CN108586622A

CN108586622A - Tat-pdcd4融合蛋白及其在治疗卵巢癌药物中的应用

Info

Publication number: CN108586622A
Application number: CN201810449353.8A
Authority: CN
Inventors: 张利宁; 朱法良; 王群; 李艳; 郭春; 李媛; 王革
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2018-05-11
Filing date: 2018-05-11
Publication date: 2018-09-28

Abstract

本发明提供了一种TAT‑PDCD4融合蛋白及其在治疗卵巢癌药物中的应用，所述TAT‑PDCD4融合蛋白包括TAT的核心肽段区域、PDCD4和His标签。该融合蛋白跨膜速率高，可以高效携带PDCD4靶向到达卵巢癌细胞，对卵巢癌的增殖和迁移的抑制能力强，且在体内发挥药效时间长。本发明TAT‑PDCD4融合蛋白可以作为一种药物，其对非靶向组织或细胞的毒害较弱，安全性有保障，为卵巢癌疾病的治疗提供一种新的途径和思路。本发明通过体外表达TAT‑PDCD4融合蛋白，表达量高，可控性强，生产成本相对较低，容易实现大规模生产。

Description

TAT-PDCD4融合蛋白及其在治疗卵巢癌药物中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及TAT-PDCD4融合蛋白及其在治疗卵巢癌药物中的应用。

背景技术

卵巢癌是女性生殖系统常见的三大恶性肿瘤之一，其中卵巢上皮癌的死亡率更是居于妇科肿瘤的首位。该肿瘤起病隐匿，早期症状不明显，不易发现，当确诊时60％～70％已为晚期，且大多数已扩散到子宫双侧附件，大网膜及盆腔各器官，手术很难清除肿瘤组织。并且术后放、化疗效果均不理想，亟需找到一种辅助药物用于术后辅助治疗以清除残余的肿瘤细胞或组织。

PDCD4(programmed cell death 4)是一种新的抑癌基因。其编码产物可以与eIF4A结合抑制蛋白合成，又可以抑制AP-1(Activator protein-1)转录，从而抑制下游靶分子表达。研究发现，在卵巢癌组织PDCD4表达低于正常组织(L Zhang et al，Programmedcell death 4enhances chemosensitivity of ovarian cancer cells by activatingdeath receptor pathway in vitro and in vivo.Cancer Sci.；Ngan HYet al，Loss ofProgrammed cell death 4(Pdcd4)associates with theprogression of ovariancancer.Mol Cancer.)；Hextan Y.S.Ngan及其合作者研究发现，PDCD4通过上调P21和P27活性抑制卵巢癌细胞增殖；申请人还发现PDCD4可增强卵巢癌细胞系对化疗药物敏感性，其作用主要机制是通过诱导肿瘤细胞凋亡；此外，申请人发现通过小鼠皮下成瘤实验研究发现，瘤内注射PDCD4表达质粒组形成的肿瘤组织明显小于对照组。通过以上研究预示PDCD4可以作为治疗卵巢癌的预选靶点，但是通过注射PDCD4表达质粒方式应用到人体治疗疾病存在一定风险，还有PDCD4在细胞内发挥作用，而PDCD4蛋白又不能通过主动跨膜运输进入细胞内部，所以在临床应用PDCD4作为化疗辅助药物受到局限。

腺病毒是目前最为有效的基因传递系统，临床研究基因的治疗方案中病毒载体占大多数，在专利CN101219222A PDCD4重组表达载体在制备治疗卵巢癌药物中的应用，将PDCD4与病毒性载体构建成重组载体制备成治疗卵巢癌的化学药物，使其在肿瘤细胞中高效表达，用以治疗卵巢癌。虽然腺病毒转到效率高，但是存在着很多潜在的不利因素，如1999年9月美国少年在接收以病毒载体介导的基因治疗中不幸死亡，这一案例为病毒载体在人类基因治疗中的作用敲响警钟(腺病毒相关病毒载体的安全性评价,国际病毒学杂志,2006)。

TAT蛋白是人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)编码的一段富含碱性氨基酸、带正电荷的多肽，属于蛋白转导域家族的一员。其全长及11个碱性氨基酸富集区的核心肽段(YGRKKRRQRRR)不仅能够在包括蛋白质、多肽及核酸等多种外源生物大分子的跨膜转导过程中具有重要作用，而且能够携带外源生物大分子通过活体细胞的各种生物膜性结构。但是，到目前为止，还没有将TAT与PDCD4结合应用到制备治疗卵巢癌药物中。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的一个目的是提供一种TAT-PDCD4的融合蛋白，该融合蛋白的作用是可以使PDCD4快速靶向到达卵巢癌细胞，并在细胞内富集，从而有效抑制卵巢癌细胞(SKOV3细胞)增殖。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供了一种融合蛋白，其包含TAT肽段、PDCD4和His标签，所述TAT肽段选自TAT中11个碱性氨基酸的核心肽段，其中TAT肽段氨基酸残基序列如SEQ ID NO.1所示、PDCD4氨基酸残基序列如SEQ ID NO.2所示、His标签氨基酸残基序列如SEQ ID NO.3所示。

所述融合蛋白具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ IDNo.4；

2)将序列表中SEQ IDNo.4的氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有同等活性的由SEQ ID No.4衍生得到的蛋白质。

本发明还提供编码上述融合蛋白的基因，是具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID No.5的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID No.4蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No.5限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在65℃下杂交并洗膜。

含有本发明基因的重组表达载体、转基因细胞系及转基因重组菌均属于本发明的保护范围。

其中，所述重组表达载体，是将所述基因插入到大肠杆菌表达载体中得到的重组表达载体；所述大肠杆菌表达载体为Pet30a；

所述转基因重组菌，是将所述的重组表达载体导入宿主细胞中，筛选得到的转基因重组菌；所述宿主细胞，可以是动物细胞、昆虫细胞、酵母、大肠杆菌，优选大肠杆菌BL21。

本发明还提供一种制备上述融合蛋白的方法，是将所述基因克隆到表达载体中，将所述表达载体导入大肠杆菌，筛选阳性克隆，经菌体培养和诱导表达后，分离纯化得到该融合蛋白。

其中，所述表达载体为Pet30a质粒；

所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)；

所述诱导为诱导表达的诱导剂为IPTG。

所述纯化方法为Ni2+亲和层析技术纯化。

本发明的另一个目的提供一种包含上述融合蛋白的药物组合物，该药物组合物除含有上述融合蛋白外，还进一步地包括药学上可接受的载体、赋形剂或佐剂。

本发明的再一个目的提供上述融合蛋白、药物组合物在制备用于治疗卵巢癌疾病的药物中的应用。具体来说就是，利用抑癌基因PDCD4可以抑制卵巢癌细胞增殖这一特性，构建了含有His标签的PET30a-TAT-PDCD4-His表达质粒，进而制备治疗卵巢癌的药物，充分利用其自身抑癌基因的特点，以及TAT蛋白的转导作用，使PDCD4靶向到达卵巢癌部位后，并高效表达，发挥抗抑制卵巢癌增值的效应，实现治疗卵巢癌的目的。

本发明的有益效果为：

1.本发明首次将PDCD4与TAT结合，形成一种运输PDCD4进入细胞的系统，通过研究发现，其可以高效穿膜到达卵巢癌细胞，实现抑制卵巢癌的增殖和迁移的作用，该系统减少药物对非靶向组织或细胞的毒害，为该蛋白的安全性提供保障，为卵巢癌治疗探索提供新方法。

2.本发明TAT-PDCD4融合蛋白跨膜速率高。细胞免疫荧光标记结果显示，30分钟时TAT-PDCD4融合蛋白已进入细胞，只是细胞浆内量很少，在细胞边缘呈点状分布；60分钟时TAT-PDCD4融合蛋白主要分布在细胞浆内，细胞核内很少；3小时时蛋白不仅分布于胞浆，细胞核中也明显有分布；另外，还发现从30min开始蛋白几乎同时进入所有细胞，这远远高于质粒转染效果。

3.本发明TAT-PDCD4融合蛋白在体内发挥药效时间长。TAT-PDCD4细胞内动力学研究发现，本发明融合蛋白可在肿瘤细胞内存在较长时间，其在细胞内部72小时尚能检测到，这为以后药物研发提供理论基础。

4.本发明融合蛋白是蛋白质药物，可以通过降解、排泄以及受体介导的内吞等作用方式被清除，因而不会在体内蓄积，对人体无毒副作用。

5.本发明通过体外表达TAT-PDCD4融合蛋白，表达量高，可控性强，生产成本相对较低，容易实现大规模生产。

附图说明

图1A为纯化后TAT-PDCD4融合蛋白SDS-PAGE电泳，B为TAT-PDCD4融合蛋白Westenblot结果，其中泳道1为TAT-PDCD4融合蛋白。

图2为TAT-PDCD4跨膜速度研究时激光共聚焦显微镜结果显示。

图3为TAT-PDCD4-His融合蛋白在细胞内存在时间研究时激光共聚焦显微镜结果显示。

图4为TAT-PDCD4-His蛋白对SKOV3细胞的增殖抑制作用。

图5.GFP-PDCD4-pcDNA3.1重组质粒转染H293细胞。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不用来限制本发明的范围。

本发明蛋白纯化试剂盒为Beyogold ^TM His-tag purification Resin,P2218,碧云天生物技术有限公司；

实施例1TAT-PDCD4-His重组表达载体的构建

融合基因的构建：依据SEQ ID No.5的DNA序列设计引物(见下表1)，通过引物合成PCR方法将基因序列融合，并克隆入表达载体pET30a(+)。

表1引物

1.PCR获取克隆目标序列：

a.全长PCR：反应体系见表2：

表2全长PCR一轮反应体系反应体系

反应条件：95℃3min

b.胶回收上述步骤PCR产物：对以上产物进行割胶回收。

c.Gibson重组反应实验

1)PCR的同时，用NdeI/BamHI处理pET30a(+)质粒，进行胶回收。

2)Gibson重组反应体系：将上述PCR回收产物5ul和5ul空载质粒pET30a(+)酶切回收产物加入到10ul Gibson重组MIXGibson中，50℃水浴锅水浴30min。

2.菌落筛选

挑取过夜平板中单菌落，用T7/T7t引物进行菌落PCR电泳鉴定阳性克隆，随机选择连3个阳性菌落，扩增上述菌落，测序。据测序结果选取基因序列正确的菌株。

实施例2TAT-PDCD4-His融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达和纯化

将测序正确的重组克隆质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单克隆菌落接种至2mlPBL培养基(含卡那霉素)摇床培养过夜。次日按1:100接种至大体积LB培养基，250转/分培养至OD 600于0.3-0.5之间，接着加适量诱导剂IPTG，继续摇床培养6h，离心弃上清备用，按试剂盒进行蛋白纯化和去除内毒素。然后对其进行SDS-PAGE及Western-blot分析，如图1，从分子量判断泳道1所得蛋白是TAT-PDCD4融合蛋白，因此，该试验成功表达并纯化得到TAT-PDCD4-His融合蛋白。

实施例3TAT-PDCD4-HIS跨膜速度研究

1)细胞接种卵巢癌细胞-SKOV3用胰酶消化，计数，然后接种细胞至预先放置盖玻片的24孔细胞培养板中。37℃，5％CO2培养过夜。

2)融合蛋白TAT-PDCD4刺激细胞弃上清，添加含有5ug/ml的TAT-PDCD4蛋白，分别继续培养30分钟、1小时和3小时。

3)染色抗体处理前先用4％多聚甲醛固定10分钟(每孔300ul)，接着鼠抗人PDCD4抗体孵育1小时，然后FITC-兔抗鼠二抗处理30分钟，再用DAPI处理细胞3分钟，最后将盖玻片取出，细胞朝下至于在玻片上，加适量防淬灭剂，封片备用。

4)激光共聚焦显微镜观察

结果：从图2激光共聚焦显微镜结果显示：30分钟时TAT-PDCD4蛋白已进入细胞，只是细胞浆内量很少，在细胞边缘呈点状分布；60分钟时蛋白主要分布在细胞浆内，细胞核内很少；3小时时蛋白不仅分布于胞浆，细胞核中也明显有分布；另外，还发现从30min开始蛋白几乎同时进入所有细胞，这远远高于质粒转染效果。

对比例：

发明人构建了pcDNA-PDCD4-GFP表达质粒，将质粒转染H293细胞。研究发现，转染24小时后，荧光显微镜观察并拍照结果如图5，照片中绿色荧光细胞即亮色部分为pcDNA-PDCD4-GFP转染成功的细胞，转染成功率仅为30％左右。也就是说，质粒转染24h后，只有30％左右的转染进细胞，而本发明TAT-PDCD4蛋白进入细胞效率几乎为100％，且进入细胞仅需几十分钟，操作方法有十分方便。

实施例4TAT-PDCD4-His融合蛋白在细胞内存在时间研究

1)细胞种板方法同实施例3。

2)TAT-PDCD4-His融合蛋白刺激

蛋白刺激方法：首先弃细胞培养上清，添加适量含有融合蛋白(5ug/ml)的细胞培养液(含10％胎牛血清)。孵育三小时后，弃上清并用PBS清洗一次，然后添加等体积的细胞培养液继续培养。首先是72小时组，然后依次是48小时、36小时、24小时、12小时和6小时组，最后同时处理所有细胞。

3)染色抗体处理前先用4％多聚甲醛固定10分钟(每孔300ul)，接着用小鼠抗人PDCD4抗体孵育1小时，然后用FITC标记的兔抗小鼠二抗孵育30分钟，再用DAPI处理细胞3分钟，最后将盖玻片取出，细胞朝下至于载玻片上，加适量防淬灭剂，封片备用。

4)激光共聚焦显微镜观察

结果：图3激光共聚焦显微镜结果显示：结果显示外源融合蛋白可在肿瘤细胞内存在较长时间，其在细胞内部72小时尚能检测到，这为以后药物研发提供理论基础。该部分仅提供部分时间点的结果。

实施例5TAT-PDCD4-His融合蛋白可对卵巢癌细胞(SKOV3细胞)增殖的影响研究

1)细胞接种于96孔板细胞悬液100ul/孔，细胞量为3×103/孔，37℃，5％CO2培养过夜。

2)TAT-PDCD4-HIS融合蛋白刺激刺激浓度20ug/ml，10ug/ml、5u/ml、2.5ug/ml、1.25ug/ml、0.625ug/ml，每个浓度三复孔。

3)刺激时间为24小时、48小时或72小时。

4)CCK8处理细胞添加CCK8，孵育1小时。

5)检测OD450酶标仪检测.

结果：从图4结果显示：TAT-PDCD4-His融合蛋白存在部位与内源性PDCD4基本一致，可有效抑制卵巢癌细胞(SKOV3细胞)增殖。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> TAT-PDCD4融合蛋白及其在治疗卵巢癌药物中的应用

<130> 2010

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 2

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

His His His His His His

1 5

<210> 3

<211> 469

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 3

Pro Pro Gln Met Asp Val Glu Asn Glu Gln Ile Leu Asn Val Asn Pro

1 5 10 15

Ala Asp Pro Asp Asn Leu Ser Asp Ser Leu Phe Ser Gly Asp Glu Glu

20 25 30

Asn Ala Gly Thr Glu Glu Ile Lys Asn Glu Ile Asn Gly Asn Trp Ile

35 40 45

Ser Ala Ser Ser Ile Asn Glu Ala Arg Ile Asn Ala Lys Ala Lys Arg

50 55 60

Arg Leu Arg Lys Asn Ser Ser Arg Asp Ser Gly Arg Gly Asp Ser Val

65 70 75 80

Ser Asp Ser Gly Ser Asp Ala Leu Arg Ser Gly Leu Thr Val Pro Thr

85 90 95

Ser Pro Lys Gly Arg Leu Leu Asp Arg Arg Ser Arg Ser Gly Lys Gly

100 105 110

Arg Gly Leu Pro Lys Lys Gly Gly Ala Gly Gly Lys Gly Val Trp Gly

115 120 125

Thr Pro Gly Gln Val Tyr Asp Val Glu Glu Val Asp Val Lys Asp Pro

130 135 140

Asn Tyr Asp Asp Asp Gln Glu Asn Cys Val Tyr Glu Thr Val Val Leu

145 150 155 160

Pro Leu Asp Glu Arg Ala Phe Glu Lys Thr Leu Thr Pro Ile Ile Gln

165 170 175

Glu Tyr Phe Glu His Gly Asp Thr Asn Glu Val Ala Glu Met Leu Arg

180 185 190

Asp Leu Asn Leu Gly Glu Met Lys Ser Gly Val Pro Val Leu Ala Val

195 200 205

Ser Leu Ala Leu Glu Gly Lys Ala Ser His Arg Glu Met Thr Ser Lys

210 215 220

Leu Leu Ser Asp Leu Cys Gly Thr Val Met Ser Thr Thr Asp Val Glu

225 230 235 240

Lys Ser Phe Asp Lys Leu Leu Lys Asp Leu Pro Glu Leu Ala Leu Asp

245 250 255

Thr Pro Arg Ala Pro Gln Leu Val Gly Gln Phe Ile Ala Arg Ala Val

260 265 270

Gly Asp Gly Ile Leu Cys Asn Thr Tyr Ile Asp Ser Tyr Lys Gly Thr

275 280 285

Val Asp Cys Val Gln Ala Arg Ala Ala Leu Asp Lys Ala Thr Val Leu

290 295 300

Leu Ser Met Ser Lys Gly Gly Lys Arg Lys Asp Ser Val Trp Gly Ser

305 310 315 320

Gly Gly Gly Gln Gln Ser Val Asn His Leu Val Lys Glu Ile Asp Met

325 330 335

Leu Leu Lys Glu Tyr Leu Leu Ser Gly Asp Ile Ser Glu Ala Glu His

340 345 350

Cys Leu Lys Glu Leu Glu Val Pro His Phe His His Glu Leu Val Tyr

355 360 365

Glu Ala Ile Ile Met Val Leu Glu Ser Thr Gly Glu Ser Thr Phe Lys

370 375 380

Met Ile Leu Asp Leu Leu Lys Ser Leu Trp Lys Ser Ser Thr Ile Thr

385 390 395 400

Val Asp Gln Met Lys Arg Gly Tyr Glu Arg Ile Tyr Asn Glu Ile Pro

405 410 415

Asp Ile Asn Leu Asp Val Pro His Ser Tyr Ser Val Leu Glu Arg Phe

420 425 430

Val Glu Glu Cys Phe Gln Ala Gly Ile Ile Ser Lys Gln Leu Arg Asp

435 440 445

Leu Cys Pro Ser Arg Gly Arg Lys Arg Phe Val Ser Glu Gly Asp Gly

450 455 460

Gly Arg Leu Lys Pro

465

<210> 4

<211> 489

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 4

Met Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Met Asp

1 5 10 15

Val Glu Asn Glu Gln Ile Leu Asn Val Asn Pro Ala Asp Pro Asp Asn

20 25 30

Leu Ser Asp Ser Leu Phe Ser Gly Asp Glu Glu Asn Ala Gly Thr Glu

35 40 45

Glu Ile Lys Asn Glu Ile Asn Gly Asn Trp Ile Ser Ala Ser Ser Ile

50 55 60

Asn Glu Ala Arg Ile Asn Ala Lys Ala Lys Arg Arg Leu Arg Lys Asn

65 70 75 80

Ser Ser Arg Asp Ser Gly Arg Gly Asp Ser Val Ser Asp Ser Gly Ser

85 90 95

Asp Ala Leu Arg Ser Gly Leu Thr Val Pro Thr Ser Pro Lys Gly Arg

100 105 110

Leu Leu Asp Arg Arg Ser Arg Ser Gly Lys Gly Arg Gly Leu Pro Lys

115 120 125

Lys Gly Gly Ala Gly Gly Lys Gly Val Trp Gly Thr Pro Gly Gln Val

130 135 140

Tyr Asp Val Glu Glu Val Asp Val Lys Asp Pro Asn Tyr Asp Asp Asp

145 150 155 160

Gln Glu Asn Cys Val Tyr Glu Thr Val Val Leu Pro Leu Asp Glu Arg

165 170 175

Ala Phe Glu Lys Thr Leu Thr Pro Ile Ile Gln Glu Tyr Phe Glu His

180 185 190

Gly Asp Thr Asn Glu Val Ala Glu Met Leu Arg Asp Leu Asn Leu Gly

195 200 205

Glu Met Lys Ser Gly Val Pro Val Leu Ala Val Ser Leu Ala Leu Glu

210 215 220

Gly Lys Ala Ser His Arg Glu Met Thr Ser Lys Leu Leu Ser Asp Leu

225 230 235 240

Cys Gly Thr Val Met Ser Thr Thr Asp Val Glu Lys Ser Phe Asp Lys

245 250 255

Leu Leu Lys Asp Leu Pro Glu Leu Ala Leu Asp Thr Pro Arg Ala Pro

260 265 270

Gln Leu Val Gly Gln Phe Ile Ala Arg Ala Val Gly Asp Gly Ile Leu

275 280 285

Cys Asn Thr Tyr Ile Asp Ser Tyr Lys Gly Thr Val Asp Cys Val Gln

290 295 300

Ala Arg Ala Ala Leu Asp Lys Ala Thr Val Leu Leu Ser Met Ser Lys

305 310 315 320

Gly Gly Lys Arg Lys Asp Ser Val Trp Gly Ser Gly Gly Gly Gln Gln

325 330 335

Ser Val Asn His Leu Val Lys Glu Ile Asp Met Leu Leu Lys Glu Tyr

340 345 350

Leu Leu Ser Gly Asp Ile Ser Glu Ala Glu His Cys Leu Lys Glu Leu

355 360 365

Glu Val Pro His Phe His His Glu Leu Val Tyr Glu Ala Ile Ile Met

370 375 380

Val Leu Glu Ser Thr Gly Glu Ser Thr Phe Lys Met Ile Leu Asp Leu

385 390 395 400

Leu Lys Ser Leu Trp Lys Ser Ser Thr Ile Thr Val Asp Gln Met Lys

405 410 415

Arg Gly Tyr Glu Arg Ile Tyr Asn Glu Ile Pro Asp Ile Asn Leu Asp

420 425 430

Val Pro His Ser Tyr Ser Val Leu Glu Arg Phe Val Glu Glu Cys Phe

435 440 445

Gln Ala Gly Ile Ile Ser Lys Gln Leu Arg Asp Leu Cys Pro Ser Arg

450 455 460

Gly Arg Lys Arg Phe Val Ser Glu Gly Asp Gly Gly Arg Leu Lys Pro

465 470 475 480

Glu Ser Tyr His His His His His His

485

<210> 5

<211> 1471

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

catatgggca ggaagaagcg gagacagcga cgaagacctc ctcaaatgga tgtagaaaat 60

gagcagatac tgaatgtaaa ccctgcagat cctgataact taagtgactc tctcttttcc 120

ggtgatgaga aaatgctggg actgaggaaa taaagaatga aataaatgga aattggattt 180

cagcatcctc cattaacgaa gctagaatta atgccaaggc aaaaaggcga ctaaggaaaa 240

actcatcccg ggacctggca gaggcgattc ggtcagcgac agtgggagtg acgcccttag 300

aagtggatta actgtgccaa ccagtccaaa gggaaggttg ctggataggc gatccagatc 360

tgggaaagga aggggactac caagaaaggt ggtgcaggag gcaaaggtgt ctggggtaca 420

cctggacagg tgtatgatgt ggaggaggtg gatgtgaaag atcctaacta tgatgatgac 480

caggagaact gtgtttatga aactgtagtt tgcctttgga tgaaagggca tttgagaaga 540

ctttaacacc aatcatacag gaatattttg agcatggaga tactaatgaa gttgcggaaa 600

tgttaagaga tttaaatctt ggtgaaatga aaagtgagta ccagtgttgg cagtatcctt 660

agcattggag gggaaggcta gtcatagaga gatgacatct aagcttcttt ctgacctttg 720

tgggacagta atgagcacaa ctgatgtgga aaaatcattt gaaaattgtt gaaagatcta 780

cctgaattag cactggatac tcctagagca ccacagttgg tgggccagtt tattgctaga 840

gctgttggag atggaatttt atgtaatacc tatattgata gttacaaaga actgtagatt 900

gtgtgcaggc tagagctgct ctggataagg ctaccgtgct tctgagtatg tctaaaggtg 960

gaaagcgtaa agatagtgtg tggggctctg gaggtgggca gcaatctgtc aatcacttgt 1020

taaagagatt gatatgctgc tgaaagaata tttactctct ggagacatat ctgaagctga 1080

acattgcctt aaggaactgg aagtacctca ttttcaccat gagcttgtat atgaagctat 1140

tatatggttt tagagtcaac tggagaaagt acatttaaga tgattttgga tttattaaag 1200

tccctttgga agtcttctac cattactgta gaccaaatga aaagaggtta tgagagaatt 1260

tacaatgaaa tccggacatt aatctggatg tcccacattc atactctgtg ctggagcggt 1320

ttgtagaaga atgttttcag gctggaataa tttccaaaca actcagagat ctttgtcctt 1380

caaggggcag aaagcgtttg taagcgaagg agatggaggt cgtcttaaac cagagagcta 1440

ccaccaccat catcatcact aatgaggatc c 1471

<210> 6

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

tgtttaactt taagaaggag atatacatat gggcaggaag aagcggagac agc 53

<210> 7

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

tcgaattcgg atcctcatta gtgatgatga tggtggtggt agctctctgg tttaagacg 59

Claims

1.一种融合蛋白，其特征在于，该融合蛋白主要由TAT中11个碱性氨基酸的核心肽段区与PDCD4连接组成，其中TAT肽段氨基酸残基序列如SEQ ID NO.1所示、PDCD4氨基酸残基序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，该融合蛋白还包含一个标签；所述标签优选为His标签，氨基酸残基序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为：

1)序列表中的SEQ ID No.4所示氨基酸序列组成的蛋白；或，

2)SEQ ID No.4所示氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸衍生的并具有与1)所述蛋白具有同等功能的蛋白质。

4.一种编码权利要求1～3任一所述的融合蛋白的基因。

5.根据权利要求4所述的基因，其特征在于，是具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID No.5的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID No.4蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No.5限定的DNA序列杂家的核苷酸序列。

6.含有权利要求4或5所述的基因的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌；所述重组表达载体，是将所述基因插入到大肠杆菌表达载体中得到重组表达载体；所述大肠杆菌表达载体为Pet30a质粒；所述转基因重组菌，是将所述重组表达载体导入宿主细胞中，筛选得到的转基因重组菌；所述宿主细胞，可以是动物细胞、昆虫细胞、酵母、大肠杆菌，优选大肠杆菌BL21(DE3)。

7.一种制备权利要求1～3任一所述融合蛋白的方法，其特征在于，将权利要求4或5所述的基因克隆到表达载体，将所述表达载体导入大肠杆菌，筛选阳性克隆，经菌体培养和诱导表达后，分离纯化得到该融合蛋白；所述表达载体为Pet30a质粒；所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)；所述诱导剂为IPTG；所述纯化方法为Ni²⁺亲和层析技术纯化。

8.权利要求1～3任一所述的融合蛋白在制备治疗卵巢癌药物中的应用。

9.一种用于治疗卵巢癌的药物组合物，其特征在于，包含权利要求1～3任一所述的融合蛋白。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，还包括有药学上可接受的载体、赋形剂或佐剂。