CN105983103A - 基因工程菌vnp20009-m在制备预防和治疗癌症转移的药物上的应用 - Google Patents

基因工程菌vnp20009-m在制备预防和治疗癌症转移的药物上的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105983103A
CN105983103A CN201610081270.9A CN201610081270A CN105983103A CN 105983103 A CN105983103 A CN 105983103A CN 201610081270 A CN201610081270 A CN 201610081270A CN 105983103 A CN105983103 A CN 105983103A
Authority
CN
China
Prior art keywords
plasmid
vnp20009
cancer
carcinoma
methioninase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610081270.9A
Other languages
English (en)
Inventor
赵子建
周素瑾
林艳
赵正刚
李芳红
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Huajin Pharmaceutical Technology Co Ltd
Original Assignee
Guangzhou Huajin Pharmaceutical Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou Huajin Pharmaceutical Technology Co Ltd filed Critical Guangzhou Huajin Pharmaceutical Technology Co Ltd
Priority to JP2017567516A priority Critical patent/JP6853793B2/ja
Priority to EP16764155.4A priority patent/EP3272363A4/en
Priority to AU2016232910A priority patent/AU2016232910B2/en
Priority to PCT/CN2016/074408 priority patent/WO2016145974A1/zh
Priority to CA2979760A priority patent/CA2979760C/en
Priority to KR1020177029565A priority patent/KR20170129201A/ko
Publication of CN105983103A publication Critical patent/CN105983103A/zh
Priority to US15/706,754 priority patent/US20180008682A1/en
Priority to ZA2017/06397A priority patent/ZA201706397B/en
Priority to HK18109249.0A priority patent/HK1253770A1/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/51—Lyases (4)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/005—Enzyme inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y404/00—Carbon-sulfur lyases (4.4)
    • C12Y404/01—Carbon-sulfur lyases (4.4.1)
    • C12Y404/01011—Methionine gamma-lyase (4.4.1.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/42—Salmonella
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了减毒鼠伤寒沙门氏菌的基因工程菌VNP20009‑M在制备预防和治疗转移后癌症的药物上的应用，基因工程菌VNP20009‑M对癌细胞具有肿瘤靶向性以及显著的抑制转移和生长的效应，可以用于制备预防和治疗转移后肿瘤的药物。

Description

基因工程菌VNP20009-M在制备预防和治疗癌症转移的药物上的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及基因工程菌VNP20009-M在制备预防和治疗癌症的药物上的应用。
背景技术
恶性肿瘤是当今社会威胁人类健康和患者生存的重大疾病病种。据世界卫生组织(WHO)统计，2012年全世界新患癌症的病人约1400万，死于癌症约820万人。我国肿瘤登记中心发布的2012年数据显示，中国每年新增癌症病例约350万，约有250万人因此死亡。其中，肿瘤转移则是癌症患者死亡的最主要原因。肿瘤转移是一种复杂的、多步骤的生物学过程，肿瘤患者体内的癌细胞发展到一定程度会通过循环系统转移到远处并存活下来，形成与原发瘤同样类型的肿瘤。转移作为肿瘤的主要恶性表现，严重影响了肿瘤患者的疗效和预后。当临床诊断出原发肿瘤时，约50％的患者已产生了转移。肿瘤的转移是威胁肿瘤患者生存的最大杀手，也是肿瘤治疗的最大瓶颈。在当今种类繁多的抗癌药物市场中，临床一线的化疗药物(如阿霉素、多柔比星、紫杉醇等)大多作用于肿瘤的生存、增殖、血管生存等领域，以肿瘤转移为特异性靶点的药物较为少见，并且仅有的几种抗肿瘤转移药物因其副作用大，患者耐药性等原因而导致药效有限。因此，抗肿瘤转移药物长期处于市场严重缺乏状态，开发治疗肿瘤转移药物具有极为重要的现实意义。
组蛋白甲基转移酶EZH2是多梳抑制复合物2(PRC2)中具有组蛋白甲基转移酶的活性成分，主要通过将三个甲基基团加到组蛋白3的27号赖氨酸(H3K27)参与染色质凝聚，从而抑制相关基因(例如抑癌基因)的转录。研究发现，EZH2及组蛋白H3K27甲基化与癌症密切相关。EZH2首先被发现在淋巴瘤、转移性前列腺癌和乳腺癌中高表达，和乳腺癌的浸润相关。除此之外，EZH2在肺癌、淋巴癌、白血病、胰腺癌、宫颈癌、肠癌、肝癌、胃癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌等许多人类恶性肿瘤中过度表达，而且其表达水平在转移的肿瘤中显著升高，与癌症病人的预后不良密切相关。靶向EZH2药物的临床前模型显示其能够抑制脑癌及前列腺癌的进展。因此，EZH2可以作为治疗癌症转移的潜在药物靶点，通过降低EZH2的表达和活性，从而减少组蛋白的甲基化，增强抑癌基因的表达来治疗肿瘤。
随着细菌以及病毒的靶向性和基因工程技术的发展，20世纪90年代中期以来，细菌治疗肿瘤的研究急速增多。研究人员发现鼠伤寒沙门氏菌可以作为一种很好的基因载体，在小鼠体内能够定向并有效地杀死肿瘤细胞。沙门菌属是一群在人和动物肠道内寄生的革兰氏阴性、侵袭性细胞内兼性厌氧菌。VNP20009为msb B、pur I基因缺失的减毒鼠伤寒沙门菌株，遗传稳定，对抗生素敏感。msb B基因为脂质酰化为内毒素所必需，其缺失使类脂质A末端不能酰化，降低了毒性；pur I基因参与嘌呤代谢，其缺失使细菌的繁殖需要外源性腺嘌呤。VNP20009还降低了自身诱导机体产生的肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)，从而降低炎性反应。因此，它的低致病性提高了用于临床治疗的安全性。VNP20009已被广泛用于癌症研究，它可作用于多种小鼠实体瘤模型，包括黑色素瘤、肺癌、结肠癌、乳腺癌、肾癌。VNP20009作为肿瘤基因治疗载体的一个主要优点是它能够高度靶向聚集于肿瘤部位。研究人员在多种实体肿瘤的小鼠模型中发现，VNP20009在肿瘤内的数量较肝脏等主要器官内高200～l000倍。VNP20009能在肿瘤组织缺氧坏死区优先聚集并繁殖，相同时间内肿瘤组织内细菌的扩增代次显著高于正常组织，使得减毒沙门菌成为新型抗瘤制剂和肿瘤靶向治疗的载体成为可能。沙门菌导致肿瘤生长减慢可能机制包括：肿瘤生长所需要的营养物质为细菌所消耗，细菌所产生的酶，如天冬酰胺酶，可耗竭肿瘤生长必需氨基酸；细菌向胞外微环境分泌的局部毒素或者产生的肿瘤坏死因子α，都可影响肿瘤血管形成；此外，在细菌生长部位的非特异性炎症反应可潜在激活抗肿瘤T细胞。但尚未发现VNP20009对肿瘤转移的抑制作用。
肿瘤细胞为了维持其高增殖率，需要足够的营养。除了糖之外，对甲硫氨酸(Methionine，Met)、谷胺酰氨、精氨酸等需要量尤其大。研究证实甲硫氨酸依赖性是绝大多数肿瘤细胞的共同特征，如乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、肾癌、膀胱癌、黑色素瘤、神经胶质瘤等，而正常细胞不存在Met依赖性。一些体内体外实验相继证实，直接食用甲硫氨酸缺乏的膳食可以延缓肿瘤细胞的增殖。但是若膳食中Met长期缺乏或不足，将会引起机体营养不良、代谢障碍，还可因DNA长期处于低甲基化状态加剧癌变。那么，通过甲硫氨酸酶(L-methioninase)特异性地将Met分解，从而降低体内甲硫氨酸，则能更加有效地抑制肿瘤细胞生长或使之消退。但是，由于哺乳动物本身不表达甲硫氨酸酶，所以外源性给予的方式有一定的副作用，往往引起机体的免疫反应。甲硫氨酸属必需氨基酸，在甲硫氨酸腺甘转移酶催化下，生成S-腺甘甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)。SAM又称为活性甲硫氨酸，是体内最重要的甲基直接供体，参与体内DNA、蛋白质等多种不同物质的甲基转移催化反应。其中，EZH2可以将SAM的活性甲基转移到组蛋白的特定氨基酸上，从而参与染色体的表观修饰，抑制相关基因的转录。我们前期已经制备了表达甲硫氨酸酶的减毒沙门氏菌VNP20009-M，对乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌都能促进细胞凋亡，有很好的抗肿瘤效果。我们已递交专利申请书(专利号201310062253.7、201310688936.3、201410183149.8)，其中201310062253.7已经获得授权。甲硫氨酸酶分解降低体内甲硫氨酸含量，不仅能够促进肿瘤细胞的凋亡，而且有可能通过减少SAM含量有效的抑制EZH2的活性，从而抑制肿瘤的转移。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供减毒鼠伤寒沙门氏菌的基因工程菌VNP20009-M在制备预防和治疗癌症转移的的生物药物上的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
基因工程菌VNP20009-M在制备预防和治疗转移后癌症的药物上的应用，其中，所述基因工程菌为克隆有L-methioninase基因的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009。
所述的基因工程菌VNP20009-M优选为携带了质粒的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，其中，所述质粒上克隆有L-methioninase基因。
其中，所述的基因工程菌VNP20009-M按照如下方法构建得到：将L-methioninase基因亚克隆至质粒中，得到L-methioninase表达质粒，将L-methioninase表达质粒电转化至减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，即得。
其中，所述质粒包括但不限于pSVSPORT质粒、pTrc99A质粒、pcDNA3.1质粒、pBR322质粒或pET23a质粒。
最为优选的是，在构建基因工程菌VNP20009-M的过程中，当选用pSVSPORT质粒时，将L-methioninase基因亚克隆至质粒中，得到L-methioninase表达质粒，然后将L-methioninase表达质粒电转化至减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中得到基因工程菌。
其中，所述的电转化条件为电压2400V，电阻400Ω，电容25μF，放电时间4ms。
其中，所述的癌症包括但不限于肺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、食道癌、喉癌、白血病、淋巴癌、黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、皮肤癌、支气管癌、细支气管癌、尿道癌、肾癌、口腔癌、阴道癌、胆管癌、膀胱癌或鼻咽癌。
上述癌症预防和治疗的给药方式可通过多种途径进行给药，包括但不限于：口服给药、局部给药、注射给药(包括但不限于经静脉、腹膜、皮下、肌肉、瘤内给药)等。
减毒鼠伤寒沙门氏菌的基因工程菌VNP20009-M在制备组蛋白甲基转移酶EZH2抑制剂中的应用，所述基因工程菌为克隆有L-methioninase基因的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009。
所述的基因工程菌VNP20009-M优选为携带了质粒的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，其中，所述质粒上克隆有L-methioninase基因。
其中，所述的L-methioninase以及基因工程菌VNP20009-M按照如下方法构建得到：将L-methioninase基因亚克隆至质粒中，得到L-methioninase表达质粒，将L-methioninase表达质粒转化至大肠杆菌中纯化可得甲硫氨酸酶蛋白，或电转化至减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，即得VNP20009-M。
其中，所述质粒包括但不限于pSVSPORT质粒、pTrc99A质粒、pcDNA3.1质粒、pBR322质粒或pET23a质粒。
最为优选的时，在构建基因工程菌VNP20009-M的过程中，当选用pSVSPORT质粒时，将L-methioninase基因通过Kpn I和Hind III酶切位点亚克隆至质粒中，得到L-methioninase表达质粒，然后将L-methioninase表达质粒电转化至减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中得到基因工程菌。
其中，所述的电转化条件为电压2400V，电阻400Ω，电容25μF，放电时间4ms。
上述组蛋白甲基转移酶EZH2抑制剂的给药方式可通过多种途径进行给药，包括但不限于：口、局部、注射(包括但不限于经静脉、腹膜、皮下、肌肉、瘤内给药)等。
有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优势：
(1)基因工程菌VNP20009-M不仅具有抗肿瘤效果，而且能够有效的抑制肿瘤的转移。
(2)本发明提供的表达甲硫氨酸酶的减毒鼠伤寒沙门氏菌(VNP20009-M)通过抑制甲基转移酶EZH2的表达和活性，成为甲基转移酶EZH2的抑制剂，降低组蛋白H3K27甲基化水平，从而抑制肿瘤的侵袭转移。在预防和治疗恶性肿瘤，特别是癌症的转移中的应用中有广阔的前景。
附图说明
图1是质粒pSVSPORT-L-methioninase酶切鉴定1％琼脂糖凝胶电泳图。
图2是Western blot鉴定methioninase表达结果图。
图3是检测沙门氏菌中methioninase活性结果图。
图4是Transwells检测基因工程菌VNP20009-M抑制前列腺癌细胞的侵袭(***，p<0.001)。
图5是Transwells检测methioninase抑制前列腺癌细胞的侵袭(***，p<0.001)。
图6是Western blot鉴定高表达methioninase后前列腺癌细胞PC-3细胞EZH2以及H3K27me3的表达结果图。
图7是高效液相色谱-串联质谱联用定量分析前列腺癌肿瘤组织中游离甲硫氨酸含量的结果图(*，p<0.05)。
图8是高效液相色谱-串联质谱联用定量分析前列腺癌肿瘤组织中腺苷甲硫氨酸(SAM)含量的结果图(**，p<0.01，*，p<0.05)。
图9是注射沙门菌对裸鼠体重的影响结果图。
图10是静脉给予数量为2*105CFU沙门菌后活体成像观察前列腺癌信号随时间的变化。
图11是静脉给予数量为2*105CFU沙门菌后前列腺癌信号变化曲线图。
图12是静脉给予数量为2*105CFU沙门菌后55天前列腺癌小鼠脊椎的肿瘤大小结果图。
图13是静脉给予数量为2*105CFU沙门菌后55天前列腺癌小鼠脊椎HE病理切片结果。
图14是静脉给予数量为2*105CFU沙门菌后55天前列腺癌小鼠睾丸以及附睾HE病理切片结果图。
图15是静脉给予数量为2*106CFU沙门菌后活体成像观察胰腺癌信号随时间的变化。
图16静脉给予数量为2*105CFU沙门菌后活体成像观察乳腺癌信号随时间的变化。
图17是静脉给予数量为2*105CFU沙门菌后乳腺癌小鼠信号变化曲线图。
图18是静脉给予数量为2*106CFU沙门菌后乳腺癌小鼠肺部HE病理切片结果。箭头所指小鼠肺部组织中有乳腺癌肿瘤的侵袭。
图19静脉给予数量为2*106CFU沙门菌后小鼠肺癌模型的生存率。
图20静脉给予数量为2*106CFU沙门菌后小鼠肺部肿瘤的结果图。箭头所示为小鼠肺部肿瘤。
图21是静脉给予数量为2*105CFU沙门菌后肝癌小鼠模型的肿瘤大小结果图。
图22是静脉给予数量为2*105CFU沙门菌后肝癌小鼠模型的肺部病理切片结果。箭头所指小鼠肺部组织中有肝癌肿瘤的侵袭。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：基因工程菌的构建。
(1)构建表达L-methioninase基因的质粒。
先合成L-methioninase(GenBank：L43133.1)基因亚克隆至pUC57质粒(金斯瑞公司)，接着通过Kpn I和Hind III酶切位点亚克隆至pSVSPORT质粒(invitrogen)，得到pSVSPORT-L-methioninase表达质粒。具体构建过程如下：
将pSVSPORT质粒用Kpn I和Hind III双酶切，酶切体系为：2μg质粒DNA，3μL 10×buffer，1.5μL Kpn I酶，1.5μL Hind III酶，加入ddH2O补足体积至30μL，37℃温浴3h。然后将酶切体系在1％的琼脂糖凝胶中通过电泳分离，切出4.1kb大小的DNA条带，用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。
通过全基因合成得到L-methioninase编码区域DNA片段亚克隆至pUC57质粒(金斯瑞公司)，用Kpn I和Hind III双酶切，酶切体系为：3μg质粒DNA，3μL 10×buffer，1.5μL Kpn I酶，1.5μL Hind III酶，加入ddH2O补足体积至30μL，37℃温浴3h。然后将酶切体系在1％的琼脂糖凝胶中通过电泳分离，切出1.2kb大小的DNA条带，用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。
将pSVSPORT(Kpn I/Hind III)和L-methioninase编码区域DNA片段(Kpn I/HindIII)连接，连接反应中加入2μL载体、6μL插入片段、1μL T4DNA连接酶，16℃温浴16h。
将连接产物转化到E.coli DH5α(Takara)的感受态细胞中。取一管50μL的DH5α感受态细胞置于冰上，待其融化后，向其中加入5μL上述连接产物，轻弹混匀，后于冰上孵育30min；42℃热击60s，后冰上静置2min；加入500μL无抗性的LB液体培养基，37℃震荡培养1h后涂布在含氨苄青霉素抗性的LB培养基平板上，过夜培养。
克隆生长出来后，挑单克隆菌落至3mL含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃震荡培养16h，提取质粒DNA，用Kpn I和Hind III酶切鉴定，阳性克隆中可得到4.1kb、1.2kb的两条DNA条带，如图1所示。再通过测序进一步确定阳性克隆的序列完全正确。
(2)构建携带质粒的VNP20009菌和携带克隆有L-methioninase的基因的质粒的VNP20009菌。
将pSVSPORT和pSVSPORT-L-methioninase表达质粒分别电转化至VNP20009菌株(YS1646，ATCC号202165)，分别命名为VNP20009-V和VNP20009-M。具体构建过程如下：
将感受态细菌VNP20009置于冰上，待其融化后移入预冷电转杯，向其中加入2μL质粒，轻弹混匀，于冰上孵育1min。将电转杯放入电转仪，条件设置为电压2400V，电阻400Ω，电容25μF，放电时间4ms。电击完立刻加入1mL SOC培养基，轻轻混匀。37℃震荡培养1h；用移液器将细菌沉淀吹打均匀后涂布在含氨苄青霉素抗性的LB-O培养基平板上。然后将平板置于37℃温箱培养16h。VNP20009-V和VNP20009-M用LB-O培养后，提取质粒，酶切鉴定正确。
取1×108沙门菌用蛋白裂解液提取蛋白，进行10％SDS-PAGE电泳，再稳压冰浴电转至PVDF膜，BSA室温封闭1h后，TBST漂洗3×5min，加入兔抗L-methioninase抗体(1：1000)，4℃孵育过夜。TBST漂洗3次，每次5min再加HRP标记的抗兔二抗(1：10000)，室温孵育1h，TBST漂洗3次，每次5min，ECL化学发光法显影。结果如图2所示，在分子量约43kD处有特异性条带，说明VNP20009-M与VNP20009、VNP20009-V相比，L-methioninase表达量显著提高。
将L-甲硫氨酸和吡哆醛分别与VNP20009-V和VNP20009-M菌体混合，37℃孵育10min后用50％三氯乙酸终止，离心取上清，与3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物(MBTH)充分混匀，50℃孵育30min后，测定320nm处的吸光值，以每分钟催化转化1μmolα-酮丁酸的酶量定义为1个酶活性单位。结果显示(图3)，沙门菌VNP20009-M的甲硫氨酸酶活性比VNP20009-V高10倍。
实施例2：基因工程菌VNP20009-M的抗肿瘤转移效果。
1、基因工程菌VNP20009-M对前列腺癌细胞侵袭能力的影响。取对数生长期的前列腺癌细胞PC-3(雄激素非依赖性)接种于6孔板中，待细胞密度长至70％-80％左右，分别以1*106CFU/孔加入VNP20009-V和VNP20009-M，另设空白对照组。细菌与细胞共培养30min后，用PBS清洗5遍，然后使用胰酶消化细胞，离心收集细胞计数，并按照5*104/小室将细胞加入铺有matrigel胶的transwell小室，上室使用无血清培养基，下室使用含20％胎牛血清的培养基。PBS和培养基里都含12μg/mL青霉素、20μg/mL链霉素、10μg/mL的卡那霉素。细胞培养36h后进行结晶紫染色，对穿透过小室的细胞拍照计数，计数结果见图4，***为P<0.001。结果显示VNP20009-M与前列腺癌细胞共培养之后，能穿过小室的细胞数量比PBS组、VNP20009-M组明显减少，说明VNP20009-M对肿瘤细胞侵袭能力有显著性抑制。
2、甲硫氨酸酶对前列腺癌细胞侵袭能力的影响。取对数生长期的前列腺癌细胞PC-3接种于6孔板中，待细胞密度长至70％-80％左右，使用Roche转染试剂分别转染空载质粒(vector)和高表达甲硫氨酸酶(methioninase)的质粒，另设空白对照组(control)。转染24h后，做transwell侵袭实验，操作方法同上述1。结果如图5所示，高表达甲硫氨酸酶之后，穿过小室的前列腺癌细胞减少，表明细胞侵袭能力下降。转染48小时后提取细胞总蛋白，做western blot检测组蛋白甲基转移酶EZH2。转染72小时后提取细胞核蛋白，做western blot检测EZH2下游靶分子组蛋白H3K27。结果如图6所示，高表达甲硫氨酸酶后，甲基转移酶EZH2的表达量减少，组蛋白H3K27甲基化水平降低，即EZH2活性显著降低。
3、皮下注射2*106个人前列腺癌细胞PC-3。待肿瘤体积达到0.1～0.2cm3时，将荷瘤裸鼠随机分组：PBS组、VNP20009-V组和VNP20009-M组，以2×106CFU/只的剂量，采用瘤内注射方式给药，对照组注射同等体积PBS。在给药后第10天，剥离裸鼠肿瘤，提取肿瘤组织蛋白，使用高效液相色谱-串联质谱联用定量分析肿瘤组织中游离甲硫氨酸含量和腺苷甲硫氨酸含量。结果发现，给予沙门菌VNP20009-M后，肿瘤组织中的游离甲硫氨酸含量明显降低，约为PBS组和VNP20009-V组的3/4(图7)，腺苷甲硫氨酸含量也显著降低，约为PBS组和VNP20009-V组的2/3(图8)。这些结果提示我们，VNP20009-M可以作为一种很好的EZH2抑制剂，其能够有效降低组织内的甲硫氨酸和腺苷甲硫氨酸的含量，通过减少SAM含量有效的抑制EZH2的活性。
以上实验提示我们，VNP20009-M入侵肿瘤细胞后，表达甲硫氨酸酶，可能通过降低组蛋白甲基转移酶EZH2的表达及活性，使得肿瘤细胞侵袭转移能力降低。
4、构建表达荧光素酶的肿瘤细胞株。取状态良好，处于对数生长期的293FT细胞接种六孔板培养过夜，37℃，5％CO2。次日，用Roche转染试剂对293FT细胞进行转染，每孔共转染1.5μg PLJM1-luc、1.125μg psPAX2、0.375μg PMD2.G质粒。转染48h后，收集细胞培养上清，4℃，3000r/min离心5min，-80℃保存上清，即荧光素酶慢病毒。前列腺癌细胞PC-3，胰腺癌细胞CFPAC-1分别接种于6孔板中，次日，每孔加入1ml(约1.0×108感染滴度)荧光素酶慢病毒和终浓度8μg/ml的polybrene。24h后，在培养基里加入嘌呤霉素筛选，每2天换液一次，2周之后得到稳定表达荧光素酶的肿瘤细胞株PC-3-luc，CFPAC-luc。
5、用含有10％胎牛血清的F-12K培养基培养细胞PC-3-luc，以每只5×105个细胞通过尾静脉注射到裸鼠体内。将荷瘤裸鼠随机分组，每组10只：PBS组、VNP20009-V组和VNP20009-M组。
6、用LB-O培养VNP20009-V和VNP20009-M，当OD≈0.6时，收集菌体，然后用PBS重悬，以2×105CFU/只的剂量，采用尾静脉注射方式给药，对照组注射同等体积PBS。给药后，观察裸鼠的活动、进食、体重。结果如图9所示，注射细菌后，小鼠体重未受影响。而且裸鼠的进食、粪便也无异常，说明VNP20009-V和VNP20009-M对裸鼠无明显毒性。
7、给药后分别在第1d、11d、24d、44d和56d，使用小动物活体成像系统(Caliper)观察小鼠肿瘤的转移和生长情况。每只小鼠腹腔注射150μg/kg D-荧光素钾，与肿瘤细胞表达的荧光素酶反应后产生光学信号，利用仪器显示图像，用以显示肿瘤细胞所在部位和数量。结果如图10所示，在给药后1天，各组的肿瘤信号强度基本相同。但是在给药后第11天开始，PBS组和VNP20009-V组小鼠在脊椎、附睾处出现强信号，并且随着时间的推移，这两组小鼠全身信号呈线性增强(图11)。从45天开始，PBS组小鼠的脊椎处可见黄豆大小的突起，质硬、活动度差。在解剖后发现裸鼠脊椎处有肿瘤包块形成，转移肿瘤呈灰白色隆起于腰椎表面成团块状，直径约1cm(图12)。而VNP20009-M组小鼠肿瘤细胞信号强度明显低于PBS组和VNP20009-V组，部分小鼠几乎无法检测到光信号。小鼠组织的病理切片结果(图13)与小动物活体成像的结果一致，PBS组以及VNP20009-V组小鼠的脊椎髓腔有成群密集的未分化上皮肿瘤细胞，细胞排列紊乱，异形性明显，核大深染，核内有多形的、数目不均的染色质，有些肿瘤细胞已经破坏了脊椎骨质。同时，这两组小鼠的睾丸和附睾中也发现有大量的肿瘤细胞浸润(图14)。但是，VNP20009-M组小鼠的脊椎、睾丸以及附睾仅观察到少量的肿瘤细胞，甚至部分小鼠都没观察到肿瘤细胞。除此以外，各组小鼠的肺部、肝脏、肾脏等组织未见明显肿瘤浸润。这些结果说明，沙门菌VNP20009-M能够显著抑制该前列腺癌肿瘤向骨转移、生长。
8、操作方法同上述5、6和7，尾静脉注射相同数量的胰腺癌细胞CFPAC-luc。在造模后第3天，以2*106CFU/只的剂量，采用尾静脉注射方式给药，对照组注射同等体积PBS。同样，定期进行活体成像观察肿瘤转移情况。结果发现，PBS组以及VNP20009-V组均出现强的荧光信号，主要位于肺部。而VNP20009-M组基本观察不到信号(图15)。这些结果提示，沙门菌VNP20009-M同样能够有效抑制该胰腺癌肿瘤的转移和生长。
9、操作方法同上述5、6和7，尾静脉注射1.25*105个乳腺癌细胞MDA-MB-231-luc。在造模后第3天，以2*105CFU/只的剂量，采用尾静脉注射方式给药，对照组注射同等体积PBS。同样，定期进行活体成像观察肿瘤转移情况。结果发现，PBS组以及VNP20009-V组均出现强的荧光信号，主要位于肺部，并且随着时间的推进，信号强度显著增强(图16、图17)。小鼠的病理切片结果与活体成像结果一致，PBS以及VNP20009-V组的肺部有肿瘤细胞的浸润，这些细胞核大深染，异型性明显(图18箭头处为肿瘤细胞)。而VNP20009-M组基本观察不到信号，且肺部的病理切片结果表明肿瘤细胞明显减少，甚至观察不到肿瘤。此外，PBS组的小鼠的脊椎也有肿瘤转移，其他组织未见异常。这些结果也提示我们，沙门菌VNP20009-M同样能够有效抑制该乳腺癌肿瘤的转移和生长。
10、操作方法同上述5、6，对B6小鼠尾静脉注射5*105个肺癌细胞LLC。在造模后第3天，以2*106CFU/只的剂量，采用尾静脉注射方式给药，对照组注射同等体积PBS。在给药之后，定期测量小鼠体重，观察小鼠状态，记录小鼠死亡时间。结果发现，PBS组小鼠38天后全部死亡，VNP20009组有40％存活，而VNP20009-M还有60％的小鼠存活。生存率实验结果初步显示，VNP20009-M能显著延长患瘤小鼠的生存期(图19)。解剖小鼠后发现，PBS组以及VNP20009-V组小鼠有严重的肺部肿瘤，而VNP20009-M组小鼠的肺部的转移灶明显比对照组小，且数量要少(图20)。这些结果说明，沙门菌VNP20009-M同样能够有效抑制该肺癌肿瘤的生长和转移。
11、皮下注射2*106个人高转移肝癌细胞HCCLM3。在造模后第3天，将荷瘤裸鼠随机分组：PBS组、VNP20009-V组和VNP20009-M组，以2*105CFU/只的剂量，采用尾静脉注射方式给药，对照组注射同等体积PBS。结果发现，对照组小鼠的肿瘤都正常生长并增长迅速，而给予沙门菌VNP20009-M后，肿瘤生长停滞，部分小鼠肿瘤消失(图21)。小鼠的肺部病理切片发现，PBS以及VNP20009-V组的肺部有肿瘤细胞的浸润，这些细胞核大深染，异型性明显。(图22箭头处为肿瘤细胞)。而VNP20009-M组的肺部的肿瘤细胞明显减少，甚至观察不到肿瘤。这些结果也提示我们，沙门菌VNP20009-M同样能够有效抑制该肝癌肿瘤的转移和生长。
上述动物实验进一步说明，本发明所采用的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009-M能够通过抑制EZH2的表达和活性来抑制肿瘤的转移，具有良好的抗肿瘤效果。
本发明表明减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009-M可以用于制备治疗抗肿瘤转移的药物，除了前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌和肝癌之外，对其他肿瘤，包括肝癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、食道癌、喉癌、白血病、淋巴癌、黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、皮肤癌。支气管癌、细支气管癌、尿道癌、肾癌、口腔癌、阴道癌、胆管癌、膀胱癌、鼻咽癌以及其他各种癌症的转移可能均有效果。上述质粒并不局限于pSVSPORT质粒，pTrc99A质粒、pcDNA3.1质粒、pBR322质粒或pET23a质粒以及克隆有L-methioninase基因的上述质粒同样具有类似效果。

Claims (10)

1.基因工程菌VNP20009-M在制备预防和治疗转移后癌症的药物上的应用，其中，所述基因工程菌VNP20009-M为克隆有L-methioninase基因的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的基因工程菌VNP20009-M为携带了质粒的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，其中，所述质粒上克隆有L-methioninase基因。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的癌症包括但不限于肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、食道癌、喉癌、白血病、淋巴癌、黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、皮肤癌、支气管癌、细支气管癌、尿道癌、肾癌、口腔癌、阴道癌、胆管癌、膀胱癌或鼻咽癌。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的基因工程菌VNP20009-M按照如下方法构建得到：将L-methioninase基因亚克隆至质粒中，得到L-methioninase表达质粒，将L-methioninase表达质粒电转化至减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，即得。
5.根据权利要求2或4所述的应用，其特征在于，所述质粒包括但不限于pSVSPORT质粒、pTrc99A质粒、pcDNA3.1质粒、pBR322质粒或pET23a质粒。
6.基因工程菌VNP20009-M在制备组蛋白甲基转移酶EZH2抑制剂中的应用，所述基因工程菌VNP20009-M为克隆有L-methioninase基因的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的基因工程菌VNP20009-M为携带了质粒的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，其中，所述质粒上克隆有L-methioninase基因。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的基因工程菌VNP20009-M按照如下方法构建得到：将L-methioninase基因亚克隆至质粒中，得到L-methioninase表达质粒，将L-methioninase表达质粒电转化至减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，即得。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述质粒包括但不限于pSVSPORT质粒、pTrc99A质粒、pcDNA3.1质粒、pBR322质粒或pET23a质粒。
10.根据权利要求1或6所述的应用，其特征在于，给药方式包括但不限于口服给药、局部给药或注射给药。
CN201610081270.9A 2015-03-17 2016-02-05 基因工程菌vnp20009-m在制备预防和治疗癌症转移的药物上的应用 Pending CN105983103A (zh)

Priority Applications (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017567516A JP6853793B2 (ja) 2015-03-17 2016-02-24 遺伝子組換え細菌ｖｎｐ２０００９−ｍの、がん転移を予防および治療するための医薬品の調製における使用
EP16764155.4A EP3272363A4 (en) 2015-03-17 2016-02-24 Use of gene engineering bacteria vpn 20009-m in preparation of medicaments for preventing and treating cancer metastasis
AU2016232910A AU2016232910B2 (en) 2015-03-17 2016-02-24 Use of Gene Engineering Bacteria VNP 20009-M in Preparation of Medicaments for Preventing and Treating Cancer Metastasis
PCT/CN2016/074408 WO2016145974A1 (zh) 2015-03-17 2016-02-24 基因工程菌vnp20009-m在制备预防和治疗癌症转移的药物上的应用
CA2979760A CA2979760C (en) 2015-03-17 2016-02-24 Use of genetically engineered strain vnp20009-m in manufacturing medicaments for preventing or treating cancer metastasis
KR1020177029565A KR20170129201A (ko) 2015-03-17 2016-02-24 암 전이를 예방 및 치료하기 위한 의약 제조에서 유전자 조작 박테리아 vpn 20009-m의 용도
US15/706,754 US20180008682A1 (en) 2015-03-17 2017-09-17 Use of genetically engineered strain vnp20009-m in preventing and treating cancer metastasis
ZA2017/06397A ZA201706397B (en) 2015-03-17 2017-09-21 Use of genetically engineered strain vnp20009-m in manufacturing medicaments for preventing or treating cancer metastasis
HK18109249.0A HK1253770A1 (zh) 2015-03-17 2018-07-17 基因工程菌vnp20009-m在製備預防和治療癌症轉移的藥物上的應用

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510117994 2015-03-17
CN201510117994X 2015-03-17

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105983103A true CN105983103A (zh) 2016-10-05

Family

ID=57040121

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610081270.9A Pending CN105983103A (zh) 2015-03-17 2016-02-05 基因工程菌vnp20009-m在制备预防和治疗癌症转移的药物上的应用

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20180008682A1 (zh)
EP (1) EP3272363A4 (zh)
JP (1) JP6853793B2 (zh)
KR (1) KR20170129201A (zh)
CN (1) CN105983103A (zh)
AU (1) AU2016232910B2 (zh)
CA (1) CA2979760C (zh)
HK (1) HK1253770A1 (zh)
WO (1) WO2016145974A1 (zh)
ZA (1) ZA201706397B (zh)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017036302A1 (zh) * 2015-08-31 2017-03-09 南京华贞生物医药科技有限公司 减毒鼠伤寒沙门氏菌基因工程菌在制备治疗肝癌药物上的应用
CN106591208A (zh) * 2016-12-07 2017-04-26 南昌大学 表达DNase I、AIF或整合有该毒素的重组单链抗体的载体菌株及该菌株的应用
CN106591365A (zh) * 2016-12-07 2017-04-26 南昌大学 一种减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的真核细胞质粒转染方法
CN106755036A (zh) * 2016-12-07 2017-05-31 南昌大学 一种细菌和抗体结合双靶向抑杀实体瘤药物的制备方法
CN106913883A (zh) * 2017-04-01 2017-07-04 广州华津医药科技有限公司 基因工程菌vnp20009‑m在制备预防和治疗肺癌药物中的应用
CN107115533A (zh) * 2017-04-01 2017-09-01 广州华津医药科技有限公司 基因工程菌vnp20009‑m在制备治疗恶性肉瘤药物中的应用
CN110643623A (zh) * 2019-09-17 2020-01-03 广州维生君生物科技有限公司 人可溶性cd80融合基因转化乳酸菌及其应用
CN112190717A (zh) * 2020-10-16 2021-01-08 广东工业大学 减毒鼠伤寒沙门氏菌及其基因工程菌在制备治疗急性白血病的药物上的应用
CN114712403A (zh) * 2022-03-27 2022-07-08 江苏靶标生物医药研究所有限公司 一种减毒沙门氏菌在制备治疗肺癌胸腔积液药物中的应用

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3550976A4 (en) 2016-12-07 2020-06-10 MD Biosciences, Inc. METHOD FOR SYNERGISTIC TREATMENT OF CANCER
WO2020210378A1 (en) * 2019-04-08 2020-10-15 University Of Massachusetts Localization of payload delivery systems to tumor sites via beacon cell targeting
CN112245573A (zh) * 2020-10-16 2021-01-22 广东工业大学 减毒鼠伤寒沙门氏菌的基因工程菌在制备治疗癌症的药物上的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103146626A (zh) * 2013-02-28 2013-06-12 南京华贞生物医药科技有限公司 一种治疗乳腺癌的基因工程菌及其构建方法和应用
CN103656684A (zh) * 2013-12-03 2014-03-26 南京华贞生物医药科技有限公司 减毒鼠伤寒沙门氏菌及其基因工程菌在制备治疗胰腺癌的药物上的应用
CN103961721A (zh) * 2014-04-30 2014-08-06 南京华贞生物医药科技有限公司 减毒鼠伤寒沙门氏菌及其基因工程菌在制备治疗前列腺癌的药物上的应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5891704A (en) * 1992-11-19 1999-04-06 Anticancer, Inc. Method to produce high levels of methioninase
US6190657B1 (en) * 1995-06-07 2001-02-20 Yale University Vectors for the diagnosis and treatment of solid tumors including melanoma
CN101579362A (zh) * 1999-10-04 2009-11-18 维昂药品公司 用于将效应分子定向递送至肿瘤的组合物及方法
JP2008504822A (ja) * 2004-06-29 2008-02-21 アンチキャンサー インコーポレーテッド 癌選択的栄養要求株

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103146626A (zh) * 2013-02-28 2013-06-12 南京华贞生物医药科技有限公司 一种治疗乳腺癌的基因工程菌及其构建方法和应用
CN103656684A (zh) * 2013-12-03 2014-03-26 南京华贞生物医药科技有限公司 减毒鼠伤寒沙门氏菌及其基因工程菌在制备治疗胰腺癌的药物上的应用
CN103961721A (zh) * 2014-04-30 2014-08-06 南京华贞生物医药科技有限公司 减毒鼠伤寒沙门氏菌及其基因工程菌在制备治疗前列腺癌的药物上的应用

Cited By (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017036302A1 (zh) * 2015-08-31 2017-03-09 南京华贞生物医药科技有限公司 减毒鼠伤寒沙门氏菌基因工程菌在制备治疗肝癌药物上的应用
CN106755036B (zh) * 2016-12-07 2020-05-19 南昌大学 一种细菌和抗体结合双靶向抑杀实体瘤药物的制备方法
CN106591208A (zh) * 2016-12-07 2017-04-26 南昌大学 表达DNase I、AIF或整合有该毒素的重组单链抗体的载体菌株及该菌株的应用
CN106591365A (zh) * 2016-12-07 2017-04-26 南昌大学 一种减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的真核细胞质粒转染方法
CN106755036A (zh) * 2016-12-07 2017-05-31 南昌大学 一种细菌和抗体结合双靶向抑杀实体瘤药物的制备方法
AU2018241656B2 (en) * 2017-04-01 2020-10-29 Guangzhou Sinogen Pharmaceutical Co., Ltd Applications of genetically engineered bacteria VNP20009-M in preparation of drugs for preventing and treating lung cancer
CN106913883A (zh) * 2017-04-01 2017-07-04 广州华津医药科技有限公司 基因工程菌vnp20009‑m在制备预防和治疗肺癌药物中的应用
WO2018177374A1 (zh) 2017-04-01 2018-10-04 广州华津医药科技有限公司 基因工程菌vnp20009-m在制备预防和治疗肺癌药物中的应用
US11771721B2 (en) * 2017-04-01 2023-10-03 Guangzhou Sinogen Pharmaceutical Co., Ltd Applications of genetically engineered bacteria VNP20009-M in preparation of drugs for preventing and treating lung cancer
EP3583956A4 (en) * 2017-04-01 2020-02-12 Guangzhou Sinogen Pharmaceutical Co., Ltd APPLICATION OF VNP2009-M MYCETE IN GENETIC ENGINEERING IN THE PREPARATION OF A MEDICINAL PRODUCT FOR THE TREATMENT OF SARCOMAS
EP3586877A4 (en) * 2017-04-01 2020-04-15 Guangzhou Sinogen Pharmaceutical Co., Ltd APPLICATIONS OF GENETICALLY MANIPULATED BACTERIA VNP20009-M FOR THE PRODUCTION OF MEDICINAL PRODUCTS FOR THE PREVENTION AND TREATMENT OF LUNG CANCER
CN107115533A (zh) * 2017-04-01 2017-09-01 广州华津医药科技有限公司 基因工程菌vnp20009‑m在制备治疗恶性肉瘤药物中的应用
WO2018177375A1 (zh) 2017-04-01 2018-10-04 广州华津医药科技有限公司 基因工程菌vnp20009-m在制备治疗恶性肉瘤药物中的应用
AU2018241657B2 (en) * 2017-04-01 2020-11-05 Guangzhou Sinogen Pharmaceutical Co., Ltd Application of genetically engineered bacteria VNPO20009-M in preparing drug for treating malignant sarcoma
CN110643623A (zh) * 2019-09-17 2020-01-03 广州维生君生物科技有限公司 人可溶性cd80融合基因转化乳酸菌及其应用
CN112190717A (zh) * 2020-10-16 2021-01-08 广东工业大学 减毒鼠伤寒沙门氏菌及其基因工程菌在制备治疗急性白血病的药物上的应用
CN112190717B (zh) * 2020-10-16 2023-12-15 广州华津医药科技有限公司 减毒鼠伤寒沙门氏菌及其基因工程菌在制备治疗急性白血病的药物上的应用
CN114712403A (zh) * 2022-03-27 2022-07-08 江苏靶标生物医药研究所有限公司 一种减毒沙门氏菌在制备治疗肺癌胸腔积液药物中的应用
CN114712403B (zh) * 2022-03-27 2024-05-17 江苏靶标生物医药研究所有限公司 一种减毒沙门氏菌在制备治疗肺癌胸腔积液药物中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
US20180008682A1 (en) 2018-01-11
JP2018513209A (ja) 2018-05-24
CA2979760C (en) 2023-08-22
ZA201706397B (en) 2019-12-18
JP6853793B2 (ja) 2021-03-31
EP3272363A1 (en) 2018-01-24
AU2016232910B2 (en) 2021-05-27
WO2016145974A1 (zh) 2016-09-22
KR20170129201A (ko) 2017-11-24
CA2979760A1 (en) 2016-09-22
EP3272363A4 (en) 2018-10-24
AU2016232910A1 (en) 2017-09-21
HK1253770A1 (zh) 2019-07-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105983103A (zh) 基因工程菌vnp20009-m在制备预防和治疗癌症转移的药物上的应用
CN103656684B (zh) 减毒鼠伤寒沙门氏菌及其基因工程菌在制备治疗胰腺癌的药物上的应用
CN103961721B (zh) 减毒鼠伤寒沙门氏菌及其基因工程菌在制备治疗前列腺癌的药物上的应用
CN103146626B (zh) 一种治疗乳腺癌的基因工程菌及其构建方法和应用
US11318172B2 (en) Use of genetically engineered bacterium of attenuated Salmonella typhimurium in for treating liver cancer
Fan et al. Umbilical cord‐derived mesenchymal stromal/stem cells expressing IL‐24 induce apoptosis in gliomas
CN112190717A (zh) 减毒鼠伤寒沙门氏菌及其基因工程菌在制备治疗急性白血病的药物上的应用
CN113528427A (zh) 一种结直肠靶向载药外泌体及应用和治疗结直肠疾病药物
CN108310383A (zh) Nqo1抑制剂在制备肝癌治疗药物中的用途
CN113476606B (zh) Upk1a-as1抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用
CN110423812A (zh) Skiv2l2（MTR4）基因在肿瘤治疗中的用途
CN103110958B (zh) Tt1基因在制备治疗肿瘤的药物中的应用
US9439934B1 (en) Application of an attenuated salmonella typhimurium, its genetically engineered bacterium in preparing drugs for the treatment of prostate cancer
CN107115533A (zh) 基因工程菌vnp20009‑m在制备治疗恶性肉瘤药物中的应用
Siddiqui et al. Induction of the human heat shock promoter HSP70B by nutritional stress: implications for cancer gene therapy
CN107217054A (zh) G6pd基因及其表达产物在治疗结直肠癌中的应用
CN107536845A (zh) 一种防治肿瘤的药物及其用途
CN110638839A (zh) 重组沙门氏菌vnp20009-m在制备治疗骨肉瘤的药物中的应用
CN101816633A (zh) 用于预防治疗癌症的微球缓释制剂及应用
CN106421787A (zh) 靶向scnn1a的肿瘤治疗药物及应用
CN117122618A (zh) 重组沙门氏菌在制备治疗骨肉瘤、软骨肉瘤药物中的应用
KR20130097585A (ko) 암치료 보조용 조성물
CN117679444A (zh) 肠道共生多形拟杆菌及其mcm酶在维持肠道屏障稳态及改善肠道炎症中的应用
CN115927638A (zh) Acadl在制备三阴乳腺癌分化诱导诊断试剂中的应用
CN116036088A (zh) 吴茱萸次碱及其衍生物在制备乳腺癌分化诱导剂中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination