CN109718385B - Klotho-beta的功能与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物医学领域，具体涉及Klotho‑beta在的功能与应用。本发明通过现代分子生物学实验证明，外源性加入KLB可以抑制肿瘤细胞的增殖，同时也可以促进肿瘤细胞凋亡，为肿瘤的治疗提供了新的靶点和思路。

Description

Klotho-beta的功能与应用

技术领域

本发明属于分子生物医学领域，具体涉及Klotho-beta在的功能与应用。

背景技术

肺癌，其发病率占所有肿瘤的1/3，每年新增病例有180万，每年有160万病人死于肺癌，平均每四个肿瘤病人就有一个是因肺癌致命。肺癌的发病率和死亡率已经超过男性前列腺癌和女性的乳腺癌，成为当今世界癌症中的头号杀手，其五年生存率不到15％。有85％-90％的肺癌病人都是吸烟导致的，一手烟和二手烟均可以导致肺癌，此外肺癌病人不断地年轻化。尽管目前有不少治疗方案，如手术治疗、放化疗、靶向治疗以及免疫治疗，但是由于肺癌病人被诊断出来绝大多数都是中晚期，不能很好地采用手术治疗，只能把治疗手段转向更具特异性的靶向治疗和免疫治疗。

根据显微镜下看到的肺癌细胞的大小和形态，肺癌可以分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌。有85％的肺癌病人诊断出是非小细胞肺癌。非小细胞肺癌根据病理学的形态特诊可以分为肺腺癌、肺鳞癌和大细胞癌。对于腺癌的研究，由于基因组检测发现了腺癌中普遍有基因突变如EGFR,BRAF,AKT1等，以及基因融合如ALK,ROS1等，目前临床已经有一些疗效比较好的靶向药物作常规治疗，但由于这些靶向药物长时间使用后，肿瘤会产生耐药性，绝大多数肺癌病人最终还是会复发。并且这些基因突变和基因融合在鳞癌中特异性并不高，所以这些药物对于鳞癌的治疗并没有显著效果。针对肺癌的研究还是需要更好更特异，副作用更小的药物。

Klotho-beta简称KLB。Klotho-beta基因的大小为130kDa，编码单次跨膜蛋白，由胞外结构域、单个跨膜结构域和胞内结构域组成。其中细胞内结构域非常短(29个氨基酸)并且没有明确的功能。Klotho-beta基因对应的蛋白为β-klotho。

现有技术中也没有Klotho-beta与肺癌的相关性报道。

发明内容

为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供Klotho-beta在的功能与应用。

为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供Klotho-beta及Klotho-beta上调剂用于制备肿瘤治疗药物中的用途。

在一种实施方式中，所述肿瘤选自肺癌或前列腺癌。

在一种实施方式中，所述肿瘤治疗药物至少具有以下功用之一：

(1)抑制肿瘤细胞生长；(2)抑制肿瘤细胞增殖；(3)促进肿瘤细胞凋亡。

在一种实施方式中，所述Klotho-beta上调剂是指提高Klotho-beta水平的物质。

具体地，所述提高Klotho-beta水平可以采用各种化学、物理、生物的方法。包括但不限于：

(1)调节Klotho-beta代谢通路以提高Klotho-beta水平；

(2)于肿瘤细胞内直接增加Klotho-beta水平。

可通过过表达Klotho-beta的方式直接增加肿瘤细胞内的Klotho-beta水平。例如可将Klotho-beta或Klotho-beta模拟物递送至体内或肿瘤细胞内直接增加Klotho-beta水平。

调节Klotho-beta代谢通路可以是采用Klotho-beta激动剂来提高Klotho-beta活性或促进Klotho-beta转录或表达，从而上调Klotho-beta水平。

提高Klotho-beta活性是指使Klotho-beta活性提高。优选地，相比提高前，Klotho-beta活性提高至少10％，较佳的提高至少30％，再佳的提高至少50％，更佳的提高70％，最佳的提高至少90％。

促进Klotho-beta转录或表达是指：使Klotho-beta高表达，或者提高Klotho-beta转录活性。

本领域技术人员可以使用常规方法对Klotho-beta转录或表达进行调控。

优选地，Klotho-beta转录或表达提高至少10％，较佳的提高至少30％，再佳的提高至少50％，更佳的提高70％，最佳的提高至少90％。

本发明实施例已证实，通过过表达的方式或外源添加的形式直接增加细胞内Klotho-beta水平可抑制肿瘤增殖、促进肿瘤细胞凋亡。而基于现有技术可知，前述调节Klotho-beta代谢通路的方法可上调Klotho-beta水平。由此可推知，前述调节Klotho-beta代谢通路的方法亦可获得抑制肿瘤增殖、促进肿瘤细胞凋亡的效果，进而认为这些方法亦可治疗肿瘤。

因此，Klotho-beta上调剂可以是Klotho-beta、Klotho-beta模拟物或Klotho-beta激动剂。

所述肿瘤治疗药物必然包括Klotho-beta或Klotho-beta上调剂，并以Klotho-beta或Klotho-beta上调剂作为前述功用的有效成分。

所述肿瘤治疗药物中，发挥前述功用的有效成分可以仅为Klotho-beta或Klotho-beta上调剂，亦可包含其他可起到类似功用的分子。

亦即，Klotho-beta或Klotho-beta上调剂为所述肿瘤治疗药物的唯一有效成分或有效成分之一。

所述肿瘤治疗药物可以为单成分物质，亦可为多成分物质。

所述肿瘤治疗药物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。

所述肿瘤治疗药物主要针对的对象为哺乳动物，如啮齿类动物、灵长类动物等。

本发明的第二方面，提供一种治疗肿瘤的方法，为向对象施用Klotho-beta或Klotho-beta上调剂。

在一种实施方式中，所述肿瘤选自肺癌或前列腺癌。

所述对象可以为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。

所述对象可以是罹患肿瘤的患者或者期待预防或缓解肿瘤的个体。也可以是离体的肿瘤细胞。例如，肺癌细胞或前列腺癌细胞。具体地，肺癌细胞可以是H520，HCC95，A549，SK-MES-1，HCC15和H1581。前列腺癌细胞可以是PC-3，DU145。

Klotho-beta或Klotho-beta上调剂可以在接受肿瘤治疗前、中、后向对象施用。

本发明的第三方面，提供一种肿瘤治疗药物，包括有效剂量的Klotho-beta或Klotho-beta上调剂。

在一种实施方式中，所述肿瘤选自肺癌或前列腺癌。

在一种实施方式中，所述肿瘤治疗药物，包括有效剂量的Klotho-beta或Klotho-beta上调剂及药用载体。

所述肿瘤治疗药物必然包括Klotho-beta或Klotho-beta上调剂，并以Klotho-beta或Klotho-beta上调剂作为前述功用的有效成分。

所述肿瘤治疗药物中，发挥前述功用的有效成分可以仅为Klotho-beta或Klotho-beta上调剂，亦可包含其他可起到类似功用的分子。

亦即，Klotho-beta或Klotho-beta上调剂为所述肿瘤治疗药物的唯一有效成分或有效成分之一。

所述肿瘤治疗药物可以为单成分物质，亦可为多成分物质。

所述肿瘤治疗药物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。

所述肿瘤治疗药物主要针对的对象为哺乳动物，如啮齿类动物、灵长类动物等。

本发明的第四方面，提供一种肿瘤联合治疗药物组合，包括有效剂量的Klotho-beta或Klotho-beta上调剂，和至少一种其他肿瘤治疗药物。

在一种实施方式中，所述肿瘤选自肺癌或前列腺癌。

所述联合治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种：

一)将Klotho-beta或Klotho-beta上调剂和其他肿瘤治疗药物分别制成独立的制剂，制剂的剂型可相同或不同，给药途径亦可相同或不同。

当其他肿瘤治疗药物为抗体时，一般采用胃肠外给药型。当其他肿瘤治疗药物为化学药物时，给药形式可以比较丰富，可以是胃肠道给药亦可以是非胃肠道给药。一般推荐针对各化学药物的已知给药途径给药。

二)将Klotho-beta或Klotho-beta上调剂和其他肿瘤治疗药物配置成复方制剂，在将Klotho-beta或Klotho-beta上调剂和其他肿瘤治疗药物采用相同给药途径给药并同时施加时，可采用将两者配置成复方制剂的形式。

本发明的第五方面，提供一种治疗肿瘤的方法，为向对象施用有效量的Klotho-beta或Klotho-beta上调剂以及向对象施用有效量的其他肿瘤治疗药物和/或向对象实施其他肿瘤治疗手段。

在一种实施方式中，所述肿瘤选自肺癌或前列腺癌。

可以同步地或顺序地给予有效量的Klotho-beta或Klotho-beta上调剂和至少一种有效量的其他肿瘤治疗药物。

基于Klotho-beta为本发明首次发现的肿瘤治疗靶点，在与Klotho-beta或Klotho-beta上调剂以外的其他肿瘤治疗药物联合用药中，至少可以起到疗效相加的效果，进一步增强对于肿瘤的治疗效果。

其他肿瘤治疗药物包括但不限制于：抗体药物、化学药物或靶向型药物等。

所述Klotho-beta或Klotho-beta上调剂可以是胃肠道给药或者胃肠外给药。其他肿瘤治疗药物可以是胃肠道给药或者胃肠外给药。

本发明的第六方面，提供Klotho-beta或Klotho-beta上调剂在制备具有以下任一项或多项作用的药物中的用途：

(1)抑制肿瘤细胞生长；(2)抑制肿瘤细胞增殖；(3)促进肿瘤细胞凋亡。

在一种实施方式中，所述肿瘤选自肺癌或前列腺癌。

本发明的第七方面，提供Klotho-beta在制备或筛选肿瘤治疗药物中的用途。

在一种实施方式中，所述肿瘤选自肺癌或前列腺癌。

在一种实施方式中，Klotho-beta作为作用靶标。

所述用途具体是指：将Klotho-beta作为作用对象，对候选物质进行筛选，以找到Klotho-beta上调剂，作为备选的肿瘤治疗药物。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过现代分子生物学实验证明，外源性加入KLB可以抑制肿瘤细胞的增殖，同时也可以促进肿瘤细胞凋亡，为肿瘤的治疗提供了新的靶点和思路。

附图说明

图1A：通过慢病毒过表达KLB，72小时后可以显著抑制肺癌肿瘤细胞(H520，人肺鳞癌细胞)的增殖。

图1B：通过慢病毒过表达KLB，72小时后可以显著抑制肺癌肿瘤细胞(HCC95，人肺鳞癌细胞)的增殖。

图1C：通过慢病毒过表达KLB，72小时后可以显著抑制肺癌肿瘤细胞(HCC15，人肺鳞癌细胞)的增殖。

图1D：通过慢病毒过表达KLB，72小时后可以显著抑制肺癌肿瘤细胞(SK-MES-1，人肺鳞癌细胞)的增殖。

图1E：通过慢病毒过表达KLB，72小时后可以显著抑制肺癌肿瘤细胞(A549，人肺腺癌细胞)的增殖。

图2A：外源性的加入β-klotho在72小时之后，可以显著抑制肺癌细胞(H520，人肺鳞癌细胞)的增殖。

图2B：外源性的加入β-klotho在72小时之后，可以显著抑制肺癌细胞(HCC95，人肺鳞癌细胞)的增殖。

图2C：外源性的加入β-klotho在72小时之后，可以显著抑制肺癌细胞(SK-MES-1，人肺鳞癌细胞)的增殖。

图2D：外源性的加入β-klotho在72小时之后，可以显著抑制肺癌细胞(H1581，人肺大细胞癌细胞)的增殖。

图2E：外源性的加入β-klotho在72小时之后，可以显著抑制前列腺癌细胞(人前列腺癌细胞DU145)的增殖。

图2F：外源性的加入β-klotho在72小时之后，可以显著抑制前列腺癌细胞(人前列腺癌细胞PC-3)的增殖。

图2G：外源性加β-klotho，对293T细胞没有影响。

图2H：外源性加β-klotho，对支气管上皮细胞Beas-2b没有影响。

图2I：外源性加β-klotho，对肺成纤维细胞HFL-1没有影响。

图3：外源性加β-klotho，肺癌细胞HCC95凋亡信号增强，早期凋亡和晚期凋亡都受到增强。

图4：肺癌细胞顺转过表达KLB质粒后，增殖的marker PCNA蛋白表达量下调，在蛋白水平进一步验证了KLB对于肺癌细胞的增殖起到了抑制效果。

图5：实验说明：顺转下调KLB的siRNA(购自life technology)可显著抑制肺癌细胞(人肺鳞癌细胞HCC95和人肺鳞癌细胞SK-MES-1)中KLB的表达水平，促进肺癌细胞(人肺鳞癌细胞HCC95和人肺鳞癌细胞SK-MES-1)增殖，采用双氧水促进肺腺癌细胞A549及肺鳞癌细胞SK-MES-1凋亡，而下调KLB可以减少肿瘤细胞由于双氧水刺激造成的死亡，说明下调KLB对肺癌细胞的生长有保护作用。

图6：实施例3的试验路线图。

图7A：14只老鼠皮下瘤图。

图7B：肿瘤质量的量化图。

图7C：肿瘤体积的生长变化图。

图7D：随着肿瘤的生长，老鼠的体重没有明显变化。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1

一、实验方法

1、通过在肺癌细胞中转染过表达慢病毒，从而让肺癌细胞中持续表达KLB蛋白：

(1)构建过表达KLB的慢病毒；

1)KLB基因【基因名称KLB(NM_175737)，物种(Human)】通过化学合成的方式获得，KLB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：

GGCCGTTTTTGGCTTTTTTGTTAGACGAAGCTTGGGCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTAC CGGTCGCCACCATGAAGCCAGGCTGTGCGGCAGGATCTCCAGGGAATGAATGGATTTTCTTCAGCACTGATGAAATAACCACACGCTATAGGAATACAATGTCCAACGGGGGATTGCAAAGATCTGTCATCCTGTCAGCACTTATTCTGCTACGAGCTGTTACTGGATTCTCTGGAGATGGAAGAGCTATATGGTCTAAAAATCCTAATTTTACTCCGGTAAATGAAAGTCAGCTGTTTCTCTATGACACTTTCCCTAAAAACTTTTTCTGGGGTATTGGGACTGGAGCATTGCAAGTGGAAGGGAGTTGGAAGAAGGATGGAAAAGGACCTTCTATATGGGATCATTTCATCCACACACACCTTAAAAATGTCAGCAGCACGAATGGTTCCAGTGACAGTTATATTTTTCTGGAAAAAGACTTATCAGCCCTGGATTTTATAGGAGTTTCTTTTTATCAATTTTCAATTTCCTGGCCAAGGCTTTTCCCCGATGGAATAGTAACAGTTGCCAACGCAAAAGGTCTGCAGTACTACAGTACTCTTCTGGACGCTCTAGTGCTTAGAAACATTGAACCTATAGTTACTTTATACCACTGGGATTTGCCTTTGGCACTACAAGAAAAATATGGGGGGTGGAAAAATGATACCATAATAGATATCTTCAATGACTATGCCACATACTGTTTCCAGATGTTTGGGGACCGTGTCAAATATTGGATTACAATTCACAACCCATATCTAGTGGCTTGGCATGGGTATGGGACAGGTATGCATGCCCCTGGAGAGAAGGGAAATTTAGCAGCTGTCTACACTGTGGGACACAACTTGATCAAGGCTCACTCGAAAGTTTGGCATAACTACAACACACATTTCCGCCCACATCAGAAGGGTTGGTTATCGATCACGTTGGGATCTCATTGGATCGAGCCAAACCGGTCGGAAAACACGATGGATATATTCAAATGTCAACAATCCATGGTTTCTGTGCTTGGATGGTTTGCCAACCCTATCCATGGGGATGGCGACTATCCAGAGGGGATGAGAAAGAAGTTGTTCTCCGTTCTACCCATTTTCTCTGAAGCAGAGAAGCATGAGATGAGAGGCACAGCTGATTTCTTTGCCTTTTCTTTTGGACCCAACAACTTCAAGCCCCTAAACACCATGGCTAAAATGGGACAAAATGTTTCACTTAATTTAAGAGAAGCGCTGAACTGGATTAAACTGGAATACAACAACCCTCGAATCTTGATTGCTGAGAATGGCTGGTTCACAGACAGTCGTGTGAAAACAGAAGACACCACGGCCATCTACATGATGAAGAATTTCCTCAGCCAGGTGCTTCAAGCAATAAGGTTAGATGAAATACGAGTGTTTGGTTATACTGCCTGGTCTCTCCTGGATGGCTTTGAATGGCAGGATGCTTACACCATCCGCCGAGGATTATTTTATGTGGATTTTAACAGTAAACAGAAAGAGCGGAAACCTAAGTCTTCAGCACACTACTACAAACAGATCATACGAGAAAATGGTTTTTCTTTAAAAGAGTCCACGCCAGATGTGCAGGGCCAGTTTCCCTGTGACTTCTCCTGGGGTGTCACTGAATCTGTTCTTAAGCCCGAGTCTGTGGCTTCGTCCCCACAGTTCAGCGATCCTCATCTGTACGTGTGGAACGCCACTGGCAACAGACTGTTGCACCGAGTGGAAGGGGTGAGGCTGAAAACACGACCCGCTCAATGCACAGATTTTGTAAACATCAAAAAACAACTTGAGATGTTGGCAAGAATGAAAGTCACCCACTACCGGTTTGCTCTGGATTGGGCCTCGGTCCTTCCCACTGGCAACCTGTCCGCGGTGAACCGACAGGCCCTGAGGTACTACAGGTGCGTGGTCAGTGAGGGGCTGAAGCTTGGCATCTCCGCGATGGTCACCCTGTATTATCCGACCCACGCCCACCTAGGCCTCCCCGAGCCTCTGTTGCATGCCGACGGGTGGCTGAACCCATCGACGGCCGAGGCCTTCCAGGCCTACGCTGGGCTGTGCTTCCAGGAGCTGGGGGACCTGGTGAAGCTCTGGATCACCATCAACGAGCCTAACCGGCTAAGTGACATCTACAACCGCTCTGGCAACGACACCTACGGGGCGGCGCACAACCTGCTGGTGGCCCACGCCCTGGCCTGGCGCCTCTACGACCGGCAGTTCAGGCCGTCACAGCGCGGGGCCGTGTCGCTGTCGCTGCACGCGGACTGGGCGGAACCCGCCAACCCCTATGCTGACTCGCACTGGAGGGCGGCCGAGCGCTTCCTGCAGTTCGAGATCGCCTGGTTCGCCGAGCCGCTCTTCAAGACCGGGGACTACCCCGCGGCCATGAGGGAATACATTGCCTCCAAGCACCGACGGGGGCTTTCCAGCTCGGCCCTGCCGCGCCTCACCGAGGCCGAAAGGAGGCTGCTCAAGGGCACGGTCGACTTCTGCGCGCTCAACCACTTCACCACTAGGTTCGTGATGCACGAGCAGCTGGCCGGCAGCCGCTACGACTCGGACAGGGACATCCAGTTTCTGCAGGACATCACCCGCCTGAGCTCCCCCACGCGCCTGGCTGTGATTCCCTGGGGGGTGCGCAAGCTGCTGCGGTGGGTCCGGAGGAACTACGGCGACATGGACATTTACATCACCGCCAGTGGCATCGACGACCAGGCTCTGGAGGATGACCGGCTCCGGAAGTACTACCTAGGGAAGTACCTTCAGGAGGTGCTGAAAGCATACCTGATTGATAAAGTCAGAATCAAAGGCTATTATGCATTCAAACTGGCTGAAGAGAAATCTAAACCCAGATTTGGATTCTTCACATCTGATTTTAAAGCTAAATCCTCAATACAATTTTACAACAAAGTGATCAGCAGCAGGGGCTTCCCTTTTGAGAACAGTAGTTCTAGATGCAGTCAGACCCAAGAAAATACAGAGTGCACTGTCTGCTTATTCCTTGTGCAGAAGAAACCACTGATATTCCTGGGTTGTTGCTTCTTCTCCACCCTGGTTCTACTCTTATCAATTGCCATTTTTCAAAGGCAGAAGAGAAGAAAGTTTTGGAAAGCAAAAAACTTACAACACATACCATTAAAGAAAGGCAAGAGAGTTGTTAGCGGTATGGACTACAAGGATGACGATGACAAGGATTACAAAGACGACGATGATAAGGACTATAAGGATGATGACGACAAATGAGCTAGCCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCC。

2)构建过表达慢病毒质粒：

载体：GV358，酶切位点：AgeI/AgeI，将KLB序列重组到载体中；

对照的阴性质粒采用的是乱序的和KLB基因同等长度的序列；

3)包装慢病毒：

采用三质粒系统，p-DELTA,VSVG，以及目标质粒，在293T细胞中共转染，在转染完成后的48-72h进行病毒收获，目标质粒和阴性对照质粒分别转染，并通过超速离心提纯慢病毒，最后慢病毒滴度在2*10⁸。

(2)建立肺癌细胞系的过表达稳转株和对应的阴性对照稳转株：

1)癌细胞铺板24孔板5*10⁴细胞，24小时贴壁后，根据滴度分别加入过表达病毒和对照病毒，同时加5ug/ml的polybrene作为助转剂；

2)24小时后换为正常培液；

3)转病毒72小时后，细胞传代扩增，待细胞量达到5*10⁶后，流式分选绿色荧光在10％的细胞继续培养，扩增，冻存，即为稳转的细胞；

4)一般在第一次流式分选之后，扩增3代之后重新流式分选细胞，确保细胞纯度。

5)铺板：96孔板每孔1*10⁴细胞，分别铺对照细胞和过表达细胞；

6)在24小时,48小时,72小时,96小时分别采用CCK-8的方法,每孔加入CCK-8试剂10ul,反应1-4小时后，在450nm吸光度处用酶标仪采集数据，分析细胞的增殖情况。

2、通过在肺癌细胞系及肺成纤维细胞HFL-1,支气管上皮细胞Beas-2b及293T细胞中外源性添加β-klotho,来检测对肺癌细胞的增殖的影响，进一步地扩大细胞系的范围，在前列腺癌PC-3和DU145细胞系中外源性添加β-klotho，检测β-klotho对前列腺癌细胞的影响：

1)培养肿瘤细胞，待细胞状态较好在细胞的对数增长期细胞计数铺板96孔板，每孔1*10⁴细胞；

2)24小时后待细胞贴壁，换为不含血清，含有不同浓度的β-klotho(4ng/ml,40ng/ml,400ng/ml)培养液培养细胞；

3)在24小时,48小时,72小时,96小时分别采用CCK-8的方法,每孔加入CCK-8试剂10ul,反应1-4小时后，在450nm吸光度处用酶标仪采集数据，分析细胞的增殖情况；

3、外源性加β-klotho，验证β-klotho对肺癌细胞HCC95的凋亡的影响：

1)培养肿瘤细胞，待细胞状态较好在细胞的对数增长期细胞计数铺板24孔板，每孔5*10⁴细胞；

2)24小时后待细胞贴壁，换为不含血清，含有β-klotho 400ng/ml培养液继续培养细胞72小时；

3)收集细胞上清液并同时消化细胞，离心1200rpm,4min,4℃；

4)加入500ul PBS重悬细胞；离心1200rpm,4min,4℃；

5)去掉上清液，加入100ul 1X binding buffer(用ddH2O稀释)，重悬，加入5ul标记过的Annexin，避光室温15分钟；

6)加入200ul 1X binding buffer和5ul 7-AAD溶液；

7)上机检测。

4、上调KLB，在蛋白水平验证KLB对细胞增殖的抑制效果

1)培养肿瘤细胞，待细胞状态较好在细胞的对数增长期细胞计数铺板6孔板，每孔2*10⁵细胞；

2)24小时后待细胞贴壁,用lipo3000顺转过表达KLB质粒及其对照质粒：质粒为包装慢病毒的对照质粒和过表达质粒；

3)72小时后，收集蛋白，western bolt检测蛋白量。

二、实验结果和讨论

1、如图1A、1B、1C、1D、1E所示，在不同的肺癌细胞中过表达KLB可以显著抑制肿瘤细胞的生长。

2、如图2A、2B、2C、2D所示，在不同的肺癌细胞中外源性加β-klotho，可以显著抑制肿瘤细胞的生长。

如图2E、2F所示，在不同的前列腺癌细胞中外源性加β-klotho，可以显著抑制肿瘤细胞的生长。

如图2G、2H、2I所示，外源性加β-klotho，对正常细胞没有影响。

由此可见，β-klotho可以特异性地抑制肿瘤细胞的增殖。

3、如图3所示，外源性加β-klotho可以促进肺癌细胞HCC95的凋亡。

4、如图4所示，在不同肺癌细胞中过表达KLB可以明显降低增殖marker PCNA的表达。

实施例2

本实施例是在肺癌细胞中顺转下调KLB的siRNA，以低表达β-klotho的试验及数据。

本实施例中所使用的顺转下调KLB的siRNA，购自life technology。

顺转下调KLB的siRNA：

正向序列：CCACACGUAUAGGAAUACtt(SEQ ID NO.2)；

反向序列：GUAUUCCUAUAGCGUGUGGtt(SEQ ID NO.3)；

实验流程：

(1)细胞铺板2*10⁵每孔细胞到六孔板；

(2)24小时待细胞贴壁后，用RNAimax(购自life technology)转染siRNA；

(3)24小时后，细胞换液，加1mM H₂0₂处理细胞；6h后流式检测细胞凋亡。

如图5实验说明：顺转下调KLB的siRNA(购自life technology)可显著抑制肺癌细胞(人肺鳞癌细胞HCC95和人肺鳞癌细胞SK-MES-1)中KLB的表达水平，采用双氧水促进肺腺癌细胞A549及肺鳞癌细胞SK-MES-1凋亡，而下调KLB可以减少肿瘤细胞由于双氧水刺激造成的死亡，说明下调KLB对肺癌细胞的生长有保护作用。

实施例3

本实施例为KLB过表达动物实验。

4周龄雄性裸鼠购自上海灵畅生物科技有限公司，为了保证小鼠肿瘤大小的一致性，采用先小鼠皮下成瘤后二次成瘤的方法，具体操作如下：

在小鼠皮下注射HCC15人源肺鳞癌细胞5X10⁶，四周成瘤到直径1cm的皮下瘤；

取出皮下瘤，切割成直径3mm的小块，重新缝合到新的小鼠皮下二次成瘤，一共14只老鼠；

3天后，缝合线脱落，开始瘤内注射过表达KLB的慢病毒及其对照病毒(同实施例1中所使用的慢病毒及其对照病毒)，治疗时间点如下图6所示；每隔三天称量老鼠体重，测量肿瘤大小；

4周后，取出肿瘤。

实验结果分析：

瘤内连续4周注射过表达KLB的慢病毒可以显著抑制肿瘤的生长。

如图7A所示，14只老鼠皮下瘤图，说明了：瘤内连续四周注射过表达KLB的慢病毒可以显著抑制肿瘤细胞的生长。

如图7B所示，肿瘤质量的量化图，说明了：瘤内连续四周注射过表达KLB的慢病毒肿瘤的质量和注射对照慢病毒的肿瘤质量有显著差异，p＝0.0004。

如图7C所示，肿瘤体积的生长变化图，说明了：瘤内连续四周注射过表达KLB的慢病毒肿瘤的体积从第21天开始和注射对照慢病毒的肿瘤体积有显著差异，p<0.001。

如图7D所示，随之肿瘤的生长，老鼠的体重没有明显变化，说明了：本实施例所使用的慢病毒对老鼠体重没有明显变化，不会对老鼠造成伤害。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> Klotho-beta的功能及应用

<130> 176050

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3476

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggccgttttt ggcttttttg ttagacgaag cttgggctgc aggtcgactc tagaggatcc 60

ccgggtaccg gtcgccacca tgaagccagg ctgtgcggca ggatctccag ggaatgaatg 120

gattttcttc agcactgatg aaataaccac acgctatagg aatacaatgt ccaacggggg 180

attgcaaaga tctgtcatcc tgtcagcact tattctgcta cgagctgtta ctggattctc 240

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<210> 2

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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<210> 3

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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Claims (3)

1.Klotho-beta基因作为有效成分用于制备肺癌治疗药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肺癌治疗药物至少具有以下功用之一：（1）抑制肺癌细胞生长；（2）抑制肺癌细胞增殖；（3）促进肺癌细胞凋亡。

3.Klotho-beta蛋白作为有效成分在制备肺癌治疗药物中的用途。

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