荡培养0.5~1 h 进行复苏，并同时利用290nm～312nm紫外光间歇性照射，每次照射时长为2-4分钟，相邻两次照射的间隔时间为3-8分钟，4000 rpm 离心 30 s，弃掉 800 μL的上清液，将剩余菌体沉淀重悬；
涂布：将菌体沉淀涂布于含卡那霉素的 LB 固体培养基，37℃过夜培养；
再次电转：取阳性克隆细胞继续培养两代后，将其再次制成感受态细胞，加入pLysS-OmpA-ATRAM质粒，再次进行电转的步骤，并涂布菌体沉淀于含卡那霉素及 氯霉素的 LB 固体培养基中对转化细胞进行筛选，取阳性克隆细胞得到重组菌株；所述pLysS-OmpA-ATRAM质粒的浓度为50~200ng/ul。
2.根据权利要求1所述菌影的制备方法，其特征在于，所述将所述重组菌株于LB培养基中培养并加入IPTG诱导噬菌体α3裂解蛋白表达，包括：
从平板上挑取EcN/ΔtnaA::T7 RNAP/ pET29a-E-α3+pLysS-OmpA-ATRAM单克隆菌落于对应的LB液体培养基中培养10-16小时；
将培养得到的细菌转接至新的培养基中继续培养，当菌液OD600值培养至0.4-1.0时，加入1mM IPTG诱导噬菌体α3裂解蛋白E表达。
3.根据权利要求1所述菌影的制备方法，其特征在于，所述收集培养后的所得溶液中的菌影加入冻干保存剂进行冻干保存，得到大肠杆菌菌影，包括：
裂解2h后，4000 rpm 离心 15 min收集菌体沉淀，以菌体沉淀与β-丙内酯的体积比为1:2000 加入β-丙内酯并置于4℃灭活细菌12h；
将灭活的菌液于4000 rpm 离心 15 min收集菌体沉淀，加入1×PBS清洗2次，最后加入甘露醇溶液；
将样品放入-80℃冻干 24 h，-20℃保存备用，即可得到大肠杆菌菌影。
4.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括以质量比为2:1~30:1进行混合的大肠杆菌菌影及黑色素瘤相关抗原；所述大肠杆菌菌影应用如权利要求1-3任一项所述的制备方法制备得到。
5. 根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述大肠杆菌菌影为大肠杆菌 Nissle1917菌影和/或表面展示酸触发性理性膜肽的大肠杆菌Nissle 1917菌影。
6.根据权利要求4所述组合物，其特征在于，所述黑色素瘤相关抗原为模式抗原OVA（257-264）。
7.一种组合物的制备方法，所述制备方法用于制备如权利要求4-6任一项所述的组合物，其特征在于，所述制备方法包括：
将大肠杆菌菌影以及黑色素瘤相关抗原以质量比为2:1~30:1进行混合后，得到混合物；
将所述混合物于36-39℃溶于1×PBS溶液并于170-250rpm的摇床孵育0.5-1.5小时，得到对应的组合物。
8.根据权利要求7所述组合物的制备方法，其特征在于，所述混合物进行结合的温度为37℃。
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