CN108342415B - 一种用于治疗癌症的慢病毒质粒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于治疗癌症的慢病毒质粒及其应用，所述用于治疗癌症的慢病毒质粒中含有编码靶向DHX33的小分子RNA的核酸序列：sh‑DHX33‑2:5’‑TTGGGAAGCTGGTTGGCTATACTCGAGTATAGCCAACCA GCTTCCCAA‑3’。所述小分子RNA具有敲低DHX33的蛋白含量使之达到基本水平的作用，以降低c‑Myc的致癌性和维持癌性特征的作用，从而达到治疗癌症的目的。

Description

一种用于治疗癌症的慢病毒质粒及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，主要涉及一种用于治疗癌症的慢病毒质粒及其应用。
背景技术
在过去十年间，中国癌症病人的新增数目呈逐年上升趋势，而癌症病人的五年平均存活率却不到一成，远远低于发达国家的五成以上的水平。根据最新统计数据显示：中国癌症新增人口已经跃居世界前列。上述严峻的形式使得从全新的视角了解和探索癌症的治疗变得极为迫切。
c-Myc是在多种癌症中高表达的癌基因之一，可在多种癌症中出现基因扩增或易位(translocation)；同时，Myc的抑制蛋白Mga基因缺失突变也可引起Myc 的过度表达。c-Myc在细胞内主要与Max结合，形成c-Myc/Max二聚体复合物的转录因子，发挥调控下游基因进而刺激细胞增生和代谢的功能，该功能的失调几乎出现在所有人类癌症中。针对癌细胞对癌基因的生长依赖(oncogene addiction)，对病人使用靶向不同癌蛋白的治疗药物，可以专一性地抑制癌症的发展，延长病人寿命，实现精准个性化治疗。其中最突出的例子是EGFR的络氨酸激酶受体抑制剂EGFR-TKI，已在临床取得了很好的疗效。然而，尽管在小鼠模型中抑制c-Myc被证明能够有效遏制癌症的发生发展，但由于c-Myc本身作为一个转录因子，是难以靶向的,因此至今医学上尚无有效的药物能针对性地抑制c-Myc信号途径的激活。
既然癌基因c-Myc本身难以靶向控制，那么针对其上游或下游信号途径来筛选抗癌药物则显得尤为重要。目前，癌症研究中对一些比较经典的癌基因或抑癌基因途径的上游信号途径了解比较清晰，但是对于癌基因/抑癌基因下游信号传导途径，人们了解的并不全面。这些下游分子对维持癌细胞性状至关重要，可以综合多种上游信号通路来调控细胞生长，是未来抗癌药物开发的潜在源泉。例如，蛋白质翻译是细胞内最保守的生命活动之一，其中4E-BP通过与 eIF4E结合调控cap-dependent蛋白翻译(是维持细胞正常功能的途径之一)，而这一重要控制途径在很多癌症中却出现失调，导致癌细胞的生长、分裂对蛋白合成有着很强的依赖性，目前对eIF4E介导的蛋白翻译调控机制的研究已经成为癌症生物学一个研究热点。再比如调控细胞代谢的蛋白PKM2在癌细胞中的表达量比正常细胞中高很多倍，它参与癌细胞的糖酵解Warburg效应、调控代谢重组等；抑制PKM2被证明可以抑制癌细胞增生繁殖，而对正常细胞没有显著副作用。核糖体生成一直以来被认为是细胞保守的生命活动(housekeeping) 之一，RNA聚合酶Ⅰ的转录可被多种癌基因、抑癌基因的信号通路调控，其在很多癌细胞中显示增强的转录活性。近年来RNA聚合酶Ⅰ被认为是癌症治疗的又一个潜在药物靶点，其中CX5461是第一个进入Ⅰ期临床的抑制RNA聚合酶Ⅰ转录药物，它对癌细胞的靶向性专一，而对正常细胞的损害很小，是普通化疗药物无法比拟的。
综上所述，蛋白质翻译、Warburg效应、核糖体生成等在癌细胞中异常活跃的现象都可以作为研究对象，即通过抑制这些下游途径同样可达到抑制癌症发展的目的，进而为潜在的癌症治疗手段的开发提供思路。随着癌症个体化治疗的发展，部分药物可以达到有效抑制癌症发展的目的。但是由癌基因c-Myc扩增或激活引起的诸多癌症至今仍缺乏有效的治疗药物。我们以前发现RNA解旋酶家族的一个成员DHX33参与了蛋白质翻译和核糖体RNA的生成，进一步的研究发现这一蛋白主动参与抑制细胞凋亡。DHX33是c-Myc下游的一个基因，在c-Myc诱导的癌症发生过程中起着至关重要的作用。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于治疗癌症的慢病毒质粒及其应用，旨在提供一种新的治疗癌症的药物。
本发明的技术方案如下：
一种用于治疗癌症的慢病毒质粒，其中，所述用于治疗癌症的慢病毒质粒中含有编码靶向DHX33的小分子RNA的核酸序列：
sh-DHX33-2:5’-TTGGGAAGCTGGTTGGCTATACTCGAGTATAG CC AACCAGCTTCCCAA-3’。
所述的用于治疗癌症的慢病毒质粒，其中，用于治疗癌症的慢病毒质粒中含有以下核酸序列：
sh-DHX33-2-前寡核苷酸：5’-CCGGTTGGGAAGCTGGTTGGCTATA CTCGAGTATAGCCAACCAGCTTCCCAATTTTTG 3’,
sh-DHX33-2-后寡核苷酸：5’-AATTCAAAAATTGGGAAGCTGG TTGGCTATACTCGAGTATAGCCAACCAGCTTCCCAA-3’。
所述的用于治疗癌症的慢病毒质粒，其中，所述慢病毒质粒为 pLKO.1-vector，所述小RNA序列的基因通过限制酶切位点AgeI/EcoRI克隆到 pLKO.1质粒中。
一种如上所述的用于治疗癌症的慢病毒质粒的应用，其中，将所述慢病毒质粒用于制备治疗癌症的药物，所述癌症为由癌基因c-Myc扩增或激活引起的癌症。
所述的用于治疗癌症的慢病毒质粒的应用，其中，所述癌症为肺腺癌。
有益效果：由癌基因c-Myc扩增或激活引起的诸多癌症至今仍缺乏有效的治疗药物，本发明的用于治疗癌症的基因靶向药物、慢病毒质粒和慢病毒及其制备方法，所述用于治疗癌症的慢病毒质粒中含有靶向DHX33的小RNA序列： sh-DHX33-2:5’-TTGGGAAGCTGGTTGGCTATA CTCGAGTATAGCCAACCAGCTTCCCAA-3’。所述小分子RNA具有敲低DHX33的蛋白含量使之达到基本水平的作用，以降低c-Myc的致癌性和维持癌性特征的作用，从而达到治疗癌症的目的。
附图说明
图1为本发明实施例1中蛋白含量的检测结果图。
图2为本发明实施例1中显微镜下观察细胞的凋亡情况的检测结果图。
图3为本发明实施例1中用流式细胞仪检测的细胞凋亡分析图。
图4为本发明实施例2中摆BT549蛋白含量的检测结果图。
图5为本发明实施例2中H1299蛋白含量的检测结果图。
图6为本发明实施例2中细胞凋亡基因Bcl-2和BAD信使RNA水平的检测结果图。
图7为本发明实施例2中分析DHX33结合在Bcl-2和BAD基因启动子的染色体免疫共沉降实验的PCR产物电泳结果图。
图8为本发明实施例3中DHX33 mRNA量的实时荧光PCR检测结果图。
图9为本发明实施例3中DHX33蛋白量的检测结果图。
图10为本发明实施例3中c-Myc转录因子与启动子DNA结合的保守区域 E-box中各个碱基示意图。
图11为本发明实施例3中DHX33基因近端启动子中含有的E-Box位点及序列的示意图。
图12为本发明实施例4中证明c-Myc蛋白直接结合在DHX33基因启动子产生电泳移动速率变化的分析结果。
图13为本发明实施例4中正常肺组织和肺癌组织实例中的DHX33的表达与c-Myc的表达对比图。
图14为本发明实施例4中各个蛋白量的分析图。
图15为本发明实施例4中细胞迁移实验
图16为本发明实施例4中BrdU细胞增殖实验为
图17为本发明实施例4中细胞的软琼脂悬浮独立生长实验对比图。
图18为本发明实施例4中分析肺腺癌细胞中缺失DHX33后引起细胞迁移抑制的对比图。
图19为本发明实施例5中对照组与实验组在小鼠体内形成肿瘤的能力的对比图。
图20为本发明实施例5中对照组与实验组对裸鼠内形成肿瘤的定量分析的结果图。
图21为本发明实施例6中分析各种靶向DHX33的小RNA分子抑制 DHX33蛋白表达的结果分析图。
具体实施方式
本发明提供一种用于治疗癌症的慢病毒质粒及其应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明中提供一种用于治疗癌症的小RNA分子，所述小RNA分子具有敲低DHX33的蛋白含量使之达到基本水平的作用，以降低c-Myc的致癌性和维持癌性特征的作用，从而达到治疗癌症的目的。
所述小RNA分子为小发夹RNA，其序列为：
TTGGGAAGCTGGTTGGCTATA(SEQ ID NO:17)。
本发明中提供一种用于治疗癌症的基因靶向药物，所述基因靶向药物为编码具有敲低DHX33的蛋白含量作用的小分子RNA的核酸序列，其核酸序列如下：
(5’-3’)sh-DHX33-2:5’-TTGGGAAGCTGGTTGGCTATACTCGAGT ATAGCCAACCAGCTTCCCAA-3’。
该基因靶向药物采用现有慢病毒导入细胞内。所述癌症为由癌基因c-Myc 扩增或激活引起的癌症，如肺腺癌。所述基因靶向药物具有敲低DHX33的蛋白含量使之达到基本水平的作用，以降低c-Myc的致癌性和维持癌性特征的作用，从而达到治疗肺腺癌的目的。由于c-Myc本身作为一个转录因子，是难以靶向的，本发明中通过实验研究表明，DHX33是c-Myc引发的癌症治疗上的一个靶向位点，DHX33调控是癌基因c-Myc的下游途径之一，而本发明则所提供的基因靶向药物则是从其下游信号途径来阻止癌症发生发展。因此，本发明还提供所述用于治疗癌症的小RNA分子的应用，将所述用于治疗癌症的小RNA分子用于制备治疗癌症的药物。所述癌症为由癌基因c-Myc扩增或激活引起的癌症，更具体地为所述癌症为肺腺癌。
本发明中还提供一种用于治疗癌症的慢病毒质粒，所述慢病毒质粒含有编码靶向DHX33的小RNA序列的基因，所述小RNA具有敲低DHX33蛋白表达水平的作用，所述慢病毒质粒中含有编码靶向DHX33的小RNA序列(其中 sh-DHX33-1为以前公开序列，本发明中用作实验对照)：
sh-DHX33-1:(5’-3’):GCTATCGCAAAGTGATCATTTCTCGAGAAATGATCA CTTTGCGATAGC(SEQ ID NO:1)；
sh-DHX33-2:(5’-3’):TTGGGAAGCTGGTTGGCTATACTCGAGTATAGCCA ACCAGCTTCCCAA(SEQ ID NO:2)。
进一步地，所述慢病毒质粒制备需要pLKO.1-vector、pCMV-VSV-G及 pCMV-dR8.2dvpr(均可通过购买获得)。在本申请中，对慢病毒质粒的型号不作要求和限定，只要能表达该小RNA序列的基因并能转染细胞的慢病毒即可。
在本发明中采用的是pLKO.1质粒作为具体实施例，所述小RNA序列的基因通过限制酶切位点AgeI/EcoRI克隆到pLKO.1质粒中。都添加在pLKO.1质粒的限制酶切位点AgeI/EcoRI。为了构建sh-DHX33-1和sh-DHX33-2的慢病毒质粒，通过华大基因公司合成的DNA，分别是：
sh-DHX33-1-前寡核苷酸：5’-CCGGGCTATCGCAAAGTGATCATTT CTCGAGAAATGATCACTTTGCGATAGCTTTTTG 3’(SEQ ID NO:3)；
sh-DHX33-1-后寡核苷酸：5’–AATTCAAAAAGCTATCG CAAAGT GATCATTTCTCGAGAAATGATCACTTTGCGATAGC 3’(SEQ ID NO:4)；
sh-DHX33-2-前寡核苷酸：5’-CCGGTTGGGAAGCTGGTTGGCTA TACTCGAGTATAGCCAACCAGCTTCCCAATTTTTG-3’(SEQ ID NO:5)；
sh-DHX33-2-后寡核苷酸：5’-AATTCAAAAA TTGGGAAGCTGGTT GGCTATACTCGAGTATAGCCAACCAGCTTCCCAA-3’(SEQ ID NO:6)；。
然后，将上述序列的RNA序列克隆到pLKO.1质粒的限制酶切位点 AgeI/EcoR中即可，得到质粒pLKO.1-shRNA。
本发明中还提供一种用于治疗癌症的慢病毒，所述慢病毒为基因靶向药物，为具有敲低DHX33蛋白表达水平作用的慢病毒，所述慢病毒中含有上述慢病毒质粒。
本发明中还提供所述慢病毒的具体制备方法，包括以下步骤：
用Lipofectamine 2000(Life Technologies)脂质体导入技术在293T细胞中转染质粒混合物：具体操作方法是采用10厘米的细胞培养皿做转染，待293T 细胞生长到90％的融合度时，将下述质粒混合，包括pLKO.1-shRNA(即上述慢病毒质粒)、pCMV-VSV-G、pCMV-dR8.2dvpr，质粒混合的比例为9：8：1，使总DNA量达到每个培养皿12微克；
经过16-18小时更换成含有抗生素(盘尼西林和链霉素)的培养基，再过 24或48小时，用无菌移液管收集细胞培养基，低速离心，1000～2000转/分钟，两分钟，病毒再经过分装于5毫升的无菌离心管中，存放于零下80度的冰箱。
以下通过实施例作进一步说明。
实施例1：癌细胞中缺失DHX33后迅速导致细胞凋亡
包括以下步骤：
1)根据目标小RNA序列，合成编码该目标小RNA序列的基因序列；该小 RNA序列为靶向DHX33的小RNA序列；
2)将该基因序列克隆至病毒质粒中；
3)将病毒质粒转染到病毒载体上；
4)将病毒载体浸染癌细胞系BT549(HTB-122)和HCC1806(CRL-2335)；
5)浸染完成后，更换新培养基，进行传代培养；
6)培养一段时间后，提取总蛋白，用免疫印迹技术分析DHX33蛋白的表达量。
1、慢病毒质粒的构建：
实验组：靶向DHX33的RNA的序列如下:
sh-DHX33-1:(5’-3’):GCTATCGCAAAGTGATCATTT(作为阳性对照组)；
sh-DHX33-2:(5’-3’):TTGGGAAGCTGGTTGGCTATA。
对照组：作为阴性对照的小RNA(shScrambled)序列为：
(5’-3’):CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCG。
将编码上述序列的小发夹RNA序列分别克隆到pLKO.1vector的限制酶切位点AgeI/EcoRI上。
具体如下：
(1)将寡聚核酸用水溶解得到浓度为20微摩尔的溶液，将配对的前寡聚核酸和后寡聚核酸按以下的配方加入无菌PCR小管内：各5微升的前寡聚核酸， 5微升的10XNEB缓冲液2(购买所得)和35微升的水。
(2)在100摄氏度处理10分钟。
(3)然后缓慢冷却到70摄氏度处理10分钟，然后再缓慢地冷却到室温放置3个小时。
(4)将6微克的pLKO.1TRC质粒(购买所得)加入5微升的10XNEB 缓冲液1(购买所得)，1微升的限制内切酶AgeI,然后加水到50微升，混合好后在37摄氏度培育2个小时。用Qiaquick gel extraction kit(购买所得)提纯切割后的质粒片段，然后加入5微升的10XNEB缓冲液(针对EcoRI)，1微升的EcoRI,加水到50微升，在37摄氏度培育2个小时。
(5)用0.8％的低熔点琼脂糖凝胶分离得到的DNA片段，可以看到两个片段，切割7KB的片段，然后提纯测定DNA浓度。
(6)用2微升前面准备好的退火后的寡聚核酸，加入20纳克的提纯的DNA 片段，加入2微升10X的DNA连接酶缓冲液，和1微升的DNAT4连接酶，然后加水到20微升，放在室温过夜。
(7)第二天，用2微升的连接物用于转化50微升的XL-10gold大肠杆菌感受态细胞(购买所得)。将转化产物铺到含有氨苄青霉素100微克每毫升培养基的LB琼脂培养皿中，然后放置在37摄氏度过夜培育。
(8)第二天，用无菌牙签挑取单个菌落在含有上述浓度的氨苄青霉素的LB 培养基中，在37度培育10个小时，然后用QIAGEN的质粒提取试剂盒提取质粒DNA。
(9)用500纳克的质粒DNA，加入EcoRI/NcoI各0.5微升，2微升的 10NEB缓冲液(针对EcoRI)的，加水到20微升。在37度培育1个小时。
(10)用琼脂糖凝胶电泳筛选阳性克隆，阳性克隆有一个5KB和一个2KB 的条带，测序分析鉴定核酸序列是否正确无误。
(11)扩增阳性克隆，然后用QIAGEN大抽质粒提取试剂盒提取高纯度质粒。
2、慢病毒的制备：用Lipofectamine 2000(Life Technologies)脂质体导入技术在293T细胞中转染质粒混合物。具体操作方法是采用10厘米的细胞培养皿做转染，待293T细胞生长到90％的融合度时，将下述质粒混合，包括 pLKO.1-shRNA，pCMV-VSV-G，pCMV-dR8.2dvpr，质粒混合的比例为9：8：1，使总DNA量达到每个培养皿12微克。经过16-18小时更换成含有抗生素(盘尼西林和链霉素)的培养基，再过24或48小时，用无菌移液管收集细胞培养基，低速离心，2000转/分钟，两分钟，病毒再经过分装于5毫升的无菌离心管中，存放于零下80度的冰箱。
3、癌细胞系BT549和HCC1806从美国的ATCC获得。这两种细胞分别被编码小发夹RNA的慢病毒侵染，72小时后收集细胞并提取总蛋白。具体提取蛋白的方法是将细胞悬于细胞裂解液中(20毫摩尔的Tris-HCl，150毫摩尔的NaCl，1毫摩尔的EDTA，1％Triton-X-100，1％SDS，并补加蛋白酶和磷酸酶的抑制剂)。构建得到DHX33稳定缺失及稳定表达细胞系。用免疫印迹技术分析DHX33 蛋白在各个样品中的表达量，用抗-GAPDH的抗体分析总蛋白上样量。
结果如图1所示，对照组DHX33稳定表达体系shSCR-BT549和 shSCR-HCC1806，都能检测到DHX33蛋白；实验组DHX33稳定缺失体系 1-sh-DHX33-BT549、1-sh-DHX33-HCC1806、2-sh-DHX33-BT549、 2-sh-DHX33-HCC1806几乎检测不到DHX33蛋白。
4、为了分析癌细胞缺失DHX33后的表型，癌细胞中缺失了DHX33后，在显微镜下观察细胞的死亡现象。结果图2所示，对照组shSCR-BT549和 shSCR-HCC1806没有缺失DHX33的细胞生长旺盛，融合度高；而缺失DHX33 的两组细胞1-sh-DHX33-BT549、1-sh-DHX33-HCC1806、2-sh-DHX33-BT549、 2-sh-DHX33-HCC1806表现非常明显的死亡现象。说明了癌细胞中缺失了 DHX33会迅速导致细胞死亡。
为进一步分析细胞在缺失DHX33之后是否有凋亡的现象，将细胞进一步用Annexin V染色。具体方法是将细胞悬浮于磷酸缓冲液中(137毫摩尔的NaCl， 2.7毫摩尔KCl，10毫摩尔的Na2HPO4，1.8毫摩尔KH2PO4)，使浓度达到每毫升1*106个细胞。然后在细胞的悬浮液中加入Annexin V-FITC，室温处理15分钟后，将细胞用70微米的滤网过滤，然后进行流式细胞仪的分析。结果如图3 显示，细胞在缺失DHX33后有明显的细胞凋亡现象，对照组的凋亡比例很小。
实施例2：DHX33调控了控制细胞凋亡的重要基因Bcl-2和BAD
细胞凋亡是细胞在感受外界或内在环境的变化启动的程序性死亡过程。在由内因引起的细胞凋亡过程中，线粒体蛋白起了很重要的作用。线粒体内膜上的Bak/Bax形成聚合体通道，释放线粒体内的细胞色素c到细胞质中，随之引发了凋亡小体的生成和caspase的激活，进而引起不可逆的一系列蛋白酶切反应和细胞的凋亡。有两个蛋白调控Bak/Bax的聚合或激活，Bcl-2可以抑制Bak/Bax 的激活，而BAD却抑制Bcl-2的活力。癌细胞一般有较高含量的Bcl-2蛋白或较低水平的BAD从而抑制其凋亡。
1、为了分析DHX33对凋亡的抑制作用，在本实验中，选取了两种生长旺盛的癌细胞。癌细胞系H1299(CRL－5803)和BT549(HTB-122)从美国的ATCC获得。这两种细胞分别被编码小发夹RNA的慢病毒(这里采用的实施例中制备得到的克隆有sh-DHX33-1或sh-DHX33-2的慢病毒，以及对照组 shScrambled)处理，96小时后收集细胞并提取总蛋白。总蛋白的提取方法如前所述。用免疫印迹技术分析细胞凋亡重要因子BAD和Bcl-2在各个样品中的表达量。
本实施例中同时也分析了DHX33的缺失效率和反应细胞凋亡的标志物：切割的PARP，用抗-微管蛋白的抗体分析总蛋白上样量。结果如图4和图5所示，对照组shSCR-BT549中，BAD的表达量低，shSCR-H1299中，Bcl-2表达量高；而缺失DHX33的1-sh-DHX33-BT549和2-sh-DHX33-H1299中，BAD的表达量高，而1-sh-DHX33-H1299和2-sh-DHX33-BT549中，Bcl-2表达量低。说明了 DHX33对控制细胞凋亡的基因BAD和BCL-2有调控作用。
2、我们同时分析了上述细胞在缺失DHX33后，BAD和Bcl-2信使RNA的表达水平。本实验中我们首先用Clontech试剂盒(Nucleospin RNA II)提取了细胞中的总RNA。用反转录酶将信使RNA反转录成为与其对应的互补DNA。然后通过定量PCR的方法分析Bcl-2和BAD信使RNA在各个样品中的含量。我们选择GAPDH作为内参，同时分析DHX33的信使RNA含量以确定DHX33 已经缺失。
采用的PCR引物如下：
人Bcl-2(前引物)-5'-ACAGTCCCATCAAAACTCCTG-3'(SEQ ID NO:7)；
人Bcl-2(后引物)-5'-TTACAGGCACAGAACATCCAG-3'(SEQ ID NO:8)；
人BAD(前引物)-5'-GACCTTCGCTCCACATCC-3'(SEQ ID NO:9)；
人BAD(后引物)-5'-AGTACTTCCGCCCATATTCAAG-3'(SEQ ID NO:10)。
结果如图6所示，在信使RNA水平，DHX33的降低导致这两个基因转录的变化；而且，克隆有sh-DHX33-2的慢病毒比克隆有sh-DHX33-1的慢病毒相比，其抑制DHX33表达的效果要更好。
3、为了研究这种调控的机制，我们更进一步分析DHX33蛋白是否直接调控了BAD和Bcl-2基因的转录。为此，我们采用染色体免疫共沉降来分析DHX33 是否结合在BAD和Bcl-2的启动子上。我们采用人肺癌细胞系H1299，将1*107细胞用胰蛋白酶消化之后，悬浮于完全的10毫升DMEM培养基中，加入37％甲醛使浓度达到1％，混合使发生交联10分钟后，马上加入2.5摩尔甘氨酸使浓度达到0.125摩尔，处理5分钟终止交联反应。然后每分钟1000转条件下离心 2分钟去掉上清液，将细胞沉淀用磷酸缓冲液洗两次，离心方法同前。然后将细胞裂解，具体用2毫升的裂解液，裂解液含有1％SDS，50毫摩尔的Tris-HCl， 2毫摩尔的EDTA，150毫摩尔的NaCl，和蛋白酶和磷酸酶的抑制剂。细胞在冰上裂解10分钟后，用40％输出的超声破碎仪充分裂解，剪短长链DNA使达到 500bp-1000bp的大小。细胞裂解液经高速离心之后，提取上清液，然后用RIPA 裂解液稀释五倍分成均匀的三部分，加入50微升的蛋白A-琼脂糖珠在4度混合 30分钟，然后离心获取上清液。分别加入抗体包括anti-DHX33的抗体(SantaCruz),anti-TBP(Santa Cruz)和IgG作为阴性对照。在4度混合培育过夜使抗体与抗原结合，然后加入蛋白A-琼脂糖25微升使抗体结合蛋白A-琼脂糖，在4 度混合1个半小时后，离心去掉上清液。将沉淀用含有0.5摩尔NaCl的RIPA 缓冲液洗5次。然后用洗脱液(0.2摩尔的NaOH，1％SDS)洗脱免疫沉淀物，每次100微升，共洗2次。在洗脱下来的溶液中加入6摩尔的NaCl使其浓度达到0.6摩尔。然后在65度出理过夜使DNA和蛋白解交联。用PCR产物提取试剂盒提取其中的DNA片段之后。用PCR的方法分析DHX33结合在BAD和Bcl-2 启动子的效率。
分析BAD和Bcl-2启动子序列的引物序列：
人BAD启动子(前引物)-5'-CCACGCTCCTCTCTCCTAT-3'(SEQ ID NO:11)；
人BAD启动子(后引物)-5'-GGCTATGGGCGGAAGTTT-3'(SEQ ID NO:12)；
人Bcl-2(前引物)-5'-GGGAATCGATCTGGAAATCCTC-3'(SEQ ID NO:13)；
人Bcl-2(后引物)-5'-CCCATCAATCTTCAGCACTCT-3’(SEQ ID NO:14)。
结果如图7所示，DHX33直接作为转录因子调控这两个基因的转录。
实施例3：c-Myc可以正向调控DHX33的mRNA和蛋白表达
使用NIH3T3细胞，用编码c-Myc的慢病毒处理，用puromycin筛选得到稳定表达这一蛋白的细胞。96小时后，提取RNA及总蛋白，分析DHX33 mRNA 及蛋白量，用总GAPDH做内参对照。结果如图8和图9所示，图8是DHX33 mRNA量，图9是DHX33蛋白量。结果发现c-Myc处理的细胞有高含量的DHX33. 当癌基因c-Myc在细胞中表达之后，细胞发生了癌性转化，在这一过程中，可以看到DHX33的蛋白出现迅速升高的现象。
图10：c-Myc癌基因作为转录因子识别特定的碱基序列，这些特定的碱基序列被命名为E-box.如图所示。c-Myc转录因子与启动子DNA结合的保守区域E-box中各个碱基的保守型(Y-轴)。
图11：通过分析发现DHX33的近端启动子附近有多个E-box.如图所示， DHX33基因近端启动子中含有的E-Box位点及序列。这些分析说明很可能c-Myc 可以直接结合在DHX33的启动子周围调节DHX33的基因转录。
图12：EMSA实验分析c-Myc蛋白是否直接结合在DHX33的启动子上。1) 待标记探针的制备
克隆DHX33近端的2kb的启动子区域pGL3 control质粒(购买所得)上，然后用顶点诱变试剂盒(购买所得)将DHX33近端的3个E-box突变得到野生型和突变型的DHX33启动子。分别以pGL3 control DHX33野生型和pGL3 control DHX33突变型为模板，以 5’-CTAGCTAGCTAGTTTGGACAGAGAAGGGGAAAAC-3’(SEQ ID NO:15) 和5’-CCGCTCGAGCGGCCCTCTCAGGTGCAGACAAC-3’(SEQ ID NO:16) 为引物，PCR制备待标记探针，然后用PCR产物纯化试剂盒纯化。
2)生物素标记探针
(1)待标记探针95℃加热2分钟，立即冰浴使成单链；
(2)按如下方法37℃反应30分钟进行探针标记
Figure BDA0001217281230000131
Figure BDA0001217281230000141
(3)加入2.5微升标记终止液终止反应
(4)加入52.5微升氯仿-异戊醇(24:1)，涡旋，12000～14000g离心2分钟，上清即为单链DNA探针
(5)加入退火缓冲液，加热至95℃，缓慢降温至室温制得生物素标记的 EMSA探针
3)按如下方式进行EMSA检测
(1)配制4％的聚丙烯酰胺凝胶10毫升
Figure BDA0001217281230000142
(2)制备如下各样品。加入标记好的探针前先混匀，室温放置10分钟，并让冷探针优先反应，然后加入标记好的探针，混匀，室温放置20分钟。加入 1μL上样缓冲液(10X，无色)，混匀立即上样。检测结果如下表1所示，以下数字均为微升。
表1
Figure BDA0001217281230000143
Figure BDA0001217281230000151
实施例4
为了进一步分析癌症组织中DHX33的表达与癌蛋白c-Myc表达的相关性，从而表明c-Myc可能是DHX33的上游调控基因，在肺癌组织中共染了c-Myc 和DHX33，图13显示的是在很多肺癌组织中DHX33的表达与c-Myc的表达成正相关。图13在c-Myc阳性的肺癌组织中，DHX33蛋白同时显示阳性的比率大约66％(10/15)，图中第一行normal tissue是正常肺组织，图中第二～四行lung cancer是三个肺癌组织实例显示。
为了表明DHX33对c-Myc的致癌性和维持癌性特征至关重要，在c-Myc 过表达的细胞体系中敲低DHX33的蛋白含量使之达到基本水平，可见在DHX33 缺失后c-Myc过表达的细胞其分裂生长是否会受到抑制。具体地操作过程为：在NIH3T3细胞中，用c-Myc过表达慢病毒处理细胞，然后在c-Myc过表达的情况下分别用编码shSCR对照(shScrambled)和shDHX33(sh-DHX33-2)的慢病毒处理使DHX33达到接近基本水平。图14的是各个蛋白量的分析图。图15是分析转化细胞的迁移率的实验结果。图16是BrdU细胞增殖实验，图17 是细胞的软琼脂悬浮独立生长实验。从图15到图17中，可以发现在DHX33缺失后，细胞的癌性特征和生长增殖受到抑制。图18：在肺腺癌细胞H1299细胞中缺失DHX33后，可见细胞的迁移率发生了明显的抑制。DAPI标记的是细胞的迁移率在shSCR图有较高的蓝色标记细胞，而在shDHX33样品中几乎看不到细胞迁移，有很少的蓝色标记细胞。右面的明场图是所有被分析的细胞数，在对照组和实验组是几乎一样的。
实施例5：DHX33的缺失使细胞降低了被c-Myc转化后在裸鼠内成瘤的能力
本实施例中是用于证明DHX33对c-Myc过表达引起癌症发生的重要性。用实施例1中制备得到的慢病毒处理癌细胞，构建DHX33基因沉默的稳定细胞系。将细胞皮下注射入免疫缺陷小鼠体内，然后监测肿瘤的生长情况。含有较高 c-Myc的细胞在小鼠体内可以形成肿瘤，但如果在沉默DHX33到基本水平后，细胞大大降低了在小鼠内形成肿瘤的能力。图19是细胞在敲低DHX33后失去在小鼠体内形成肿瘤的能力。图20是对肿瘤细胞在裸鼠内形成肿瘤的定量分析。
实施例6：比较本发明中所用的sh-DHX3-2与一种已知的靶向DHX33的小 RNA(sh-DHX33-1)的基因沉默效率的比较。可见DHX33蛋白的敲低效率非常明显。
综上所述，研究表明，DHX33调控是癌基因c-Myc的下游途径之一，在部分非小细胞肺癌中，DHX33蛋白表达很高，且在部分癌组织中DHX33与c-Myc 呈现共阳性(前期基础，图13---即实施例4)。细胞实验证实c-Myc可以正向调控DHX33的转录，在被c-Myc转化的细胞中DHX33蛋白量下降会引起细胞生长和致癌性的抑制(前期基础，图14-18---即实施例5)。
DHX33归属于一类DEAH/DEAD RNA解旋酶家族，它们的氨基酸序列中都包含有七个到八个高度保守的氨基酸序列，DEAD/DEAH肽段便是其中的一个重要区段。DHX33所在家族——RNA解旋酶家族可参与调节RNA代谢的各个方面，包括RNA剪接、RNA编辑、RNA降解、mRNA翻译、核糖体RNA 生成及RNA转录等。近年来人们陆续发现很多RNA解旋酶在癌症发生发展中起重要作用，比如DDX5在多种癌症中如乳腺癌、前列腺癌及T细胞白血病中高表达并对癌症的发生、发展起重要作用。DHX9(RNA解旋酶A)在很多癌症如神经母细胞瘤和淋巴癌中参与癌症的生长并介导对抗癌药物的抗性。我们的前期研究表明，DHX33对细胞生长起非常重要的促进作用，它可以调控RNA 聚合酶I的转录活性，从而促进细胞内核糖体RNA的生成(参考文献MCB， 2011)。DHX33还可以通过调控mRNA的翻译促进细胞增生(参考文献MCB2015)并被癌蛋白Ras、Akt，及抑癌蛋白ARF、NF1所调控(参考文献MCB 2013)
本申请试图从c-Myc调控DHX33的角度出发研究DHX33对癌症发生发展的重要性。在分子机制上，我们发现DHX33解旋酶促进细胞生长的全部功能并不仅仅体现在促进核糖体生成和蛋白翻译上，我们的研究进一步揭示DHX33调控很多重要的细胞凋亡因子。
综上，本发明中明确DHX33在癌症的发生发展中起至关重要的作用， DHX33是c-Myc引发的癌症治疗上的一个潜在靶向位点。本申请为攻克癌症的提供了新通路和关键分子，为实验开发提供一个新的视角和理论及物质基础。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳开悦生命科技有限公司
<120> 一种用于治疗癌症的慢病毒质粒及其应用
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因靶向DHX33的sh-DHX33-1的主要核酸序列
<400> 1
gctatcgcaa agtgatcatt tctcgagaaa tgatcacttt gcgatagc 48
<210> 2
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因靶向药物sh-DHX33-2的主要核酸序列
<400> 2
ttgggaagct ggttggctat actcgagtat agccaaccag cttcccaa 48
<210> 3
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> sh-DHX33-1-前寡核苷酸序列
<400> 3
ccgggctatc gcaaagtgat catttctcga gaaatgatca ctttgcgata gctttttg 58
<210> 4
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> sh-DHX33-1-后寡核苷酸序列
<400> 4
aattcaaaaa gctatcgcaa agtgatcatt tctcgagaaa tgatcacttt gcgatagc 58
<210> 5
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> sh-DHX33-2-前寡核苷酸序列
<400> 5
ccggttggga agctggttgg ctatactcga gtatagccaa ccagcttccc aatttttg 58
<210> 6
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> sh-DHX33-2-后寡核苷酸序列
<400> 6
aattcaaaaa ttgggaagct ggttggctat actcgagtat agccaaccag cttcccaa 58
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人Bcl-2 前引物
<400> 7
acagtcccat caaaactcct g 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人Bcl-2 后引物
<400> 8
ttacaggcac agaacatcca g 21
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人BAD前引物
<400> 9
gaccttcgct ccacatcc 18
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人BAD后引物
<400> 10
agtacttccg cccatattca ag 22
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人BAD启动子 前引物
<400> 11
ccacgctcct ctctcctat 19
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人BAD启动子后引物
<400> 12
ggctatgggc ggaagttt 18
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人Bcl-2启动子前引物
<400> 13
gggaatcgat ctggaaatcc tc 22
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人Bcl-2启动子后引物
<400> 14
cccatcaatc ttcagcactc t 21
<210> 15
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DHX33启动子的PCR引物
<400> 15
ctagctagct agtttggaca gagaagggga aaac 34
<210> 16
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DHX33启动子的PCR引物
<400> 16
ccgctcgagc ggccctctca ggtgcagaca ac 32
<210> 17
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有敲低DHX33的蛋白含量作用的小RNA分子序列
<400> 17
ttgggaagct ggttggctat a 21

Claims (2)

1.一种用于治疗癌症的慢病毒质粒，其特征在于，所述用于治疗癌症的慢病毒质粒中含有编码靶向DHX33 的小分子RNA 的核酸序列：
sh-DHX33-2: 5’-TTGGGAAGCTGGTTGGCTATACTCGAGTATAGCC 5 AACCAGCTTCCCAA-3’；
用于治疗癌症的慢病毒质粒中还含有以下核酸序列：
sh-DHX33-2-前寡核苷酸：5’ -CCGGTTGGGAAGCTGGTTGGCTATACTCGAGTATAGCCAACCAGCTTCCCAATTTTTG 3’,
sh-DHX33-2- 后寡核苷酸： 5’-AATTCAAAAATTGGGAAGCTGG10 TTGGCTATACTCGAGTATAGCCAACCAGCTTCCCAA-3’；
所述慢病毒质粒用于制备治疗癌症的药物，所述癌症为由癌基因
c-Myc 扩增或激活引起的肺腺癌。
2.根据权利要求1 所述的用于治疗癌症的慢病毒质粒，其特征在于，所述慢病毒质粒为pLKO.1-vector，所述小分子RNA 的核酸序列通过限15 制酶切位点AgeI/EcoRI克隆到pLKO.1 质粒中。
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Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DHX33 Transcriptionally Controls Genes Involved in the Cell Cycle;Baolei Yuan et al;《Molecular and Cellular Biology》;20160920;第2903页-2904页前言部分、第2904页左栏第4段、第2914-2916页、图7 *

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