KR20100109912A - 핵산을 세포로 전달하기 위한 약학 조성물 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 다량체 단백질 형질도입 도메인(PTD) 또는 스페이서-혼입된 PTD를 함유하는 핵산 결합 분자를 이용하여 핵산을 세포로 전달하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 핵산 결합 분자와 복합체 또는 컨쥬게이트를 형성하는 핵산을 함유하는 신규한 조성물에 관한 것이다. 핵산 결합 분자는 다량체 PTD 또는 스페이서-혼입된 PTD를 함유할 수 있고, 추가로 핵산 결합 영역을 함유할 수 있다. 본 발명의 핵산 복합체 또는 컨쥬게이트는 표적 유전자의 발현을 억제하고/하거나, 표적 유전자의 기능을 측정하는데 이용될 수 있다.

Description

핵산을 세포로 전달하기 위한 약학 조성물 및 방법{PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS AND METHODS FOR DELIVERING NUCLEIC ACIDS INTO CELLS}
본 발명은 다량체 단백질 형질도입 도메인(PTD) 및/또는 스페이서-혼입된 PTD을 함유하는 핵산 결합 분자를 이용하여 생체 내 또는 시험관 내에서 핵산을 세포로 전달하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 핵산 결합 분자와 복합체 또는 컨쥬게이트를 형성하는 핵산을 함유하는 신규한 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 표적 유전자의 기능을 측정할 뿐 아니라, 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법에 관한 것이다.
RNA 간섭(RNAi)이란 짧은 RNA 단편이 유전자 발현의 중요한 매개자인 메신저 RNA(mRNA)를 간섭하여 mRNA의 분해를 야기하여 mRNA 생성물로서 단백질의 합성을 차단하는 과정을 의미한다. 짧은 RNA 단편이 mRNA와 염기 쌍을 형성하면, 세포에서 분해되는 이중-가닥 RNA가 형성된다. RNAi의 유전자 발현에 대한 선택적인 효과로 인해 RNAi는 특정한 유전자의 기능을 조사할 때 귀중한 조사 수단이 된다. 또한, RNAi는 종종 표적 유전자의 발현을 특이적으로 억제하는 신규한 약물의 개발에 이용되어 왔다.
그 기원에 따라, 짧은 RNA 단편은 외인성 공급원으로부터 유래되는 경우 작은 간섭 RNA(siRNA)로 분류되고([Elbashir, S. M., et al ., Nature 411:494-498 (2001)]), 세포 자신의 게놈에 있는 RNA-코딩 유전자로부터 생성되는 경우에는 마이크로RNA(miRNA)로 분류된다.
siRNA의 용도는 크게 다음과 같은 2가지 카테고리로 나누어질 수 있다: (1) 화학적 합성 또는 생물학적 합성에 의해 생산된 siRNA 또는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)가 세포로 직접 전달되는 경우, 및 (2) siRNA를 발현할 수 있는 다양한 DNA 벡터를 세포로 주입하고, 이에 의해 세포가 siRNA를 생성하는 경우(예를 들면 미국 특허 제6,278,039호; 미국 특허 출원 제2002/0006664호; 제WO 99/32619호; 제WO 01/29058호; 제WO 01/68836호; 및 제WO 01/96584호를 참고할 수 있다). 이들의 이점이 효과적으로 이용될 수 있도록 이들 2가지 카테고리에 근거한 다양한 적용 기법이 이용될 수 있다. 후자의 경우, 최근에는 또한 siRNA를 제조할 수 있는 DNA 벡터를 전달하여 암과 같은 질병에서 켜지는 유전자를 하향조절하고자 시도되어 왔다([Meyer, M. and Wagner, E., Hum . Gene Ther . 17(11):1062-1076 (2006)]).
RNAi에서는, 핵산을 생체 내 및 시험관 내에서 세포로 전달하는 효율이 RNAi의 효율을 결정한다. 그러나, siRNA 또는 siRNA용 DNA 벡터를 세포로 전달하는 효율은 2가지 기법을 실제로 적용하는데 있어 주요한 방해물로서 남아있다. 이는 RNA 또는 DNA와 같은 핵산이 세포막을 투과하기에는 너무 크기 때문이다. 비록 이의 기작이 명확하게 밝혀지진 않았지만, 실험에서, 이들 핵산은 물리적 또는 화학적 수단을 필요로 하지 않고 세포로 도입될 수 있다. 그러나, 핵산의 전달은 너무 낮은 효율을 갖고 있기 때문에 실제로 적용하기 어렵다.
실험실에서 시험관 내 실험에 가장 흔하게 이용되는 한가지 방법은 핵산의 전달을 돕기 위해서 리포솜을 이용하는 것이다. 1980년대에, 양이온성 리포솜이 개발되었고, 이는 중성 리포솜에 비해 형질감염 효율을 매우 개선시켰다. 그러나, 이 효율은 시험관 내 실험에서는 높지만, 생체 내에서는 혈액이나 체액으로 인해 현저히 감소된다. 또한, 리포솜 그 자체가 강한 독성을 갖고 있기 때문에 다량의 리포솜을 적용하기가 어렵고, 따라서, 인체에서 이의 적용이 제한된다.
핵산을 세포로 전달하기 위한 다른 방법은 바이러스 벡터를 이용하는 것이다. 바이러스 벡터는 효과적인 담체로서 이용될 수 있지만, 외래 유전자를 인간의 세포에 도입하는데 대한 윤리적인 문제점에 추가하여 세포 발암 현상과 같은 심각한 부작용을 갖는 것으로 발견되어, 안전성을 보증하기 위한 광범위한 임상 연구가 강하게 요구된다. 이러한 이유로, 현재의 상황에서는, 바이러스 벡터의 생체 내 도입은 많은 연구에도 불구하고 임상이나 산업계에서 신뢰성있게 사용될 수 없다.
예를 들면 전기천공 및 유체역학 주입에 의해 네이키드(naked) 핵산(즉, 이들의 전달을 돕기위한 임의의 다른 성분이 없는 핵산)을 물리적으로 전달하는 다른 방법 또한 연구되어 왔다. 최근 연구의 결과는 네이키드 RNA를 정맥, 복강 또는 안구로 전달하면 특정 유전자의 발현이 녹-다운(knock down)될 수 있음을 나타내었다([Herweijer, H. and Wolff, J. A., Gene Ther . 10(6):453-458 (2003)]; [Hagstrom, J. E. et al ., Mol . Ther . 10(2):386-398 (2004)]). 그러나, 이들 방법의 특징으로 인해 이를 실제로 적용하는 것이 제한된다.
또한, 폴리에틸렌이민(PEI) 등을 포함하는 나노입자를 전달 벡터로서 이용하는데 촛점을 둔 연구가 활발하게 수행되어 왔다.
전달의 낮은 효율성 이외에, siRNA를 실제로 이용하는데 있어 다른 방해물은 이것이 짧은 생체 내 반감기를 갖고 있어서, 증가된 양을 이용할 것이 요구된다는 점이다. RNA 분해효소에 대해 저항성을 갖도록 RNA의 포스페이트 주쇄를 포스포로티오에이트 등으로 변형하고자 시도되어왔다. 더욱이, RNA를 폴리에틸렌글리콜(PEG), 콜레스테롤 등으로 개질시킴으로써, RNA의 반감기를 증가시키는데 초점을 둔 연구가 또한 수행되었다. 그러나, 이런 다양한 시도와 연구에도 불구하고, 낮은 핵산 전달 효율성이 RNAi의 실제 이용에서의 주된 문제점으로 남아있다.
최근, 단백질 형질도입 도메인(PTD)의 이용이 제안되었다. PTD는 생물학적 활성 분자를 세포로 전달하는데 유용한 작은 분자량의 펩타이드이다([Viehl C.T., et al ., Ann . Surg . Oncol . 12:517-525 (2005)]; [Noguchi H., et al ., Nat . Med . 10:305-309 (2004)]; 및 [Fu A.L., et al ., Neurosci . Lett . 368:258-62 (2004)]). 다양한 PTD가 공지되어 있지만, 대부분의 경우 PTD중의 양전하 아미노산의 수가 매우 높다. 가장 흔히 알려진 PTD는 HIV의 Tat이고, 또한 Antp, VP22, 합성 폴리아르기닌 등이 있다. 최근, MPH-1, Sim-2 등이 발견되었다.
PTD는 이의 종류나 세포 유형과는 무관하게 시험관 내 또는 생체 내에서 분자의 효율적인 전달을 수행하는 것으로 알려져 있다. 대부분의 PTD는 핵산과 안정한 비-공유결합을 형성하고 핵산을 세포로 전달할 수 있다. 안테나페디아 호메오도메인의 3번째 헬릭스가 작은 올리고뉴클레오타이드와 안정한 비-공유결합 복합체를 형성하여 이들의 내부화를 촉진시키는 것으로 나타났다([Dom, G., et al ., Nucleic Acids Res . 31:556-561 (2003)]). Pep-3는 비-공유결합 상호작용을 통해 펩타이드 핵산과 안정한 복합체를 형성하고, 이들의 세포로의 전달을 촉진시키는 것으로 보고되었다([Morris, M. C., et al ., Nucleic Acids Res . 35 (2007)]). HIV gp41의 융합 서열로부터 유래된 소수성 도메인 및 SV40 T-항원의 핵 국소화 서열로부터 유래된 친구성 도메인을 함유하는 MPG 펩타이드가 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 비-공유 결합을 형성하여 올리고뉴클레오타이드를 배양된 포유동물 세포로 전달하는 것이 입증되었다([Morris, M. C. et al ., Nucleic Acids Res . 25:2730-2736 (1997)]). Tat 펩타이드의 이량체, 삼량체 및 사량체가 비-공유결합 상호작용을 통해 플라스미드 DNA와 안정한 입자를 형성하고, 이들의 세포로의 전달을 촉진하는 것으로 보고되었다([Rudolph, C., et al ., J. Biol . Chem . 278:11411-11418 (2003)]).
PTD는 또한 핵산과 안정한 공유결합을 형성하여 이들의 전달을 촉진시킬 수 있다. 리포솜에 공유 결합된 Tat 펩타이드는 DNA의 신속한 전달을 촉진시킨다([Torchilin, V. P., et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 98:8786-8791 (2001)] 및 [Torchilin, V. P., et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 100:1972-1977 (2003)]). 불안정한 결합, 예를 들면 다이설파이드 결합을 통해 펩타이드 핵산 분자를 혈장 막을 가로질러 전달하기 위해 페너트라틴과 트랜스포탄을 이용하는 것 또한 개시되었다(예를 들면 미국 특허 제6,025,140호 참조).
siRNA와 공유 결합을 형성하는 PTD가 개시되어 왔다. Tat 펩타이드는 siRNA에 공유결합하여 siRNA의 핵 전달을 촉진한다([Chiu, Y., et al ., Chem . Biol . 11(8):1165-1175 (2004)]). 페너트라틴과 트랜스포탄 펩타이드는 siRNA에 공유 결합하여 siRNA의 효율적인 세포 전달을 촉진한다([Davidson, T. J., et al ., J. Neurosci. 24(45):10040-10046 (2004)]; [Muratovska, A. and Eccles, M. R., FEBS 558:63-68 (2004)]).
비록 일부 연구에서 높은 전달 효율이 달성되지만, siRNA 또는 siRNA를 위한 DNA 벡터의 전달에서 PDT를 이용하면 안정하고 높은 효율의 RNAi 효과가 생성되지 않는다. 또한, PDT의 이용이 무의미한 효과를 제공한다는 보고도 있다. Tat 또는 페너트라틴 펩타이드에 공유 결합된 siRNA는 생체 내에서 RNAi 효과를 나타내지 않았다([Moschos, S. A., et al ., poster presentation at the Biochemical Society Focused Meeting, UK, (2007)]).
이전에 언급한 바와 같이, 대부분의 PTD는 핵산의 음전하를 띤 포스페이트 주쇄에 결합할 수 있는 양전하를 띤 아미노산이 풍부하다. 핵산과 PTD사이의 이러한 결합은 PTD와 핵산이 비-공유 결합을 형성하는 경우와 이들이 공유결합을 형성하는 경우 둘 모두 가능하다. 대부분의 연구는 단일 PTD 유니트만을 이용하였다. PTD와 핵산사이의 약한 결합조차도 전달 기능을 유지하는데 중요한 PTD의 구조에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, PTD의 전달 효율이 크게 감소될 수 있다. 핵산에 결합하지 않는 PTD는 세포로 전달되는 능력을 유지하지만, 핵산을 전달하는데 이용될 수는 없다. 또한 핵산에 결합한 PTD는 세포로 전달되는 능력이 감소된다. 결과적으로, 종래의 연구에서 PTD를 이용하여 핵산을 세포로 전달하는 방법은 효과적이거나 효율적이지 않았다.
따라서, 본 발명자는 다량체 PTD 또는 스페이서-혼입된 PTD 분자가 세포로 전달되는 능력을 유지하고 있는, 핵산을 세포로 전달하기 위한 다량체 PTD 또는 스페이서-혼입된 PTD 분자를 고안하였다.
본 발명의 목적은 핵산 결합 분자를 이용하여 생체 내 또는 시험관 내에서 핵산을 세포로 효율적으로 전달하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 하나 이상의 다량체 PTD 또는 스페이서-혼입된 PTD를 함유하는 핵산 결합 분자와 복합체 또는 컨쥬게이트를 형성한 핵산을 포함하는 복합체 또는 컨쥬게이트를 제공한다. 스페이서-혼입된 PTD는 1 내지 250kd, 5 내지 180kd, 5 내지 150kd 또는 5 내지 30kd의 분자량에 상응하는 길이를 가질 수 있다. 핵산과 핵산 결합 분자 사이의 결합이 PTD의 구조에 영향을 미치지 않고, 따라서 이의 전달 기능이 유지되기 때문에, 핵산을 세포로 전달하는 효율이 크게 증가될 것이다.
본 발명의 한 양태는 하나 이상의 PTD 분자를 포함하는 하나 이상의 다량체 PTD 또는 스페이서-혼입된 PTD를 함유하는 핵산 결합 분자와 복합체 또는 컨쥬게이트를 형성한 단일 가닥 RNA이다.
본 발명의 다른 양태는 하나 이상의 PTD 분자를 포함하는 하나 이상의 다량체 PTD 또는 스페이서-혼입된 PTD를 함유하는 핵산 결합 분자와 복합체 또는 컨쥬게이트를 형성한 이중-가닥 RNA이다.
추가의 양태는 하나 이상의 PTD 분자를 포함하는 하나 이상의 다량체 PTD 또는 스페이서-혼입된 PTD를 함유하는 핵산 결합 분자와 복합체 또는 컨쥬게이트를 형성한 이중-가닥 핵산이다.
한 양태는 5개 이상의 PTD 분자를 포함하는 하나 이상의 다량체 PTD를 함유하는 핵산 결합 분자와 복합체 또는 컨쥬게이트를 형성한 이중 가닥 RNA이다.
본 발명은 또한 하나 이상의 PTD 분자를 포함하는 하나 이상의 다량체 PTD 또는 스페이서-혼입된 PTD를 함유하는 핵산 결합 분자와 복합체 또는 컨쥬게이트를 형성한 포스페이트 주쇄를 포함하는 단일 가닥 핵산을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
추가의 양태는 하나 이상의 PTD 분자를 포함하는 하나 이상의 다량체 PTD 또는 스페이서-혼입된 PTD를 함유하는 핵산 결합 분자와 복합체 또는 컨쥬게이트를 형성한 이중 가닥 RNA를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
추가의 양태는 하나 이상의 PTD 분자를 포함하는 하나 이상의 다량체 PTD 또는 스페이서-혼입된 PTD를 함유하는 핵산 결합 분자와 복합체 또는 컨쥬게이트를 형성한 이중 가닥 핵산을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 하나 이상의 PTD 분자를 포함하는 하나 이상의 다량체 PTD 또는 스페이서-혼입된 PTD를 포함하는 핵산 결합 분자에 관한 것이다.
본 발명은 또한 하나 이상의 핵산 결합 분자와 복합체 또는 컨쥬게이트를 형성한 상기 핵산 분자중 임의의 하나를 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 하나 이상의 핵산 결합 분자와 복합체 또는 컨쥬게이트를 형성한 상기 핵산 분자중 임의의 하나의 전달을 촉진시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 하나 이상의 핵산 결합 분자와 복합체 또는 컨쥬게이트를 형성한 상기 핵산을 이용하여 세포에서 표적 유전자의 기능을 측정하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 하나 이상의 핵산 결합 분자와 복합체 또는 컨쥬게이트를 형성한 상기 핵산을 이용하여 세포에서 표적 유전자의 발현을 억제시키는 방법에 관한 것이다.
상기 양태 모두의 경우, 핵산 결합 분자는 하나 이상의 핵산 결합 영역을 추가로 함유할 수 있다.
도 1은 핵산과 핵산 결합 분자 사이의 관계를 나타낸다. 도 1A는 핵산 결합 영역을 갖는 핵산 결합 분자를 나타내고, 여기서, PTD는 핵산과 복합체를 형성하지 않는다. 도 1B는 핵산 결합 영역을 갖는 핵산 결합 분자를 나타내고, 이는 핵산과 복합체를 형성한 다른 물질과 PTD의 조합이다. 도 1C는 핵산 결합 영역을 갖는 핵산 결합 분자(이는 핵산과 복합체를 형성한 PTD이다)를 도시한다. 도 1D는 핵산과 컨쥬게이트를 형성한 핵산 결합 영역을 갖는 핵산 결합 분자를 나타낸다. 도 1E는 핵산과 복합체를 형성한 핵산 결합 영역을 갖는 핵산 결합 분자를 나타낸다. 핵산 결합 영역은 다량체 PTD, 및 다량체 PTD의 내부 또는 말단 중 하나의 스페이서를 포함한다. 스페이서는 입체 장애 효과를 갖는다.
도 2는 재조합 다량체 PTD 발현용 벡터의 제조 방법을 나타낸다. 도 2a는 Sim-2UB(v)PTD(2), Sim-2UB(v)PTD(4), AntpUB(v)PTD(2) 및 AntpUB(v)PTD(4)의 재조합 단백질 발현용 벡터의 제조 방법을 나타낸다. 도 2b는 Sim-2UB(v)PTD(2), Sim-2UB(v)PTD(4), AntpUB(v)PTD(2) 및 AntpUB(v)PTD(4)의 N-말단 유비퀴틴 융합 단백질 발현용 벡터의 제조 방법을 나타낸다.
도 2c는 PTD(2)UB 및 PTD(4)UB의 N-말단 유비퀴틴 융합 단백질의 발현용 벡터의 제조 방법을 나타낸다. 도 2a, 2B, 2C 및 2D에서 PTD는 Hph-1을 나타낸다.
도 2d는 MPH-1-PTD 팔량체와 유비퀴틴의 융합 단백질의 발현용 벡터의 제조 방법을 나타낸다.
도 2e는 MPH-1-PTD 사량체 및 육량체와 유비퀴틴의 융합 단백질의 발현용 벡터의 제조 방법을 나타낸다.
도 3은 유비퀴틴과의 N-말단 융합 단백질로서 발현되었을 때, 가용성 단백질로서 다량체 PTD 및/또는 스페이서-혼입된 PTD를 정제하는 방법을 나타낸다.
도 4는 Src-류 어댑터 단백질(SLAP)과의 융합 단백질로서 발현되었을 때, 불용성 단백질로서의 다량체 PTD를 정제하는 방법을 나타낸다.
도 5는 다이설파이드 결합을 통한 컨쥬게이션에 의해 2개의 PTD 이량체로부터 PTD 사량체를 합성하는 방법 및 PTD 사량체와 PTD 이량체로부터 PTD 육량체를 합성하는 방법을 나타낸다.
도 6은 서로 다른 공유 결합을 통한 컨쥬게이션에 의해 siRNA-다량체 PTD를 합성하는 방법을 나타낸다.
도 7은 스페이서-혼입된 단백질에 의한 siRNA의 전달 효율을 나타낸다. siRNA의 하나의 가닥은 카복시플루오레세인(FAM)으로 라벨링되었다. siRNA를 단독으로(siRNA CTL) 형질도입하고, AUBP2 (AntpUB(v)PTD(2)), SUBP2 (Sim-2UB(v)PTD(2)), P2UB (PTD(2)UB) 또는 리포솜(Lipo)과 복합체를 형성하였다. 형질도입된 세포를 FACS에 의해 분석하였다.
도 8은 다량체 PTD중의 PTD의 수와 siRNA 전달 사이의 관련성을 나타낸다. 형질도입된 세포를 FACS로 분석하였다. 도 8은 530/30 필터(FL-1H)에 대한 형광 강도의 높이를 나타낸다.
도 9는 PTD 대 siRNA의 비가 세포로의 전달의 상대적인 효율성에 미치는 효과를 보여준다. siRNA는 다량체 PTD 또는 스페이서-혼입된 PTD와 복합체 또는 컨쥬게이트를 형성하였다. 형질도입된 세포를 FACS로 분석하였다. 도 9는 530/30 필터(FL-1H)에 대한 형광 강도의 높이를 보여준다.
도 10은 표적 유전자인 PKCA의 전사를 억제하는 능력을 보유한 스페이서-혼입된 단백질로 운반된 siRNA를 나타낸다.
도 11은 표적 유전자인 GAPDH의 활성을 억제하는 능력을 보유한 다량체 PTD로 운반된 siRNA를 나타낸다.
도 12는 PTD 사량체가 EGFP를 인코딩하는 플라스미드 DNA를 세포로 형질도입할 수 있음을 나타낸다. 전달 효율은 EGFP의 형광을 FACS에 의해 측정함으로써 분석되었다. 도 12는 530/30 필터(FL-1H)에 대한 형광 강도의 높이를 나타낸다.
본 발명은 하나 이상의 핵산 결합 분자를 이용하여 생체 내 및 시험관 내에서 핵산을 세포로 효과적으로 전달하는 방법에 관한 것이다. 핵산 결합 분자는 다량체 PTD 및/또는 스페이서-혼입된 PTD를 포함하는 분자로서 정의될 수 있고, 핵산에 결합하여 핵산을 세포로 전달하는 능력을 갖고 있다. 세포로 전달되는 핵산은 생물학적으로 활성이거나 활성이 아닐 수 있다.
본 발명의 한 양태는 하나 이상의 PTD 분자를 포함하는 하나 이상의 다량체 PTD 및/또는 스페이서-혼입된 PTD를 함유하는 핵산 결합 분자와 복합체 또는 컨쥬게이트를 형성하는 포스페이트 주쇄를 포함하는 단일 가닥 핵산이다.
본 발명의 바람직한 양태는 3개 이상의 PTD 분자를 포함하는 다량체 PTD 및/또는 스페이서-혼입된 PTD를 함유하는 핵산 결합 분자와 복합체 또는 컨쥬게이트를 형성하는 포스페이트 주쇄를 포함하는 단일 가닥 핵산이다.
포스페이트 주쇄를 포함하는 단일 가닥 핵산은 shRNA, 안티센스 RNA 또는 cDNA(상보성 DNA)일 수 있다.
본원에서 이용되는 용어 "짧은 헤어핀 RNA" 또는 "shRNA"는 짧은 루프 및 줄기에 19 내지 27개의 염기 쌍을 갖는 RNA 분자를 의미한다. shRNA는 이중 가닥 줄기의 서열과 상동성인 유전자의 발현을 선택적으로 침묵시킬 수 있다. 포유동물 세포는 shRNA를 siRNA로 전환시켜 선택적인 유전자 침묵을 매개할 수 있다([Paddison et al ., Genes and Dev . 16(8):948-58 (2002)]). shRNA는 그 자체가 폴딩되어 이중 가닥 구조(헤어핀 줄기-루프 구조)를 형성하는 단일 가닥 RNA이므로, 이중-가닥 핵산 뿐 아니라 단일-가닥으로 간주될 수 있다.
본원에서 이용되는 바와 같은, 용어 "펩타이드 핵산" 또는 "PNA"는 핵산 및 다른 폴리뉴클레오염기 가닥에 서열-특이적으로 혼성화될 수 있는 합성 뉴클레오염기 다량체의 부류를 의미한다. PNA 주쇄는 DNA와 RNA에서 하전된 포스페이트 기를 갖는 데옥시라이보스 및 라이보스 당 주쇄 대신, 펩타이드 결합에 의해 연결된 반복 N-(2-아미노에틸)-글라이신 유니트로 구성된다. 폴리뉴클레오염기 가닥의 뉴클레오염기 사이의 혼성화는 전형적으로 수소 결합에 대해 잘 확립된 규칙에 따른다. 왓슨-크릭 염기 쌍의 경우, 전형적으로 아데닌(A) 염기는 티민(T)과 쌍을 이루고, 사이토신(C) 염기는 구아닌(G)과 쌍을 이룬다. 다양한 다른 염기-쌍 모티프가 핵산 분야에서 잘 공지되어 있다.
본 발명의 다른 양태는 하나 이상의 PTD 분자를 포함하는 하나 이상의 다량체 PTD 및/또는 스페이서-혼입된 PTD를 함유하는 핵산 결합 분자와 복합체 또는 컨쥬게이트를 형성한 이중 가닥 RNA이다.
바람직한 양태는 2개 이상의 PTD 분자를 포함하는 다량체 PTD 및/또는 스페이서-혼입된 PTD를 함유하는 핵산 결합 분자와 복합체 또는 컨쥬게이트를 형성한 이중 가닥 RNA이다.
다량체 PTD 및/또는 스페이서-혼입된 PTD는 PTD의 C- 또는 N-말단에서 또는 이 내부에 하나 이상의 스페이서를 포함할 수 있다. 스페이서는 핵산과 복합체를 형성할 수 없는 단백질의 도메인 또는 단백질일 수 있다. 스페이서-혼입된 PTD는 1 내지 250kd, 5 내지 180 kd, 5 내지 150 kd 또는 5 내지 30 kd의 분자량에 상응하는 길이를 가질 수 있다. 예를 들면, 항체의 Fc 도메인, 전체 항체, 알부민, 애덕신(알파), 애덕신(베타), 알파-시누클레인, 알파A 크리스탈린(열-충격 단백질 베타-4; HspH4), 알파B 크리스탈린(열-충격 단백질 베타-5; HspH5), 아포지단백 A-1(Apo-A1), 베타-갈락토시다제, 클라트린 코트 조합 단백질 AP50, 사이토크롬-c-옥시다제, 녹색 형광 단백질(GFP), GTP 결합 단백질 Rheb, 헤마글루티닌, Ras GTP분해효소, Rho-GTP분해효소-활성화 단백질(p50-rhoGAP), 작은 프롤린이 풍부한 단백질 2E(SPR-2E), 투불린 알파-1, 투불린 베타-1, 유비퀴틴형 1-활성화 효소 E1A 또는 유비퀴틴형 1-활성화 효소 E1B을 스페이서로 이용할 수 있다. 바람직한 스페이서는 유비퀴틴(UB)이다.
본 발명의 한 양태는 스페이서-혼입된 PTD를 포함하는 핵산 결합 분자이고, 여기서, 스페이서-혼입된 PTD는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 PTD 및 하나 이상의 스페이서를 함유한다(예를 들면 서열번호: 1 내지 60). 따라서, 스페이서-혼입된 PTD는 1 내지 20개, 2 내지 15개, 2 내지 10개, 1 내지 5개, 2 내지 8개, 2 내지 5개 또는 2 내지 4개의 PTD 및 하나 이상의 스페이서를 포함할 수 있다. 스페이서는 핵산 서열에 결합하지 않는 아미노산 서열이다.
이중 가닥 RNA는 siRNA, 가교결합된 siRNA 유도체, shRNA, miRNA 또는 유전자조작된 RNA 전구체를 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다. 이중 가닥 RNA는 화학적으로 합성되거나, DNA 주형으로부터 시험관 내에서 전사되거나, 또는 유전자조작된 RNA 전구체로부터 생체 내에서 전사될 수 있다.
본원에서 이용되는 용어 "짧은 간섭 RNA" 또는 "siRNA"는 자기-상보적 센스 및 안티센스 영역을 포함하는 임의의 이중 가닥 RNA 분자를 의미하고, 여기서, 안티센스 영역은 발현을 하향조절하기위한 표적 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 일부를 포함하고, 센스 영역은 표적 핵산 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 일부를 포함한다. 센스 영역은 표적 핵산 서열 또는 일부와 실질적으로 동일한 서열을 갖는다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 siRNA는 16 내지 30개 뉴클레오타이드의 이중 가닥 RNA를 포함하고, 보다 더 바람직하게는 5' 및 3' 말단의 각각에서 19개의 뉴클레오타이드 이중 영역 및 2-뉴클레오타이드 오버행(overhang)을 갖도록 쌍을 이룬 21개의 뉴클레오타이드 센스 및 21개의 뉴클레오타이드 안티센스 가닥을 포함한다. 보다 더 바람직하게는, 2-뉴클레오타이드 3' 오버행은 2' 데옥시뉴클레오타이드(예를 들면 개선된 뉴클레아제 저항성을 위한 TT)를 포함한다.
본원에서 이용되는 용어 "마이크로RNA" 또는 "miRNA"는 mRNA 조절 및 분해의 다양한 양태에 관여하는 것으로 보이는 약 22개 뉴클레오타이드 길이의 세포 자체의 게놈에서 RNA-코딩 유전자로부터 생성되는 매우 작은 비-코딩 RNA를 의미한다([Zeng et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 100(17):9779-84 (2003)]).
미국 특허 출원 제10/672,069호에 개시된 바와 같은 가교결합된 siRNA 유도체는 본원에 그 전체가 참고로 혼입되어 있다. 예를 들면 신체에서 반감기를 증가시키기 위해 조성물의 약동학을 변경시키는데 가교결합이 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 2개의 가닥이 가교결합되도록 2개의 상보적인 핵산 가닥을 갖는 siRNA를 포함하는 siRNA 유도체를 포함한다. 예를 들면 가닥중 하나의 3' OH 말단이 변형될 수 있거나, 또는 2개의 가닥이 3' OH 말단에서 가교결합되고 개질될 수 있다. siRNA 유도체는 단일 가교결합을 함유할 수 있다(예를 들면 소랄렌 가교결합). 일부 양태에서, siRNA 유도체는 3' 말단에 바이오틴 분자(예를 들면 광분해성 바이오틴), 펩타이드, 펩티도미메틱, 나노입자, 유기 화합물(예를 들면 형광 염료와 같은 염료) 또는 덴트리머를 갖는다. 이런 방식으로 siRNA를 개질시키면, 상응하는 siRNA에 비해, 생성된 siRNA 유도체의 세포 흡수를 개선시키거나 세포 표적화를 개선시킬 수 있고, 세포에서 siRNA 유도체를 추적하거나 상응하는 siRNA에 비해 siRNA 유도체의 안정성을 개선시키는데 유용하다. 따라서, 당 분자의 숙련자들은 가교결합된 siRNA 유도체가 당 분야에서 일반적으로 공지된 바와 같은 RNAi를 매개하는 능력을 유지하면서도 개선된 성질을 갖는지 측정하기 위해 다양한 방법으로 개질된 가교결합된 siRNA 유도체를 스크리닝할 수 있다.
유전자조작된 RNA 전구체에서와 같은 본원에서 이용되는 용어 "유전자 조작된"은 전구체가 천연에서 발견되지 않고 전구체의 핵산 서열의 전부 또는 일부가 인간에 의해 창조되거나 선택됨을 의미한다. 일단 창조되거나 선택되면, 서열은 세포 내부에서의 기작에 의해 복제되거나, 번역되거나, 전사되거나 또는 달리 가공될 수 있다. 따라서, 유전자 조작된 핵산 분자, 예를 들면 트랜스유전자로부터 나온 세포 내부에서 제조된 RNA 전구체는 유전자 조작된 RNA 전구체이다. 유전자 조작된 RNA 전구체는 siRNA를 형성하기 위해 신체에서 가공되는 작은 일시적 RNA(stRNA)의 천연 발생 전구체와 유사한 인공 구축물이다. 유전자 조작된 RNA 전구체는 당 분야에 공지된 표준 방법에 의해, 예를 들면 자동화된 DNA 합성기(예를 들면 바이오서치, 어플라이드 바이오시스템스 등에서 상업적으로 이용가능한 것들)를 이용하거나, 또는 핵산 분자에 의해 인코딩됨으로써 합성될 수 있다.
추가의 양태는 하나 이상의 PTD 분자를 포함하는 하나 이상의 다량체 PTD 및/또는 스페이서-혼입된 PTD를 함유하는 핵산 결합 분자와 복합체 또는 컨쥬게이트를 형성한 이중 가닥 핵산이다.
한 양태는 5개 이상의 PTD 분자를 포함하는 다량체 PTD를 포함하는 핵산 결합 분자와 복합체 또는 컨쥬게이트를 형성한 이중 가닥 핵산이다.
이중 가닥 핵산은 siRNA, 이중 가닥 RNA, 혼성 이중 가닥 핵산 및 원형 RNA를 발현할 수 있는 이중 가닥 DNA 벡터를 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다.
본원에서 이용되는 용어 "DNA 벡터"는 구축물이 발현되는 세포에서 siRNA 잔기를 생산하는 RNA를 발현하기 위해 이용되는 복제가능한 핵산 구축물을 의미한다. 이런 벡터는 (2) 이중 가닥 RNA(siRNA, 또는 siRNA로 가공될 수 있는 shRNA)를 생성하도록 전사되는 "코딩" 서열에 기능적으로 연결된 (1) 유전자 발현에 대해 조절 작용을 갖는 유전 요소, 예를 들면 프로모터, 오퍼레이터 또는 인핸서, 및 (3) 적절한 전사 개시 및 종결 서열의 조합체를 포함하는 전사 유니트를 포함한다. 프로모터와 다른 조절 요소의 선택은 일반적으로 의도된 숙주 세포에 따라 변화된다. DNA 벡터는 원형 또는 선형화된 플라스미드일 수 있거나, 또는 또한 비-감염성이고 비통합성(즉, 척추동물 세포의 게놈으로 통합되지 않은)일 수 있는 다른 선형 DNA일 수 있다. 선형화된 플라스미드는 이전에는 원형이었지만, 예를 들면 제한 엔도뉴클레아제를 이용한 소화에 의해 선형화된 플라스미드이다. 선형 DNA는 예를 들면 문헌[Cherng, J.Y., et al ., J. Control . Release 60:343-53 (1999)] 및 [Chen, Z.Y., et al ., Mol . Ther . 3:403-10 (2001)](이들 둘 모두는 본원에 참고로 인용되어 있다)에 논의된 바와 같은 특정 상황에서 유리할 수 있다. DNA 벡터에서, 전사를 제어하는 조절 요소는 일반적으로 포유동물, 미생물, 바이러스 또는 곤충의 유전자로부터 유래된다. 숙주에서 복제할 수 있는 능력은 일반적으로 복제 기원에 의해 부여되고, 형질전환체의 인식을 용이하게 하는 선택 유전자가 추가로 혼입될 수 있다. 바이러스, 예를 들면 레트로바이러스, 아데노바이러스 등으로부터 유래된 벡터를 이용할 수 있다.
본원에서 이용되는 용어 "혼성 이중 가닥 핵산"은 이중 가닥 RNA와 유사한 기능을 갖는 이중 가닥 핵산을 의미한다. 혼성 이중 가닥 핵산은 RNA 가닥과 DNA 가닥으로 구성될 수 있다. 바람직하게는 RNA 가닥은 안티센스 가닥이고, 목적 mRNA에 결합한다. DNA와 RNA 가닥의 혼성화에 의해 만들어진 혼성 이중 가닥 핵산은 혼성화된 상보적 부분 및 바람직하게는 하나 이상의 3' 오버행잉 말단을 갖는다.
본원에서 이용되는 용어 "환상 RNA"는 2개의 루프 모티프를 함유하는 RNA 분자를 의미하고, 여기서, 원형 RNA의 루프 영역중 하나 또는 둘 모두는 생물학적으로 분해가능하다. 예를 들면, 본 발명의 원형 RNA는 생체 내에서 루프 영역의 분해가 3'-말단 오버행을 갖는 이중 가닥 siRNA, 예를 들면 약 2개의 뉴클레오타이드를 포함하는 3'-말단 뉴클레오타이드 오버행을 생성할 수 있다.
한 양태는 5개 이상의 PTD 분자를 포함하는 다량체 PTD를 포함하는 핵산 결합 분자와 복합체 또는 컨쥬게이트를 형성한 이중 가닥 DNA이다.
단백질 형질도입 도메인( PTD )
PTD는 단백질, 펩타이드, 핵산, 및 관심있는 화학적 화합물을 생체 내에서 또는 시험관 내에서 세포로 전달 또는 흡수되게 하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 다량체 PTD 및/또는 스페이서-혼입된 PTD로서 사용하기 위해서, 본 발명자들은 재조합 단백질 생산 과정 또는 화학적 합성 공정에 의해 생성된 여러 펩타이드를 구축하였다. 바람직한 전달 영역 및 사용되는 링커의 종류에 따라 다른 종류의 PTD를 이용할 수 있다. PTD는 3 내지 30개의 아미노산, 바람직하게는 5 내지 15개의 아미노산으로 구성되고, 이중 10 내지 30% 이상은 바람직하게는 아르기닌 잔기이다. 그러나, 임의의 아르기닌 잔기가 없는 PTD 또한 예상된다.
다량체 PTD 및/또는 스페이서-혼입된 PTD는 예를 들면 동종이량체, 동종삼량체, 동종육량체 및 다른 동종다량체를 포함한 동종-다량체이거나, 또는 예를 들면 이종이량체, 이종사량체, 이종육량체 및 다른 이종다량체일 수 있다. 본 발명의 양태는 하기의 것들중 하나 이상의 조합을 포함하는 동종- 또는 이종-다량체 PTD 및/또는 스페이서-혼입된 PTD를 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다:
마우스 전사 인자(MPH-1) 또는 인간 전사 인자(HPH-1) YARVRRRGPRR (서열 번호:1);
Tat-PTD (YGRKKRRQRRR) (서열 번호:2);
Antp 또는 페너트라틴(RQIKIWFQNRRMKWKK) (서열 번호:3);
트랜스포탄(CLIKKALAALAKLNIKLLYGASNLTWG) (서열 번호:4);
HSV-1 구조 단백질 Vp22 (DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE) (서열 번호:5);
폴리아르기닌 R7 (RRRRRRR) (서열 번호:6);
막 전위 서열 (MTS) (AAVALLPAVLLALLAPAAADQNQLMP) (서열 번호:8);
Pep-1 (KETWWETWWTEWSQPKKKRKV) (서열 번호:9),
Pep-2 (KETWFETWFTEWSQPKKKRKV) (서열 번호:10), 및
Pep-3 (YGFKKFRKPWTWWETWWTE) (서열 번호:11)
을 포함하는 짧은 양친매성 펩타이드 담체;
Sim-2 (AKAARQAAR) (서열 번호:12);
MPG (GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV) (서열 번호:13);
KALA (WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA) (서열 번호:14); 및
분지된 폴리리신 (미국 특허 출원 제2006/0041058호 및 [Eom, K. D. et al ., J. Nanosci. Nanotechnol . 6(11):3532-3538 (2006)]에 개시된 것).
(표 1 및 2에 도시된 바와 같은) C-말단 Cys가 괄호안에 있는 본 발명의 서열(서열 번호: 15 내지 20, 21, 31 내지 42, 45, 57 내지 60)은 Cys가 선택적임을 나타낸다. 따라서, C-말단 Cys가 제거된 서열 또한 예상되고, 본 발명의 양태이다. C-말단 시스테인이 siRNA에 컨쥬게이팅되는데 이용될 수 있다. 반대로, C-말단 Cys를 갖는 것으로 도시되지 않은 본 발명의 서열(서열번호: 1 내지 14, 22 내지 30, 43, 44 및 46 내지 56)은 siRNA에 컨쥬게이팅되었을 때 C-말단에 Cys를 포함할 수 있다.
본 발명의 PTD 다량체 PTD 및/또는 스페이서-혼입된 PTD의 특정한 예가 하기 표 1 및 2에 열거되어 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
*: UB(v)는 카복실 말단의 Gly 잔기가 Val로 치환된 유비퀴틴의 돌연변이 형태이다. (C)로 끝나는 서열(서열번호: 20, 31 내지 42, 45, 57 내지 60)은 Cys가 선택적임을 의미한다. C-말단 Cys가 제거된 서열 또한 예상되고, 본 발명의 양태이다.
이들 PTD와 실질적으로 유사한 변형체, 예를 들면 이와 65% 이상 동일한 변형체 또한 예상된다. 물론, 동일성 %는 예를 들면 65%, 67%, 69%, 70%, 73%, 75%, 77%, 83%, 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성으로 더욱 높을 수 있다. 일반적으로, 치환은 보존성 치환이다. 이런 PTD 변형체를 제조하는 방법은 당 분야에서는 일상적이다.
PTD 또는 이의 변형체는 또한 치환, 결실 또는 부가를 가질 수 있다. 보존성 또는 비-보존선 아미노산 치환, 결실 또는 부가에 의해 변형될 수 있다. 일부 양태에서는, 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된다. 당 분야의 숙련자들은 단백질 기능을 덜 수행할 것 같거나 유의하게 수행하지 않을 것 같은 아미노산 치환을 충분히 인식하고 있다(예를 들면 하나의 지방족 아미노산을 제 2의 지방족 아미노산으로 대체). 예를 들면 표현형적으로 침묵 아미노산 치환을 제조하는 방법에 관한 안내가 [Bowie, J. U. et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions,"Science 247:1306-1310 (1990)]에 제공되어 있다.
PTD 또는 이의 변형체는 또한 변형된 주쇄, 예를 들면 올리고카바메이트 또는 올리고유레아 주쇄를 가질 수 있다(예를 들면 [Wang et al ., J. Am . Chem . Soc . 119:6444-6445 (1997)]; [Tamilarasu et al ., J. Am . Chem . Soc . 121:1597-1598 (1999)]; [Tamilarasu et al ., Bioorg . Of Med . Chem . Lett . 11:505-507 (2001)] 참고).
핵산 결합 영역
모든 상기 언급된 양태에서, 핵산 결합 분자는 하나 이상의 핵산 결합 영역을 추가로 포함할 수 있다. "핵산 결합 영역"은 핵산에 결합할 수 있는 영역으로 정의된다. 핵산에 정전기적으로 결합할 수 있는 양이온 물질, 예를 들면 폴리라이신, 폴리아르기닌, 염기성 측쇄를 갖는 아미노산의 임의의 다른 중합체 또는 폴리에틸렌이민(PEI) 등을 이용할 수 있다. 양이온 물질은 양이온 물질과 음이온 핵산 포스페이트 주쇄사이의 정전기 상호작용을 통해 서열-독립적인 방식으로 핵산에 결합하는 것으로 생각된다. 양이온성 물질과 DNA 사이의 상호작용의 강도가 다른 것들 중에서도 양이온 물질의 전반적인 순전하를 반영할 것으로 당 분야의 숙련자들에게 이해된다.
적합한 양이온 물질은 폴리라이신, 예를 들면 10 내지 20개의 라이신 잔기, 15 내지 17개의 잔기, 특히 16개의 잔기를 갖는 폴리라이신, 즉 K16를 포함한다. (분자당 평균 16개의 양전하를 갖는) 3.4kDa의 분자량을 갖는 폴리-L-라이신 및 폴리-D-라이신이 바람직하다. 다른 적합한 중합체는 (중성 pH에서 분자당 평균 12개의 양전하를 갖는) 2kDa의 분자량을 갖는 PEI를 포함한다. PTD 그 자체는 매우 양전하를 띠는 분자이고, 또한 유사하게 사용될 수 있다. 용어 "핵산 결합 영역"은 상기 개시된 물질과 동일한 기작으로 핵산에 결합할 수 있는 임의의 물질을 포함하고자 한다.
다량체 PTD 및/또는 스페이서-혼입된 PTD에 추가하여, 핵산 결합 영역이 핵산 결합 분자의 일부인 경우, PTD가 핵산에 결합할 확률이 감소될 수 있도록 핵산 결합 영역이 핵산에 결합할 수 있다. 따라서, PTD가 이의 원래 구조를 유지할 확률이 높아져서 PTD가 세포로 전달되는 능력이 유지된다. PTD가 세포로 전달되는 능력은 PTD가 화물에 직접 결합할 것을 요구하지 않는다. PTD의 전달 효과는 심지어 핵산 결합 영역이 존재하여, PTD가 핵산에 직접 결합하는 것을 방해하는 경우에도 유지된다(도 1A).
따라서, PTD가 핵산 결합 영역으로서 이용되고, 다량체 PTD 및/또는 스페이서-혼입된 PTD가 핵산을 세포로 전달하기 위핸 핵산 담체로서 이용되는 경우, 핵산을 세포로 전달하기 위한 이의 효율은 크게 증가될 것이다(도 1B).
생산 방법
본 발명은 또한 핵산 결합 영역이 있거나 없는 다량체 PTD 및/또는 스페이서-혼입된 PTD를 포함하는 핵산 결합 분자와 복합체 또는 컨쥬게이트를 형성하는 임의의 상기 핵산 분자중 하나를 생산하는 방법에 관한 것이다.
다량체 PTD 및/또는 스페이서-혼입된 PTD는 화학적 합성 방법 또는 재조합 단백질 생산 방법에 의해 생산될 수 있다. 사량체 또는 육량체를 생산하기 위해, 다이설파이드 결합과 같은 공유 결합을 통한 이량체의 컨쥬케이트화가 이용될 수 있다. 바람직한 양태에서, 시스테인 잔기는 2개의 PTD 이량체의 말단 단부에 위치한다. 그런 다음, pH 8 내지 11에서 저온에서 느리게 교반하는 공기 산화 방법을 이용하여 다이설파이드 결합이 도입된다. 이량체와 사량체를 조합함으로써 이런 방식으로 육량체가 제조될 수 있다.
결합이 정전기 상호작용을 통해 일어나는 경우, 핵산과 핵산 결합 분자 사이의 결합은 비-공유결합 분자일 수 있다. 핵산과 핵산 결합 분자가 일정한 비율로 혼합되면, 복합체가 형성된다. 1:1 내지 1:20, 1:1 내지 1:3, 또는 1:2의 핵산 대 핵산 결합 분자의 비가 복합체를 생산하는데 이용될 수 있다.
핵산과 핵산 결합 분자 사이의 결합은 또한 다이설파이드 결합 또는 아미드 결합과 같은 공유 결합을 통해 수행될 수 있다. 당 분야에서 일반적이고 잘 공지된 방법에 따라 임의의 적합한 결합(예를 들면 에스터 결합, 카바메이트 결합, 설포네이트 결합, 티오에스터 결합, 티오에터 결합 등)을 생성할 수 있다. 핵산과 핵산 결합 분자 사이에 다이설파이드 결합을 형성하기 위해서, 2개의 분자는 티올 기(이중 하나는 이탈기를 가질 수 있다)를 갖도록 유도체화될 수 있다. 그런 다음, 핵산과 핵산 결합 분자 사이에 다이설파이드 결합이 생성되도록 변형된 핵산을 충분한 시간(및 이러한 적절한 온도, pH, 몰 비 등의 조건 하에서) 동안 연결을 위해 제조된 핵산 결합 분자와 함께 항온처리한다. 효율적인 결합을 형성하는데 필요한 조건 뿐만 아니라 공유 결합을 형성하는 다수의 방법 및 전략이 당 분야의 숙련자들에게 명확할 것이다.
본 발명은 또한 (i) 다량체 PTD 및/또는 스페이서-혼입된 PTD를 포함하는 핵산 결합 분자와 복합체 또는 컨쥬게이트를 형성한 핵산을 생성하는 단계; (ii) 핵산 결합 분자와 복합체 또는 컨쥬게이트를 형성한 핵산을 세포 배양 매질에 첨가하는 단계; 및 (iii) 단계 (ii)에서 제조된 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 핵산 결합 분자와 복합체 또는 컨쥬게이트를 형성한 핵산 결합 분자중 임의의 하나를 세포로 전달하는 것을 용이하게 하는 방법에 관한 것이다.
세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계는 핵산이 세포로 전달되도록, 이러한 기간 및 이러한 농도, 온도, pH 등의 조건 하에서 세포를 배양하는 것으로 정의된다. 본 발명을 이용한 특정 프로토콜은 다수의 인자(예를 들면 사용되는 세포 유형, 핵산의 크기, PTD)에 따라 다양할 것이고 당 분야의 숙련자들에게 쉽게 인식될 것이다.
생물학적 용도
본 발명은 또한 (i) 핵산 결합 분자와 복합체 또는 컨쥬게이트를 형성한 핵산을 세포 배양 배지로 첨가하는 단계; (ii) 표적 유전자의 발현이 억제되기에 충분한 양으로 핵산이 세포로 전달되도록 단계 (i)에서 제조된 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계; (iii) 세포를 유지시키고, 여기서, 표적 유전자의 상응하는 mRNA가 분해되는 단계; 및 (iv) 적절한 대조군 세포에 대해 세포의 표현형을 관찰하고 비교하여 세포 내의 표적 유전자의 기능에 대한 정보를 수집하는 단계를 포함하는, 다량체 PTD 및/또는 스페이서-혼입된 PTD를 포함하는 핵산 결합 분자와 복합체 또는 컨쥬게이트를 형성한 핵산을 이용하여 세포 내의 표적 유전자의 기능을 측정하는 방법에 관한 것이다.
다양한 옵션이 표적 유전자의 발현 억제를 검출하는데 이용가능하다. 적합한 분석법은 예를 들면 도트 블럿, 노던 블럿, 동일 반응계 혼성화, ELISA, 면역침전법, 효소 성능과 같은 당 분야의 숙련자들에게 공지된 기법을 이용하여 표적 세포로부터 전사되는 mRNA의 수준 또는 표적 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 수준의 조사, 및 또한 당 분야의 숙련자들에게 공지된 다른 분석법을 포함한다. 표적 유전자 mRNA 수준을 측정하는데 다수의 방법이 이용가능하다. 이런 방법은 예를 들면 도트 블럿 분석, 동일반응계 혼성화, RT-PCR, 정량적 역-전사 PCR, 노던 블럿 및 핵산 프로브 어레이 방법을 포함한다. 유사하게, 단백질 수준에서의 변화를 검출하기 위해 다양한 방법이 이용될 수 있다. 예시적인 방법은 웨스턴 블럿 분석, 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 면역학적 분석을 수행한 후 항체와 단백질 사이에 형성된 복합체를 검출하는 방법, 및 단백질이 검출가능한 활성을 갖는 한, 활성 분석법을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다. 일반적으로, 핵산 결합 분자와 복합체 또는 컨쥬게이트를 형성하는 핵산과 함께 배양된 세포 내에서의 단백질 또는 mRNA 수준을 핵산 결합 분자와 복합체 또는 컨쥬게이트를 형성하는 핵산과 함께 배양되지 않은 대조군 세포와 비교하여 핵산이 세포로 전달되어 표적 단백질의 발현을 억제하는지를 측정한다.
세포의 표현형을 관찰하여 표적 유전자의 발현 억제와 비례하는 표현형 변화를 검출할 수 있다. 이런 표현형 변화는 예를 들면 세포사멸, 외형 변화, 세포 증식에서의 변화, 및 또한 다른 세포 활성의 변화를 포함할 수 있다. 특정 유전자의 발현의 방해가 이들 세포 활성중 하나 이상의 감소 또는 증가를 야기하면, 표적 유전자의 기능이 이들 세포 경로중 하나 이상에 할당될 수 있다. 본 발명은 또한 표적 유전자의 발현을 차단 또는 활성화시키는 치료 방법에 관한 것이다.
"표적 유전자"는 그의 발현이 선택적으로 억제되거나, 또는 "침묵"되는 유전자이다. 이러한 침묵은 shRNA, 안티센스 RNA, miRNA, siRNA, 유전자조작된 RNA 전구체, 혼성 이중 가닥 핵산 또는 원형 RNA와 표적 유전자의 mRNA 사이의 결합에 의해 유도된 표적 유전자의 mRNA 분해를 촉진시킴으로써 달성된다. 이들 분자의 한 부분 또는 절편은 표적 유전자의 mRNA의 일부, 예를 들면 약 16 내지 약 40개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드에 실질적으로 상보적인 안티센스 가닥이다. 유전학 또는 서열규명에 의해 이전에 확인된 임의의 유전자가 표적을 나타낼 수 있다. 표적 유전자는 대사적 또는 구조적 유전자, 또는 효소를 인코딩하는 유전자 뿐 아니라 발생학적 유전자 및 조절 유전자를 포함할 수 있다. 본 발명의 표적 유전자는 천연 단백질을 코딩하는 유전자 또는 조절 유전자의 경우에서처럼 세포에 내인성인 유전자일 수 있고; 다르게는, 바이러스 또는 박테리아 유전자, 트랜스포손 또는 트랜스유전자의 경우에서와 같이 표적 유전자가 세포에 대해 이종성 또는 외인성일 수 있다.
본원에서 이용되는 "세포"는 이의 일반적인 생물학적 의미로 사용되고, 전체 다세포 유기체를 의미하지 않고, 특히 인간을 의미하지 않는다. 세포는 유기체, 예를 들면, 조류, 식물, 및 포유동물(예를 들면 인간, 소, 양, 유인원, 원숭이, 돼지, 개 및 고양이)에 존재할 수 있다. 세포는 원핵세포(예를 들면 박테리아 세포) 또는 진핵세포(예를 들면 포유동물 또는 식물 세포)일 수 있다. 세포는 체세포 또는 생식 계열 기원, 분화전능성 또는 만능성, 분할성 또는 비-분할성일 수 있다. 세포는 또한 생식세포 또는 배아세포, 줄기 세포 또는 완전히 분화된 세포로부터 유래되거나 또는 이들을 포함할 수 있다.
본 발명은 단일 표적 유전자의 기능을 측정하는 방법으로 한정되지 않고, 게놈-전체 유전자의 기능을 측정하는 방법 또한 포함한다. 기능적 게놈에서 RNAi 라이브러리를 고안하는 접근법은 [Huesken, D. et al ., Nat . Biotechnol . 23(8): 995-1001 (2005)], [Vanhecke, D. and Janitz, M. Drug Discov . Today 10(3): 205-12 (2005)] 및 [Janitz, M. et al ., Handb . Exp . Pharmacol . 97-104 (2006)]에 개시되어 있다.
치료적 용도
본 발명은 또한 핵산 결합 분자와 복합체 또는 컨쥬게이트를 형성하는 핵산을 이용하여 세포에서 표적 유전자의 발현을 억제하는 치료적 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 한 양태는 유전자 발현을 변형시킴으로써 치료될 수 있는 광범위한 질병 및 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 환자에서 질병 상태 또는 다른 부정적인 상황의 발생 또는 심각성을 예방, 조절하거나 치료(검출가능하거나 측정가능한 정도로 하나 이상의 증후를 경감시킴)하는데 효과적으로 이용될 수 있다. 예를 들면 생체 내에서 뉴클레아제 분해에 대한 증가된 내성을 제공하고/하거나 개선된 세포 흡수를 통해 가교결합된 siRNA 유도체를 이용하는 것이 종종 천연 siRNA 분자의 성질과 비교하여 개질된 siRNA의 성질을 개선시키는 것도 이들 및 관련된 치료 조성물 및 방법에 포함된다. 본원 명세서에 따라 쉽게 결정될 수 있는 바와 같이, 다수의 화학적 변형을 갖는 가교결합된 siRNA 유도체는 이들의 RNA 간섭(RNAi) 활성을 보유할 것이다. 따라서, 본 발명은 다양한 치료적, 진단적, 표적 평가, 유전적 발견, 유전자 조작 및 약물유전학 용도를 위한 유용한 시약 및 방법을 제공한다.
본 발명은 환자에서 특정한 질병 상태 또는 다른 부정적인 상황과 관련된 유전자의 발현을 조절하는 핵산 또는 이의 절편을 제공함으로써 추가의 목적 및 이점을 만족한다. 전형적으로, 핵산은 본 발명의 질병 상태 또는 부정적인 상황과 관련된 일상적 또는 원인 인자로서 증가된 수준에서 발현되는 유전자를 표적으로 할 것이다. 본원에서, 유전자의 발현은 하나 이상의 관련된 질환 증후의 심각성 또는 재발을 예방하거나, 경감시키거나 감소시키는 수준으로 효과적으로 하향조절될 것이다. 다르게는, 표적 유전자의 발현이 질병 또는 다른 부정적인 상황의 결과 또는 귀착점으로서 반드시 증가되지 않는 다양한 명확한 질병 모델의 경우, 그럼에도 불구하고, 표적 유전자의 하향 조절은 유전자 발현을 감소시킴으로써(즉, 표적 유전자의 단백질 생성물 및/또는 선택된 mRNA의 수준을 감소시켜서) 치료적 결과를 생성할 것이다.
다르게는, 본 발명은 하나의 유전자의 더 낮은 발현을 표적로 할 수 있고, 이는 그의 발현이 표적 유전자의 생성물 또는 활성에 의해 부정적으로 조절되는 "다운스트림" 유전자의 상향조절을 야기할 수 있다. 다수의 임의의 유전자를 포함하는, 동물 개체에서 선택된 질병 조건과 관련된 하나 이상의 상이한 유전자의 표적 발현이 선택된 질병 상태와 연관된 우발적인 또는 기여 인자로서 비정상적으로 증가하는 것으로 알려진 필적할만한 방법들이 제공된다. 본 발명은 표적 질병 상태에 대한 다른 표준 치료제와 함께 투여될 수 있다.
"유전자 발현의 조절"이란 표적 유전자의 발현이 상향조절되거나 하향조절되는 것을 의미하고, 이는 세포에 존재하는 mRNA 수준, 또는 mRNA 번역, 또는 표적 유전자에 의해 인코딩되는 단백질 또는 단백질 아단위의 합성의 상향조절 또는 하향조절을 포함할 수 있다. 유전자 발현의 조절은 또한 본 발명의 단백질 또는 아단위의 발현, 수준 또는 활성이 모듈레이터(예를 들면 siRNA)의 부재하에서 관찰되는 것보다 더 크거나 더 적도록, 상향조절되거나 하향조절되는 표적 유전자에 의해 인코딩되는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 아단위의 존재, 양 또는 활성에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 용어 "조절"은 "억제" 또는 "감소"를 의미할 수 있지만, 단어 "조절"의 사용이 이들 정의로 제한되지는 않는다.
"억제," "하향조절" 또는 "감소"라는 표현은 유전자의 발현 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 아단위를 인코딩하는 RNA 분자 또는 등가의 RNA 분자의 수준, 또는 표적 유전자에 의해 인코딩되는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 아단위의 수준 또는 활성이 본 발명의 핵산 분자의 부재하에서 관찰되는 것 미만으로 감소됨을 의미한다. 한 양태에서, 억제, 하향조절 또는 감소는 불활성화되거나 감쇠된 분자의 존재하에서 관찰되는 수준보다 낮다. 다른 양태에서, 억제, 하향조절 또는 감소는 예를 들면 스크램블된 서열을 갖는 핵산 또는 미스매치를 갖는 핵산의 존재하에서 관찰되는 수준보다 낮다. 다른 양태에서, 본 발명의 핵산을 갖는 유전자 발현의 억제, 하향조절 또는 감소는 핵산의 부재하에서 보다 핵산의 존재 하에서 더 크다.
문구 "표적 유전자의 발현 억제"는 본 발명의 분자가 표적 유전자를 하향조절하는 능력을 의미한다. 하향조절의 정도를 조사하기 위해서, 특정한 구축물을 발현하는 배양액중의 흥미있는 미생물 또는 세포의 샘플 또는 분석을 구축물 발현이 없는 대조군 시료와 비교한다. (구축물 발현이 없는) 대조군 시료에 100%의 상대적인 값이 할당된다. 대조군에 대한 시험 값이 약 90%, 종종 50%일 때, 일부 양태에서는 25% 내지 0%일 때 표적 유전자의 발현 억제가 달성된다. 적합한 분석법은 예를 들면 당 분야의 숙련자들에게 공지된 표현형 분석법 뿐만 아니라, 도트 블럿, 노던 블럿, 동일 반응계 혼성화, ELISA, 면역침전, 효소 기능과 같은 당 분야의 숙련자들에게 공지된 기법을 이용하여 단백질 또는 mRNA 수준을 조사하는 것을 포함한다.
"개체"란 핵산 전달을 위해 그 자체가 개체인 세포 또는 외식된 세포의 공여자 또는 수령인으로서 또는 개체로서의 유기체를 포함할 수 있는 유기체, 조직 또는 세포를 의미한다. 따라서, "개체"는 본 발명의 핵산 분자가 투여되고, 본원에 개시된 폴리뉴클레오타이드 전달-개선 폴리펩타이드에 의해 개선될 수 있는 시험관내 또는 생체 외 기관, 조직 또는 세포 개체를 포함하는 유기체, 기관, 조직 또는 세포를 의미할 수 있다. 예시적인 개체는 포유동물 개체 또는 세포, 예를 들면 인간 환자 또는 세포를 포함한다.
예시적인 양태 이내에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 류마티스 관절염(RA)의 증후를 치료 또는 예방하기 위한 종양 괴사 인자-α(TNF-α)의 발현을 조절하기 위한 치료 수단으로서 유용하다. 본원에서, 본 발명은 또한 이중-가닥 RNA를 이용한 RNAi에 의해 TNF-α의 발현 및 활성을 조절하는데 유용한 화합물, 조성물 및 방법을 추가로 제공한다. 보다 상세한 양태에서, 본 발명은 이중-가닥 RNA, 예를 들면 siRNA, miRNA 및 shRNA, 및 포유동물 개체에서 RA의 증후를 예방하거나 경감하기 위해 TNF-α 유전자 및/또는 TNF-α의 발현을 조절하는데 효과적인 관련된 방법을 제공한다.
본 발명은 국소적 주입(예를 들면 건선 관절염 또는 RA로 감염된 환자의 관절로, 또는 건선을 치료하기 위해 건선 플라크의 부위에서의 국소적 주입)에 의해 또는 경피로 임의의 형태로 투여될 수 있다. 보다 상세한 양태에서, 본 발명은 TNF-α RNA를 효과적으로 하향조절하고, 이에 의해 하나 이상의 TNF-α-관련된 염증 질환을 감소 또는 방지하는 TNF-α의 mRNA에 대한 치료 효과량의 이중-가닥 RNA를 투여하는 방법 및 제형을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 또한 세포 분할에 관련된 유전자 또는 종양 세포 에서 다르게 상향조절되는 유전자를 침묵시킴으로써 암을 치료하는 방법을 포함한다.
본 발명의 분자는 핵산 결합 분자 단독에 대해 복합체 또는 컨쥬게이트를 형성하는 핵산을 추가로 포함하거나, 또는 하나 이상의 추가 성분, 예를 들면 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 부형제, 아쥬방트, 유화제, 완충제, 안정화제, 보존제 등을 추가로 포함하는 제형 내부에서의 투여를 포함하지만, 이로 한정되지 않는 당 분야에 숙련된 이들에게 공지된 다양한 방법에 의해 세포로 투여될 수 있다. 일부 양태에서, 핵산 결합 분자에 복합체 또는 컨쥬게이트를 형성하는 핵산은 리포솜에서 캡슐화되거나, 하이드로겔, 사이클로덱스트린, 생분해성 나노캡슐, 생물접착성 미소구, 또는 단백질 벡터(예를 들면 국제 특허 공개 공보 제WO00/53722호 참고)로 혼입될 수 있다. 다르게는, 핵산/핵산 결합 분자/비히클 조합은 주입 펌프를 이용함으로써 또는 직접 주사에 의해 국소적으로 전달될 수 있다. 피하, 근육내 또는 경피인 직접 주사는 표준 바늘 및 주사 방법을 이용하거나, 또는 [Conry et al ., Clin . Cancer Res . 5:2330-2337 (1999)] 및 국제 PCT 공개 공보 제WO 99/31262호에 개시된 것들과 같은 바늘 없는 방법에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 경구 투여를 위한 정제, 캡슐 또는 엘릭시르로서, 직장 투여를 위한 좌약으로서, 주사 투여를 위한 멸균 용액, 현탁액으로서, 및 당 분야에 공지된 다른 조성물로서 배합되고 이용될 수 있다.
약학 조성물 또는 배합물이란 예를 들면 인간을 포함한 환자 또는 세포로 투여, 예를 들면 전신 투여하기에 적합한 형태의 조성물 또는 배합물을 의미한다. 적합한 형태는 부분적으로는 경구, 경피 또는 주입과 같은 들어가는 경로 또는 용도에 의존한다. 이런 형태는 조성물 또는 배합물이 표적 세포(즉, 음전하 핵산이 전달에 바람직한 세포)에 도달하는 것을 방해하지 않아야만 한다. 예를 들면 혈류로 주입되는 약학 조성물은 용해성이어야만 한다. 다른 인자는 당 분야에 공지되어 있고, 독성과 같은 고려사항을 포함한다.
"전신 투여"란 생체 내 전신 흡수 또는 약물의 혈류에서의 축적 후 전체 몸으로의 분배를 의미한다. 전신 흡수를 이끌어내는 투여 경로는 정맥내, 피하내, 복강내, 흡입, 경구, 폐내 및 근육내를 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다. 이들 투여 경로 각각은 바람직한 음전하 핵산을 접근가능한 병에 걸린 조직에 노출시킨다. 약물의 순환계로의 진입 속도는 분자량 또는 분자 크기의 함수인 것으로 보인다. 본 발명의 화합물을 포함하는 리포솜 또는 다른 약물 담체의 이용은 일부 조직 유형, 예를 들면 망상 내피 시스템(RES)의 조직에서 약물을 잠재적으로 국소화시킬 수 있다. 약물이 세포, 예를 들면 림프구 및 거식세포의 표면과 결합하는 것을 용이하게 할 수 있는 리포솜 배합물이 또한 유용하다. 이 접근법은 비정상적인 세포, 예를 들면 암 세포의 대식 세포 및 림프구 면역 인식의 특이성이라는 이점을 이용함으로써 약물의 표적 세포로의 개선된 전달을 제공할 수 있다.
"약학적으로 허용가능한 배합물"은 이들의 바람직한 활성에 가장 적합한 물리적 위치에서 본 발명의 핵산 분자의 효과적인 분배를 허용하는 조성물 또는 배합물을 의미한다. 본 발명의 핵산 분자와의 배합에 적합한 약물의 비한정적인 예는 약물의 CNS로의 진입을 개선시킬 수 있는 P-당단백질 억제제(예를 들면 플루로닉(Pluronic) P85)([Jolliet-Riant and Tillement, Fundam . Clin . Pharmacol . 13:16-26 (1999)]); 뇌내 이식후 지속 방출 전달을 위한 폴리 (DL-락타이드-코글리콜라이드) 미세구와 같은 생물학적 분해가능한 중합체([Emerich, D. F. et al ., Cell Transplant 8:47-58 (1999)]); 및 혈관-뇌 장벽을 가로질러 약물을 전달할 수 있고 뉴론 흡수 기작을 변형시킬 수 있는 부하된 나노입자, 예를 들면 폴리부틸시아노아크릴레이트로 제조된 것들([Schroeder, U. et al ., Prog . Neuropsychopharmacol . Biol . Psychiatry 23(5):941-949 (1999)])을 포함한다. 본 발명의 핵산 분자를 위한 전달 전략의 다른 비한정적인 예는 [Boado et al ., J. Pharm. Sci . 87:1308-1315 (1998)]; [Tyler et al ., FEBS Lett . 421:280-284 (1999)]; [Pardridge et al ., PNAS USA 92:5592-5596 (1995)]; [Boado, Adv . Drug Delivery Rev . 15:73-107 (1995)]; [Aldrian-Herrada et al ., Nucleic Acids Res . 26:4910-4916 (1998)]; 및 [Tyler et al ., PNAS USA 96:7053-7058 (1999)]에 개시되어 있는 문헌들을 포함한다.
본 발명은 또한, 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제 중의 약학적 효과량의 바람직한 화합물을 포함하는, 저장 또는 투여를 위해 제조된 조성물을 포함한다. 치료 용도로 허용가능한 담체 또는 희석제는 약학 분야에 잘 공지되어 있고, 예를 들면 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985)]에 개시되어 있다. 예를 들면 방부제, 안정화제, 염료 및 향료가 제공될 수 있다. 이들은 나트륨 벤조에이트, 소르브산, 및 p-하이드록시벤조산의 에스터를 포함한다. 또한 산화방지제 및 현탁제가 이용될 수 있다.
"약학적으로 효과적인 투여량"은 질병 상태의 방지, 발생 억제 또는 치료 (질병 상태의 증후의 어느 정도의 경감, 바람직하게는 모든 증후의 경감)에 필요한 투여량이다. 약학적으로 효과적인 투여량은 질병의 유형, 사용되는 조성물, 투여 경로, 치료받는 포유동물의 유형, 고려되는 특정 포유동물의 신체적 특성, 동시적인 약물, 및 당 분야의 숙련자들이 인식할 다른 인자에 의존한다. 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 수득된 자료를 인간에서 이용하기 위한 투여량 범위를 공식화하는데 이용할 수 있다. 이런 화합물의 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 또는 전혀 없는 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 이내이다. 투여량은 이용된 투여 형태 및 이용되는 투여 경로에 의존하여 이 범위 이내에서 다양할 수 있다. 세포 배양에서 측정된 바와 같은 IC50 (즉, 증후의 최대의 절반을 억제하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도를 달성하기 위해 동물 모델에서 공식화될 수 있다. 이런 정보는 인간에서 유용한 투여량을 보다 정확하게 측정하기 위해 사용될 수 있다. 혈장에서의 수준은 예를 들면 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.
본원에서 정의되는 바와 같은, 본 발명의 약학적으로 효과적인 투여량은 선택되는 핵산에 의존한다. 예를 들면, shRNA를 인코딩하는 플라스미드가 선택되면, 약 1㎍ 내지 1000mg의 범위의 선택된 단일 투여량 양이 투여될 수 있고; 일부 양태에서, 10, 30, 100 또는 1000㎍이 투여될 수 있다. 일부 양태에서는, 1 내지 5g의 조성물이 투여될 수 있다. 조성물은 하루에 1회 이상 내지 (이틀에 1회를 포함하여) 1주에 1회 이상으로 투여될 수 있다. 당 분야의 숙련자들은 질병 또는 질환의 심각성, 이전의 치료법, 개체의 일반적인 건강 및/또는 연령 및 존재하는 다른 질환을 포함하지만, 이로 한정되지 않는 일부 인자가 개체를 효과적으로 치료하는데 필요한 투여량 및 시기에 영향을 미칠 수 있음을 인식할 것이다. 더욱이, 개체의 치료는 단일 치료를 포함하거나, 바람직하게는 일련의 치료를 포함할 수 있다.
경구 투여를 위해, 본 발명을 캡슐, 정제, 분말, 과립 또는 현탁액으로 제공할 수 있다. 경구 조성물은 또한 구강세척액으로 이용하기 위해 액체 담체를 이용하여 제조될 수 있다. 약학적 상용성 결합제 및/또는 아쥬방트 물질이 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. 정제, 환제, 캡슐, 트로쉐 등은 임의의 하기 성분, 또는 유사한 성질의 화합물을 함유할 수 있다: 결합제, 예를 들면 미세결정성 셀룰로스, 트라가칸트 검 또는 젤라틴; 부형제, 예를 들면 전분 또는 락토스, 분해제, 예를 들면 알긴산, 프리모겔 또는 옥수수 전분; 윤활제, 예를 들면 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로츠(Sterotes); 활제, 예를 들면 콜로이드성 이산화규소; 감미제, 예를 들면 슈크로스 또는 사카린; 또는 향료, 예를 들면 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 향료. 조성물은 또한 종래의 단위 투여 형태로 추가로 제공될 수 있고, 제어 방출 제형, 완충제 및/또는 장내 코팅을 이용하여 제조될 수 있다.
수성 현탁액은 수성 현탁액의 제조에 적합한 부형제와 혼합된 활성 물질을 함유한다. 이런 부형제는 현탁제, 예를 들면 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 하이드로프로필-메틸셀룰로스, 나트륨 알기네이트, 폴리비닐피롤리돈, 트라가칸트 검 및 아카시아검이고; 분산 또는 습윤화제는 천연 포스파타이드, 예를 들면 레시틴, 또는 알킬렌 옥사이드와 지방산의 축합 생성물, 예를 들면 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 또는 에틸렌 옥사이드와 장쇄 지방족 알콜의 축합 생성물, 예를 들면 헵타데카에틸렌옥시세탄올, 또는 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 헥시톨로부터 유래된 부분적 에스터의 축합 생성물, 예를 들면 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올리에이트, 또는 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유래된 부분적 에스터의 축합 생성물, 예를 들면 폴리에틸렌 소르비탄 모노올리에이트일 수 있다. 수성 현탁액은 또한 하나 이상의 방부제, 예를 들면 에틸, 또는 n-프로필 p-하이드록시벤조에이트, 하나 이상의 착색제, 하나 이상의 향료, 및 하나 이상의 감미제, 예를 들면 슈크로스 또는 사카린을 함유할 수 있다.
활성 성분을 식물성 오일, 예를 들면 낙화생유, 올리브유, 호마유 또는 코코넛유, 또는 광물성 오일, 예를 들면 액체 파라핀에 현탁시킴으로써 유성 현탁액이 배합될 수 있다. 유성 현탁액은 증점제, 예를 들면 밀랍, 경질 파라핀 또는 세틸 알콜을 함유할 수 있다. 감미제 및 향료는 입에 맞는 경구 제제를 제공하기 위해 첨가될 수 있다. 이들 조성물은 아스코브산과 같은 항산화제를 첨가함으로써 보존될 수 있다.
물을 첨가함으로써 수성 현탁액의 제조에 적합한 분산성 분말 및 과립은 분산제, 습윤화제, 현탁제 및 하나 이상의 방부제와 혼합된 활성 성분을 제공한다. 적합한 분산제, 습윤화제, 또는 현탁제는 상기에 이미 언급된 것들에 의해 예시된다. 추가의 부형제, 예를 들면 감미제, 향료 및 착색제가 또한 존재할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 또한 수중유 현탁액의 형태일 수 있다. 유성 상은 식물성 오일 또는 광유 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 적합한 유화제는 천연 검, 예를 들면 아카시아 검, 또는 트라가칸트 검, 천연 포스파티드, 예를 들면 대두, 레시틴, 및 지방산과 헥시톨에서 유래된 에스터 또는 부분적 에스터, 무수물, 예를 들면 소르비탄 모노올리에이트, 및 상기 부분적 에스터와 에틸렌 옥사이드의 축합 생성물, 예를 들면 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올리에이트일 수 있다. 유화액은 또한 감미제 및 향료를 함유할 수 있다.
약학 조성물은 멸균된 주사가능한 수성 또는 유성 현탁액의 형태일 수 있다. 이 현탁액은 상기 언급된 적합한 분산 또는 습윤화제 및 현탁제를 이용하여 공지된 기법에 따라 배합될 수 있다. 멸균된 주사가능한 제제는 또한 무-독성 비경구적으로 허용가능한 희석제 또는 용매 중의 멸균된 주사가능한 용액 또는 현탁액, 예를 들면 1,3-부탄다이올 중의 용액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용가능한 비히클 및 용매 중에, 물, 링거 용액, 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균된 고정 오일은 용매 또는 현탁 매질로서 통상적으로 이용된다. 이 목적을 위해서, 합성 모노- 또는 다이글리세라이드를 포함하는 임의의 블랜드 고정된 오일이 이용될 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산이 주사가능한 제제의 제조에서 용도를 발견한다.
본 발명은 또한 좌약, 예를 들면 약물의 직장 투여를 위한 형태로 투여될 수 있다. 이들 조성물은 약물을 실온에서는 고체이지만 직장 온도에서는 액체이고 따라서 직장에서 용융되어 약물을 방출하는 적합한 비-자극성 부형제와 함께 혼합함으로써 제조될 수 있다. 이런 물질은 코코아 버터 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
흡입에 의한 투여의 경우, 본 발명은 적합한 추진제, 예를 들면 이산화탄소와 같은 기체를 함유하는 가압 용기 또는 분배기, 또는 분무기로부터의 에어로졸 분무의 형태로 전달될 수 있다. 이런 방법은 미국 특허 제6,468,798호에 개시된 것들을 포함한다.
경점막 또는 경피 수단에 의해 또한 전신 투여될 수 있다. 경점막 또는 경피 투여의 경우, 침투되는 장벽에 적절한 침투제가 제형에 이용된다. 이런 침투제는 일반적으로 당 분야에 공지되어 있고, 예를 들면 경점막 투여의 경우, 세제, 담즙염 및 푸시드산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 비강 분무 또는 좌약을 이용함으로써 달성될 수 있다. 경피 투여의 경우, 활성 화합물은 당 분야에 일반적으로 공지되어 있는 연고, 고약, 겔 또는 크림으로 배합된다.
본 발명은 또한, 미국 특허 제6,194,389호에 개시된 마이크로-입자 DNA 백신 기법, 및 미국 특허 제6,168,587호에 개시된 분말-형태 백신을 갖는 포유동물의 경피성 바늘없는 백신접종 뿐 아니라, 예를 들면 유전자 총, 바이오 인젝터 및 피부 패치를 이용하여 핵산 약물을 투여하는데 적합한 임의의 방법에 의해 투여될 수 있다. 또한, [Hamajima et al ., Clin . Immunol . Immunopathol . 88(2):205-210 (1998)]에 개시된 바와 같은 비강내 전달이 가능하다. 리포솜(예를 들면 미국 특허 제6,472,375호에 개시된 것들) 및 미세캡슐화 또한 이용될 수 있다. 생물학적 분해성 표적화 마이크로입자 전달 시스템 또한 이용될 수 있다(예를 들면 미국 특허 제6,471,996호에 개시된 바와 같음).
정의
편의상, 본 명세서, 실시예 및 첨부된 특허청구범위에서 이용되는 일부 용어들이 여기에 수집되어 있다. 달리 한정되지 않는 한, 본원에서 이용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명에 관한 당 분야의 숙련자들에게 흔히 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본원에서 이용되는 용어 "핵산"은 폴리뉴클레오타이드, 예를 들면 데옥시라이보핵산(DNA), 및, 적절한 경우, 라이보핵산(RNA)을 의미한다. 용어는 또한 단일 가닥(예를 들면 센스 또는 안티센스) 및 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드를 개시하는 양태에 적용가능한 것들을 포함하는 것으로 이해되어야만 한다. 상기 용어는 공지된 뉴클레오타이드 유사체 또는 개질된 주쇄 잔기 또는 연결기(이는 합성, 천연 또는 비-천연이며, 언급된 핵산과 유사한 결합 성질을 갖고, 언급된 뉴클레오타이드와 유사한 방식으로 대사된다)를 함유하는 핵산을 포함한다. 이런 유사체의 예는 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 라이보뉴클레오타이드, 및 헵타이드-핵산(PNA)을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다.
혈청 리보뉴클리아제에 의한 핵산의 분해를 방지하고, 따라서 이의 효능을 증가시키기 위해 당, 염기 및 포스페이트 개질이 핵산 분자에 도입될 수 있다. 예를 들면, 올리고뉴클레오타이드는 뉴클리아제 저항성 기, 예를 들면 2'-아미노, 2'-C-알릴, 2'-플루오로, 2'-O-메틸, 2'-O-알릴, 2'-H, 뉴클레오타이드 염기 개질을 이용한 개질에 의해 안정성이 개선되고/되거나 생물학적 안정성이 개선되도록 개질된다([Usman and Cedergren, TIBS 17:34 (1992)]; [Usman et al ., Nucleic Acids Symp . Ser . 31:163 (1994)]; 및 [Burgin et al ., Biochemistry 35:14090 (1996)] 참고). 핵산 분자의 당 개질은 문헌에서 광범위하게 개시되어 왔다. 국제 특허 공개 공보 제WO91/03162호; 국제 특허 공개 공보 제WO 92/07065호; 국제 특허 공개 공보 제WO93/15187호; 국제 PCT 특허 공개 공보 제WO 97/26270호; 국제 PCT 공개 공보 제WO 98/13526호; 미국 특허 제5,334,711호; 미국 특허 제5,627,053호; 미국 특허 제5,716,824; 미국 특허 제6,300,074호; [Perrault et al ., Nature 344:565-568 (1990)]; [Pieken et al ., Science 253:314-317 (1991)]; [Usman and Cedergren, Trends in Biochem . Sci . 17:334-339 (1992)]; [Beigelman et al ., J. Biol . Chem . 270:25702 (1995)]; [Karpeisky et al ., Tetrahedron Lett . 39:1131(1998)]; [Earnshaw and Gait, Biopolymers ( Nucleic Acid Sciences ) 48:39-55(1998)]; [Verma and Eckstein, Annu . Rev . Biochem . 67:99-134 (1998)]; 및 [Burlina et al., Bioorg . Med . Chem . 5:1999-2010 (1997)]를 참고할 수 있다. 상기의 모든 문헌은 촉매작용을 변형시키지 않고 당, 염기 및/또는 포스페이트 등의 핵산 분자로의 혼입 위치를 결정하는 일반적인 방법 및 전략에 대해 개시하고 있다.
이러한 개시 내용을 살펴보면, 세포 내에서 RNAi를 촉진시키는 능력이 유의하게 억제되지 않는 한, 본 발명의 핵산을 변형시키기 위해 본원에 개시된 것과 유사한 변형법을 이용할 수 있다. 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트 및/또는 5'-메틸포스포네이트 연결을 갖는 올리고뉴클레오타이드 뉴클레오타이드간 연결의 화학적 변형이 안정성을 개선시키는 반면, 과도한 개질은 일부 독성 또는 감소된 활성을 야기할 수 있다. 따라서, 핵산 분자를 고안할 때, 이들 뉴클레오타이드간 연결의 양이 감소되어야만 한다. 이들 연결 농도의 감소는 독성을 감소시켜야만 하고, 이들 분자의 증가된 효율 및 더 높은 특이성을 야기해야만 한다.
본 발명의 핵산은 또한 당 분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 라벨링될 수 있다; 예를 들면, 핵산은 형광단, 예를 들면 Cy3, 플루오레세인 또는 로다민을 이용하여 라벨링될 수 있다. 라벨링은 키트, 예를 들면 사일런서(SILENCER)TM siRNA 라벨링 키트(암비온(Ambion))를 이용하여 수행될 수 있다. 또한, 핵산은 예를 들면 3H, 32P 또는 다른 적절한 동위원소를 이용하여 방사성라벨링될 수 있다.
"RNA"란 하나 이상의 라이보뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 분자를 의미한다. "라이보뉴클레오타이드"란 β-D-라이보-푸라노스 잔기의 2' 위치에서 하이드록실 기를 갖는 뉴클레오타이드를 의미한다. 용어는 이중 가닥 RNA, 단일 가닥 RNA, 단리된 RNA, 예를 들면 부분적으로 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 재조합 생성된 RNA, 및/또한 하나 이상의 뉴클레오타이드의 첨가, 결실, 치환 및/또는 변형에 의해 천연 RNA와 상이한 변형된 RNA를 포함한다. 이런 변형은 비-뉴클레오타이드 물질을 siRNA의 단부에 첨가하거나, 또는 내부적으로 예를 들면 RNA의 하나 이상의 뉴클레오타이드에 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 RNA 분자에서의 뉴클레오타이드는 또한 비-표준 뉴클레오타이드, 예를 들면 비-천연 뉴클레오타이드 또는 화학적으로 합성된 뉴클레오타이드 또는 데옥시뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 이들 변형된 RNA 분자는 천연 RNA의 유사체 또는 유사 RNA로서 언급될 수 있다.
"센스 영역"은 핵산의 안티센스 영역에 대해 상보성을 갖는 핵산의 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 또한, 핵산의 센스 영역은 표적 핵산 서열과 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
"안티센스 영역"은 핵산의 센스 영역에 대해 상보성을 갖는 핵산의 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 또한, 핵산의 안티센스 영역은 표적 핵산 서열과 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
본원에서 이용되는 용어 "복합체를 형성한"은 비-공유 결합을 통해 매개되는 2개의 분자 사이의 상호작용을 의미한다. 다음과 같은 4가지 주된 유형의 비-공유 결합이 있다: 수소 결합, 이온 상호작용, 반 데르 발스 상호작용 및 소수성 결합. 양전하 PDT는 응집체, 나노입자 또는 용해성 복합체로서 음전하 핵산과 복합체를 형성하는 비-공유 정전기적 복합체를 형성할 수 있다.
본원에서 이용되는 용어 "컨쥬게이트를 형성한"은 공유 결합을 통해 매개되는 2개의 분자 사이의 상호작용을 의미한다. 공유 결합은 일반적으로 안정하다. 공유 결합의 예는 다이설파이드 결합 또는 아미드 결합을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다. 그러나, 매우 다양한 공유 결합이 적용가능하도록 광범위하게 다양한 작용기(예를 들면 에스터 결합, 카바메이트 결합, 설포네이트 결합, 티오에스터 결합 또는 티오에터 결합)를 이용할 수 있다는 것은 당 분야의 숙련자들에게 명확할 것이다. 공유 결합은 센스 가닥, 안티센스 가닥중 어느 하나, 또는 화학적으로 개질된 핵산 분자의 양 가닥 모두의 3'-말단, 5'-말단 또는 3'-말단과 5'-말단 둘 모두에 존재할 수 있다.
본원에서 이용되는 바와 같은 용어 "다량체 PTD"는 하나 이상의 도메인, 및 도메인 사이의 연결기를 함유하는 펩타이드 쇄를 의미한다. 본 발명의 다량체 펩타이드의 도메인은 동일하여 동종 다량체를 형성하거나, 서로 상이하여 이종 다량체를 형성할 수 있다. 동종- 또는 이종-다량체는 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체 또는 그 이상의 다량체를 포함할 수 있다. 전형적으로, 연결기는 1 내지 5개의 아미노산, 및 이에 이어서 다른 단량체와의 가교결합을 허용하는 아미노산 잔기, 예를 들면 시스테인 잔기로 구성된다. 비록 시스테인 잔사가 2개의 펩타이드 분자사이에 다이설파이드 가교를 형성할 수 있어 바람직하지만, 펩타이드 쇄를 다량체화시키는 다른 수단이 당분야의 숙련자들에게 공지되어 있다. 예를 들면, 시스테인 잔기 대신에, 화학적으로 가교결합될 수 있는 아미노산 잔기 또는 다른 화학적 실재, 예를 들면 인공 아미노산이 포함될 수 있다(예를 들면 당 잔기에 대해서는 본원에 참고로 인용된 [Marcaurelle et al ., Tetrahedron Lett . 39:8417-8420 (1998)] 참고).
"표적 유전자"는 그의 발현이 선택적으로 억제되거나 침묵되는 유전자이다. 이러한 침묵은 표적 유전자의 mRNA의 분해를 촉진시키거나, 표적 유전자의 mRNA의 번역을 억제함으로써 달성될 수 있다. 분해 또는 번역 억제는 shRNA, 안티센스 RNA, miRNA, siRNA, 유전자조작된 RNA 전구체, 혼성 이중 가닥 핵산 또는 원형 RNA 및 표적 유전자의 mRNA 사이의 결합에 의해 유도될 수 있다. 이들 언급된 분자의 일부 또는 절편은 표적 유전자의 mRNA의 일부, 예를 들면 약 16 내지 40개 뉴클레오타이드에 실질적으로 상보적인 안티센스 가닥이다. 유전학 또는 서열규명에 의해 이전에 확인된 임의의 유전자가 표적을 나타낼 수 있다. 표적 유전자는 대사적 또는 구조적 유전자 또는 효소를 인코딩하는 유전자뿐 아니라 발생 유전자 및 조절 유전자를 포함할 수 있다. 표적 유전자는 직접적 또는 간접적으로 표현형 특성에 영향을 미치는 방식으로 유기체 또는 표현형이 조사되는 세포에서 발현될 수 있다. 조절 유전자 또는 천연 단백질을 코딩하는 유전자의 경우에서처럼, 본 발명의 표적 유전자는 세포에 내인성인 유전자일 수 있고; 다르게는, 바이러스 또는 박테리아 유전자, 트랜스포손 또는 트랜스유전자의 경우에서처럼, 표적 유전자가 세포에 대해 이종성 또는 외인성일 수 있다. 어느 경우에서든, 표적 유전자의 억제되지 않은 발현이 질병 또는 질환을 야기할 수 있다.
2개의 핵산과 관련하여 문구 "실질적으로 동일한"은, 하기에 예시된 것들과 같은 서열 비교 알고리듬을 이용하여 측정하거나, 시각적 검사에 의해 측정하였을 때, 최대 상응도에 대해 비교하여 정렬하였을 때, 75% 이상, 바람직하게는 80% 또는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 두개 이상의 서열 또는 하부서열을 의미한다. 바람직하게는, 적어도 약 16 내지 40개 뉴클레오타이드 길이, 또는 40 내지 60개 뉴클레오타이드 길이, 다른 양태에서는 적어도 60 내지 80 뉴클레오타이드 길이에 걸친 영역에서, 또다른 양태에서는 적어도 90 내지 100개 뉴클레오타이드 길이에 걸치 영역에서 실질적인 동일성이 존재하고, 또다른 양태에서는 비교되는 서열의 전체 길이, 예를 들면 뉴클레오타이드의 코딩 영역에 걸쳐 서열이 실질적으로 동일하다.
본원에서 이용되는 용어 "실질적으로 상보성인"은 특정한 혼성화 조건 하에서 혼성화되는 충분히 상보적인 2개의 서열로서 정의된다. 본 발명에서는 높은 엄격성, 중간 엄격성 및 낮은 엄격성 조건을 비롯한 다양한 혼성화 조건이 이용될 수 있다. 높은 엄격성 조건은 당 분야에 공지되어 있고, 예를 들면 [Maniatis et al ., Molecular Cloning : A Laboratory Manual , 2 nd Edition (1989)] 및 [Ausubel et al ., Short Protocols in Molecular Biology (1989)]을 참고할 수 있고, 이들 둘 모두 본원에 참고로 혼입되어 있다. 일반적으로 높은 엄격성 조건은 한정된 이온 강도 pH에서 특정한 서열에 대한 열 융점(Tm)에 비해 약 5 내지 10℃ 더 낮도록 선택된다. Tm은 (한정된 이온 강도, pH 및 핵산 농도 하에서) 표적 서열과 상보적인 프로브의 50%가 평형에서 표적 서열에 혼성화되는 온도이다. (표적 서열이 Tm에서 과량으로 존재하므로 프로브의 50%가 평형 상태에서 점유된다) 높은 엄격성 조건은 pH 7.0 내지 8.3에서 염 농도가 약 1.0M 나트륨 이온 미만, 전형적으로 약 0.01 내지 1.0M 나트륨 이온 농도(또는 다른 염)이고, 온도가 짧은 프로브(예를 들면 10 내지 50 뉴클레오타이드)의 경우 약 30℃ 이상이고, 긴 프로브(예를 들면 50 뉴클레오타이드 초과)의 경우 약 60℃ 이상인 것들이다. 높은 엄격성 조건은 또한 포름아미드와 같은 탈안정화제를 첨가하여 달성될 수 있다. 당 분야에 공지된 바와 같이, 중간 또는 낮은 엄격성 조건 또한 이용될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 개시되어 있고, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위해개시되어 있으며, 하기 특허청구범위에 한정된 바와 같은 본 발명의 범위를 어떤 방식으로든 한정하고자 하지 않는다.
실시예
실시예 1
다량체 PTD 의 화학적 합성
펩타이드 자동 합성기(아리조나주 투손 소재의 심포니 PTI)를 이용하여 2-클로로트라이틸 수지를 이용한 표준 단계별 플루오렌-9-일 메톡시카보닐(Fmoc) 고형 상 방법에 따라 펩타이드를 합성하였다. Fmoc 아미노산을 0.2M 1-메틸-2-피롤리돈(NMP) 용액에 저장하였다. 커플링제(DIC, HOBt)를 0.2M NMP 용액에 미리 용해시켰다. 모든 Fmoc 아미노산은 커플링제의 5배 과량이었다. 커플링 시간은 30분이었다. Fmoc 탈보호는 NMP 용액중의 20% 피페리딘을 이용하여 수행되었다. 트라이플루오로아세트산(TFA)/H2O(95:5 v/v)을 이용하여 3시간동안 아미노산 측쇄의 수지로부터 펩타이드를 분해시켰다. 수지를 TFA로 세척하고, 여과액을 부분적으로 증발시켰다. 조질 생성물을 다이에틸 에터로 침전시키고, 원심분리에 의해 수집하고, H2O에 용해시키고, 동결건조시켰다. UV 검출기(230nm)가 구비된 SCL-10A VP 시마츠 장치 상의 시마츠 심-팩(Shimadzu Shim-pack) C18 컬럼 (250x0.6 mm, 5㎛, 100Å, 유속: 1ml/분) 상에서 RP-HPLC를 이용하여 펩타이드를 분석하고, 정제하였다. 이렇게 제조된 다량체 PTD의 아미노산 서열은 하기와 같다:
화학적으로 합성된 MPH-1-PTD 단량체: YARVRRRGPRR(C) (서열 번호:15);
화학적으로 합성된 MPH-1-PTD 이량체 a: YARVRRRGPRRGGYARVRRRGPRRGG(C) (서열번호:16);
화학적으로 합성된 MPH-1-PTD 이량체 b: CGGYARVRRRGPRRGGYARVRRRGPRRGG(C) (서열번호:17); 및
화학적으로 합성된 MPH-1-PTD 삼량체:
YARVRRRGPRRGYARVRRRGPRRGYARVRRRGPRRG(C) (서열번호:18).
실시예 2
재조합 다량체 PTD 및/또는 스페이서-혼입된 PTD - 용해성 발현
다량체 PTD의 화학적 합성이 상대적으로 단순한 공정이지만, 화학적 합성에 의한 큰 다량체 PTD의 제조는 기술적 및 경제적 제한으로 인해 제한될 수 있다. 이러한 이유로, 이량체까지의 다량체는 재조합 단백질 기법과 조합된 화학적 합성을 통해 제조되었고, 사량체보다 큰 다량체 및 스페이서-혼입된 PTD는 재조합 단백질로서 제조되었다. 본 발명의 재조합 단백질의 발현을 위해 제조된 벡터는 도 2에 도시되어 있다.
PTD가 강한 양전하를 갖는 짧은 펩타이드이기 때문에, 이들은 단독으로 발현되면 쉽게 분해되는 경향이 있다. 따라서, 유비퀴틴(UB)과의 융합 단백질을 제조하고, 제조된 융합 단백질을 정제한 후, 유비퀴틴 프로테아제(UBP)를 이용하여 정제된 융합 단백질을 분해함으로써 다양한 PTD 및 스페이서-혼입된 PTD가 구축되었다(도 3에 도시되어 있음).
스페이서를 포함하는 다량체 PTD 및/또는 스페이서-혼입된 PTD는 N-말단 UB 융합 단백질 또는 비-융합 단백질로서 제조되었다. 스페이서로서 이용되는 UB가 UBP에 의해 분해될 수 있기 때문에 UB 스페이서의 카복실-말단 잔기인 Gly를 Val로 치환하여 UBP에 의한 분해를 방지하였다. 이 돌연변이된 도메인을 UB(v)로 나타낸다(도 2에 도시되어 있음). UB가 C-말단 형 PTD(2)UB에 위치하면, C-말단 UB가 UBP에 의해 분해될 수 없기 때문에 야생형 UB를 이용하였다.
종래의 열 쇼크 방법([Sambrook et al., Molecular cloning 2nd Ed.])에 따라 도 2 및 3의 플라스미드에 의해 이. 콜라이(BL21)를 형질전환시켰다. 재조합 단백질 발현은 IPTG의 첨가에 의해 유도되었다. 2 내지 8시간의 유도 후에, 세포를 원심분리에 의해 수확하고, 세포 펠렛을 적절한 용균 완충액으로 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 20분간 초음파처리하고, 원심분리에 의해 청정화시켰다. 재조합 단백질을 정제하기 위해서 상층액을 이온 교환 크로마토그래피 컬럼(SP FF, GE 헬쓰케어) 상에 부하하였다. PTD의 Arg 잔기가 중성 pH에서 양전하를 갖기 때문에, 재조합 단백질은 높은 pI 값을 갖는다. 따라서, 재조합 단백질은 SP FF 컬럼 상에서 높은 전도성에서 용출되지만, 대부분의 이. 콜라이 숙주 단백질은 그 높은 전도성에서 SP FF 수지에 결합되지 않았다. IEX 중의 선택된 N-말단 UB 융합 또는 비-융합 단백질을 더 높은 순도를 위해 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)을 이용하여 정제한 후, 동결건조시켰다.
UB-융합 단백질의 경우, 동결건조된 융합 단백질을 적절한 완충액에 재현탁시키고, UBP를 첨가하여 UB와 PTD 사이의 분해를 유도하였다. 후속적으로, 다량체 PTD 및/또는 스페이서-혼입된 PTD를 RP-HPLC를 이용하여 정제한 후, 동결건조하였다.
이렇게 제조된 다량체 PTD 및/또는 스페이서-혼입된 PTD의 아미노산 서열은 다음과 같다:
재조합 MPH-1-PTD 이량체: YRFYARVRRRGPRRGGARFYARVRRRGPRRGGARV(C) (서열번호:19);
재조합 MPH-1-PTD 사량체: YRFYARVRRRGPRRGGARFYARVRRRGPRRGGARFYARVRRRGPRRGGARFYARVRRRGPRRGGARV(C) (서열번호:20);
재조합 MPH-1-PTD 팔량체:
YRFYARVRRRGPRRGGARFYARVRRRGPRRGGARFYARVRRRGPRRGGARFYARVRRRGPRRGGYRFYARVRRRGPRRGGARFYARVRRRGPRRGGARFYARVRRRGPRRGGARFYARVRRRGPRRGGARV(C) (서열번호:21);
재조합 페너트라틴-UB(v) + MPH(2):
RQIKIWFQNRRMKWKKGGGQIFVKTLTGKTITLEVESSDTIDNVKSKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGVSRVYARVRRRGPRRGGARFYARVRRRGPRRGGARV(C) (서열번호:52);
재조합 페너트라틴-UB(v) + MPH(4):
RQIKIWFQNRRMKWKKGGGQIFVKTLTGKTITLEVESSDTIDNVKSKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGVSRVYARVRRRGPRRGGARFYARVRRRGPRRGGARFYARVRRRGPRRGGARFYARVRRRGPRRGGARV(C) (서열번호:58);
재조합 Sim-2-UB(v) +PTD(Hph-1)-(2):
AKAARQAARGGGQIFVKTLTGKTITLEVESSDTIDNVKSKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGVSRVYARVRRRGPRRGGARFYARVRRRGPRRGGARV(C) (서열번호:59);
재조합 Sim-2-UB(v) + PTD (Hph-1)- (4):
AKAARQAARGGGQIFVKTLTGKTITLEVESSDTIDNVKSKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGVSRVYARVRRRGPRRGGARFYARVRRRGPRRGGARFYARVRRRGPRRGGARFYARVRRRGPRRGGARV(C) (서열번호:60);
재조합 PTD(2)UB:
YARVRRRGPRRGGARFYARVRRRGPRRGGQIFVKTLTGKTITLEVESSDTIDNVKSKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGG (서열번호:44); 및
재조합　PTD(4)UB: YRFYARVRRRGPRRGGARFYARVRRRGPRRGGARFYARVRRRGPRRGGARFYARVRRRGPRRGGARVQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGG (서열번호:46).
실시예 3
컨쥬게이션에 의한 다량체 PTD의 확장
다량체 PTD의 크기를 증가시키기 위해, 다이설파이드 결합이 2개의 PTD 분자 사이에 형성될 수 있도록 시스테인 잔사를 PTD의 양쪽 말단 단부중 하나 또는 둘 모두에 위치시킨다. 예를 들면, 시스테인을 갖는 2개의 PTD 이량체를 다이설파이드 결합을 통해 연결시키면 사량체가 형성될 것이고, 이량체와 사량체를 연결시키면 육량체가 형성될 것이다(도 5 참조).
다이설파이드 결합의 도입은 pH 8 내지 11에서 저온에서 느리게 교반하는 공기 산화 방법을 이용하여 수행된다.
상기 방법을 이용하여 제조되는 다량체 PTD는 N-말단 서열규명 및 비행시간 매트릭스-보조된 레이저 탈착/이온화 질량 분광계(MALDI-TOF)에 의해 분석된다.
다량체 PTD의 강한 양전하는 음전하를 띠는 나트륨 도데실 설페이트와 복합체를 형성할 수 있고, 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 이용하여 최종 다량체 PTD 생성물을 분리시키는 것이 어려워진다. 또한, 다량체 PTD의 높은 pI 때문에 일반적인 PAGE 분석을 수행하기 어렵다. 이러한 이유로 인해, PAGE의 pH가 변화되고 전극이 역으로 연결된 후에 다량체 PTD의 PAGE 분석을 수행한다.
실시예 4
재조합 다량체 PTD - 불용성 발현
다량체 PTD는 이.콜라이에서 발현되었을 때 일부 독성을 나타내고, 이들은 또한 신속하게 분해되는 경향이 있다. 또한, 일부 PTD, 예를 들면 TAT-PTD 또는 MPH-1-PTD는 메티오닌을 함유하지 않는다. 따라서, 본 발명자는 융합 파트너와 다량체 PTD 사이에 메티오닌의 삽입을 포함하는 방법을 고안하였다. 또한, 본 발명자는 또한 다량체 PTD의 융합 파트너를 유비퀴틴 대신 쉽게 응집하는 단백질, 예를 들면 Src-류 어댑터 단백질(SLAP) 또는 제타-쇄-연관된 단백질 키나제(Zap70)로 대체함을 포함하는 방법을 고안하였다. 이들 융합은 응집되는 단백질이 봉입체에서 쉽게 축적되고, 따라서, 일반적으로 낮은 독성을 갖게 되므로 유용하다. 또한, 이들은 분해로부터 보호될 수 있고, 비교적 쉬운 방식으로 정제될 수 있다. 그러나, 봉입체는 온화한 생리학적 조건에서 용해되지 않는다. 봉입체를 용해시키기 위해서, 카오트로픽제, 예를 들면 우레아, 구아니딘, HCl, 세제를 이용할 수 있거나, 완충액 pH가 극한 범위이어야만 한다. 일반적으로, 생물학적 프로테아제는 이런 조건에서 활성일 수 없다. 따라서, 본 발명자는 화학적 분해를 택하였다. 시아노겐 브로마이드(CNBr)는 메티오닌 잔기의 카복실 말단 측면에서 특이적으로 펩타이드 결합을 절단한다. 많은 PTD가 메티오닌 잔사를 갖지 않기 때문에, CNBr을 갖는 융합 단백질의 분해가 다량체 PTD를 생성할 수 있도록 메티오닌이 PTD의 아미노 말단에 삽입될 수 있다(도 4).
예를 들면, UB 대신에 융합 파트너로서 SLAP를 이용함으로써 불용성 발현을 위해 실시예 2와 유사한 벡터가 제조되었다. SLAP 벡터의 구축은 실시예 2에 개시된 바와 같이 수행되었다. 세포의 발효, 유도, 수확, 및 용균은 실시예 2에 개시된 바와 같이 수행되었다. 용균 후, 세포 현탁액을 원심분리하고, 현탁액을 버렸다. 남아있는 봉입체를 8M 우레아 완충액에 용해시킨 후, IEX(SP FF, GE 헬쓰케어)로 정제하였다. HCl을 0.3 내지 1M 범위의 정제된 융합-단백질의 분획에 첨가하였다. 분해를 위해 CNBr을 첨가하고, 용액을 12시간동안 어두운 곳에서 실온에서 항온배양하였다. CNBr을 이용하여 분해시킨 후, 다량체 PTD를 실시예 2에 개시된 것과 동일한 방식으로 RP-HPLC를 이용하여 정제한 후, 동결건조시켰다. SLAP은 여러 개의 메티오닌 잔기를 갖기 때문에, CNBr을 이용하여 융합 단백질을 분해시키면, UB-융합 단백질에서의 단지 2개의 피크가 나타난 점에 비해, RP-HPLC의 크로마토그램에서 많은 피크를 나타내는 여러 절편을 생성하였다.
실시예 5
핵산-다량체 PTD 복합체의 생산
PTD 및 핵산은 이들 사이의 안정한 비-공유 결합의 형성을 통해 복합체를 형성할 수 있다(도 1). 핵산-다량체 PTD 복합체를 형성하기 위해서, 핵산과 다량체 PTD를 한정된 비율로 혼합시켰다. 과량의 다량체 PTD가 불용성 응집체의 형성을 야기할 수 있기 때문에, 이 비가 중요할 수 있다. 이와는 대조적으로, 과량의 핵산은 복합체의 전달 효율을 감소시킬 수 있다. 이는 하기 실험에 의해 입증되었다.
사량체 PTD 및 siRNA를 동결건조된 분말로 제조하였다. 사량체 PTD를 2xPBS 용액에 용해시키고, siRNA를 탈이온수(D.W.)에 용해시켰다. PTD 및 siRNA의 농도는 1μM이었다. 실시예 2의 사량체 PTD를 100㎕의 GAPDH siRNA 용액을 함유하는 마이크로퓨즈 튜브에 100, 150, 200, 400, 700 또는 1000㎕의 양으로 첨가하였다. 튜브의 내용물을 완전히 혼합하고, 실온에서 20분간 정치되게 두었다. 각각의 혼합물을 FACS 기계를 이용하여 형질도입 효율에 대해 분석하였다. 결과를 도 9에 나타낸다. 혼합물은 응집되었고, PTD의 양이 100㎕의 siRNA 당 700㎕이었을 때 혼탁도를 나타내었다. 따라서, 핵산의 효율적인 전달은 1:1 내지 7:1의 PTD:siRNA의 비를 이용하여 발생할 수 있다. 특히, 효율적인 전달은 3:1의 PTD:siRNA 비를 이용하여 달성될 수 있다. 최소한의 단백질 응집 및 핵산의 효율적인 전달은 2:1의 PTD:siRNA 비를 이용하여 나타났다.
실시예 6
핵산-다량체 PTD 및/또는 스페이서-혼입된 PTD 컨쥬게이트의 생산
실시예 4에서 다량체 PTD를 확대시키는 방법과 유사하게, 티올 기(-SH)를 핵산의 5' 말단에 도입하여 다량체 PTD 및/또는 스페이서-혼입된 PTD의 말단 단부에서 시스테인 잔사와 컨쥬게이트를 형성할 수 있게 한다. 실시예 2에 개시된 공기 산화 방법을 이용하여 컨쥬게이트 형성을 수행한다.
다량체 PTD 및/또는 스페이서-혼입된 PTD와 핵산을 컨쥬게이트 하는데 다른 화학적 결합이 또한 이용될 수 있다. 예를 들면, 핵산에 알데하이드를 도입하면 펩타이드의 아민 기와의 컨쥬게이트를 야기할 수 있다. 핵산에 카복실기를 도입하면 펩타이드 중의 아민 기와 아미드 결합을 형성하게 할 수 있다(도 6 참조).
실시예 7
siRNA의 다량체 PTD 및/또는 스페이서-혼입된 PTD-매개된 세포내 전달
siRNA의 세포내 전달을 매개하는 다량체 PTD 및/또는 스페이서-혼입된 PTD의 능력을 평가하였다. 이들 실험에서, siRNA는 다량체 PTD 및/또는 스페이서-혼입된 PTD, 예를 들면 스페이서가 있는 MPH-1 이량체(서열번호: 44 내지 47), MPH-1 단량체(서열번호: 15), MPH-1 이량체(서열번호: 19) 또는 MPH-1 사량체(서열번호:20)와 복합체를 형성하였다. MPH-1 단량체를 화학적으로 합성하였다. 이량체 및 사량체를 실시예 2에 개시된 바와 같이 재조합 생산하였다. 세포내 siRNA를 정량하기 위해서 RNA의 한 가닥을 형광 물질인 카복시플루오레세인(FAM)으로 라벨링하였다. 다량체 PTD 및/또는 스페이서-혼입된 PTD와 복합체를 형성한 siRNA를 동결건조된 분말로서 제조하였다. 각각의 다량체 PTD 및/또는 스페이서-혼입된 PTD를 2xPBS 용액에 용해시키고, siRNA를 탈이온수에 용해시켰다. siRNA의 농도는 1μM이었다. 단량체, 이량체 및 사량체 PTD 및 스페이서-혼입된 PTD의 농도는 각각 4μM, 2μM 및 1μM이었다. 서로 다른 PTD 다량체 사이의 농도 차이는 서로 다른 전하 비를 보상하도록 고안되었다. 스페이서-혼입된 PTD의 경우, 단백질의 농도는 실험 디자인에 의존한다. siRNA 용액 및 PTD 용액을 동일한 부피로 혼합하였다. 혼합물 중의 siRNA의 최종 농도는 100nM이었다.
siRNA-다량체 PTD 복합체를 HeLa 세포 배양액에 도입하였다. CO2 인큐베이터에서 0.5 내지 2시간동안 항온배양한 후, 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 3회 세척하고, 고무 스크래퍼를 이용하여 1ml의 PBS에 수집하였다. 수집된 세포를 원심분리시켰다. 상층액을 버리고, 세포를 1ml의 PBS에 재현탁시켰다. 이 세척 단계를 3회 반복하였다.
세척한 후, siRNA의 전달 효율을 형광-활성화된 세포-분류(FACS)를 이용하여 분석하였다. 결과를 도 7 및 8에 나타낸다. 도 8은 530/30 필터(FL-1H)에 대한 형광 강도의 높이를 나타낸다.
예상된 바와 같이, 단량체 PTD의 전달 효율은 낮았다. 이는 형질도입 단위로서 PTD의 기능 손실을 야기하는 siRNA와 단량체 PTD의 상호작용으로 인한 것일 수 있다. 이량체 PTD는 중간 효율을 나타내었고, 사량체 PTD는 가장 높은 효율을 나타내었다. 이들 결과는 siRNA의 전달 효율이 PTD 다량체 중의 PTD의 수에 비례하여 증가하였음을 입증한다. 이는 효율이 형질도입 단위로서 작용할 수 있게 하는 유리 PTD에 기인한 것일 수 있음을 나타낸다.
스페이서-혼입된 PTD의 경우, 모든 시료가 높은 형질도입 효율을 나타내었다.
실시예 8
세포로 전달되는 siRNA의 활성
PTD-전달되는 siRNA의 활성을 또한 평가하였다. 이들 실험에서, 실시예 7에 개시된 바와 같은 사량체 MPH-1 PTD(서열번호: 20) 및 스페이서-혼입된 PTD(서열번호: 43 내지 60)을 이용하였다. 사량체 PTD는 글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH) siRNA와 복합체를 형성하였다. 복합체를 HeLa 세포로 형질감염시키고, GAPDH 발현에 대한 효과를 조사하였다. GAPDH 효소 활성을 측정함으로써 GAPDH 발현 수준을 평가하였다.
스페이서-혼입된 단백질은 인간-단백질-키나제 C a-아단위(PKCA)를 목표로하여 siRNA와 복합체를 형성하였다. 복합체를 HeLa 세포로 형질감염시키고, PKCA의 mRNA 수준에 미치는 효과를 조사하였다. PKCA의 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR로 측정하였다. 혼합물을 배양된 DMEM 배지를 갖는 HeLa 세포로 도입하였다. 2시간 후, 세포를 신선한 배지로 3회 세척하였다. 세척 후, 신선한 배지를 세포에 다시 첨가하고, 세포를 24시간동안 배양하였다. 24시간의 배양 후, 트라이졸(Trizol, 등록상표)(캘리포니아 칼스배드 소재의 인비트로겐(Invitrogen)) 장치 매뉴얼에 따라 RNA를 세포로부터 추출하였다. 장치 매뉴얼에 따라 하이 캐패서티 RNA 투 cDNA 키트(High capacity RNA to cDNA kit)(캘리포니아주 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems))를 이용하여 추출된 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 제조자의 장치 매뉴얼(어플라이드 바이오시스템스 7500 시스템)에 따라, 합성된 cDNA를 주형으로 이용하여 qRT-PCR을 수행하였다. GAPDH의 mRNA 수준을 내부 보상을 위해 측정하였다.
도 10에 도시된 바와 같이 PKCA siRNA를 단독으로 도입하는 것은 PKCA의 mRNA 수준을 감소시키지 않았다. 그러나, PKCA siRNA가 스페이서-혼입된 PTD와 복합체를 형성하면, PKCA의 mRNA 수준이 모든 시료에서 감소하였다. 이 자료는 스페이서-혼입된 PTD에 의해 전달되었을 때 siRNA가 억제 활성을 보유함을 입증하였다.
이들 실험에서, 사량체 PTD를 실시예 2에서와 같이 제조하고, 실시예 4에 개시된 것과 동일한 방식으로 siRNA와 혼합하였다. 혼합물을 배양된 DMEM 배지와 함께 HeLa 세포로 도입하였다. 2시간 후, 세포를 신선한 배지로 3회 세척하였다. 세척 후, 신선한 배지를 다시 세포에 첨가하고, GAPDH 활성을 KDalert(상표명: 앰비온(Ambion): 캘리포니아주 포스터시 소재의 어플라이드 바이오시스템스 제품) 장치 매뉴얼에 따라 분석하기 전에 이틀동안 세포를 배양하였다.
도 11에 도시된 바와 같이 GAPDH siRNA를 단독으로 도입하는 것은 GAPDH 활성을 감소시키지 않았다. 그러나, GAPDH siRNA가 사량체 PTD와 복합체를 형성하면, GAPDH 활성이 투여량 의존적 방식으로 감소되었다. 이 자료는 siRNA가 사량체 PTD에 의해 전달되었을 때 활성을 보유함을 입증한다.
실시예 9
DNA 벡터의 다량체 PTD-매개된 세포내 전달
다량체 PTD가 DNA 벡터를 HeLa 세포로 전달할 수 있는 능력 또한 평가되었다. 개선된 녹색 발광 단백질(EGFP)을 인코딩하는 벡터(pEGFP-N1(캘리포니아주 마운틴 뷰 소재의 클론텍(Clontech))을 이들 실험에 이용하였다.
사량체 PTD를 실시예 2에 개시된 바와 같이 제조하고, DNA 프렙 키트(위스콘신 매디슨 소재의 프로메가(Promega))를 이용하여 DNA 벡터를 제조하였다. PTD를 0.4mg/ml의 농도까지 2xPBS에 용해시켰다. 탈이온수를 이용하여 DNA의 농도를 0.1mg/ml까지 조절하였다. DNA 용액 및 PTD 용액을 동일한 체적으로 혼합하였다. 실온에서 30분의 항온처리 후, 20㎕의 혼합물을 6mm 배양 접시의 배지에 적가하였다. DNA 벡터를 세포로 형질도입한 후, EGFP의 발현이 허용되도록 세포를 48시간동안 배양하였다. DNA 벡터의 전달 효율을 측정하기 위해 EGFP의 형광을 FACS로 측정하였다. 양성 대조군으로서 이용하기 위해서, 리포펙타민 2000TM(캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐) 형질감염 시약을 이용하여 유사한 형질감염을 수행하였다.
도 12에 도시된 바와 같이, DNA 형질감염의 효율은 리포펙타민을 이용한 경우에 비해 사량체 PTD를 이용한 경우가 더 높았다. 도 12는 530/30필터(FL-1H)에 대한 형광 강도의 높이를 나타낸다.
<110> FORHUMANTECH CO. LTD. <120> Pharmaceutical Compositions and Methods for Delivering Nucleic Acids into Cells <130> PCA810081FHT <150> US 60/990,124 <151> 2007-11-26 <160> 60 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg 1 5 10 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 2 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Drosophila sp. <400> 3 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 4 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Cys Leu Ile Lys Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Leu Asn Ile Lys 1 5 10 15 Leu Leu Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Thr Trp Gly 20 25 <210> 5 <211> 34 <212> PRT <213> herpes simplex virus <400> 5 Asp Ala Ala Thr Ala Thr Arg Gly Arg Ser Ala Ala Ser Arg Pro Thr 1 5 10 15 Glu Arg Pro Arg Ala Pro Ala Arg Ser Ala Ser Arg Pro Arg Arg Pro 20 25 30 Val Glu <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 7 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic MPH <400> 7 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly Tyr Ala Arg 1 5 10 15 Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg 20 <210> 8 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro 1 5 10 15 Ala Ala Ala Asp Gln Asn Gln Leu Met Pro 20 25 <210> 9 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val 20 <210> 10 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Lys Glu Thr Trp Phe Glu Thr Trp Phe Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val 20 <210> 11 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Tyr Gly Phe Lys Lys Phe Arg Lys Pro Trp Thr Trp Trp Glu Thr Trp 1 5 10 15 Trp Thr Glu <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ala Lys Ala Ala Arg Gln Ala Ala Arg 1 5 <210> 13 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic MPG <400> 13 Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly 1 5 10 15 Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 20 25 <210> 14 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic KALA <400> 14 Trp Glu Ala Lys Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys His 1 5 10 15 Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Lys Ala Cys Glu Ala 20 25 30 <210> 15 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic MPH-1-PTD monomer <400> 15 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Cys 1 5 10 <210> 16 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic MPH-1-PTD dimer a <400> 16 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly Tyr Ala Arg 1 5 10 15 Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly Cys 20 25 <210> 17 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic MPH-1-PTD dimer b <400> 17 Cys Gly Gly Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly 1 5 10 15 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly Cys 20 25 30 <210> 18 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic MPH-1-PTD trimer <400> 18 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Tyr Ala Arg Val 1 5 10 15 Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly 20 25 30 Pro Arg Arg Gly Cys 35 <210> 19 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic recombinant MPH-1-PTD dimer <400> 19 Tyr Arg Phe Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly 1 5 10 15 Ala Arg Phe Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly 20 25 30 Ala Arg Val Cys 35 <210> 20 <211> 68 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic recombinant MPH-1-PTD tetramer <400> 20 Tyr Arg Phe Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly 1 5 10 15 Ala Arg Phe Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly 20 25 30 Ala Arg Phe Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly 35 40 45 Ala Arg Phe Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly 50 55 60 Ala Arg Val Cys 65 <210> 21 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic recombinant MPH-1-PTD octamer <400> 21 Tyr Arg Phe Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly 1 5 10 15 Ala Arg Phe Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly 20 25 30 Ala Arg Phe Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly 35 40 45 Ala Arg Phe Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly 50 55 60 Tyr Arg Phe Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly 65 70 75 80 Ala Arg Phe Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly 85 90 95 Ala Arg Phe Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly 100 105 110 Ala Arg Phe Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly 115 120 125 Ala Arg Val Cys 130 <210> 22 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic TAT (homodimer) <400> 22 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly Tyr Gly Arg 1 5 10 15 Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 20 <210> 23 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic penetratin (homodimer) <400> 23 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 Gly Gly Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp 20 25 30 Lys Lys <210> 24 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Pep-1 (homodimer) <400> 24 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val Gly Gly Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp 20 25 30 Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 35 40 <210> 25 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic MPH + TAT <400> 25 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly Tyr Gly Arg 1 5 10 15 Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 20 <210> 26 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic MPH + penetratin <400> 26 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly Arg Gln Ile 1 5 10 15 Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 20 25 <210> 27 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic MPH + Pep-1 <400> 27 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly Lys Glu Thr 1 5 10 15 Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg 20 25 30 Lys Val <210> 28 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic TAT + penetratin <400> 28 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly Arg Gln Ile 1 5 10 15 Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 20 25 <210> 29 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic TAT + Pep-1 <400> 29 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly Lys Glu Thr 1 5 10 15 Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg 20 25 30 Lys Val <210> 30 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic penetratin + Pep-1 <400> 30 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 Gly Gly Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln 20 25 30 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 35 <210> 31 <211> 68 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic TAT (homotetramer) <400> 31 Tyr Arg Phe Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly 1 5 10 15 Ala Arg Phe Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly 20 25 30 Ala Arg Phe Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly 35 40 45 Ala Arg Phe Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly 50 55 60 Ala Arg Val Cys 65 <210> 32 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic penetratin (homotetramer) <400> 32 Tyr Arg Phe Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys 1 5 10 15 Trp Lys Lys Gly Gly Ala Arg Phe Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln 20 25 30 Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Gly Gly Ala Arg Phe Arg Gln Ile 35 40 45 Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Gly Gly Ala 50 55 60 Arg Phe Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp 65 70 75 80 Lys Lys Gly Gly Ala Arg Val Cys 85 <210> 33 <211> 68 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic MPH + TAT (heterotetramer) <400> 33 Tyr Arg Phe Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly 1 5 10 15 Ala Arg Phe Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly 20 25 30 Ala Arg Phe Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly 35 40 45 Ala Arg Phe Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly 50 55 60 Ala Arg Val Cys 65 <210> 34 <211> 78 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic MPH + penetratin (heterotetramer) <400> 34 Tyr Arg Phe Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly 1 5 10 15 Ala Arg Phe Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly 20 25 30 Ala Arg Phe Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys 35 40 45 Trp Lys Lys Gly Gly Ala Arg Phe Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln 50 55 60 Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Gly Gly Ala Arg Val Cys 65 70 75 <210> 35 <211> 78 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic TAT + penetratin (heterotetramer) <400> 35 Tyr Arg Phe Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly 1 5 10 15 Ala Arg Phe Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly 20 25 30 Ala Arg Phe Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys 35 40 45 Trp Lys Lys Gly Gly Ala Arg Phe Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln 50 55 60 Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Gly Gly Ala Arg Val Cys 65 70 75 <210> 36 <211> 73 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic MPH + TAT + penetratin (heterotetramer) <400> 36 Tyr Arg Phe Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly 1 5 10 15 Ala Arg Phe Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly 20 25 30 Ala Arg Phe Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly 35 40 45 Ala Arg Phe Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys 50 55 60 Trp Lys Lys Gly Gly Ala Arg Val Cys 65 70 <210> 37 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic MPH (homohexamer) <400> 37 Tyr Arg Phe Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly 1 5 10 15 Ala Arg Phe Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly 20 25 30 Ala Arg Phe Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly 35 40 45 Ala Arg Phe Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly 50 55 60 Ala Arg Phe Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly 65 70 75 80 Ala Arg Phe Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly 85 90 95 Ala Arg Val Cys 100 <210> 38 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic TAT (homohexamer) <400> 38 Tyr Arg Phe Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly 1 5 10 15 Ala Arg Phe Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly 20 25 30 Ala Arg Phe Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly 35 40 45 Ala Arg Phe Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Tyr Gly 50 55 60 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly Ala Arg Phe Tyr Gly 65 70 75 80 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly Ala Arg Phe Gly Gly 85 90 95 Ala Arg Val Cys 100 <210> 39 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic penetratin (homohexamer) <400> 39 Tyr Arg Phe Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys 1 5 10 15 Trp Lys Lys Gly Gly Ala Arg Phe Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln 20 25 30 Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Gly Gly Ala Arg Phe Arg Gln Ile 35 40 45 Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Gly Gly Ala 50 55 60 Arg Phe Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp 65 70 75 80 Lys Lys Gly Gly Ala Arg Phe Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn 85 90 95 Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Gly Gly Ala Arg Phe Arg Gln Ile Lys 100 105 110 Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Gly Gly Ala Arg 115 120 125 Val Cys 130 <210> 40 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic MPH + TAT + MPH (heterohexamer) <400> 40 Tyr Arg Phe Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly 1 5 10 15 Ala Arg Phe Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly 20 25 30 Ala Arg Phe Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly 35 40 45 Ala Arg Phe Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly 50 55 60 Ala Arg Phe Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly 65 70 75 80 Ala Arg Phe Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly 85 90 95 Ala Arg Val Cys 100 <210> 41 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic MPH + TAT + penetratin (heterohexamer) <400> 41 Tyr Arg Phe Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly 1 5 10 15 Ala Arg Phe Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly 20 25 30 Ala Arg Phe Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly 35 40 45 Ala Arg Phe Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly 50 55 60 Ala Arg Phe Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys 65 70 75 80 Trp Lys Lys Gly Gly Ala Arg Phe Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln 85 90 95 Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Gly Gly Ala Arg Val Cys 100 105 110 <210> 42 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic MPH + penetratin + MPH (heterohexamer) <400> 42 Tyr Arg Phe Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly 1 5 10 15 Ala Arg Phe Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly 20 25 30 Ala Arg Phe Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys 35 40 45 Trp Lys Lys Gly Gly Ala Arg Phe Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln 50 55 60 Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Gly Gly Ala Arg Phe Tyr Ala Arg 65 70 75 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Gln Leu Glu Asp 50 55 60 Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His 65 70 75 80 Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Val Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln 85 90 95 Arg Arg Arg <210> 55 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Sim-2 + MPH - Ub <400> 55 Ala Lys Ala Ala Arg Gln Ala Ala Arg Gly Gly Gly Gln Ile Phe Val 1 5 10 15 Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Ser Ser Asp 20 25 30 Thr Ile Asp Asn Val Lys Ser Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro 35 40 45 Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly 50 55 60 Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu 65 70 75 80 Val Leu Arg Leu Arg Gly Val Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro 85 90 95 Arg Arg <210> 56 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic penetratin + MPH - Ub <400> 56 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 Gly Gly Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu 20 25 30 Glu Val Glu Ser Ser Asp Thr Ile Asp Asn Val Lys Ser Lys Ile Gln 35 40 45 Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly 50 55 60 Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys 65 70 75 80 Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Val Tyr Ala Arg 85 90 95 Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg 100 <210> 57 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic penetratin + MPH(2) dimer - Ub <400> 57 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 Gly Gly Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu 20 25 30 Glu Val Glu Ser Ser Asp Thr Ile Asp Asn Val Lys Ser Lys Ile Gln 35 40 45 Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly 50 55 60 Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys 65 70 75 80 Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Val Ser Arg Val 85 90 95 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly Ala Arg Phe 100 105 110 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly Ala Arg Val 115 120 125 Cys <210> 58 <211> 161 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic penetratin + MPH(4) tetramer - Ub <400> 58 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 Gly Gly Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu 20 25 30 Glu Val Glu Ser Ser Asp Thr Ile Asp Asn Val Lys Ser Lys Ile Gln 35 40 45 Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly 50 55 60 Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys 65 70 75 80 Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Val Ser Arg Val 85 90 95 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly Ala Arg Phe 100 105 110 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly Ala Arg Phe 115 120 125 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly Ala Arg Phe 130 135 140 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly Ala Arg Val 145 150 155 160 Cys <210> 59 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Sim-2-UB(v)-Hph-1(2) <400> 59 Ala Lys Ala Ala Arg Gln Ala Ala Arg Gly Gly Gly Gln Ile Phe Val 1 5 10 15 Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Ser Ser Asp 20 25 30 Thr Ile Asp Asn Val Lys Ser Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro 35 40 45 Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly 50 55 60 Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu 65 70 75 80 Val Leu Arg Leu Arg Gly Val Ser Arg Val Tyr Ala Arg Val Arg Arg 85 90 95 Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly Ala Arg Phe Tyr Ala Arg Val Arg Arg 100 105 110 Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly Ala Arg Val Cys 115 120 <210> 60 <211> 155 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Sim-2-UB(v)-Hph-1(4) <400> 60 Ala Lys Ala Ala Arg Gln Ala Ala Arg Gly Gly Gly Gln Ile Phe Val 1 5 10 15 Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Ser Ser Asp 20 25 30 Thr Ile Asp Asn Val Lys Ser Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro 35 40 45 Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly 50 55 60 Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu 65 70 75 80 Val Leu Arg Leu Arg Gly Val Ser Arg Val Tyr Ala Arg Val Arg Arg 85 90 95 Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly Ala Arg Phe Tyr Ala Arg Val Arg Arg 100 105 110 Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly Ala Arg Phe Tyr Ala Arg Val Arg Arg 115 120 125 Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly Ala Arg Phe Tyr Ala Arg Val Arg Arg 130 135 140 Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly Ala Arg Val Cys 145 150 155

Claims (58)

  1. 핵산 결합 분자와 복합체 또는 컨쥬게이트를 형성하는 핵산 서열을 포함하는 복합체 또는 컨쥬게이트로서, 여기서, 핵산 결합 분자가 하나 이상의 단백질-형질도입 도메인(PTD) 및 하나 이상의 스페이서를 포함하는 하나 이상의 스페이서-혼입된 PTD를 포함하고, 스페이서가 상기 핵산 서열에 결합하지 않는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는, 복합체 또는 컨쥬게이트.
  2. 제 1 항에 있어서,
    핵산 서열이 포스페이트 주쇄를 포함하는 단일 가닥 핵산인 복합체 또는 컨쥬게이트.
  3. 제 1 항에 있어서,
    스페이서-혼입된 PTD가 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 PTD를 포함하는 복합체 또는 컨쥬게이트.
  4. 제 1 항에 있어서,
    단일 가닥 핵산이 shRNA, 안티센스 RNA 및 cDNA로 구성된 군에서 선택되는 복합체 또는 컨쥬게이트.
  5. 제 1 항에 있어서,
    스페이서-혼입된 PTD가 동종다량체 PTD 및 이종다량체 PTD로 구성된 군에서 선택되는 복합체 또는 컨쥬게이트.
  6. 제 1 항에 있어서,
    PTD가 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 서열번호: 10, 서열번호: 11, 서열번호: 12, 서열번호: 13, 서열번호: 14, 서열번호: 15, 서열번호: 16, 서열번호: 17, 서열번호: 18, 서열번호: 19, 서열번호: 20, 서열번호: 21, 서열번호: 22, 서열번호: 23, 서열번호: 24, 서열번호: 25, 서열번호: 26, 서열번호: 27, 서열번호: 28, 서열번호: 29, 서열번호: 30, 서열번호: 31, 서열번호: 32, 서열번호: 33, 서열번호: 34, 서열번호: 35, 서열번호: 36, 서열번호: 37, 서열번호: 38, 서열번호: 39, 서열번호: 40, 서열번호: 41, 서열번호: 42, 및 분지된 폴리리신으로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 복합체 또는 컨쥬게이트.
  7. 제 1 항에 있어서,
    스페이서-혼입된 PTD가 서열번호: 43, 서열번호: 44, 서열번호: 45, 서열번호: 46, 서열번호: 47, 서열번호: 48, 서열번호: 49, 서열번호: 50, 서열번호: 51, 서열번호: 52, 서열번호: 53, 서열번호: 54, 서열번호: 55, 서열번호: 56, 서열번호: 57, 서열번호: 58, 서열번호: 59 및 서열번호: 60으로 구성된 군에서 선택된 서열을 포함하는 복합체 또는 컨쥬게이트.
  8. 제 1 항에 있어서,
    핵산 결합 분자가 하나 이상의 핵산 결합 영역을 추가로 포함하는 복합체 또는 컨쥬게이트.
  9. 제 8 항에 있어서,
    핵산 결합 영역이 양이온 물질을 포함하는 복합체 또는 컨쥬게이트.
  10. 제 9 항에 있어서,
    양이온 물질이 폴리리신, 폴리아르기닌 및 폴리에틸렌이민으로 구성된 군에서 선택되는 복합체 또는 컨쥬게이트.
  11. 제 10 항에 있어서,
    폴리리신이 폴리-L-리신 및 폴리-D-리신으로 구성된 군에서 선택되는 복합체 또는 컨쥬게이트.
  12. 제 1 항에 있어서,
    핵산이 핵산 결합 분자와 복합체 또는 컨쥬게이트를 형성하여 나노입자를 형성하는 복합체 또는 컨쥬게이트.
  13. 제 1 항에 있어서,
    복합체 또는 컨쥬게이트가 가용성인 복합체 또는 컨쥬게이트.
  14. 제 1 항에 있어서,
    핵산이 이중 가닥 RNA이고, 가닥중 하나가 표적 유전자에 실질적으로 상보적인 복합체 또는 컨쥬게이트.
  15. 제 14 항에 있어서,
    이중 가닥 RNA 분자가 siRNA, miRNA, 유전자조작된 RNA 전구체 및 shRNA로 구성된 군에서 선택되는 복합체 또는 컨쥬게이트.
  16. 제 1 항에 있어서,
    핵산 서열이 이중 가닥 핵산인 복합체 또는 컨쥬게이트.
  17. 핵산 결합 분자와 복합체 또는 컨쥬게이트를 형성한 핵산을 포함하는 조성물로서, 핵산이 포스페이스 주쇄를 포함하는 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산이고, 핵산 결합 분자가 하나 이상의 PTD 및 하나 이상의 스페이서를 포함하는 하나 이상의 스페이서-혼입된 PTD를 포함하고, 상기 스페이서가 상기 핵산에 결합하지 않는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
  18. PTD가 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 서열번호: 10, 서열번호: 11, 서열번호: 12, 서열번호: 13, 서열번호: 14, 서열번호: 15, 서열번호: 16, 서열번호: 17, 서열번호: 18, 서열번호: 19, 서열번호: 20, 서열번호: 21, 서열번호: 22, 서열번호: 23, 서열번호: 24, 서열번호: 25, 서열번호: 26, 서열번호: 27, 서열번호: 28, 서열번호: 29, 서열번호: 30, 서열번호: 31, 서열번호: 32, 서열번호: 33, 서열번호: 34, 서열번호: 35, 서열번호: 36, 서열번호: 37, 서열번호: 38, 서열번호: 39, 서열번호: 40, 서열번호: 41, 서열번호: 42, 서열번호: 43, 서열번호: 44, 서열번호: 45, 서열번호: 46, 서열번호: 47, 서열번호: 48, 서열번호: 49, 서열번호: 50, 서열번호: 51, 서열번호: 52, 서열번호: 53, 서열번호: 54, 서열번호: 55, 서열번호: 56, 서열번호: 57, 서열번호: 58, 서열번호: 59 및 서열번호: 60 및 분지된 폴리리신으로 구성된 군에서 선택되는, 하나 이상의 스페이서-혼입된 PTD를 포함하는 핵산 결합 분자.
  19. 제 18 항에 있어서,
    단일 가닥 핵산에 결합하는 핵산 결합 분자.
  20. 제 19 항에 있어서,
    단일 가닥 핵산이 shRNA, 안티센스 RNA 및 cDNA로 구성된 군에서 선택되는 핵산 결합 분자.
  21. 제 18 항에 있어서,
    이중 가닥 핵산에 결합하는 핵산 결합 분자.
  22. 제 21 항에 있어서,
    이중 가닥 핵산이 이중 가닥 DNA 벡터, 이중 가닥 RNA, 혼성 이중 가닥 핵산 및 원형 RNA로 구성된 군에서 선택되는 핵산 결합 분자.
  23. 제 18 항에 있어서,
    하나 이상의 핵산 결합 영역을 추가로 포함하는 핵산 결합 분자.
  24. 제 23 항에 있어서,
    핵산 결합 영역이 양이온성 물질을 포함하는 핵산 결합 분자.
  25. 제 24 항에 있어서,
    양이온성 물질이 폴리리신, 폴리아르기닌 및 폴리에틸렌이민으로 구성된 군에서 선택되는 핵산 결합 분자.
  26. 제 25 항에 있어서,
    폴리리신이 폴리-L-리신 및 폴리-D-리신으로 구성된 군에서 선택되는 핵산 결합 분자.
  27. 제 18 항에 있어서,
    핵산이 핵산 결합 분자와 복합체 또는 컨쥬게이트를 형성하여 나노입자를 형성하는 핵산 결합 분자.
  28. 제 18 항에 있어서,
    복합체 또는 컨쥬게이트가 가용성인 핵산 결합 분자.
  29. (i) 재조합 단백질 생산 또는 합성 방법에 의해 핵산 결합 분자를 생성하는 단계; 및
    (ii) 핵산과 핵산 결합 분자를 혼합하여 복합체를 형성하는 단계를 포함하는, 제 18 항의 핵산 결합 분자와 복합체를 형성한 핵산을 생산하는 방법.
  30. 제 29 항에 있어서,
    복합체가 1:1 내지 4:1 비율로 핵산 결합 분자 및 핵산을 함유하는 방법.
  31. 제 30 항에 있어서,
    비가 2:1 내지 3:1인 방법.
  32. 제 31 항에 있어서,
    비가 2:1인 방법.
  33. 제 29 항에 있어서,
    핵산이 핵산 결합 분자와 복합체를 형성하여 나노입자를 형성하는 방법.
  34. 제 29 항에 있어서,
    핵산 결합 분자와 복합체를 형성한 핵산이 가용성인 방법.
  35. (i) 스페이서-혼입된 PTD를 포함하는 핵산 결합 분자와 복합체 또는 컨쥬게이트를 형성한 핵산을 생산하는 단계;
    (ii) 핵산 결합 분자와 복합체 또는 컨쥬게이트를 형성한 핵산을 세포 배양 배지에 첨가하는 단계; 및
    (iii) 세포 배양 배지를 배양하여 이에 의해 핵산이 세포에 전달되는 단계를 포함하는,
    핵산의 세포로의 전달을 용이하게 하는 방법.
  36. 제 35 항에 있어서,
    핵산이 단일 가닥 RNA, 이중 가닥 RNA, 단일 가닥 DNA 및 이중 가닥 DNA로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  37. (i) 제 2 항의 복합체 또는 컨쥬게이트를 세포 배양 배지로 첨가하는 단계;
    (ii) 표적 유전자의 발현을 억제하기에 충분한 양으로 복합체 또는 컨쥬게이트가 세포로 전달되도록 단계 (i)에서 준비된 세포 배양 배지를 배양하는 단계;
    (iii) 세포를 유지시키고, 세포 내에서 표적 유전자의 상응하는 mRNA가 분해되는 단계; 및
    (iv) 세포의 표현형을 관찰하고 적절한 대조군 세포와 비교하여, 표적 유전자의 세포 내에서의 기능에 대한 정보를 수집하는 단계
    를 포함하는, 세포 내에서 표적 유전자의 기능을 측정하는 방법.
  38. (i) 제 14 항의 복합체 또는 컨쥬게이트를 세포 배양 배지로 첨가하는 단계;
    (ii) 표적 유전자의 발현을 억제하기에 충분한 양으로 복합체 또는 컨쥬게이트가 세포로 전달되도록 단계 (i)에서 준비된 세포 배양 배지를 배양하는 단계;
    (iii) 세포를 유지시키고, 세포 내에서 표적 유전자의 상응하는 mRNA가 분해되는 단계; 및
    (iv) 세포의 표현형을 관찰하고 적절한 대조군 세포와 비교하여, 표적 유전자의 세포 내에서의 기능에 대한 정보를 수집하는 단계
    를 포함하는, 세포 내에서 표적 유전자의 기능을 측정하는 방법.
  39. (i) 제 16 항의 복합체 또는 컨쥬게이트를 세포 배양 배지로 첨가하는 단계;
    (ii) 표적 유전자의 발현을 억제하기에 충분한 양으로 복합체 또는 컨쥬게이트가 세포로 전달되도록 단계 (i)에서 준비된 세포 배양 배지를 배양하는 단계;
    (iii) 세포를 유지시키고, 세포 내에서 표적 유전자의 상응하는 mRNA가 분해되는 단계; 및
    (iv) 세포의 표현형을 관찰하고 적절한 대조군 세포와 비교하여, 표적 유전자의 세포 내에서의 기능에 대한 정보를 수집하는 단계
    를 포함하는, 세포 내에서 표적 유전자의 기능을 측정하는 방법.
  40. 핵산 결합 분자와 복합체 또는 컨쥬게이트를 형성하는 핵산을 포함하는 복합체 또는 컨쥬게이트로서, 핵산이 포스페이트 주쇄를 포함하는 단일 가닥 핵산이고, 핵산 결합 분자가 3 내지 10개의 PTD를 갖는 다량체 PTD를 포함하는, 복합체 또는 컨쥬게이트.
  41. 제 40 항에 있어서,
    단일 가닥 핵산이 shRNA, 안티센스 RNA 및 cDNA로 구성된 군에서 선택되는 복합체 또는 컨쥬게이트.
  42. 제 40 항에 있어서,
    다량체 PTD가 동종다량체 PTD 및 이종다량체 PTD로 구성된 군에서 선택되는 복합체 또는 컨쥬게이트.
  43. 제 42 항에 있어서,
    다량체 PTD가 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 서열번호: 10, 서열번호: 11, 서열번호: 12, 서열번호: 13, 서열번호: 14, 서열번호: 15, 서열번호: 16, 서열번호: 17, 서열번호: 18, 서열번호: 19, 서열번호: 20, 서열번호: 21, 서열번호: 22, 서열번호: 23, 서열번호: 24, 서열번호: 25, 서열번호: 26, 서열번호: 27, 서열번호: 28, 서열번호: 29, 서열번호: 30, 서열번호: 31, 서열번호: 32, 서열번호: 33, 서열번호: 34, 서열번호: 35, 서열번호: 36, 서열번호: 37, 서열번호: 38, 서열번호: 39, 서열번호: 40, 서열번호: 41, 서열번호: 42, 및 분지된 폴리리신으로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 복합체 또는 컨쥬게이트.
  44. 핵산 결합 분자와 복합체 또는 컨쥬게이트를 형성한 핵산을 포함하는 복합체 또는 컨쥬게이트로서, 핵산이 이중 가닥 RNA이고, 가닥중 하나가 표적 유전자에 실질적으로 상보적이고, 핵산 결합 분자가 2 내지 10개의 PTD를 갖는 다량체 PTD를 포함하는, 복합체 또는 컨쥬게이트.
  45. 제 44 항에 있어서,
    이중 가닥 RNA 분자가 siRNA, mRNA, 유전자 조작된 RNA 전구체 및 shRNA로 구성된 군에서 선택되는 복합체 또는 컨쥬게이트.
  46. 제 44 항에 있어서,
    다량체 PTD가 동종다량체 PTD 및 이종다량체 PTD로 구성된 군에서 선택되는 복합체 또는 컨쥬게이트.
  47. 제 46 항에 있어서,
    다량체 PTD가 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 서열번호: 10, 서열번호: 11, 서열번호: 12, 서열번호: 13, 서열번호: 14, 서열번호: 15, 서열번호: 16, 서열번호: 17, 서열번호: 18, 서열번호: 19, 서열번호: 20, 서열번호: 21, 서열번호: 22, 서열번호: 23, 서열번호: 24, 서열번호: 25, 서열번호: 26, 서열번호: 27, 서열번호: 28, 서열번호: 29, 서열번호: 30, 서열번호: 31, 서열번호: 32, 서열번호: 33, 서열번호: 34, 서열번호: 35, 서열번호: 36, 서열번호: 37, 서열번호: 38, 서열번호: 39, 서열번호: 40, 서열번호: 41, 서열번호: 42, 및 분지된 폴리리신으로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 복합체 또는 컨쥬게이트.
  48. 핵산 결합 분자와 복합체 또는 컨쥬게이트를 형성한 핵산을 포함하는 복합체 또는 컨쥬게이트로서, 핵산이 이중 가닥 핵산이고, 핵산 결합 분자가 5 내지 10개의 PTD를 갖는 다량체 PTD를 포함하는, 복합체 또는 컨쥬게이트.
  49. 제 48 항에 있어서,
    핵산이 이중 가닥 DNA 벡터, 이중 가닥 RNA, 혼성 이중 가닥 핵산 및 원형 RNA로 구성된 군에서 선택되는 복합체 또는 컨쥬게이트.
  50. 제 48 항에 있어서,
    다량체 PTD가 동종다량체 PTD 및 이종다량체 PTD로 구성된 군에서 선택되는 복합체 또는 컨쥬게이트.
  51. 제 50 항에 있어서,
    다량체 PTD가 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 서열번호: 10, 서열번호: 11, 서열번호: 12, 서열번호: 13, 서열번호: 14, 서열번호: 15, 서열번호: 16, 서열번호: 17, 서열번호: 18, 서열번호: 19, 서열번호: 20, 서열번호: 21, 서열번호: 22, 서열번호: 23, 서열번호: 24, 서열번호: 25, 서열번호: 26, 서열번호: 27, 서열번호: 28, 서열번호: 29, 서열번호: 30, 서열번호: 31, 서열번호: 32, 서열번호: 33, 서열번호: 34, 서열번호: 35, 서열번호: 36, 서열번호: 37, 서열번호: 38, 서열번호: 39, 서열번호: 40, 서열번호: 41, 서열번호: 42, 및 분지된 폴리리신으로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는, 복합체 또는 컨쥬게이트
  52. 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 서열번호: 10, 서열번호: 11, 서열번호: 12, 서열번호: 13, 서열번호: 14, 서열번호: 15, 서열번호: 16, 서열번호: 17, 서열번호: 18, 서열번호: 19, 서열번호: 20, 서열번호: 21, 서열번호: 22, 서열번호: 23, 서열번호: 24, 서열번호: 25, 서열번호: 26, 서열번호: 27, 서열번호: 28, 서열번호: 29, 서열번호: 30, 서열번호: 31, 서열번호: 32, 서열번호: 33, 서열번호: 34, 서열번호: 35, 서열번호: 36, 서열번호: 37, 서열번호: 38, 서열번호: 39, 서열번호: 40, 서열번호: 41, 서열번호: 42, 및 분지된 폴리리신으로 구성된 군에서 선택된 2개 이상의 PTD를 포함하는 다량체 PTD를 포함하는 핵산 결합 분자.
  53. 제 52 항에 있어서,
    단일 가닥 핵산에 결합하는 핵산 결합 분자.
  54. 제 52 항에 있어서,
    이중 가닥 핵산에 결합하는 핵산 결합 분자.
  55. (i) 제 1 항의 복합체 또는 컨쥬게이트를 세포 배양 배지로 첨가하는 단계;
    (ii) 표적 유전자의 발현을 억제하기에 충분한 양으로 복합체 또는 컨쥬게이트가 세포로 전달되도록 단계 (i)에서 준비된 세포 배양 배지를 배양하는 단계;
    (iii) 세포를 유지시키고, 세포 내에서 표적 유전자의 상응하는 mRNA가 분해되는 단계; 및
    (iv) 세포의 표현형을 관찰하고 적절한 대조군 세포와 비교하여, 표적 유전자의 세포 내에서의 기능에 대한 정보를 수집하는 단계
    를 포함하는, 세포 내에서 표적 유전자의 기능을 측정하는 방법.
  56. (i) 제 40 항의 복합체 또는 컨쥬게이트를 세포 배양 배지로 첨가하는 단계;
    (ii) 표적 유전자의 발현을 억제하기에 충분한 양으로 복합체 또는 컨쥬게이트가 세포로 전달되도록 단계 (i)에서 준비된 세포 배양 배지를 배양하는 단계;
    (iii) 세포를 유지시키고, 세포 내에서 표적 유전자의 상응하는 mRNA가 분해되는 단계; 및
    (iv) 세포의 표현형을 관찰하고 적절한 대조군 세포와 비교하여, 표적 유전자의 세포 내에서의 기능에 대한 정보를 수집하는 단계
    를 포함하는, 세포 내에서 표적 유전자의 기능을 측정하는 방법.
  57. (i) 제 44 항의 복합체 또는 컨쥬게이트를 세포 배양 배지로 첨가하는 단계;
    (ii) 표적 유전자의 발현을 억제하기에 충분한 양으로 복합체 또는 컨쥬게이트가 세포로 전달되도록 단계 (i)에서 준비된 세포 배양 배지를 배양하는 단계;
    (iii) 세포를 유지시키고, 세포 내에서 표적 유전자의 상응하는 mRNA가 분해되는 단계; 및
    (iv) 세포의 표현형을 관찰하고 적절한 대조군 세포와 비교하여, 표적 유전자의 세포 내에서의 기능에 대한 정보를 수집하는 단계
    를 포함하는, 세포 내에서 표적 유전자의 기능을 측정하는 방법.
  58. (i) 제 48 항의 복합체 또는 컨쥬게이트를 세포 배양 배지로 첨가하는 단계;
    (ii) 표적 유전자의 발현을 억제하기에 충분한 양으로 복합체 또는 컨쥬게이트가 세포로 전달되도록 단계 (i)에서 준비된 세포 배양 배지를 배양하는 단계;
    (iii) 세포를 유지시키고, 세포 내에서 표적 유전자의 상응하는 mRNA가 분해되는 단계; 및
    (iv) 세포의 표현형을 관찰하고 적절한 대조군 세포와 비교하여, 표적 유전자의 세포 내에서의 기능에 대한 정보를 수집하는 단계
    를 포함하는, 세포 내에서 표적 유전자의 기능을 측정하는 방법.
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7723299B2 (en) * 2005-11-04 2010-05-25 Forhumantech. Co., Ltd. Methods for treating rheumatoid arthritis using a CTLA-4 fusion protein
WO2011133112A1 (en) * 2010-04-20 2011-10-27 National University Of Singapore Cell penetrating peptide derived from the premembrane protein of flavivirus
US9801948B2 (en) 2011-09-21 2017-10-31 Yale University Antimicrobial compositions and methods of use thereof
CN103088065B (zh) * 2013-01-25 2014-12-10 北京银杏德济生物技术有限公司 一种能够大规模并快速高纯度地诱导间充质干细胞转决定成造血干细胞的方法
WO2017161043A1 (en) 2016-03-16 2017-09-21 The J. David Gladstone Institutes Methods and compositions for treating obesity and/or diabetes and for identifying candidate treatment agents
GR1010063B (el) * 2019-11-11 2021-08-20 Αριστοτελειο Πανεπιστημιο Θεσσαλονικης-Ειδικος Λογαριασμος Κονδυλιων Ερευνας Μεθοδος για την αναπτυξη μιας πλατφορμας για την παραγωγη δυναμενων για μεταφορα μεσω πεπτιδιου μεταγωγης (ptd), in vitro μεταγραφομενων (ivt) mrna θεραπευτικων
CN114644686B (zh) * 2022-03-24 2023-09-05 中国人民解放军陆军军医大学 一种用于dna疫苗递送系统及其应用和dna疫苗

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994000469A1 (en) * 1992-06-26 1994-01-06 Immunex Corporation Novel tyrosine kinase
US6103521A (en) * 1995-02-06 2000-08-15 Cell Genesys, Inc. Multispecific chimeric receptors
US6051429A (en) * 1995-06-07 2000-04-18 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced cationic lipid transfections
AU4328397A (en) 1996-08-23 1998-03-06 Chiron Corporation Human polyhomeotic 1 ((hph1)) acts as an oncogene
AU741546B2 (en) * 1997-07-24 2001-12-06 Perseptive Biosystems, Inc. Conjugates of transporter peptides and nucleic acid analogs, and their use
AU761027B2 (en) * 1998-08-25 2003-05-29 Merck Patent Gmbh Expression and export of angiostatin and endostatin as immunofusis
US6251599B1 (en) * 1998-11-06 2001-06-26 Selective Genetics, Inc. Stabilized nucleic acid compositions and methods of preparation and use thereof
US6903077B1 (en) * 1999-01-04 2005-06-07 University Of Vermont And State Agricultural College Methods and products for delivering nucleic acids
US20030104622A1 (en) * 1999-09-01 2003-06-05 Robbins Paul D. Identification of peptides that facilitate uptake and cytoplasmic and/or nuclear transport of proteins, DNA and viruses
AU785007B2 (en) * 1999-11-24 2006-08-24 Mcs Micro Carrier Systems Gmbh Polypeptides comprising multimers of nuclear localization signals or of protein transduction domains and their use for transferring molecules into cells
GB0103110D0 (en) * 2000-08-25 2001-03-28 Aventis Pharma Inc A membrane penetrating peptide encoded by a nuclear localization sequence from human period 1
EP1360311B1 (en) * 2000-08-25 2008-04-09 Aventis Pharmaceuticals Inc. Membrane penetrating peptides and uses thereof
US7332474B2 (en) * 2001-10-11 2008-02-19 Amgen Inc. Peptides and related compounds having thrombopoietic activity
KR20030062789A (ko) 2002-01-19 2003-07-28 포휴먼텍(주) 생체분자 전달 펩타이드 ｓｉｍ2-ｂｔｍ 및 이것을포함하는 생명공학제품
KR20030062788A (ko) 2002-01-19 2003-07-28 포휴먼텍(주) 생체분자 전달 펩타이드 ｍｐｈ1-ｂｔｍ 및 이것을포함하는 생명공학제품
KR100591936B1 (ko) * 2002-11-12 2006-06-22 포휴먼텍(주) 세포내 ｄｎａ／ｒｎａ 전달 방법, 및 이것의 기초 및임상학적 응용
US7166692B2 (en) 2003-03-04 2007-01-23 Canbrex Bio Science Walkersville, Inc. Intracellular delivery of small molecules, proteins, and nucleic acids
NZ543410A (en) * 2003-05-01 2008-07-31 Cornell Res Foundation Inc Carrier complexes comprising at least one molecule and an aromatic cationic peptide that can cross cell membranes by an energy-independent mechanism and deliver the molecules inside the cell
WO2004113497A2 (en) * 2003-06-09 2004-12-29 University Of Florida Gene delivery to tumors
CA2526506A1 (en) * 2003-06-09 2004-12-16 Boehringer Ingelheim International Gmbh Inhibitors of papilloma virus
EP2264191A1 (en) * 2003-11-21 2010-12-22 ANP Technologies, Inc. Asymmetrically branched polymer conjugates and microarray assays
US20060035815A1 (en) * 2004-05-04 2006-02-16 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Pharmaceutical compositions for delivery of ribonucleic acid to a cell
US20060024331A1 (en) * 2004-08-02 2006-02-02 Ester Fernandez-Salas Toxin compounds with enhanced membrane translocation characteristics
US7723299B2 (en) * 2005-11-04 2010-05-25 Forhumantech. Co., Ltd. Methods for treating rheumatoid arthritis using a CTLA-4 fusion protein
EP1797901A1 (en) * 2005-12-16 2007-06-20 Diatos Cell penetrating peptide conjugates for delivering nucleic acids into cells
JP2009544688A (ja) * 2006-07-24 2009-12-17 フォーヒューマンテック カンパニー リミテッド 虚血性疾患の緩和及び治療のための医薬組成物並びにそれを伝達するための方法
JP2010503616A (ja) * 2006-08-29 2010-02-04 フォルマンテク．・カンパニー， リミテッド アポトーシスを抑制するための薬学的組成物および前記薬学的組成物をデリバーするための方法
KR20080076622A (ko) * 2007-02-16 2008-08-20 포항공과대학교 산학협력단 올리고머화된 단백질 전달체와 이를 이용한 세포내바이러스 벡터 전달 방법

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