CN110156877B

CN110156877B - 抑制肿瘤的多肽类似物UBE2Z1-330aa及其编码核酸、引物对、表达载体和应用

Info

Publication number: CN110156877B
Application number: CN201910417285.1A
Authority: CN
Inventors: 胡宝英; 万春华; 李洁佳
Original assignee: Nantong University
Current assignee: Nantong University
Priority date: 2019-05-20
Filing date: 2019-05-20
Publication date: 2022-09-06
Anticipated expiration: 2039-05-20
Also published as: CN110156877A

Abstract

本发明提供一种抑制肿瘤的多肽类似物UBE2Z^1‑330aa及其编码核酸、引物对、表达载体和应用，本发明涉及药物技术领域。本发明提供的多肽类似物UBE2Z^1‑330aa，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，能够结合c‑myc并促进c‑myc在结肠癌细胞中的降解，从而发挥抑制肿瘤细胞的过度增殖的功能。可为肿瘤治疗靶点的探寻提供理论依据，对于应用于肿瘤的临床治疗具有十分重要的开发前景。

Description

抑制肿瘤的多肽类似物UBE2Z1-330aa及其编码核酸、引物对、表达载体和应用

技术领域

本发明涉及药物技术领域，尤其涉及一种抑制肿瘤的多肽类似物 UBE2Z^1-330aa及其编码核酸、引物对、表达载体和应用。

背景技术

c-myc转录因子是肿瘤发生的核心癌基因，几乎所有的恶性肿瘤细胞中均发生c-myc异常表达升高和不受控制的活化，进而导致肿瘤细胞的永生化、干细胞性、增殖、耐药和远端转移等肿瘤各方面的恶性行为。c-myc主要通过调控下游基因转录发挥上述活性，其在核内的表达决定了肿瘤细胞的恶性程度，因此，抑制肿瘤细胞中c-myc的表达是一种非常有效的肿瘤靶向治疗策略。

近年来有研究表明，c-myc在肿瘤细胞中的异常高表达与其降解调控异常有关。肿瘤细胞中c-myc异常稳定，导致其在核内聚集并转录活化众多肿瘤恶性相关蛋白，导致肿瘤的进程。因此，促进c-myc的降解是肿瘤靶向治疗的一个有效的策略。

以往的研究表明，c-myc主要通过泛素蛋白酶体通路降解，但c-myc的降解受多种因素调控，很多肿瘤细胞中c-myc发生泛素化修饰和降解通路并未发生异常，但这些细胞中c-myc的半衰期和降解水平却存在明显的异常。因此，目前还缺乏一种直接诱导c-myc降解的抗癌药物。

发明内容

本发明针对目前缺乏一种针对肿瘤细胞的核心癌基因c-myc的抗癌药物的问题，提供了一种抑制肿瘤的多肽类似物UBE2Z^1-330aa及其编码核酸、引物对、表达载体和应用，所述多肽类似物UBE2Z^1-330aa可直接结合c-myc基因，并促进c-myc降解，从而有效抑制癌细胞的永生化和增殖。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种抑制肿瘤的多肽类似物UBE2Z^1-330aa，氨基酸序列如 SEQ IDNO.1所示。

本发明还提供了一种编码上述技术方案所述多肽类似物UBE2Z^1-330aa的核酸分子，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种用于扩增上述技术方案所述核酸分子的引物对，其中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游序列的核苷酸序列如 SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了一种前述技术方案所述多肽类似物UBE2Z^1-330aa的表达载体，包括前述技术方案所述的核酸分子。

优选的，将前述技术方案所述的核酸分子插入pCMV-N-Flag的多克隆位点，得到所述表达载体。

本发明还提供了前述技术方案所述多肽类似物UBE2Z^1-330aa、核酸分子、引物对或表达载体在制备抗肿瘤药物中的应用。

优选的，所述抗肿瘤药物为靶向抑制肿瘤增殖的药物。

优选的，所述抗肿瘤药物包括抗结肠癌药物、抗肝癌药物和抗胃癌药物中的一种或多种。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

发明人研究表明，在肿瘤中UBE2Z蛋白可与c-myc发生相互作用，促进 c-myc在肿瘤细胞中的降解。因此，利用UBE2Z活性多肽类似物促进c-myc 在肿瘤细胞中的降解成为寻找抗肿瘤药物的新策略。

本发明基于肿瘤中UBE2Z与癌基因c-myc相互作用结构域的确立，提供了一种多肽类似物UBE2Z^1-330aa，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的多肽类似物UBE2Z^1-330aa为UBE2Z蛋白中具有促进c-myc在肿瘤细胞中的降解作用的330个氨基酸，能够直接结合c-myc，介导c-myc发生 FAT10翻译后修饰并介导修饰后的物质迅速降解，从而有效抑制肿瘤细胞的永生化和增殖，发挥抑制肿瘤作用。可为肿瘤治疗靶点的探寻提供理论依据，对于应用于肿瘤的临床治疗具有十分重要的开发前景。

附图说明

图1、实施例1中UBE2Z和c-myc蛋白进行免疫沉淀的免疫沉淀复合物检测实验结果图；

图2、实施例2的步骤1中重组真核表达载体图谱；

图3、实施例2的步骤2中HCT116细胞系中免疫印迹证明多肽的蛋白表达实验结果图；

图4、实施例3中多肽类似物UBE2Z^1-330aa的荧光检测c-myc降解的结果图；

图5、实施例5中免疫沉淀表明HCT116细胞系中多肽类似物可促进 c-myc发生FAT10类泛素化修饰；

图6、实施例6中免疫印迹表明HCT116细胞系中多肽类似物对c-myc 降解的实验结果图；

图7、实施例7步骤1中转染以及未转染细胞细胞培养表明细胞系中多肽类似物UBE2Z^1-330aa抑制肿瘤细胞核酸掺入。

图8、实施例7步骤2中转染以及未转染细胞细胞培养表明细胞系中多肽类似物UBE2Z^1-330aa抑制肿瘤细胞的增殖。

具体实施方式

本发明提供了一种抑制肿瘤的多肽类似物UBE2Z^1-330aa，氨基酸序列如 SEQ IDNO.1所示。本发明所述多肽类似物UBE2Z^1-330aa用于促进肿瘤细胞中c-myc发生类泛素化修饰和降解，从而达到抑制肿瘤增殖和生长的目的。

SEQ ID NO.1：

MAESPTEEAATAGAGAAGPGASSVAGVVGVSGSGGGFGPPFLPDVW AAAAAAGGAGGPGSGLAPLPGLPPSAAAHGAALLSHWDPTLSSDWDGE RTAPQCLLRIKRDIMSIYKEPPPGMFVVPDTVDMTKIHALITGPFDTPYEG GFFLFVFRCPPDYPIHPPRVKLMTTGNNTVRFNPNFYRNGKVCLSILGTW TGPAWSPAQSISSVLISIQSLMTENPYHNEPGFEQERHPGDSKNYNECIRHE TIRVAVCDMMEGKCPCPEPLRGVMEKSFLEYYDFYEVACKDRLHLQGQT MQDPFGEKRGHFDY QSLLMRLGLI RQKVLERLHN。

本发明还提供了一种编码上述技术方案所述多肽类似物UBE2Z^1-330aa的核酸分子，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明提供的核酸分子可编码得到所述多肽类似物UBE2Z^1-330aa，也可用于抑制肿瘤药物的制备中。

SEQ ID NO.2：

ATGGCGGAGAGTCCGACTGAGGAGGCGGCAACGGCGGGCGCCGG GGCGGCGGGCCCCGGGGCGAGCAGCGTTGCTGGTGTTGTTGGCGTTA GCGGCAGCGGCGGCGGGTTCGGGCCGCCTTTCCTGCCGGATGTGTGGG CGGCGGCGGCGGCAGCGGGCGGGGCCGGGGGCCCGGGGAGCGGCCT GGCTCCGCTGCCCGGGCTCCCGCCCTCAGCCGCTGCCCACGGGGCCGC GCTGCTTAGCCACTGGGACCCCACGCTCAGCTCCGACTGGGACGGCG AGCGCACCGCGCCGCAGTGTCTACTCCGGATCAAGCGGGATATCATGT CCATTTATAAGGAGCCTCCTCCAGGAATGTTCGTTGTACCTGATACTGTT GACATGACTAAGATTCATGCATTGATCACAGGCCCATTTGACACTCCTT ATGAAGGGGGTTTCTTCCTGTTCGTGTTTCGGTGTCCGCCCGACTATCC CATCCACCCACCTCGGGTCAAACTGATGACAACGGGCAATAACACAGT GAGGTTTAACCCCAACTTCTACCGCAATGGGAAAGTCTGCTTGAGTATT CTAGGTACATGGACTGGACCTGCCTGGAGCCCAGCCCAGAGCATCTCC TCAGTGCTCATCTCTATCCAGTCCCTGATGACTGAGAACCCCTATCACA ATGAGCCCGGCTTTGAACAGGAGAGACATCCAGGAGACAGCAAAAAC TATAATGAATGTATCCGGCACGAGACCATCAGAGTTGCAGTCTGTGACA TGATGGAAGGAAAGTGTCCCTGTCCTGAACCCCTACGAGGGGTGATGG AGAAGTCCTTTCTGGAGTATTACGACTTCTACGAGGTGGCCTGCAAAG ATCGCCTGCACCTTCAAGGCCAAACTATGCAGGACCCTTTTGGAGAGA AGCGGGGCCACTTTGACTACCAGTCCCTCTTGATGCGCCTGGGACTGA TACGTCAGAAAGTGCTGGAGAGGCTCCATAAT。

本发明还提供了一种用于扩增上述技术方案所述核酸分子的引物对，其中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游序列的核苷酸序列如 SEQ ID NO.4所示。利用本发明提供的引物对，可从癌细胞的cDNA或其他核酸序列中扩增得到用于编码多肽类似物UBE2Z^1-330aa的核酸分子。

SEQ ID NO.3：GGCAAGCTTATGGCGGAGAGTCCGACTGA；

SEQ ID NO.4：GGCGGATCCATTATGGAGCCTCTCCAGCA。

在本发明中，利用本发明所述引物对进行PCR扩增时的扩增条件优选为：94℃，30”；58℃，30”；72℃，90”(35循环)。

本发明还提供了一种前述技术方案所述多肽类似物UBE2Z^1-330aa的表达载体，包括前述技术方案所述的核酸分子。本发明提供的表达载体可用于制备肿瘤抑制药物。

具体的，本发明将前述技术方案所述的核酸分子插入pCMV-N-Flag的多克隆位点，得到所述表达载体。

本发明还提供了前述技术方案所述多肽类似物UBE2Z^1-330aa、核酸分子、引物对或上述技术方案所述表达载体在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明所述抗肿瘤作用是通过结合核心癌基因c-myc并诱导其降解实现的，靶向性强，是一种新的肿瘤靶向治疗途径。

在本发明中，所述抗肿瘤药物优选的包括靶向抑制肿瘤增殖的药物。本发明优选的，所述抗肿瘤药物可以是抗结核癌药物。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1 UBE2Z与c-myc蛋白在结肠癌组织中存在直接的相互作用

将结肠癌组织进行组织以IP裂解液(50mM Tris-Cl，150mM NaCl，1％ NP-40，1mMEDTA、20mM MgCl₂、1×Roche蛋白酶和磷酸酶抑制剂复合物)裂解后，分别以抗UBE2Z和c-myc的抗体进行免疫沉淀，检测免疫沉淀复合物中存在UBE2Z-myc相互作用。

结果如图1所示，表明UBE2Z和c-myc两者在结肠癌组织中存在相互作用。

实施例2多肽类似物UBE2Z^1-330aa的构建

1、多肽类似物的克隆载体构建。

以DMEM培养基添加10％胎牛血清体外培养人的HCT116结肠癌细胞系，添加1mL的Trizol裂解液提取HCT116细胞中的总RNA。将总RNA进行逆转录成HCT116结肠癌细胞cDNA文库，采用如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的上下游引物，利用PCR技术扩增出UBE2Z的^1-330aa cDNA编码序列，所述PCR扩增时的条件为：94℃，30”；58℃，30”；72℃，90”(35 循环)。将扩增得到的片段与pCMV-Flag质粒载体经限制性内切酶HindIII 和BamHI切割后连接，将连接产物转入DH5α感受态大肠杆菌中，在含Amp+ 琼脂平板上挑选克隆质粒，以碱裂解法小提重组质粒后，以PCR和琼脂糖凝胶电泳鉴定。最后，经DNA测序和核酸比对确定成功构建多肽类似物 UBE2Z^1-330aa的重组质粒。

2、多肽类似物的真核表达载体构建及其表达检测。

将步骤1构建的UBE2Z^1-330aa重组质粒和质粒pCMV-3xFlag分别双酶切 (HindIII和BamHI)后，利用回收试剂盒获得目的片段和载体连接。经转化、提取等步骤获得重组真核表达载体Flag-UBE2Z^1-330aa图谱(如图2所示)。酶切鉴定重组体，并且测序进一步确定，测序结果。将正确连接的多肽真核表达载体转染肿瘤细胞HCT116细胞系，48小时后收集细胞样品。

结果如图3所示，设空白对照组，免疫印迹结果证明了此多肽类似物 UBE2Z^1-330aa的表达。

实施例3多肽类似物UBE2Z^1-330aa可直接促进c-myc在结肠癌细胞中的降解的验证

按照实施例2所示的方法将UBE2Z的主要生物活性片段UBE2Z^1-330aa构建至pCMV-N-Flag载体中，将构建好载体转染HCT116结肠癌细胞系。转染24h后，以Flag和c-myc抗体进行免疫荧光，分析转染UBE2Z^1-330aa对细胞内c-myc表达的影响。

如图4所示，免疫荧光结果表明，UBE2Z^1-330aa多肽类似物可导致c-myc 在结肠癌细胞中的迅速降解。

实施例4多肽类似物UBE2Z^1-330aa促进c-myc发生FAT10类泛素化修饰的确定。

将实施例2构建的真核表达载体Flag-UBE2Z^1-330aa转染至肿瘤细胞 HCT116细胞系中，转染36～48h后，收集细胞并以IP裂解液(50mM Tris-HCl pH 8.0、150mM NaCl、1％NP-40、5mM EDTA、20mM MgCl₂、1×Roche蛋白酶和磷酸酶抑制剂复合物)裂解细胞13000g、4℃离心15min。将上清转移至新管，保留部分样品作为上样对照后，加入4μg的抗c-myc抗体过夜孵育后，加入30μL Protein A/Gbeads(蛋白A/G珠子)进行免疫沉淀。以IP 裂解液洗涤4遍后，加入25μL免疫印迹电泳上样缓冲液并煮沸5min，免疫印迹检测多肽类似物是否可介导c-myc存在FAT10类泛素化修饰。

如图5所示，设空白对照组，免疫印迹明确多肽类似物UBE2Z^1-330aa可显著促进c-myc发生FAT10类泛素化修饰。

实施例5多肽类似物UBE2Z^1-330aa促进c-myc降解的确定。

将实施例2构建的真核表达载体Flag-UBE2Z^1-330aa转染至肿瘤细胞 HCT116细胞系中，转染36～48h后，收集细胞。

如图6所示，设空白对照组，免疫印迹结果显示此多肽类似物 UBE2Z^1-330aa能够促进肿瘤细胞内c-myc的降解。

实施例6多肽类似物UBE2Z^1-330aa抑制肿瘤细胞增殖的能力的确定

1、EdU核酸掺入实验检测多肽类似物阻滞细胞增殖。

将实施例2构建的真核表达载体Flag-UBE2Z^1-330aa转染至肿瘤细胞 HCT116细胞系中，36小时后，以1：1000比例添加核酸类似物EdU溶液进入细胞，孵育2h。结束后，弃去培养基并用PBS洗涤细胞1次，加入4％多聚甲醛室温固定细胞30min，弃去多聚甲醛并加入2mg/mL甘氨酸溶液，摇床孵育5分钟。再以0.5％TritonX-100通透细胞5min。

用

染色反应液特异性检测细胞中EdU的掺入情况，加入5ng/mL 的DAPI溶液孵育细胞5min染细胞核，用封片剂封片并在高清荧光显微镜下检测记录各组EdU阳性细胞比例。

如图7所示，设空白对照组，被转染的HCT116细胞的细胞EdU掺入明显受到抑制。

2、CCK-8实验检测多肽类似物表达质粒抑制细胞增殖的能力。

将转染以及未转染细胞以每孔1*10⁴/孔的密度接种于96孔板中。置37℃， 5％CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养。待细胞贴壁后，每24小时以 CCK-8实验检测一次细胞增殖水平变化：将各组每3孔培养基弃去，加入含 10μL CCK-8试剂的100μL DMEM完全培养基。继续孵育2h，孵育结束后以酶标板检测细胞在490nm处的吸光度，参考波长为630nm。连续检测 5天后，绘制各组的CCK-8细胞增殖曲线。

结果如图8所示，多肽类似物UBE2Z^1-330aa过表达的细胞增殖速度明显减慢。

由以上实施例可知，本发明提供的多肽类似物UBE2Z^1-330aa可直接与 c-myc结合，并介导其降解，从而达到抑制肿瘤细胞增殖、阻滞细胞周期进程的作用，是一种新型肿瘤靶向治疗途径。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南通大学

<120> 抑制肿瘤的多肽类似物UBE2Z1-330aa及其编码核酸、引物对、表达载体和应用

<141> 2019-05-09

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 330

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Ala Glu Ser Pro Thr Glu Glu Ala Ala Thr Ala Gly Ala Gly Ala

1 5 10 15

Ala Gly Pro Gly Ala Ser Ser Val Ala Gly Val Val Gly Val Ser Gly

20 25 30

Ser Gly Gly Gly Phe Gly Pro Pro Phe Leu Pro Asp Val Trp Ala Ala

35 40 45

Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gly Pro Gly Ser Gly Leu Ala Pro

50 55 60

Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ser Ala Ala Ala His Gly Ala Ala Leu Leu

65 70 75 80

Ser His Trp Asp Pro Thr Leu Ser Ser Asp Trp Asp Gly Glu Arg Thr

85 90 95

Ala Pro Gln Cys Leu Leu Arg Ile Lys Arg Asp Ile Met Ser Ile Tyr

100 105 110

Lys Glu Pro Pro Pro Gly Met Phe Val Val Pro Asp Thr Val Asp Met

115 120 125

Thr Lys Ile His Ala Leu Ile Thr Gly Pro Phe Asp Thr Pro Tyr Glu

130 135 140

Gly Gly Phe Phe Leu Phe Val Phe Arg Cys Pro Pro Asp Tyr Pro Ile

145 150 155 160

His Pro Pro Arg Val Lys Leu Met Thr Thr Gly Asn Asn Thr Val Arg

165 170 175

Phe Asn Pro Asn Phe Tyr Arg Asn Gly Lys Val Cys Leu Ser Ile Leu

180 185 190

Gly Thr Trp Thr Gly Pro Ala Trp Ser Pro Ala Gln Ser Ile Ser Ser

195 200 205

Val Leu Ile Ser Ile Gln Ser Leu Met Thr Glu Asn Pro Tyr His Asn

210 215 220

Glu Pro Gly Phe Glu Gln Glu Arg His Pro Gly Asp Ser Lys Asn Tyr

225 230 235 240

Asn Glu Cys Ile Arg His Glu Thr Ile Arg Val Ala Val Cys Asp Met

245 250 255

Met Glu Gly Lys Cys Pro Cys Pro Glu Pro Leu Arg Gly Val Met Glu

260 265 270

Lys Ser Phe Leu Glu Tyr Tyr Asp Phe Tyr Glu Val Ala Cys Lys Asp

275 280 285

Arg Leu His Leu Gln Gly Gln Thr Met Gln Asp Pro Phe Gly Glu Lys

290 295 300

Arg Gly His Phe Asp Tyr Gln Ser Leu Leu Met Arg Leu Gly Leu Ile

305 310 315 320

Arg Gln Lys Val Leu Glu Arg Leu His Asn

325 330

<210> 2

<211> 990

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

atggcggaga gtccgactga ggaggcggca acggcgggcg ccggggcggc gggccccggg 60

gcgagcagcg ttgctggtgt tgttggcgtt agcggcagcg gcggcgggtt cgggccgcct 120

ttcctgccgg atgtgtgggc ggcggcggcg gcagcgggcg gggccggggg cccggggagc 180

ggcctggctc cgctgcccgg gctcccgccc tcagccgctg cccacggggc cgcgctgctt 240

agccactggg accccacgct cagctccgac tgggacggcg agcgcaccgc gccgcagtgt 300

ctactccgga tcaagcggga tatcatgtcc atttataagg agcctcctcc aggaatgttc 360

gttgtacctg atactgttga catgactaag attcatgcat tgatcacagg cccatttgac 420

actccttatg aagggggttt cttcctgttc gtgtttcggt gtccgcccga ctatcccatc 480

cacccacctc gggtcaaact gatgacaacg ggcaataaca cagtgaggtt taaccccaac 540

ttctaccgca atgggaaagt ctgcttgagt attctaggta catggactgg acctgcctgg 600

agcccagccc agagcatctc ctcagtgctc atctctatcc agtccctgat gactgagaac 660

ccctatcaca atgagcccgg ctttgaacag gagagacatc caggagacag caaaaactat 720

aatgaatgta tccggcacga gaccatcaga gttgcagtct gtgacatgat ggaaggaaag 780

tgtccctgtc ctgaacccct acgaggggtg atggagaagt cctttctgga gtattacgac 840

ttctacgagg tggcctgcaa agatcgcctg caccttcaag gccaaactat gcaggaccct 900

tttggagaga agcggggcca ctttgactac cagtccctct tgatgcgcct gggactgata 960

cgtcagaaag tgctggagag gctccataat 990

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggcaagctta tggcggagag tccgactga 29

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggcggatcca ttatggagcc tctccagca 29

Claims

1.一种抑制肿瘤的多肽类似物UBE2Z^1-330aa在制备抗结肠癌药物中的应用，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗结肠癌药物为靶向抑制结肠癌增殖的药物。