CN110643623B - 人可溶性cd80融合基因转化乳酸菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了人可溶性CD80(hsCD80)融合基因转化乳酸菌,包括hsCD80基因或CTB‑hsCD80融合基因转化乳酸菌,是将所述hsCD80基因或CTB‑hsCD80融合基因插入到乳酸菌表达载体pLN并转化乳酸菌获得,还公开了该转化菌在制备具有肿瘤免疫治疗效果的口服活菌药物中的应用。本发明中hsCD80和CTB‑hsCD80融合基因转化乳酸菌可制备成活菌悬液、乳制品、活菌菌粉、菌片或胶囊等活菌制剂,作为免疫治疗活菌药物口服后能在人体肠道内增殖和定植,应用于肿瘤、病毒感染或细胞内细菌感染、原发性和继发性免疫低下等疾病的预防与治疗。

Description

人可溶性CD80融合基因转化乳酸菌及其应用
技术领域
本发明属于人可溶性CD80(简称hsCD80)基因技术领域,具体涉及人可溶性CD80融合基因转化乳酸菌及其应用。
背景技术
近年来,以免疫检查点(checkpoint)分子为靶点的免疫治疗是目前抗肿瘤研究的热点,多种免疫检查点抑制剂药物,如PD-1、PD-L1人源化抗体已经获准在临床应用,并获得了较好的疗效。
恶性肿瘤之所以能逃避免疫监视,主要原因是恶性肿瘤细胞自身和免疫细胞都会表达一些免疫共抑制分子(co-inhibitory molecular),又称为免疫检查点(checkpoint)分子,产生免疫抑制,逃避机体的免疫监视。这也是肿瘤治疗需要突破的主要障碍。B7-H1(CD274)和B7-DC(CD273)是两个重要的免疫抑制分子,二者都是CD80(B7.1)的同源分子,都能与T细胞上的受体程序性死亡因子1(programmed death 1,PD-1)结合,抑制产生抗肿瘤免疫,抑制效应T细胞(Te)对肿瘤的杀伤作用。因而,二者又分别被称为PD-1配体1(PD-L1)和配体2(PD-L2)。PD-L1广泛表达于各种恶性肿瘤细胞,受干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)等细胞因子的上调。PD-L2则主要表达于DC、巨噬细胞、肥大细胞等。PD-L1和PD-L2都能与T细胞上的受体PD-1或者CD80结合。一方面抑制T细胞的活化,诱导T细胞凋亡;另一方面抑制Te细胞对肿瘤细胞产生的细胞毒作用。近年来,针对PD-1及其配体PD-L1、PD-L2,以及CTLA-4等免疫抑制分子的靶向治疗已经成为抗肿瘤治疗研究的热点。PD-1、PD-L1、PD-L2和CTLA-4的人源化抗体或抑制剂在乳腺癌、结肠癌和肺癌等恶性肿瘤的临床治疗试验中获得了可喜疗效,PD-1人源抗体nivolumab和pembrolizumab,PD-L1抗体atezolizumab已获得日本、美国和澳大利亚等国FDA批准,应用于恶性肿瘤治疗。
除PD-1外,免疫细胞活化后还表达许多检查点分子,如细胞毒T细胞抗原4(CTLA-4)、TIM3、LAG-3等。这些检查点分子通过负反馈调节机制防止免疫反应过程中发生过度免疫和自身免疫。CTLA-4是CD80的负调节受体,主要存在于活化的T细胞、调节性T细胞(Treg)和记忆T细胞(Tm)细胞。CD80与CTLA-4结合抑制辅助T细胞(Th)、Tm细胞活化,刺激Treg细胞增殖,诱导产生免疫耐受。CTLA-4抗体ipilimumab是最早获准上市的检查点抗体药物,主要用于转移性黑色素瘤治疗。TIM3和LAG-3主要表达于活化的CD4+和CD8+ T细胞,抑制Th1的活化和Te的杀伤作用。TIM3和LAG-3的抑制剂或抗体同样可以提高Te对肿瘤细胞的杀伤作用。
但是,免疫检查点抑制剂在临床上的适用范围较小。只有不到三分之一的肿瘤患者用PD-1抗体治疗后疗效确切,大多数肿瘤患者用药后疗效不佳或无效。这是因为检查点抑制剂主要通过阻断免疫抑制通路起作用,提高机体已经活化的免疫细胞的抗肿瘤作用,而在激发抗肿瘤主动免疫方面的功效较低。比如,PD-1抗体只能提高Te对肿瘤细胞的免疫效应,PD-L1抗体只对PD-L1阳性肿瘤有较好的疗效。但是,免疫细胞和恶性肿瘤通常表达多种不同的免疫抑制分子,不同个体免疫抑制分子表达水平差异较大,也不是所有患者能够自身产生较多的抗肿瘤Te细胞。因此,要提高免疫治疗药物的抗肿瘤疗效,必须首先激发机体的抗肿瘤主动免疫,或激发主动免疫药物与检查点抑制剂联合用药,才能获得较好的疗效。
CD80是重要的免疫共刺激分子(co-stimulate moleculars,CSMs),在抗肿瘤和抗病毒感染免疫中发挥重要作用。由于恶性肿瘤存在免疫抑制机制,必须要有免疫共刺激分子参与,才能激发机体产生有效的抗肿瘤免疫反应。CD80是最为重要的免疫共刺激分子,最早在活化的B淋巴细胞中发现,称为B7.1。后来的研究发现,CD80广泛分布于抗原递呈细胞(APC)、树突状细胞(DC)、T细胞、B细胞和髓系细胞。人CD80是由288个氨基酸残基(aa)组成的Ⅰ型跨膜蛋白,基因位于3号染色体长臂(3q3.1)。其中1-34aa为信号肽,35-242为胞外结构,含两段免疫球蛋白样结构区。243-263aa为跨膜的螺旋结构,264-288为胞内结构区。小鼠CD80由306个aa组成,与人CD80氨基酸序列的同源性很高,有相似的结构特征和生物学作用。
已知CD80有两个主要受体,一个是CD28,另一个是CTLA-4。CD28在T细胞上组成性表达。CD80通过与CD28结合,刺激初始T细胞增殖与活化,使之分化为Ⅰ类辅助T细胞(Th1),并分泌白细胞介素2(IL-2),促进细胞免疫。CD80-CD28的结合反过来也刺激APC细胞分泌IL-6,进一步刺激T细胞增殖与活化。CTLA-4是负调节受体,主要存在于Te、Th1、Treg和Tm细胞。CD80与CTLA-4结合抑制Th、Tm细胞活化,刺激Treg细胞增殖,诱导产生免疫耐受。
CD80具有活化和调节Tm、Te和Treg的作用。小鼠敲除CD80基因后,免疫力显著下降。经淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)刺激后,外周血和脾脏Th1、Treg、Tm和Te细胞数量全面减少。
仅含胞外结构域的可溶性CD80(简称sCD80)不仅能激活细胞免疫反应,并且能阻止免疫抑制分子的作用,显示出非常好的抗肿瘤作用,有望成为高效、适用范围广的免疫治疗新药。以往,CD80主要作为免疫佐剂分子,通过转染细胞或与抗原共表达的方式用于制备肿瘤疫苗或病原微生物疫苗。人可溶性CD80(简称hsCD80)基因转染人黑色素瘤细胞,能克服PD-L1所引起的免疫抑制作用,诱导产生免疫反应,抑制在接种到小鼠皮下的人黑色素瘤异位瘤的生长和转移。
最新研究显示,小鼠可溶性CD80(sCD80)能显著提高小鼠及人外周血淋巴细胞的抗肿瘤免疫反应。注射sCD80-Fc后,荷瘤小鼠活化淋巴细胞数量、效应淋巴细胞数量及IFN-γ分泌量皆显著增高,存活时间大大延长。sCD80可以通过多条途径发挥抗肿瘤作用:①通过与T细胞膜上CD28的相互作用,增强特异性抗肿瘤免疫反应;②通过下调PD-L1的表达,以及与PD-L1的竞争结合,阻碍免疫抑制分子PD-L1、PD-L2与受体PD-1的结合,增强Te的抗肿瘤免疫杀伤效应;③CD80还能与其他活化的检查点分子CTLA-4、TIM3和LAG-3等分子结合,克服免疫耐受,激发抗肿瘤免疫反应。CD80能刺激CD28基因敲除小鼠T淋巴细胞的分化。比较研究结果显示,可溶性CD80的抗肿瘤疗效显著好于抗PD-1、抗PD-L1和抗CTLA-4抗体,而且适用范围更广,适合各种恶性肿瘤的治疗,显示出非常好的抗肿瘤治疗前景。
然而,现有的免疫治疗药物除了适用范围小以外,还存在生产成本高、用药不便两大固有缺点,限制了其在临床上推广使用。传统的生物药物(包括抗体)的生产都离不开蛋白的分离和纯化,必须注射途径给药,存在生产成本高和用药不便这两大固有缺点。如果采用传统的生产方式制备sCD80,依然存在生产成本高、用药不便两大难于克服的问题。因此,有必要开发新的sCD80的表达生产方式和给药途径。
胃肠道是最简便、经济的生物药物生成与转化的生物反应器,乳酸菌等益生菌是免疫治疗药物口服给药途径的良好载体。我们人体自身的胃肠道是一个复杂、动态的“微生态世界”,也是一个高效的生化代谢“工厂”。据估计,一个成人肠道内的细菌总数超过1014,其生化代谢的总量相当于肝脏的代谢总量。如果能有效地利用胃肠道这个“工厂”,把它作为一个药物生成与转化的生物反应器,无疑具有经济、便利、高效的优点,为疾病预防和治疗提供一条新途径。
乳酸菌、双歧杆菌是肠道生物反应器最合适、最安全的宿主菌。乳酸菌、双歧杆菌等益生菌长期生长存在于口腔、阴道和人体消化道,尤其是下消化道(回肠、结肠)等缺氧部位,人体甚至把它们当成自身的一部分,基本不产生免疫排斥反应。益生菌具有改善肠道微生态环境、抑制致病菌生长,促进营养吸收、分解有毒产物、免疫调理和预防肿瘤发生等许多功能作用。乳酸菌、双歧杆菌在下消化道存留时间较长,数量多,并有累积效应,利于肽类药物表达和吸收利用,非常适合作为多肽药物在肠道内表达和给药的载体。
近年来,利用基因工程益生菌进行口服疫苗制备或基因治疗成为研究热点。益生菌可用于表达轮状病毒抗原、破伤风毒素C等抗原制备口服疫苗,或表达胞嘧啶脱氨酶(CD)基因进行恶性肿瘤的基因治疗。利用乳酸菌等益生菌表达干扰素、胸腺肽等免疫因子在抗病毒感染和恶性肿瘤等疾病动物模型的治疗研究中均获得了肯定的疗效。用乳球菌表达白细胞介素10(IL-10)治疗肠炎研究已经完成Ⅱ期临床试验。
利用乳酸菌表达人可溶性CD80(简称hsCD80),虽然可以克服生产成本高、用药不便两大难题。但是仅限于胃肠道恶性肿瘤的治疗。要使乳酸菌表达的人sCD80发挥全身抗肿瘤免疫作用,必须解决肠道内乳酸菌表达的大分子sCD80穿过肠粘膜屏障进入血液循环的问题。
与霍乱毒素B亚基(CTB)融合表达是促进大分子药物穿越肠粘膜屏障的有效途径。CTB是霍乱毒素与肠上皮细胞识别并结合的调节亚基。霍乱毒素由1个A亚基(CTA)和5个B亚基(CTB)组成。CTB能与肠上皮细胞上的受体——神经节苷脂M1(GM1)特异性结合,没有肠毒性。肠上皮细胞存在丰富的GM1。与CTB融合表达是重组蛋白通过肠黏膜屏障的有效方法。
有研究显示,将绿色荧光蛋白(GFP)或IFN-α与CTB在烟草中融合表达,可以显著提高烟叶口服后GFP和IFN-α通过肠黏膜吸收进入血液循环的效率。黏膜下、下腔静脉、肝脏、脾脏等组织都可检测到一定含量的GFP。在GFP与CTB之间加入特殊的蛋白酶酶切序列,融合蛋白进入肠上皮细胞后被酶切,GFP与CTB解离。只有在上皮细胞内才能检测到CTB,而下腔静脉、肝脏、脾脏等组织只能检测到GFP。说明将目的蛋白与CTB融合表达有望突破肠粘膜屏障。
发明内容
本发明的目的在于提供人可溶性CD80(简称hsCD80)融合基因转化乳酸菌,该转化乳酸菌可制成口服剂型,不携带抗生素或药物耐药基因,能在体内或体外,尤其是肠道内被诱导剂Nisin(乳球菌素)诱导表达,用于防治各种疾病比如肿瘤等。
本发明的目的还在于提供上述人可溶性CD80融合基因转化乳酸菌在制备具有肿瘤免疫治疗效果的口服活菌药物中的应用。
本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现:人可溶性CD80融合基因转化乳酸菌,包括hsCD80基因或CTB-hsCD80融合基因转化乳酸菌,是将所述hsCD80基因或CTB-hsCD80融合基因插入到乳酸菌表达载体pLN并转化乳酸菌获得,其中所述CTB-hsCD80融合基因主要由hsCD80基因和CTB基因连接而成,且在所述hsCD80基因与所述CTB基因之间引入弗林蛋白酶酶切多肽序列对应的cDNA序列,在所述hsCD80基因的胞外区结构域的N端引入分泌性信号肽SPK1。
可选地,所述转化乳酸菌不含耐药基因,其能在肠腔内或体外诱导表达并分泌重组蛋白hsCD80和/或CTB-hsCD80。
本发明中的hsCD80或CTB-hsCD80融合基因转化乳酸菌可以在肠道内表达,可直接在肠道内起作用,防治肠道肿瘤。
其中本发明中CTB-hsCD80融合基因转化乳酸菌表达的CTB-hsCD80融合蛋白还可通过CTB受体介导的内吞作用被肠上皮细胞内吞,并被弗林蛋白酶特异性酶切,释放保留有免疫学活性的游离hsCD80到细胞外或血液循环中,突破肠黏膜屏障,发挥刺激淋巴细胞活化,提高机体细胞免疫水平,阻断PD-1/PD-L1等免疫抑制通路的作用。
上述人可溶性CD80融合基因转化乳酸菌的制备方法,可以包括以下步骤:
(1)首先合成hsCD80和CTB-hsCD80融合基因,并在CTB-hsCD80融合基因中的hsCD80基因和CTB基因之间引入弗林蛋白酶酶切多肽序列对应的cDNA序列;
(2)将hsCD80和或CTB-hsCD80融合基因插入到乳酸菌表达载体pLN中,用电转化方法将重组hsCD80和CTB-hsCD80融合基因表达载体转化到LacF基因缺失的乳酸菌中,采用以乳糖为唯一碳源的选择培养基筛选出hsCD80和CTB-hsCD80融合基因转化乳酸菌。
在该人可溶性CD80融合基因转化乳酸菌的制备方法中:
可选地,步骤(2)中所述乳酸菌表达载体pLN为含LacF营养筛选基因,不含抗生素耐药基因,可用诱导剂nisin(乳球菌素)在体外或肠腔内诱导目的基因表达的质粒载体。
可选地,步骤(3)中所述乳酸菌为乳酸乳球菌(LactococcusLactis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus Acidophilus)、或植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)等乳酸菌属乳酸菌。
进一步地,所述人可溶性CD80融合基因转化乳酸菌的制备方法包括以下步骤:
(1)首先合成SPK1-hsCD80和SPK1-CTB-hsCD80融合基因,并在CTB-hsCD80融合基因中的hsCD80基因和CTB基因之间引入弗林蛋白酶酶切多肽序列对应的cDNA序列;
(2)将SPK1-hsCD80和SPK1-CTB-hsCD80融合基因插入到乳酸菌表达载体pLN中,获得重组质粒pLN-SPK1-hsCD80和pLN-SPK1-CTB-hsCD80。
(3)常规电转化方法将重组质粒pLN-SPK1-hsCD80和pLN-SPK1-CTB-hsCD80转化到LacF基因缺失的乳酸菌中,采用以乳糖为唯一碳源的选择培养基筛选出hsCD80基因或CTB-hsCD80融合基因转化乳酸菌。
即上述转化乳酸菌的制备方法包括:首先合成hsCD80和CTB-hsCD80融合基因,并对密码子进行优化使之适合乳酸菌表达;在hsCD80和CTB基因之间引入弗林蛋白酶特有的氨基酸酶切序列;将hsCD80和CTB-hsCD80融合基因插入到革兰氏阳性菌广泛宿主表达载体pLN中,上游与SPK1信号肽(片球菌K1信号肽)基因序列连接,受乳球菌素启动子(Pnisin)控制表达;然后用电转化方法将hsCD80或CTB-hsCD80融合基因表达载体转化到LacF基因缺失的乳酸菌中,采用以乳糖为唯一碳源的选择培养基筛选hsCD80和CTB-hsCD80转化乳酸菌。
在该转化乳酸菌的制备方法中:
可选地,乳酸菌宿主菌为LacF基因缺失的乳酸乳球菌(lactococcus lactis)。
可选地,所述SPK1-hsCD80或SPK1-CTB-hsCD80融合基因克隆到乳酸菌表达载体pLN中的方法为常规基因重组和克隆方法。
可选地,所述乳酸菌表达载体pLN为来源于nisin诱导表达系统(NICE),含LacF营养筛选基因,不含抗生素耐药基因的(其中nisin诱导表达系统(NICE)是目前较为通用的表达载体,市售载体为pNICE)。
可选地,电转化时的电击条件为:电压1.6kV-2.5kV,电容25μF,电阻200Ω。
可选地,所述选择培养基为只含乳糖为唯一碳源的EM培养基,乳糖的质量体积百分含量为0.5%-2.0%。
进一步的,上述转化乳酸菌的制备方法包括以下步骤:
一、hsCD80融合基因SPK1-hsCD80和SPK1-CTB-hsCD80的合成:
(1.1)根据SPK1信号肽氨基酸序列,对密码子进行优化,获得SPK1基因cDNA序列,其序列表如SEQ ID NO:1所示;
(1.2)根据hsCD80基因序列及功能区域结构,并对密码子进行优化,获得只含hsCD80胞外区结构域的hsCD80基因cDNA序列,其序列表如SEQ ID NO:2所示;
(1.3)根据CTB基因序列,并对密码子进行优化,获得CTB基因cDNA序列,其序列表如SEQ ID NO:3所示;
(1.4)将所述SPK1和所述hsCD80基因的cDNA序列连接起来形成融合基因,并在融合基因5’端和3’端分别加入NcoI和XbaI限制性核酸内切酶酶切序列,合成SPK1-hsCD80基因;
(1.5)将所述SPK1、CTB、hsCD80基因的cDNA序列连接形成融合基因,并在CTB与hsCD80基因之间引入弗林蛋白酶酶切多肽序列对应的cDNA序列,在融合基因5’端和3’端分别加入NcoI和XbaI限制性核酸内切酶酶切序列,合成SPK1-CTB-hsCD80融合基因;
二、hsCD80和CTB-hsCD80融合基因转化体的构建
(2.1)将SPK1-hsCD80和SPK1-CTB-hsCD80融合基因乳酸菌表达载体pLN中,得到连接物;
(2.2)采用电击转化法,将连接物转化到LacF基因缺失的乳酸乳球菌中,电击后,采用以乳糖为唯一碳源的选择培养基EM筛选获得hsCD80基因或CTB-hsCD80融合基因转化乳酸菌。
本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现:上述人可溶性CD80融合基因转化乳酸菌在制备具有疾病免疫治疗效果的口服活菌药物中的应用。
可选地,所述疾病为肿瘤、病毒感染疾病、细胞内细菌感染疾病、原发性和继发性免疫低下疾病。
可选地,所述肿瘤为结肠直肠癌或黑色素瘤。
可选地,所述口服活菌药物为活菌悬液、乳制品、活菌菌粉、菌片或胶囊。
与现有技术相比,本发明具有以下优点:
(1)本发明中人hsCD80和CTB-hsCD80融合基因转化乳酸菌的特点是不携带抗生素或药物耐药基因;
(2)本发明中hsCD80和CTB-hsCD80融合基因转化乳酸菌中的hsCD80和CTB-hsCD80融合基因能在体外或体内,尤其是肠道内被诱导剂Nisin诱导表达;
(3)本发明中hsCD80和CTB-hsCD80融合基因转化乳酸菌在肠道内表达,可直接在肠道内起作用,防治肠道肿瘤;
(4)本发明中CTB-hsCD80融合基因转化乳酸菌表达的CTB-hsCD80融合蛋白可通过CTB受体介导的内吞作用被肠上皮细胞内吞,并被弗林蛋白酶特异性酶切,释放保留有免疫学活性的游离hsCD80到细胞外或血液循环中,突破肠黏膜屏障,发挥刺激淋巴细胞活化,提高机体细胞免疫水平,阻断PD-1/PD-L1等免疫抑制通路的作用;
(5)本发明中hsCD80和CTB-hsCD80融合基因转化乳酸菌可制备成活菌悬液、乳制品、活菌菌粉、菌片或胶囊等活菌制剂,口服后能在人体肠道内增殖和定植,应用于肿瘤、病毒感染或细胞内细菌感染、原发性和继发性免疫低下等疾病的预防与治疗。
附图说明
图1是实施例1中CTB-hsCD80融合基因乳酸菌表达载体构建示意图;
图2是实施例2中hsCD80和CTB-hsCD80转化乳酸菌活菌口服显著抑制CT-26小鼠结肠癌皮下移植瘤生长的比较图,A1为解剖照片;A2为瘤体大小统计图;
图3是实施例3中hsCD80和CTB-hsCD80转化乳酸菌活菌口服显著抑制B16F10小鼠黑色素瘤移植瘤的生长的比较图,A1为解剖照片;A2为瘤体大小统计图;
图4是实施例3中hsCD80和CTB-hsCD80转化乳酸菌活菌口服显著刺激荷B16F10瘤小鼠脾脏淋巴细胞分化和成熟的统计图;
图5是实施例4中hsCD80和CTB-hsCD80转化乳酸菌活菌口服显著抑制APC小鼠原发性结肠癌生长的比较图,A1为解剖照片;A2为统计图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的应用方法。下述实施例和附图仅用于示例性说明,不能理解为对本发明的限制。除非特别说明,下述实施例中使用的试剂原料为常规市购或商业途径获得的生试剂原料,除非特别说明,下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。
实施例1由hsCD80和CTB-hsCD80融合基因转化乳酸菌的制备、筛选和鉴定
1、hsCD80和CTB-hsCD80融合基因的合成与重组
(1)根据SPK1(片球菌K1信号肽)信号肽氨基酸序列,对密码子进行优化,使之适合乳酸菌高效表达,设计SPK1基因cDNA序列(SEQ ID NO:1)。
(2)根据人可溶性CD80(hsCD80,是人可溶性CD80的缩写)基因序列及功能区域结构,并对密码子进行优化,使之适合乳酸菌高效表达,设计只含CD80胞外区结构域的hsCD80基因cDNA序列(SEQ ID NO:2),并在羧基端(C-端)加上Flag标签序列。根据CTB基因序列,并对密码子进行优化使之适合乳酸菌高效表达,设计CTB基因cDNA序列(SEQ ID NO:3)。
(4)将SPK1和hsCD80基因cDNA序列连接起来形成融合基因,并在融合基因5’端和3’端分别加入NcoI和XbaI限制性核酸内切酶酶切序列,交由基因合成公司合成SPK1-hsCD80融合基因双链DNA。
(5)将SPK1、CTB、hsCD80基因cDNA序列连接形成融合基因,并在CTB与hsCD80基因之间引入弗林蛋白酶酶切多肽序列对应的cDNA序列,在融合基因5’端和3’端分别加入NcoI和XbaI限制性核酸内切酶酶切序列,交由基因合成公司合成SPK1-CTB-hsCD80融合基因全基因双链DNA。
2、hsCD80和CTB-hsCD80融合基因乳酸菌表达载体构建
(1)分别用NcoI和XbaI核酸内切酶酶切SPK1-hsCD80和SPK1-CTB-hsCD80融合基因片段以及表达载体pLN,琼脂糖电泳分离目的基因片段和载体片段。
(2)分别切取SPK1-hsCD80和SPK1-CTB-hsCD80融合基因片段以及pLN载体片段(市售常规载体),用凝胶DNA回收试剂盒回收纯化融合基因和载体DNA片段。将融合基因和载体DNA片段按一定比例混合,加入连接缓冲液和T4 DNA连接酶,16℃连接6-12小时,使之连接成重组表达载体。
(3)采用电穿孔法转化乳酸菌。将1-3μg连接产物加入到100μl LacF基因缺失乳球菌(BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心提供)的感受态细胞悬液中,混匀后转移到2mm宽的电击杯中,将电击杯置于电击槽中,设定电击条件:2.5kV,电容25μF,电阻200Ω。
(4)hsCD80和CTB-hsCD80基因转化乳酸菌菌落的培养筛选。电击完后,加入200-400μL含有20mM MgCl2,2mM CaCl,0.5%乳糖的EM培养基悬浮、冲洗细菌,涂布到含有0.5%(w/v)乳糖和0.04%溴甲酚紫的EM琼脂糖平板,置于30℃厌氧箱培养48h。挑取单菌落于5mL含有0.5%乳糖的EM液体培养基中扩增培养24h。
(5)hsCD80和CTB-hsCD80转化乳酸菌的测序鉴定。收集收集5-10mL菌液细菌,加入终浓度为10mg/mL溶菌酶37℃消化30min,质粒提取试剂盒常规方法提取质粒。提取质粒送DNA测序公司用通用测序引物(TGCTTTATCAACTGCTGCTT)进行hsCD80和CTB-hsCD80基因转化乳球菌的测序鉴定。
(6)测序鉴定正确的hsCD80和CTB-hsCD80转化乳酸菌用EM培养基扩大培养,加入甘油至终浓度为25%,分装后置-20℃冰箱保存,得到hsCD80基因和CTB-hsCD80融合基因转化乳酸菌原始菌种。
CTB-hsCD80融合基因乳酸菌表达载体构建示意图如图1所示,连接有乳酸菌分泌型信号肽(signal)并引入FLAG标签的CTB-hsCD80融合基因插入到乳酸菌表达载体pLN的NcoI和XbaI限制性酶切位点,获得pLN-CTB-hsCD80重组乳酸菌表达载体,电转化获得CTB-hsCD80融合基因转化乳酸菌。
实施例2hsCD80和CTB-hsCD80转化乳酸菌活菌在防治小鼠结肠癌移植瘤中的应用
(1)CT-26小鼠结肠癌移植瘤模型的建立
选择8周龄、体重为18-20g的健康雄性BABL/c小鼠,将体外培养的CT-26小鼠结肠癌细胞悬液(约1×106个)注射接种到每只小鼠皮下,待小鼠移植瘤长到直径为0.5cm后开始喂饲菌粉治疗。
(2)转化菌的培养
用MRS培养基复苏hsCD80和CTB-hsCD80转化乳酸菌(实施例1中获得),细菌达到一定浓度后,按一定比例(1:100-500)接种到MRS培养基中,等细菌密度达到OD600为0.6-1.0时收集细菌。
(3)活菌悬液的制备
细菌培养到一定密度后,5000g-10000g离心5-10分钟收集细菌,加可食用糖盐混合溶液或饮料重悬,置4-8℃冰箱保存。
(4)冻干活菌制剂的制备
细菌培养到一定密度后,5000g-10000g离心5-10分钟收集细菌,按一定比例加防冻保护溶液(15%脱脂奶粉,5%甘油,0.9%NaCl)重悬混合,分散均匀,放入超低温冰箱预冻至完全冻结,再放入冷冻干燥机,在真空度10.0-12.00Pa条件下干燥至菌粉含水量<3%。冻干结束后,取出菌粉,分装到无菌密封容器中,-20℃保存待用。
(5)喷雾干燥肠溶活菌制剂的制备
细菌培养到一定密度后,5000g-10000g离心5-10分钟收集细菌,加入肠溶性囊材和保护剂重悬,在一定的干燥温度100-120℃,风机频率50HZ,液体流速20r/s的条件下喷雾干燥成肠溶性活菌菌粉。4-8℃冰箱保存备用。
(6)转化乳酸菌活菌菌粉细菌活力测定
称取0.1g菌粉,用1.0mLMRS培养基重悬,按1:100、1:1000、1:1000梯度稀释,分别取0.1mL菌液涂布于MRS固体培养基平板中,置厌氧培养箱37℃培养48h。计算每克菌粉落形成单位(CFU/g)。
(7)hsCD80和CTB-hsCD80转化乳酸菌活菌在防治结肠癌转移瘤中的应用
将CT-26结肠癌皮下移植瘤分成4组,每组各6只小鼠。分别为小鼠pLN空载体转化乳球菌对照组(pLN),pLN-hsCD80转化菌组(hsCD80),pLN-CTB-hsCD80转化菌组(CTB-hsCD80),阳性对照组Pembrolizumab抗体腹腔注射组(Pem Mab)。
各组小鼠分别喂饲对应的乳酸菌活菌菌粉0.1mL/只(约6×109cfu)。每日一次,连续喂饲4周。Pem Mab组隔天腹腔注射200ug Pembrolizumab药物。隔天测量小鼠的肿瘤的大小,观察各组小鼠状态。
当空白对照组小鼠瘤体直径超过2.5cm,毛发凌乱、稀疏,身体状态很差时处死小鼠。处死前摘眼球取外周血后,断颈处死,测量瘤体大小、重量,计算体积及抑瘤率。
解剖小鼠,观测肿瘤转移情况;分离脾脏淋巴细胞,流式细胞术分析小鼠细胞免疫水平;取瘤体、肝脏、脾脏、肾脏、胃、肠道内容物、肌肉等组织,免疫学测定sCD80的含量及分布;各种置4%多聚甲醛溶液中固定,切片观测病理变化及肿瘤转移情况。
如图2所示,hsCD80和CTB-hsCD80转化乳酸菌活菌口服显著抑制CT-26小鼠结肠癌的生长。其中hsCD80和CTB-hsCD80转化乳酸菌组(CTB-hsCD80)瘤体的体积显著小于空载体pLN转化菌组(pLN)。CTB-hsCD80转化乳酸菌组(CTB-hsCD80)瘤体的体积显著小于hsCD80转化菌组和空载体转化菌组(pLN)瘤体的大小,并且CTB-hsCD80组瘤体的体积小于Pem Mab组。
实施例3hsCD80和CTB-hsCD80转化乳酸菌活菌在防治小鼠黑色素瘤移植瘤中的应用
(1)B16f10小鼠黑色素瘤移植瘤模型的建立
选择8周龄、体重为18-20g的健康雄性BABL/c小鼠,将体外培养的B16f10小鼠黑色素瘤细胞悬液(约1×106个)注射接种到每只小鼠皮下,待小鼠移植瘤长到直径为0.5cm后开始喂饲菌粉治疗。
(2)hsCD80和CTB-hsCD80转化乳酸菌活菌的培养,活菌悬液、冻干活菌制剂,以及肠溶活菌制剂的制备方法及活力测定方法同实施例2。
(3)hsCD80和CTB-hsCD80转化乳酸菌活菌在防治黑色素瘤移植瘤中的应用
将黑色素瘤移植瘤模型小鼠分成3组,每组各6只小鼠,分别为pLN空载体转化乳球菌对照组(pLN),pLN-hsCD80组(hsCD80),pLN-CTB-hsCD80组(CTB-hsCD80)。
各组小鼠分别喂饲对应的乳酸菌活菌菌粉0.1mL/只(约6×109cfu)。每日一次,连续喂饲4周。隔天测量小鼠的肿瘤的大小,观察各组小鼠状态。当VC对照组小鼠瘤体直径超过2.5cm,毛发凌乱、稀疏,身体状态很差时处死小鼠。处死前摘眼球取外周血后,断颈处死,测量瘤体大小、重量,计算体积及抑瘤率。解剖小鼠,观测肿瘤转移情况;分离脾脏淋巴细胞,流式细胞术分析小鼠细胞免疫水平;病理检测和免疫学检测方法同上。
如图3所示,hsCD80和CTB-hsCD80转化乳酸菌活菌口服显著抑制B16F10小鼠黑色素瘤移植瘤的生长。CTB-hsCD80转化乳酸菌组(CTB-hsCD80)瘤体的体积显著小于hsCD80转化菌组(hsCD80)和空载体转化菌组(pLN)瘤体的大小。
如图4所示,hsCD80和CTB-hsCD80转化乳酸菌活菌口服显著刺激荷B16F10瘤小鼠脾脏淋巴细胞分化和成熟。CD80-CTB转化乳酸菌组(CTB-hsCD80)小鼠脾脏成熟淋巴细胞(CD3+CD4+OR CD3+IFN-γ+)数量显著高于hsCD80转化菌组(hsCD80)和空载体转化菌组(pLN)小鼠;效应淋巴细胞(CD3+CD8+)显著高于hsCD80组和pLN组小鼠。
实施例4hsCD80和CTB-hsCD80转化乳酸菌活菌在防治原发性结肠直肠癌中的应用
(1)hsCD80和CTB-hsCD80转化乳酸菌复苏、培养及活菌菌粉制备等方法与实施例2中的方法相同。
(2)结直肠癌APCmin/+模型构建
选择APCmin/+雄鼠与C57BL雌鼠,按每笼1只雄鼠三只雌鼠比例合笼。待产下乳鼠2周后,剪脚趾标记,剪取一小截尾巴或小片耳朵。常规方法提取组织基因组DNA,按照南京模式动物资源库的方法,用聚合酶链反应(PCR)方法扩增目的DNA片段,鉴定APCmin/+杂合子。PCR产物只有700bp条带为野生型小鼠;只有300bp条带为突变纯合子小鼠;同时有300bp和700bp条带即为APCmin/+杂合子小鼠。
取6-8周APCmin/+雌雄造模,每只小鼠根据体重注射1mg/mL的AOM,注射剂量为10μLAOM/g。随后饲喂高脂饲料,观察小鼠状态和大便情况,每3天测量小鼠体重,待小鼠出现便血,甚至出现脱肛现象,则造模成功。
(3)hsCD80和CTB-hsCD80转化乳酸菌活菌口服肠道途径防治原发性小鼠结肠癌的应用
APC模型小鼠随机分成3组,每组最少6只。治疗实验选用造模成功的APCmin/+,治疗组喂饲0.1mL(约6×109cfu)。
分别为pLN-hsCD80组(hsCD80),pLN-CTB-hsCD80组(CTB-hsCD80),每日喂饲一次;空载体对照组喂饲等量pLN转化乳酸菌菌粉(pLN组)。
隔天测量小鼠的食量和体重,注意观察小鼠状态和大便情况,等空白对照组小鼠出现便血脱肛严重,体重下降明显时处死小鼠。处死前禁食12h,摘眼球取外周血后,断颈处死,测量肠管的长度、注意观测肠管内瘤体的大小,同时探查小鼠肠系膜淋巴结,肝脏、肺部是否有转移灶,切取肠管组织和肠内容物保存备用。
如图5所示,hsCD80和CTB-hsCD80转化乳酸菌活菌口服显著抑制APC小鼠原发性结肠癌的生长。hsCD80和CTB-hsCD80转化乳酸菌组(hsCD80组,CTB-hsCD80组)结、直肠部位瘤体的数目和大小均显著小于空载体转化菌组(pLN)小鼠。其中hsCD80组疗效最好,结、直肠部位瘤体完全消失。
本发明不局限于上述特定的实施方案范围内,上述实施方案仅仅是为了能够对本发明的使用过程进行详细地说明,而且有相等功能的生产方法和技术细节也属于本发明内容的一部分。事实上,本领域技术人员根据前文的描述,就能够根据各自需要找到不同的调整方案,这些调整都应在本文所附的权利要求书的范围内。
序列表
<110> 广州维生君生物科技有限公司
<120> 人可溶性CD80融合基因转化乳酸菌及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 72
<212> DNA
<213> 片球菌K1信号肽(SPK1)
<400> 1
atgaaaaaga ttcttacact tgtctttatt tttgttattt caattcttac agctacaaat 60
gttcatgcat ta 72
<210> 2
<211> 624
<212> DNA
<213> 人可溶性CD80(hsCD80)
<400> 2
gctatccatg ttactaagga agtgaaagaa gtggcaacgc tgtcctgtgg tcacaatgtt 60
tctgttgaag agctggcaca aactcgcatc tactggcaaa aggagaagaa aatggtgctg 120
actatgatgt ctggggacat gaatatatgg cccgagtaca agaaccggac catctttgat 180
atcactaata acctctccat tgtgatcctg gctctgcgcc catctgacga gggcacatac 240
gagtgtgttg ttctgaagta tgaaaaagac gctttcaagc gggaacacct ggctgaagtg 300
acgttatcag tcaaagctga cttccctaca cctagtatat ctgactttga aattccaact 360
tctaatatta gaaggataat ttgctcaacc tctggaggtt ttccagagcc tcacctctcc 420
tggttggaaa atggagaaga attaaatgcc atcaacacaa cagtttccca agatcctgaa 480
actgagctct atgctgttag cagcaaactg gatttcaata tgacaaccaa ccacagcttc 540
atgtgtctca tcaagtatgg acatttaaga gtgaatcaga ccttcaactg gaatacaacc 600
aagcaagagc attttcctga taac 624
<210> 3
<211> 372
<212> DNA
<213> 霍乱毒素B亚基(CTB)
<400> 3
atgattaaat taaaatttgg tgtttttttt acagttttac tatcttcagc atatgcaaat 60
ggaacacctc aaaatattac tgatttgtgt gcagaatacc acaacacaca aatacatacg 120
ctaaatgata agatattttc gtatacagaa tctctagctg gaaaaagaga gatggctatc 180
attactttta agaatggtgc aacttttcaa gtagaagtac caggtagtca acatatagat 240
tcacaaaaaa aagcgattga aaggatgaag gataccctga ggattgcata tcttactgaa 300
gctaaagtcg aaaagttatg tgtatggaat aataaaacgc ctcatgcgat tgccgcaatt 360
agtatggcaa at 372

Claims (4)

1.人可溶性CD80融合基因转化乳酸菌,其特征是:包括hsCD80基因或CTB-hsCD80融合基因转化乳酸菌,是将所述hsCD80基因或CTB-hsCD80融合基因插入到乳酸菌表达载体pLN并转化乳酸菌获得,其中所述CTB-hsCD80融合基因主要由hsCD80基因和CTB基因连接而成,且在所述hsCD80基因与所述CTB基因之间引入弗林蛋白酶酶切多肽序列对应的cDNA序列,在所述hsCD80基因的胞外区结构域的N端引入分泌性信号肽SPK1;
所述人可溶性CD80融合基因转化乳酸菌的制备方法,包括以下步骤:
一、hsCD80融合基因SPK1-hsCD80和SPK1-CTB-hsCD80的合成:
(1.1)根据SPK1信号肽氨基酸序列,对密码子进行优化,获得SPK1基因cDNA序列,其序列表如SEQ ID NO:1所示;
(1.2)根据hsCD80基因序列及功能区域结构,并对密码子进行优化,获得只含hsCD80胞外区结构域的hsCD80基因cDNA序列,其序列表如SEQ ID NO:2所示;
(1.3)根据CTB基因序列,并对密码子进行优化,获得CTB基因cDNA序列,其序列表如SEQID NO:3所示;
(1.4)将所述SPK1和所述hsCD80基因的cDNA序列连接起来形成融合基因,并在融合基因5’端和3’端分别加入NcoI和XbaI限制性核酸内切酶酶切序列,合成SPK1-hsCD80基因;
(1.5)将所述SPK1、CTB、hsCD80基因的cDNA序列连接形成融合基因,并在CTB与hsCD80基因之间引入弗林蛋白酶酶切多肽序列对应的cDNA序列,在融合基因5’端和3’端分别加入NcoI和XbaI限制性核酸内切酶酶切序列,合成SPK1-CTB-hsCD80融合基因;
二、hsCD80和CTB-hsCD80融合基因转化体的构建
(2.1)将SPK1-hsCD80和SPK1-CTB-hsCD80融合基因乳酸菌表达载体pLN中,得到连接物;
(2.2)采用电击转化法,将连接物转化到LacF基因缺失的乳酸乳球菌中,电击后,采用以乳糖为唯一碳源的选择培养基EM筛选获得hsCD80基因或CTB-hsCD80融合基因转化乳酸菌。
2.根据权利要求1所述的人可溶性CD80融合基因转化乳酸菌,其特征是:所述转化乳酸菌不含耐药基因,其能在肠腔内或体外诱导表达并分泌重组蛋白hsCD80和/或CTB-hsCD80。
3.权利要求1所述的人可溶性CD80融合基因转化乳酸菌在制备具有疾病免疫治疗效果的口服活菌药物中的应用;所述疾病为肿瘤,所述肿瘤为结肠直肠癌或黑色素瘤。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征是:所述口服活菌药物为活菌悬液、乳制品、活菌菌粉、菌片或胶囊。
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