CN111574611B

CN111574611B - 一种促进stat3活化的人源蛋白及其药物应用

Info

Publication number: CN111574611B
Application number: CN202010447683.0A
Authority: CN
Inventors: 陈刘婷
Original assignee: Nantong University
Current assignee: Nantong University
Priority date: 2020-05-25
Filing date: 2020-05-25
Publication date: 2023-05-16
Anticipated expiration: 2040-05-25
Also published as: CN111574611A

Abstract

本发明公开一种促进STAT3活化的人源蛋白MSX1，其特征在于，其DNA序列如SEQ ID NO：1所示；其氨基酸序列部分SEQ ID NO：2所示。本发明还公开一种促进STAT3活化的人源蛋白MSX1的获得方法，其特征在于，包括以下步骤：利用高度特异的STAT3荧光素酶报告基因载体，在人胚肾293细胞中转染人的10000多个独立的表达克隆，通过荧光素酶报告基因实验进行系统筛选获得了促进STAT3活化的调节因子。本发明还公开MSX1在制备预防或治疗与STAT3活化失调相关肿瘤的药物方面的应用。本发明针对MSX1设计抑制药物，通过抑制MSX1来降低STAT3的活性，用于各种肿瘤的治疗。

Description

一种促进STAT3活化的人源蛋白及其药物应用

技术领域

本发明属于生物基因技术领域，涉及促进转录因子STAT3（signal transducerand activator of transcription 3）活化的核因子，具体涉及一种促进STAT3活化的人源蛋白及其在制备防治与STAT3活化失调相关肿瘤的药物方面的应用。

背景技术

STAT3（signal transducer and activator of transcription 3）是一种存在与人体，可在各种类型细胞中广泛表达的转录因子，主要以没有活性的单体形式存在于细胞质中。被IL-6、OSM、LIF等细胞因子激活后，STAT3转录活性结构域的酪氨酸残基发生磷酸化，并与另一个磷酸化的STAT3相互作用，以二聚体的形式进入细胞核，结合到特异的增强子元件上，调控大量与细胞增殖、分化、凋亡及血管新生等相关基因的转录。

虽然在正常细胞中STAT3是一个瞬时激活、受到严密调控的转录因子，但在肿瘤细胞中，STAT3却是一个高表达并持续性激活的癌基因，已被证实与头颈癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、前列腺癌、白血病等多种实体肿瘤的发生、转移和归巢密切相关(Hodge et al., 2005;Yu and Jove, 2004)。

因此，STAT3活化途径中的关键因子均可作为药物涉及筛选的靶标，调节STAT3活性的研究为肿瘤的治疗提供了新的途径。如STAT3的直接抑制剂WP1066，目前正处于治疗复发性脑瘤患者的I期临床试验阶段；另一个抑制磷酸化STAT3（p-STAT3）的小分子化合物WP1220也已经在2019年8月被允许进行皮肤T细胞淋巴瘤局部治疗的临床试验（Moleculin.Retrieved November 12, 2019, from http://www.moleculin.com/）。

发明内容

本发明目的是提供一种促进STAT3活化的人源蛋白及其在制备防治与STAT3活化失调相关肿瘤的药物方面的应用，为治疗肿瘤提供新的药物靶标和治疗新途径。

本发明的实施例提供一种促进STAT3活化的人源蛋白MSX1，其特征在于，其DNA序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步的，一种促进STAT3活化的人源蛋白MSX1，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO：2所示。

本发明的实施例还提供一种促进STAT3活化的人源蛋白MSX1的获得方法，其特征在于，包括以下步骤：利用高度特异的STAT3荧光素酶报告基因载体，在人胚肾293细胞中转染人的10000多个独立的表达克隆，通过荧光素酶报告基因实验进行系统筛选获得了促进STAT3活化的调节因子。

本发明的实施例还提供MSX1在制备预防或治疗与STAT3活化失调相关肿瘤的药物方面的应用。

进一步的，所述药物通过抑制MSX1表达来降低STAT3的活性。

本发明的上述技术方案的有益效果如下：

（1）本发明的实施例通过在293细胞中过量表达MSX1能够剂量依赖性地活化STAT3，利用CRISPR Cas9 技术获得MSX1缺失的293细胞，并证明MSX1的缺失能够抑制STAT3的活化，并使IL-6、OSM和LIF诱导STAT3激活的能力明显降低。

（2）由于能够对STAT3活性起调节作用的蛋白可作为潜在的蛋白药物直接调节STAT3的活性，或者作为药物设计的靶标，本发明的药物通过调节其活性间接调节STAT3的活化。

（3）本发明提供的MSX1可以调控STAT3的活化，因此，可以为干预STAT3活化的药物筛选的分子提供设计靶标及肿瘤的诊断标记；针对MSX1设计抑制药物，通过抑制MSX1来降低STAT3的活性，用于各种肿瘤的治疗。

附图说明

图1为本发明的实施例中MSX1对STAT3及MSX1对转录因子IRF1的效应的荧光素酶报告基因实验比对结果图。

图2为本发明的实施例中MSX1缺失的293细胞与对照细胞的荧光素酶报告基因实验结果图。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。

实施例1、本发明所使用材料来源清单

1、人胚肾293细胞购自ATCC；

2、细胞培养用DMEM，胎牛血清，0.05%胰酶溶液，青链霉素溶液购自GIBCO

3、STAT3荧光素酶报告基因载体购于QIAGEN；

4、pGL3-IRF1荧光素酶报告基因载体由Dr. Uli Schindler惠赠；

5、pRL-SV40 Renilla荧光素酶报告基因载体购于Promega；

6、筛选所用的全长cDNA表达克隆购于Origene；

7、CRISPR-Cas9所用载体pGL-U6-sgRNA和pST1374-Cas9-D10A由武汉大学张晓东教授惠赠；

8、载体构建所需限制性内切酶购自NEB；胶回收试剂盒和DNA小提试剂盒购自天根；

9、PCR引物由中国上海生工生物工程公司合成；

10、双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自Promega；

11、重组人源细胞因子IL-6、OSM和LIF均购于Peprotech；

12、转染试剂Lipofectamine 2000 购于Invitrogen。

实施例2、MSX1功能鉴定-MSX1促进STAT3的活化

293细胞转入0.1μg STAT3或IRF1荧光素酶报告基因载体，0.02μg pRL-SV40Renilla荧光素酶报告基因载体以平衡转染效率。同时转入图1中标注量（0.0、0.01μg、0.02μg、0.04μg、0.08μg、0.16μg ）的MSX1表达克隆。转染后约24小时检测荧光素酶报告基因的活性。每一样品设置三个平行实验，结果为三次独立实验所得结果的平均。

其中，（1-1）、细胞培养和细胞转染的方法如下：

（1-1-1）人胚肾293细胞放置在温度为37℃，二氧化碳浓度为5%的培养箱中进行培养。

（1-1-2）293细胞（1×10⁵）接种于24孔板中，当细胞密度达到60-70%时，参照《分子克隆实验指南》使用磷酸钙沉淀转染法进行转染。

（1-2）、荧光素酶报告基因实验的方法如下：

（1-2-1）293细胞（1×10⁵）接种于24孔板中，当细胞密度达到60-70%时使用磷酸钙沉淀转染法进行转染。

（1-2-2）每个样品设置3个平行实验组，加入适量空载体以保证每组转染的DNA总量相等。

（1-2-3）每孔转入STAT3荧光素酶报告基因载体 (0.1μg)。为平衡转染效率，同时转入0.02μg pRL-SV40 Renilla荧光素酶报告基因载体。

（1-2-4）转染18-20小时后用荧光检测试剂盒检测STAT3及pRL-SV40 Renilla荧光素酶报告基因载体的活性，方法参照产品说明。

荧光素酶报告基因实验结果显示，MSX1在293细胞中过量表达时，能够剂量依赖性地活化STAT3，如图1所示。为了检测这种活化作用是否具有特异性，本发明同时检测了MSX1对另一个转录因子IRF1的效应，结果表明MSX1对IRF1没有明显的激活或抑制作用，如图1所示，说明MSX1对STAT3的活化作用是相对特异的。

实施例3、MSX1功能鉴定-MSX1抑制IL-6、OSM和LIF诱导的STAT3的活化

为了检测MSX1在生理条件下的功能，本发明检测了MSX1表达的缺失能否影响IL-6、OSM和LIF诱导的STAT3的活化。本发明通过CRISPR Cas9技术构建了MSX1缺失的293细胞系，western blot结果显示MSX1缺失的293细胞中没有MSX1蛋白的表达。

其中，sgRNA载体的构建及MSX1缺失细胞系的构建方法如下：

参照文献方法（Ran et al., 2013），通过在线设计网站（http://tools.genome-engineering.org）确定人源MSX1基因第一个外显子上的靶定片段5’-AGGCGCTCATGGCCGACCAC-3’。

设计PCR引物：5’-TGGAGGCGCTCATGGCCGACC-3’ (forward) 和5’-TTGACGAGCGCATCTTCTGG-3’ (reverse)，通过退火合成oligo，插入已用限制性内切酶Bbs I酶切过的pGL-U6-sgRNA载体，得到MSX1的sgRNA载体。

将pGL-U6-sgRNA和pST1374-Cas9-D10A用Lipofectamine 2000转染到已传代于24孔板中的293细胞中，24小时后将细胞传至6孔板，并用嘌呤霉素（1μg/mL）和blast（1μg/mL）进行筛选。48小时后用完全培养基将细胞稀释到一系列的96孔板中。两周后挑取单克隆进行鉴定和培养。

MSX1缺失的细胞中IL-6、OSM和LIF诱导的STAT3活化的能力下降。MSX1缺失的细胞和对照细胞中分别转入0.1μg STAT3荧光素酶报告基因载体，同时转入0.02μg pRL-SV40Renilla荧光素酶报告基因载体以平衡转染效率。转染24小时后换无血清培养基饥饿过夜，加入IL-6（20ng/mL）、OSM（5ng/mL）和LIF（5ng/mL）处理细胞，6小时后检测荧光素酶报告基因的活性。在本实施例中，细胞培养和细胞转染的方法与实施例2中的方法相同。荧光素酶报告基因实验方法如实施例2中的荧光素酶报告基因实验方法相同。

荧光素酶报告基因实验结果显示，与对照293细胞相比，MSX1缺失的293细胞中本底水平的STAT3活性明显降低（图2），并且MSX1缺失的293细胞中IL-6、OSM和LIF诱导STAT3激活的能力受到明显抑制。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南通大学

<120> 一种促进STAT3活化的人源蛋白及其药物应用

<141> 2020-05-25

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 912

<212> DNA

<213> 肌节同源盒基因1(Muscle segment homeobox 1 )

<400> 1

atggccccgg ctgctgacat gacttctttg ccactcggtg tcaaagtgga ggactccgcc 60

ttcggcaagc cggcgggggg aggcgcgggc caggccccca gcgccgccgc ggccacggca 120

gccgccatgg gcgcggacga ggagggggcc aagcccaaag tgtccccttc gctcctgccc 180

ttcagcgtgg aggcgctcat ggccgaccac aggaagccgg gggccaagga gagcgccctg 240

gcgccctccg agggcgtgca ggcggcgggt ggctcggcgc agccactggg cgtcccgccg 300

gggtcgctgg gagccccgga cgcgccctct tcgccgcggc cgctcggcca tttctcggtg 360

gggggactcc tcaagctgcc agaagatgcg ctcgtcaaag ccgagagccc cgagaagccc 420

gagaggaccc cgtggatgca gagcccccgc ttctccccgc cgccggccag gcggctgagc 480

cccccagcct gcaccctccg caaacacaag acgaaccgta agccgcggac gcccttcacc 540

accgcgcagc tgctggcgct ggagcgcaag ttccgccaga agcagtacct gtccatcgcc 600

gagcgcgcgg agttctccag ctcgctcagc ctcactgaga cgcaggtgaa gatatggttc 660

cagaaccgcc gcgccaaggc aaagagacta caagaggcag agctggagaa gctgaagatg 720

gccgccaagc ccatgctgcc accggctgcc ttcggcctct ccttccctct cggcggcccc 780

gcagctgtag cggccgcggc gggtgcctcg ctctacggtg cctctggccc cttccagcgc 840

gccgcgctgc ctgtggcgcc cgtgggactc tacacggccc atgtgggcta cagcatgtac 900

cacctgacat ag 912

<210> 2

<211> 303

<212> PRT

<213> 肌节同源盒基因1(Muscle segment homeobox 1 )

<400> 2

Met Ala Pro Ala Ala Asp Met Thr Ser Leu Pro Leu Gly Val Lys Val

1 5 10 15

Glu Asp Ser Ala Phe Gly Lys Pro Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gln Ala

20 25 30

Pro Ser Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Met Gly Ala Asp Glu Glu

35 40 45

Gly Ala Lys Pro Lys Val Ser Pro Ser Leu Leu Pro Phe Ser Val Glu

50 55 60

Ala Leu Met Ala Asp His Arg Lys Pro Gly Ala Lys Glu Ser Ala Leu

65 70 75 80

Ala Pro Ser Glu Gly Val Gln Ala Ala Gly Gly Ser Ala Gln Pro Leu

85 90 95

Gly Val Pro Pro Gly Ser Leu Gly Ala Pro Asp Ala Pro Ser Ser Pro

100 105 110

Arg Pro Leu Gly His Phe Ser Val Gly Gly Leu Leu Lys Leu Pro Glu

115 120 125

Asp Ala Leu Val Lys Ala Glu Ser Pro Glu Lys Pro Glu Arg Thr Pro

130 135 140

Trp Met Gln Ser Pro Arg Phe Ser Pro Pro Pro Ala Arg Arg Leu Ser

145 150 155 160

Pro Pro Ala Cys Thr Leu Arg Lys His Lys Thr Asn Arg Lys Pro Arg

165 170 175

Thr Pro Phe Thr Thr Ala Gln Leu Leu Ala Leu Glu Arg Lys Phe Arg

180 185 190

Gln Lys Gln Tyr Leu Ser Ile Ala Glu Arg Ala Glu Phe Ser Ser Ser

195 200 205

Leu Ser Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg

210 215 220

Ala Lys Ala Lys Arg Leu Gln Glu Ala Glu Leu Glu Lys Leu Lys Met

225 230 235 240

Ala Ala Lys Pro Met Leu Pro Pro Ala Ala Phe Gly Leu Ser Phe Pro

245 250 255

Leu Gly Gly Pro Ala Ala Val Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ser Leu Tyr

260 265 270

Gly Ala Ser Gly Pro Phe Gln Arg Ala Ala Leu Pro Val Ala Pro Val

275 280 285

Gly Leu Tyr Thr Ala His Val Gly Tyr Ser Met Tyr His Leu Thr

290 295 300

Claims

1.一种促进STAT3活化的人源蛋白MSX1的获得方法，其特征在于，包括以下步骤：利用高度特异的STAT3荧光素酶报告基因载体，在人胚肾293细胞中转染人的10000多个独立的表达克隆，通过荧光素酶报告基因实验进行系统筛选获得了促进STAT3活化的调节因子，所述促进STAT3活化的调节因子MSX1，其DNA序列如SEQ ID NO：1所示；其氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。