CN103110958B - Tt1基因在制备治疗肿瘤的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明通过实验证明，将TT1基因的重组表达载体转染到人宫颈癌细胞HeLa、人肝癌细胞HepG2、人肺癌细胞A549、人前列腺癌细胞PC3，所述各种癌细胞的生长受到抑制，与对照相比，生长速度有明显降低，同时，对化疗药物顺铂的敏感性增强，在较低的化疗药物浓度下(1μg/ml)就可达到癌细胞生长受抑制的效果。实验结果表明，TT1基因及其编码的多肽可在制备治疗肿瘤的药物中应用。所述TT1基因具有如下核苷酸序列：(1)：SEQ ID NO.1所述核苷酸序列；或(2)：在SEQ ID NO.1限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且与SEQ ID NO.1的序列编码功能相同的多肽。

Description

TT1基因在制备治疗肿瘤的药物中的应用

技术领域

本发明属于肿瘤药物制备领域，特别涉及一种植物源抗逆基因TT1的用途。

背景技术

TT1基因是从甘蓝型油菜(Brassica napus L.)中分离得到的一种基因，现有技术仅公开了该基因具有提高植物抗逆性的用途(见专利申请号200810045667.8)。

癌细胞是一种变异的细胞，是产生癌症的病源，癌细胞与正常细胞不同，有无限生长、转化和转移三大特点，因此难以消灭。现阶段，治疗癌症的方法主要有手术疗法、化学疗法、放射疗法。化学疗法简称“化疗”，即用化学药物治疗癌症，化疗药物能在癌细胞生长繁殖的不同环节抑制或杀死癌细胞，达到治疗目的。但现有的化学药物均有不同程度的毒副作用，它们在杀伤癌细胞的同时对正常人体细胞也有损害，尤其是杀伤人体中生长发育旺盛的血液、淋巴组织细胞等，而这些细胞与组织是人体重要的免疫防御系统，破坏了人体的免疫系统，癌症就可能迅速发展，造成严重后果。因此，进行化疗时往往出现不同程度的副作用，如恶心、呕吐、脱发等。许多资料证明，临床肿瘤化疗中化疗剂量强度与治疗效果明显相关，如果提高药物的剂量强度和按计划进行甚至缩短间隔时间，将显著提高治疗的有效率及治愈率，这已在乳腺癌、卵巢癌、淋巴瘤等的治疗中得到证实。但剂量强度过大，药物的毒副作用越大，越容易对正常人体细胞造成损害；而剂量强度不够不仅不能杀灭癌细胞，相反会造成癌细胞对抗癌药物摄取减少或对损伤细胞的修补能力增加等而产生抗药性。因此，如何权衡化疗药物剂量和治疗效果，已成为临床肿瘤化疗所关注的重点问题。

随着分子生物学、分子遗传学、免疫学等相关学科的发展和渗透，基因治疗特别是肿瘤基因治疗技术迅速发展。所谓基因治疗是指在基因水平上治疗疾病的方法。其手段包括基因置换、基因修正、基因修饰、基因失活、引入新基因等。我国是世界上较早开展基因治疗基础研究和临床试验的国家之一。经过多年的发展，在基因导入和基因治疗临床试验等方面都取得了很大进展。尤其是肿瘤基因治疗临床试验方面，我国目前已有重组腺病毒(p53)抗癌注射液市场化，疱疹病毒胸苷激酶(TK)基因治疗恶性脑胶质瘤、以树突状细胞为基础的肿瘤细胞治疗与基因治疗、IL-2基因工程胃癌细胞等等。然而，癌症的发病机制是极其复杂的，基因治疗技术中的许多环节和问题仍然困扰着科学家，现阶段的基因治疗仅是对传统的手术治疗、化疗和放疗的补充。因此，作为当前临床肿瘤研究的新热点，寻找更多有利于肿瘤基因治疗的基因具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于证明TT1基因及其所表达的多肽可抑制人或动物细胞的生长，同时增强人或动物细胞对化疗药物的敏感性，以便开发出一类配合化疗药物治疗肿瘤的新型药物。

本发明所述TT1基因已在Genbank注册，注册号GU204975，具有如下核苷酸序列：

(1)：SEQ ID NO.1所述核苷酸序列；

或(2)：在SEQ ID NO.1限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且与SEQ ID NO.1的序列编码功能相同的多肽。

所述“在SEQ ID NO.1限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生序列”形成的的TT1基因序列一般是指编码具有SEQ ID NO.1所编码的蛋白活性的多肽的核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指所述序列中有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1同源性低至约89％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.1所述的序列。另外，“在SEQ ID NO.1中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生序列”的含义还包括能在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与SEQ ID NO.1所述核苷酸序列杂交的核苷酸序列；还包括与SEQ ID NO.1中的核苷酸序列的同源性至少80％，较佳地至少89％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列；还包括能编码具有与天然的SEQ ID NO.1相同功能的蛋白的SEQID NO.1中开放阅读框序列的变异形式，这些变异形式包括(但并不限于)：若干个核苷酸的缺失、插入和/或取代(通常为1～90个，较佳地1～60个，更佳地1～20个，最佳地1～10个)，以及在5’和/或3’端添加数个核苷酸(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)。所述“功能相同”是指抑制人或动物细胞生长，同时增强人或动物细胞对化疗药物敏感性。

本发明所述TT1基因编码的多肽具有如下氨基酸序列：

(1)：SEQ ID NO.2所述氨基酸序列；

或(2)：在SEQ ID NO.2限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸衍生所得的氨基酸序列，且与SEQ ID NO.2所述氨基酸序列的多肽功能相同。

本发明通过实验证明，将TT1基因的重组表达载体转染到人宫颈癌细胞HeLa、人肝癌细胞HepG2、人肺癌细胞A549、人前列腺癌细胞PC3，所述各种癌细胞的生长受到抑制，与对照相比，生长速度有明显降低，同时，对化疗药物顺铂的敏感性增强，在较低的化疗药物浓度下(1μg/ml)就可达到癌细胞生长受抑制的效果。实验结果表明，TT1基因及其编码的多肽可在制备治疗肿瘤的药物中应用。

所述TT1基因的重组表达载体，是将TT1基因可操作地连于载体的表达调控序列获得。上述载体可选用本领域已知的各种载体，如病毒载体(逆转录病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体)、非病毒载体(质粒、阳离子脂质体和阳离子聚合物)、细菌载体(大肠杆菌Escherichia coli，沙门氏菌Salmonella，耶尔森氏菌Yersinia，志贺菌Shigella，李氏杆菌Listeria等)，通常选用pcDNA3、pLNCX、pCMV、pEGFP、pSG5、pSV2中的一种。

所述的“可操作地连于”表示如下情况：即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

本发明具有以下有益效果：

1、为TT1基因及其编码的多肽开掘了新的医疗用途，开发了新的应用领域。

2、为宫颈癌、肝癌、肺癌、前列腺癌等癌症患者提供了一种新的治疗药物，此种药物配合化疗药物治疗肿瘤(癌症)可明显降低毒副作用。

附图说明

图1是转染子HeLa-TT1及其对照的RT-PCR鉴定图谱，转染子HeLa-TT1细胞具有TT1和β-actin条带，而HeLa细胞对照和空载体对照仅有β-actin条带。

图2是转染子HeLa-TT1及其对照的Western Blotting鉴定谱图，转染子HeLa-TT1细胞具有TT1和β-actin条带，而HeLa细胞对照和空载体对照仅有β-actin条带。

图3是转染子HeLa-TT1及其对照细胞在37℃下的生长情况示意图。

图4是转染子HeLa-TT1及其对照细胞在37℃下的生长曲线，其中，A图为无顺铂条件下的生长曲线；B图为1μg/ml顺铂条件下的生长曲线。

图5是转染子HepG2-TT1及其对照的RT-PCR鉴定谱图，转染子HepG2-TT1细胞具有TT1和β-actin条带，而HepG2细胞对照和空载体对照仅有β-actin条带。

图6是转染子HepG2-TT1及其对照的Western Blotting鉴定谱图，转染子HepG2-TT1细胞具有TT1和β-actin条带，而HepG2细胞对照和空载体对照仅有β-actin条带。

图7是转染子HepG2-TT1及其对照细胞在37℃下培养不同时间的生长情况示意图。

图8是转染子HepG2-TT1及其对照细胞在37℃下的生长曲线，其中，A图为无顺铂条件下的生长曲线，B图为1μg/ml顺铂条件下的生长曲线。

图9是转染子A549-TT1及其对照细胞在37℃下的生长曲线，其中，A图为无顺铂条件下的生长曲线；B图为1μg/ml顺铂条件下的生长曲线。

图10是转染子PC3-TT1及其对照细胞在37℃下的生长曲线，其中，A图为无顺铂条件下的生长曲线；B图为1μg/ml顺铂条件下的生长曲线。

具体实施方式

下面通过实施例并结合附图，进一步说明而不限定本发明。

下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook，Russell的分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

下述实施例中，人宫颈癌细胞HeLa，人肝癌细胞HepG2，人肺癌细胞A549，人前列腺癌细胞PC3均购自美国模式培养物集存库(ATCC)。

大肠杆菌(E.coli)DH5α菌株为Qiagen公司产品；载体pET-28a(+)和pcDNA 3.1(+)均为Invitrogen公司产品。T4 DNA连接酶、限制性内切酶均为美国Fermentas(MBI)公司产品；焦碳酸二乙酯(DEPC)、Taq DNA聚合酶、Pfu高保真DNA聚合酶、dNTPs、PCR及凝胶DNA纯化试剂盒、质粒提取试剂盒、Bcip/NBT试剂盒均为北京天根科技公司产品；无血清培养基、DMEM培养液、RPMI 1640培养液、胎牛血清、细胞培养用磷酸缓冲液、细胞培养用胰蛋白液均为HyClone公司产品；RNA提取试剂RNAiso Plus为大连宝生物公司(Takara)产品；脂质体Lipofectamine 2000为美国Invitrogen产品；顺铂、MTT、抗生素G418为美国Sigma产品；DNA第一链合成试剂盒ReverTra Ace为日本东洋纺公司(Toyobo)产品；小鼠抗Myc标签抗体、小鼠抗β-actin抗体、碱性磷酸酶标记马抗小鼠IgG为北京中杉金桥公司产品；PVDF膜为美国Millipore公司产品。其余化学实际均为市售分析纯。

下述实施例中，当“SEQ ID NO：1”单独出现时，本领域技术人员可理解其为“SEQ IDNO：1所示核苷酸序列”的简称。

实施例1：TT1基因抑制人宫颈癌细胞HeLa生长并增加其对顺铂的敏感性

1、TT1动物细胞重组表达载体的构建

1.1原核重组表达载体pET-28a(+)-TT1的构建

根据SEQ ID NO：1所示核苷酸序列设计引物，

上游引物(SEQ ID NO.3)：5’-CGCGGATCCATGTCGGATCATTTGAGTTTATG-3’，

下游引物(SEQ ID NO.4)：5’-CCGGAGCTCTCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3’。

然后经PCR从油菜cDNA中扩增SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列

PCR程序如下：

1.95℃        4min(预变性)

2.95℃        30s(变性)

3.53℃        30s(复性)

4.72℃        50s(延伸)

5.2-4步骤  循环30次

6.72℃        5min(终延伸)

7.4℃         保存。

对PCR产物纯化(纯化操作见Qiagen公司所公开的资料)，然后用BamH1与Sac1酶切，胶回收，与原核表达载体pET-28a(+)连接(连接位点：BamH1与Sac1)，获得含有SEQ ID NO：1序列的原核重组表达载体pET-28a(+)-TT1。

1.2真核重组表达载体pcDNA3.1(+)-Myc-TT1的构建

pcDNA.1(+)-Myc为在pcDNA 3.1(+)的NheI和HindIII位点之间插入了来自c-Myc的抗原决定族后构建的质粒，来自c-Myc的抗原决定族的序列见SEQ ID NO：5。

根据SEQ ID NO.1所述核苷酸序列设计扩增TT1基因的引物：

上游引物(SEQ ID NO.6)：5’-CCCAAGCTTATGTCGGATGATTTGAGTTTA-3’，

下游引物(SEQ ID NO.7)：5’-CGGAATTCTCAGACTGGTGTTGGGTTGGA-3’。

以原核重组表达载体pET-28a(+)-TT1为模板，用Pfu高保真DNA聚合酶，以上述引物PCR扩增TT1基因，反应体系如下：

pET-28a(+)-TT1(300ng/μl)	1.0μl
		primer 1(20nM)	4.5μl
primer 2(20nM)	4.5μl
		dNTP(1mM)	9.0μl
10×Buffer	5.0μl
		Pfu polymerase	1.0μl
H2O	25.0μl
		Total volume	50.0μl

PCR扩增条件如下：

变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃2min，30个循环。

PCR后使用PCR纯化试剂盒纯化产物，使用限制性内切HindIII和EcoRI消化纯化后的PCR产物和真核表达载体pcDNA3.1(+)-Myc，消化产物经凝胶电泳、凝胶照像、凝胶切割后，用凝胶纯化试剂盒纯化；纯化后的PCR片段和pcDNA3.1(+)-Myc载体片段在T4连接酶作用下16℃连接时间过夜(连接位点HindIII和EcoRI)；之后将连接产物转化感受态大肠杆菌(E.coli)DH5α，将转化细胞涂布于氨苄平板培养，挑取单菌落，进行菌落PCR检测；得到阳性菌落后，大量培养，提取质粒，进行载体测序检验。测序正确后，即得到真核重组表达载体pcDNA3.1(+)-Myc-TT1。

2、细胞培养

宫颈癌HeLa细胞培养使用含有体积浓度10％的胎牛血清的DMEM培养液，在37℃、体积浓度5％CO₂及饱和湿度的条件下培养，常规传代，实验时取对数生长期细胞。

3、稳定转染

在24孔板的孔中按1×105/孔的量接种细胞，将细胞用胰蛋白液消化、计数并铺板；

培养24小时后，对于每孔细胞，制备转染混合物：用50μl无血清培养基稀释2.0μl脂质体Lipofectamine2000，室温静置5min；用50μl无血清培养基稀释0.8μg真核重组表达载体pcDNA3.1(+)-Myc-TT1；混合上述两种溶液，室温静置20min，将得到的转染混合物加入24孔板上的目标孔，并依次按以下步骤操作：

(1)培养24小时后，1∶10传代入新鲜培养基；

(2)在步骤(1)完成后培养24小时，然后往目标孔中加入筛选抗生素G418至800μg/ml；

(3)在步骤(2)完成后加入筛选抗生素G418后培养4天，细胞开始大量死亡，仅剩零星细胞，换液，加G418至200μg/ml；

(4)在步骤(3)完成后培养7天，可见形成了细胞克隆，消化细胞，稀释至2个细胞/200μl，在96孔板孔中接种稀释的细胞，接种量为200μl/孔；

(5)在步骤(4)完成后培养8天，扩大培养规模，把96孔板中细胞接种到24孔板；

(6)在步骤(5)完成后培养5天，继续扩大培养规模，把24孔板中细胞接种到6孔板；

(7)在步骤(6)完成后培养5天，收获细胞，此即为稳定表达TT1的细胞转染子。

为进行对照试验，将未转入TT1基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-Myc同样以上述步骤稳定转染细胞，获得空载体对照细胞。

4、稳定转染子鉴定——RT-PCR

使用试剂RNAiso Plus提取稳定表达TT1的细胞转染子的RNA，提取步骤参见试剂RNAiso Plus的说明书。

RT-PCR采用两步法，第一步为逆转录，第二步为PCR。

逆转录反应体系如下：

RNA(1μg/ml)	1μl
		Oligo dT(18)(0.5μg/ml)	1μl
RT enhancer	0.5μl
		RNase inhibitor	0.5μl
5×Buffer	4μl
		dNTP(1mM)	2μl
Taq polymerase	1μl
		H2O	10μl
Total volume	20μl

逆转录反应条件如下：

42℃60min；85℃5min。

以逆转录反应得到的cDNA为模板，进行PCR，反应体系如下：

DNA模板(300ng/μl)	1.0μl
		上游(SEQ ID NO.3)(20nM)	2.0μl
下游(SEQ ID NO.4)(20nM)	2.0μl
		dNTP(1mM)	2.0μl
10×Buffer	2.0μl
		Taq polymerase	1.0μl
H2O	10.0μl
		Total volume	20.0μl

PCR扩增条件如下：

变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃1min，30个循环。

将RT-PCR产物电泳照相，结果见图1。从图1可以看出，稳定表达TT1的宫颈癌HeLa细胞转染子(以下简称“转染子HeLa-TT1”)具有TT1和β-actin条带，而宫颈癌HeLa细胞对照和空载体对照仅有β-actin条带。在转录水平上说明转染子HeLa-TT1构建成功。

5、稳定转染子鉴定——Western Blotting

参照Bio-rad公司提供的Western Blotting操作程序进行鉴定。鉴定结果见图2，从图2可以看出，转染子HeLa-TT1具有TT1和β-actin条带，而宫颈癌HeLa细胞对照和空载体对照仅有β-actin条带，在翻译水平上说明转染子HeLa-TT1构建成功。

6、细胞生长情况的测定

本实施例选用MTT法检测细胞生长，MTT全称为3-(4，5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝，是一种黄颜色的染料。活细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的蓝紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm或570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。具体操作方法如下：

收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，向96孔板每孔加入100μl，将待测细胞密度调至约5000个/孔，将96孔板置于37℃、5％CO₂条件下孵育24小时；加入5mg/ml的MTT试剂20μl/孔，将96孔板置于37℃、5％CO₂条件下继续孵育4小时；弃上清，加入DMSO 150μl/孔，至摇床上低速振荡溶解蓝色颗粒；选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔的光吸收值，记录结果；连续测六天，以时间为横坐标、光吸收值为纵坐标，绘制细胞生长曲线；对生长曲线添加趋势线，得到拟合方程式和拟合度指标R2，从拟合方程式中提取斜率；以每种类型细胞的斜率除以第一天的MTT数据，得到标准化生长速率。

7、转染子HeLa-TT1的生长情况

选用MTT法测定了转染子HeLa-TT1的生长情况及HeLa细胞对照、空载体对照的生长情况(测定方法如上所述)，测定结果见图3。从图3可以看出，HeLa细胞对照，转染子HeLa-TT1和空载体对照的A490nm的平均值(6孔平均)分别为：0.332，0.244，0.322，HeLa细胞对照和空载体对照的数值分别比转染子HeLa-TT1高36％和32％，经统计分析表明转染子HeLa-TT1的生长显著低于HeLa细胞对照和空载体对照(p＜0.001和p＜0.001)。此结果表明，TT1稳定转染宫颈癌HeLa细胞后，抑制了该细胞生长。

8、转染子HeLa-TT1对顺铂的敏感性检测

顺铂是一种抗癌症化学药，具有抑制肿瘤细胞生长的作用。在细胞培养液中加入1μg/ml顺铂，采用上述步骤6所述MTT法研究转染子HeLa-TT1对顺铂的敏感性，结果发现TT1基因及其编码的多肽可增加宫颈癌HeLa细胞对顺铂的敏感性，实验结果见图4。图4A为在37℃、无顺铂条件下，HeLa细胞对照、转染子HeLa-TT1和空载体对照细胞的生长曲线，从图4A可以看出，HeLa细胞对照，转染子HeLa-TT1和空载体对照的细胞生长速率分别为0.905、0.678和0.848，转染子HeLa-TT1比HeLa细胞对照和空载体对照生长分别慢了25％和20％。图4B为在37℃、1μg/ml顺铂条件下，HeLa细胞对照、转染子HeLa-TT1和空载体对照的生长曲线，由图4B可以看出，HeLa细胞对照、转染子HeLa-TT1和空载体对照的生长速率分别为0.253、0.101和0.210，转染子HeLa-TT1比HeLa细胞对照和空载体对照生长分别慢了60％和52％。

实验结果表明，1μg/ml顺铂可抑制转染子HeLa-TT1的生长，而HeLa细胞对照和空载体对照的生长速率比无顺铂时虽然有所降低，但是还能继续生长。以上结果说明TT1增加了宫颈癌HeLa细胞对顺铂的敏感性。

实施例2：TT1基因抑制人肝癌细胞HepG2生长并增加其对顺铂的敏感性

1、TT1动物细胞重组表达载体的构建，同实施例1。

2、细胞培养

肝癌HepG2细胞用含体积浓度10％胎牛血清的DMEM培养液，在37℃、体积浓度5％CO₂及饱和湿度的条件下培养，常规传代，实验时取对数生长期细胞。

3、稳定转染，同实施例1。

4、稳定转染子鉴定——RT-PCR

方法同实施例1。

将RT-PCR产物电泳照相，结果见图5。从图5可以看出，稳定表达TT1的肝癌HepG2细胞转染子(以下简称“转染子HepG2-TT1”)具有TT1和β-actin条带，而肝癌HepG2细胞对照和空载体对照仅有β-actin条带。在转录水平上说明转染子HepG2-TT1构建成功。

5、稳定转染子鉴定——Western Blotting

方法同实施例1。

鉴定结果见图6，从图6可以看出，转染子HepG2-TT1具有TT1和β-actin条带，而肝癌HepG2细胞对照和空载体对照仅有β-actin条带，在翻译水平上说明转染子HepG2-TT1构建成功。

6、细胞生长情况的测定，同实施例1。

7、转染子HepG2-TT1的生长情况

不同培养时间条件下，测定了转染子HepG2-TT1的生长情况，测定结果见图7。从图7可以看出，在37℃，不同培养时间条件下，转染子HepG2-TT1的生长慢于HepG2细胞对照和空载体对照，经统计学分析，差异均为显著(p＜0.01和p＜0.001)。由此结论：TT1稳定转染肝癌HepG2细胞后，抑制了该细胞的生长。

8、转染子HepG2-TT1对顺铂的敏感性检测

在细胞培养液中加入1μg/ml顺铂，用MTT法研究转染子HepG2-TT1对顺铂的敏感性，结果发现TT1可增加肝癌HepG2细胞对顺铂的敏感性。实验结果见图8。图8A为在37℃、无顺铂条件下，HepG2细胞对照、转染子HepG2-TT1和空载体对照细胞的生长曲线。从图8A可以看出，在37℃、无顺铂条件下，HepG2细胞对照、转染子HepG2-TT1和空载体对照的生长速率分别为1.423、0.358和1.407。图8B为在37℃、1μg/ml顺铂条件下，HepG2细胞对照、转染子HepG2-TT1和空载体对照细胞的生长曲线。从图8B可以看出，HepG2细胞对照、转染子HepG2-TT1和空载体对照的生长速率分别为0.592、-0.048和0.589。

在绘制细胞生长曲线的同时，对细胞进行了显微照像，结果发现，在37℃、无顺铂条件下，生长至第六天转染子HepG2-TT1的细胞密度明显小于HepG2细胞对照和空载体对照；在37℃、1μg/ml顺铂条件下，生长至第六天转染子HepG2-TT1的细胞密度明显小于HepG2细胞对照和空载体对照，而且其细胞状态表明细胞已大量死亡。

实验结果表明，1μg/ml顺铂完全抑制了转染子HepG2-TT1的生长，而HepG2细胞对照和空载体对照的生长速率比较无顺铂时虽然有所降低，但是还能继续生长。以上结果说明TT1增加了肝癌HepG2细胞对顺铂的敏感性。

实施例3：TT1基因抑制人肺癌细胞A549生长并增加其对顺铂的敏感性

1、TT1动物细胞重组表达载体的构建，同实施例1。

2、细胞培养

肺癌A549细胞用含体积浓度10％胎牛血清的RPMI 1640培养液，在37℃、体积浓度5％CO₂及饱和湿度的条件下培养，常规传代，实验时取对数生长期细胞。

3、稳定转染，同实施例1。

4、稳定转染子鉴定——RT-PCR

方法同实施例1。

将RT-PCR产物电泳照相，结果可见稳定表达TT1的肺癌A549细胞转染子(以下简称“转染子A549-TT1”)具有TT1和β-actin条带，而肺癌A549细胞对照和空载体对照仅有β-actin条带。在转录水平上说明转染子A549-TT1构建成功。

5、稳定转染子鉴定——Western Blotting

方法同实施例1。

结果可见，转染子A549-TT1具有TT1和β-actin条带，而肺癌A549细胞对照和空载体对照仅有β-actin条带，在翻译水平上说明转染子A549-TT1构建成功。

6、转染子A549-TT1的生长情况及对顺铂的敏感性检测

细胞生长情况的测定，同实施例1。用MTT法研究转染子A549-TT1对顺铂的敏感性。结果见图9。

图9A为在37℃、无顺铂条件下，A549细胞对照、转染子A549-TT1和空载体对照细胞的生长曲线，从图9A可以看出，在37℃、无顺铂条件下，转染子A549-TT1的生长速度缓慢，低于A549细胞对照和空载体对照。说明TT1稳定转染肺癌A549细胞后，抑制了该细胞的生长。

图9B为37℃、1μg/ml顺铂条件下A549细胞对照、转染子A549-TT1和空载体对照细胞的生长曲线，从图9B可以看出，加入顺铂后，三种细胞的生长速度都有了明显降低，转染子A549-TT1的生长速度慢于A549细胞对照和空载体对照。

实验结果表明，1μg/ml顺铂可抑制转染子A549-TT1的生长，而A549细胞对照和空载体对照的生长速率比较无顺铂时虽然有所降低，但是还能继续生长。以上结果说明TT1增加了肺癌A549细胞对顺铂的敏感性。

实施例4：TT1基因抑制人前列腺癌细胞PC3生长并增加其对顺铂的敏感性

1、TT1动物细胞重组表达载体的构建，同实施例1。

2、细胞培养

前列腺癌PC3细胞用含体积浓度10％胎牛血清的DMEM培养液，在37℃、体积浓度5％CO₂及饱和湿度的条件下培养，常规传代，实验时取对数生长期细胞。

3、稳定转染，同实施例1。

4、稳定转染子鉴定——RT-PCR

方法同实施例1。

将RT-PCR产物电泳照相，结果可见稳定表达TT1的前列腺癌PC3细胞转染子(以下简称“转染子PC3-TT1”)具有TT1和β-actin条带，而前列腺癌PC3细胞对照和空载体对照仅有β-actin条带。在转录水平上说明转染子PC3-TT1构建成功。

5、稳定转染子鉴定——Western Blotting

方法同实施例1。

结果可见，转染子PC3-TT1具有TT1和β-actin条带，而前列腺癌PC3细胞对照和空载体对照仅有β-actin条带，在翻译水平上说明转染子PC3-TT1构建成功。

6、转染子PC3-TT1的生长情况及对顺铂的敏感性检测

细胞生长情况的测定，同实施例1。用MTT法研究转染子PC3-TT1对顺铂的敏感性。结果见图10。

图10A为在37℃、无顺铂条件下，PC3细胞对照、转染子PC3-TT1和空载体对照细胞的生长曲线，从图10A可以看出，在37℃、无顺铂条件下，转染子PC3-TT1的生长速度缓慢，低于PC3细胞对照和空载体对照。说明TT1稳定转染前列腺癌PC3细胞后，抑制了该细胞的生长。

图10B为37℃，1μg/ml顺铂条件下PC细胞对照、转染子PC-TT1和空载体对照细胞的生长曲线，从图10B可以看出，加入顺铂后，三种细胞的生长速度都有了明显降低，转染子PC3-TT1的生长速度慢于PC3细胞对照和空载体对照。

实验结果表明，1μg/ml顺铂可抑制转染子PC3-TT1的生长，而PC3细胞对照和空载体对照的生长速率比较无顺铂时虽然有所降低，但是还能继续生长。以上结果说明TT1增加了前列腺癌PC3细胞对顺铂的敏感性。

Claims (1)

1.TT1基因或TT1基因编码的多肽在制备治疗肿瘤的药物中的应用，所述TT1基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所述的序列，所述TT1基因编码的多肽的氨基酸序列为SEQ IDNO.2所述的序列，所述肿瘤为宫颈癌、肝癌、肺癌、前列腺癌中的一种。