CN101490080A

CN101490080A - 用于缓解和治疗缺血性病症的药物组合物及其输送方法

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Publication number: CN101490080A
Application number: CNA2007800276518A
Authority: CN
Inventors: 李尚揆; 黄基哲; 李承揆; 张桹洙
Original assignee: ForHumanTech Co Ltd
Current assignee: ForHumanTech Co Ltd
Priority date: 2006-07-24
Filing date: 2007-07-19
Publication date: 2009-07-22
Also published as: US20090087422A1; EP2044108A4; EP2044108A2; KR101574630B1; WO2008015580A2; JP2009544688A; US7902154B2; WO2008015580A3; KR20090033878A

Abstract

本发明涉及用于治疗局部缺血导致的疾病或病症的药物组合物。所述药物组合物包含磷脂酶(PL)多肽和蛋白转导结构域(PTD)的缀合物。PLC－δ在胞质钙水平的调节中起重要作用。在心肌缺血过程中，胞质钙累积介导致病性改变。根据本发明，导致组织如心脏或脑中低氧的缺血性疾病或病症可通过给予PTD－PL缀合物预防或缓解。

Description

用于缓解和治疗缺血性病症的药物组合物及其输送方法

发明背景

发明领域

本发明涉及新的治疗局部缺血的药物组合物，其包含感兴趣的分子如磷脂酶多肽与蛋白转导结构域(PTD)的缀合物，以及输送所述药物组合物的方法。

背景技术

机体主要有赖于心脏泵血。健康的心脏将血液泵至全身以输送氧气和营养物质并去除有害的代谢产物。局部缺血导致心肌代谢的迅速改变以及心脏和细胞损害。损害程度有赖于局部缺血严重程度以及适当治疗的及时性。持续局部缺血可导致在几个小时内发生整体组织坏死。

虽然再灌注通常被认为是有益的，其通过几种机制导致组织损伤。临床上，在开放性心脏手术、心脏移植以及心脏疾病的反复中，保护心肌免受局部缺血-再灌注损伤是最有益于临床的问题。再灌注的氧化(再氧化)恢复之后低氧损伤加重是其他类型器官移植以及肝、肠、脑、肾和其他缺血综合征中细胞损伤的重要机制。

局部缺血和模拟的缺血病症导致活性氧种类增加和钙离子(Ca²⁺)过载(Bolli，R.，et al.，Physiol.Rev.79：609-634(1999))。胞质钙累积被认为是心肌缺血中出现的病理性改变的介导物(Moraru，I.I.，et al.，Biochim.Biophys.Acta 1268：1-8(1995))。胞内钙增加导致线粒体通透性转变通道(mPTP)开放。胞内钙增加进一步增强另外的mPTP开放并活化多种胞质蛋白，如磷脂酶，蛋白激酶，蛋白酶以及内切核酸酶(Bolli，R.，et al.，Physiol.Rev.79：609-634(1999))。据报道当在缺血后再灌注中用mPTP抑制剂环孢菌素A以及sanglifehrin A治疗时，收缩功能的恢复和细胞存活分别增加大约20％和62％(Javadov，S.A.，et al.，J.Physiol.549：513-524(2003))。

磷脂酶如磷脂酶C(PLC)在钙稳态的调节中起重要作用。目前，已经鉴定了11种哺乳动物PLC同工酶。其可分成四种类型：PLC-β，PLC-γ，PLC-δ和PLC-ε。PLC δ1和γ1是正常心脏细胞中的主要形式(Hansen，C.A.，et al.，J.Mol.Cell.Cardiol.27：471-484(1995)；和Schnabel，P.，et al.，J.Mol.Cell.Cardiol.28：2419-2427(1996))。

所有PLC同工酶都含有对Ca²⁺活化敏感的C2结构域(Hwang，K-C，etal.，J.Steroid Biochem.91：131-138(2004))。在PLC同种型中，PLC-δ1对胞内Ca²⁺活化最为敏感。Id.

PLC水解膜磷脂，磷脂酰肌醇4，5-双磷酸(PIP2)以产生二酰甘油(DAG)以及肌醇1，4，5-三磷酸(IP3)(Hwang，K-C，et al.，J.Steroid Biochem.91：131-138(2004))。DAG和IP3刺激蛋白激酶C(PKC)的活性并从胞内储库(intracellular reservoirs)将钙离子释放到细胞质。Id.PLC活化机制已知通过PLC-β，PLC-β分别被G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶以及ras途径活化(Rhee，S.G.，et al.，Annu.Rev.Biochem.70：281-312(2001))。

最近的研究报道，当过量钙存在细胞质中时，存在肝细胞线粒体膜内的PLC-δ1的功能是抑制钙内流(Hwang，K-C，et al.，J.Steroid Biochem.91：131-138(2004))。进一步显示PLC-δ1以至少7倍于其他同工酶的量存在于正常心肌细胞中，并且在缺血状态下，PLC-δ1的量在体外和体内均降低(Hwang，K-C，et al.，SteroidBiochem.91：131-138(2004))。当用钙蛋白酶抑制剂钙蛋白酶抑制蛋白和胱天蛋白酶抑制剂zVAD-fmk治疗时，PLC-δ1的降解被抑制。Id.此外，当PLC-δ1在心肌细胞中过表达时，缺血病症诱导的胞内Ca²⁺过载被显著拯救。Id.

这些结果表明PLC-δ1在正常心脏的胞质钙稳态中起重要作用并且其影响心肌梗塞之后的钙平衡。明显地，需要将PLC-δ1转导进入活细胞的细胞质和细胞核以治疗或预防局部缺血或缺血性病症的方法，所述方法没有有害副作用。

蛋白转导结构域(PTD)已经用于输送生物学活性分子(Viehl C.T.，et al.，Ann.Surg.Oncol.12：517-525(2005)；Noguchi H.，et al.，Nat.Med.10：305-309(2004)；和Fu A.L，et al.，Neurosci.Lett.368：258-62(2004))。PTD是低分子量肽，其用于使得生理活性分子穿透进入细胞。但是，目前没有试图利用PTD作为体内输送磷脂酶C的方式。

发明简述

本发明的一个目的是通过利用蛋白转导结构域(PTD)在体内输送多肽来有效治疗缺血性疾病和病症。

为实现上述目的，本发明提供了PTD与磷脂酶(PL)多肽的缀合物(PTD-PL)。所述缀合物可通过将PTD编码基因与磷脂酶基因融合并在体外或体内利用标准克隆技术和本领域技术人员已知的常规方法表达并分离所述融合蛋白来制备。本发明的PTD-PL缀合物因为PTD的胞内穿透和输送作用可容易地通过膜从而输送到细胞。

本发明的一个实施方案是PTD-PL缀合物治疗、降低或预防局部缺血或再灌注导致的胞内钙过载(calcium oveload)的应用。

另一实施方案是PTD-PL缀合物降低细胞内游离钙离子的浓度的应用。

本发明还涵盖利用PTD-PL缀合物降低、治疗、预防或消除低氧或局部缺血导致的心脏损伤(例如心衰和心肌梗塞)的方法。

本发明还涵盖利用PTD-PL缀合物预防和/或治疗心血管疾病、心肌缺氧或缺血性损伤的方法。

本发明还涵盖利用PTD-PL缀合物预防心衰过程中的卒中的方法。

另一实施方案是PTD-PL缀合物预防或降低低体温对象中的局部缺血-再灌注损伤的应用。

另一实施方案是PTD-PL缀合物预防器官或组织移植过程中的器官或组织损伤的应用。优选的实施方案是PTD-PLC-δ用于心脏移植的应用。

本发明另一实施方案是PTD-PL缀合物组合一或多种治疗化合物或构建体的应用。

对于所有上述实施方案，PTD与PL的一或多种片段、衍生物或类似物的融合物也包括在内。

本发明使得能够通过局部施用途径给予PTD-PL缀合物，从而最小化或避免全身性的副作用。

附图简述

图1显示利用镍珠纯化PTD-PLC-δ1。泳道1代表标准分子量蛋白，泳道2代表融合蛋白PTD-PLC-δ1。人PLC-δ1长756aa，大约85kDa。

图2A和2B显示本发明的PTD-PLC-δ1穿透进入低氧诱导的心肌细胞。图2A显示在低氧条件下培养12小时的心肌细胞中PTD-PLC-δ1蛋白的量，其浓度梯度为0-500nM。图2B显示这些条件下的细胞存活。CTL是对照。

图3显示低氧条件(低氧)下培养的心肌细胞中钙过载(泳道2)，其与含氧条件下保温的对照组(泳道1)以及用100nM PTD-PLC-δ1蛋白处理的情况(泳道3)相比较。胞内游离Ca²⁺的相对改变通过测定荧光强度来确定。

图4显示将PTD-PLC-δ1输送至并穿透内脏(心脏、肾和肝)。在心脏中，显示蛋白激酶C(PKC)的磷酸化。泳道1：正常；泳道2：低氧(1hr)和再灌注(3hr)；泳道3：低氧(1hr)和再灌注(3hr)加PTD-PLC-δ1。

图5显示PTD-PLC-δ1对治疗动物心肌梗塞模型中心脏缺血区域的作用。显示没有和存在PTD-PLC-δ1时的心肌细胞存活。I/R表示局部缺血以及随后的再灌注。

发明详述

钙和游离自由基协同作用诱导急性创伤例如局部缺血和脊髓损伤中的心脏和神经损伤。本发明涵盖用PTD-PL缀合物治疗或预防细胞如心肌细胞中的局部缺血或再灌注诱导的局部缺血。

本发明的一个实施方案是利用PTD-PL缀合物治疗、降低或预防钙过载，从而减轻或抑制心、心血管或神经细胞死亡(例如心肌细胞，神经元)。钙过载可通过例如低氧、局部缺血、再灌注、心血管(心脏)疾病或损伤如心肌梗塞或神经(脑)病或损伤如缺血性或出血性卒中引起。钙过载可出现在各个身体部位或器官，包括但不限于脑、脊髓、心脏、移植的器官或移植的肢体，并可限于这些身体部位之一。优选的实施方案利用PTD-PLC-δ缀合物治疗、降低或预防钙过载。

另一实施方案是利用PTD-PL缀合物降低细胞中游离钙离子浓度，其通过给予细胞有效量的PTD-PL进行。

本发明还涉及治疗、预防或最小化对象中心肌氧化应激如低氧或局部缺血导致的那些的方法。这可通过给予需要的对象治疗有效量PTD-PL来进行，所述PTD-PL调节心肌氧化应激使得作为氧化应激的靶的心肌细胞被保护不会发生细胞死亡。细胞死亡可能是由于例如坏死或凋亡。

本发明的另一实施方案是用PTD-PLC-δ缀合物降低或抑制心血管或神经细胞死亡的应用。心血管细胞可为例如心肌细胞，心室肌细胞，心房肌细胞，心脏干细胞，内皮细胞，血管平滑肌细胞，起搏细胞，肌成纤维细胞或成纤维细胞。所述神经细胞可为例如神经元。

本发明还涵盖治疗、预防、减轻或消除对象中低氧或局部缺血导致的心脏或神经损伤的方法，其中PTD-PL给予需要其的对象从而治疗、预防、减轻或消除低氧或缺血相关损伤。

本发明的方法和组合物可治疗、预防、减轻或消除的心脏损伤包括所有低氧和/或局部缺血导致或引起的心脏损伤。所述损伤包括但不限于心脏缺血后再灌注，充血性心衰，心肌梗塞，化合物如药物(例如阿霉素)导致的心脏毒性，由于感染(例如梅毒、克鲁斯锥虫(Trypanosoma cruzi)感染)导致的心脏损伤，爆发性心脏淀粉样变性病，心脏手术，心脏移植，以及创伤性心脏损伤(例如穿透性或钝性损伤，或主动脉瓣破裂)。所有或部分心脏可损伤，包括相关血管和/或组织如心包。本发明化合物的给予可在临床需要或合意时进行，例如在缺血后再灌注之前，在缺血后再灌注开始时，或在缺血后再灌注期间。

可通过本发明的方法和组合物治疗、预防、减轻或消除的神经损伤包括所有由低氧和/或局部缺血导致或引起的神经损伤。这种损伤包括但不限于局部缺血-再灌注损伤，化合物如药物导致的神经毒性以及寄生虫感染导致的神经损伤。

本发明还涵盖用PTD-PL缀合物预防和/或治疗心血管疾病、心肌缺氧或缺血损伤的方法。

本发明还涵盖预防器官或组织移植过程中器官或组织损伤的方法，其通过在取出所述器官或组织之前或同时给予供体PTD-PL从而使得所述器官或组织的再灌注导致的损伤减轻或预防。具体地，本发明涵盖预防低体温对象中局部缺血-再灌注损伤的方法，由此所述对象用治疗有效量的包含蛋白转导结构域(PTD)和磷脂酶多肽的融合多肽进行预治疗。

在优选的实施方案中，待移植的器官或组织是心脏或心组织。PTD-PL也可在从供者手术取出器官或组织之后与所述器官或组织接触。一些实施方案中，除了已知器官或组织保存溶液如University of Wisconsin溶液或Celsior溶液之外，还加入PTD-PL(见例如，Thabut et al.，Am.J.Respir.Crit.Care Med.164：1204-8(2001)；Faenza et al.，Transplantation 72：1274-7(2001))。

本发明还涵盖预防患有心衰的对象(例如人)中的卒中或卒中发作的方法，通过用PTC-PL和药学可接受载体治疗所述对象来进行。PTC-PL可在可能增加患者中卒中可能性的手术方法之前或同时给予。一个实施方案中，所述方法是气囊血管成形术。其他方法包括冠状动脉搭桥术以及瓣膜置换术。PTC-PL可在抗血栓剂(例如香豆素)之前、同时或之后给予。

本发明包括通过给予单独的PTD-PL或组合一或多种其他治疗化合物来治疗对象中心衰的方法。一些实施方案中，所述其他治疗化合物包括但不限于抗血小板药物，抗凝药，以及抗血栓药物或其组合。

本发明还涵盖防止患有低体温的对象(例如人)中再灌注损伤的方法，通过用PTD-PL以及药学可接受载体治疗所述对象来进行。所述对象可在本领域通常已知的用于治疗患有低体温的人的标准复温方法之前或同时利用PTD-PL进行治疗。

蛋白转导结构域(PTD)

PTD有效允许通过全身或局部给予使得感兴趣的蛋白、肽和化合物在体内或体外输送或摄取进入细胞。给予途径包括肌内、腹膜内、静脉内、口服、经鼻、皮下、皮内、经粘膜和吸入等途径。因此，如果以与蛋白、肽和/或化合物的缀合物的形式提供PTD，所述PTD可将蛋白、肽和/或化合物输送到局部区域，例如皮肤、眼球或气道。

为了本发明中PTD的应用，发明人利用固相合成方法构建了几种肽，但应理解，其他类型的PTD也可根据所需的输送区域以及使用的接头类型来使用。PTD由3-30个氨基酸、优选5-15个氨基酸组成，其中至少10-30％优选是精氨酸残基。然而，不含有任何精氨酸残基的PTD也在本发明的范围内。

一个实施方案涉及Hph-1-PTD的应用，所述PTD来自人(和小鼠)转录因子HPH-1(YARVRRRGPRR)(SEQ ID NO：1)。另一实施方案涉及应用Sim-2的PTD(AKAARQAAR)(SEQ ID NO：2)。

其他实施方案包括但不限于以下蛋白的PTD：HIV-1病毒蛋白Tat(YGRKKRRQRRR)(SEQ ID NO：3)，果蝇触角蛋白(Antp)(RQIKIWFQNRRMKWKK)(SEQ ID NO：4)，HSV-1结构蛋白Vp22(DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE)(SEQ ID NO：5)，G蛋白信号传导R7的调节物(RRRRRRR)(SEQID NO：6)，MTS(膜转位序列)，(AAVALLPAVLLALLAPAAADQNQLMP)(SEQ ID NO：7)，以及短两性肽载体Pep-1(KETWWETWWTEWSQPKKKRKV)(SEQ ID NO：8)和Pep-2(KETWFETWFTEWSQPKKKRKV)(SEQ ID NO：9)。

磷脂酶(PL)

为了实现上述目的，本发明提供PTD与多肽如磷脂酶、更具体是磷脂酶C的缀合物。存在四种主要类型的PLC酶：PLC-β(beta)，PLC-γ(gamma)，PLC-δ(delta)，PLC-ε(eta)和PLC-ζ(zeta)。每种PLC类型还由几种亚型组成，例如β1，β3，β4，δ1，δ3。

一个实施方案是PTD与磷脂酶C delta 1的缀合物(PLC-δ1)。PLC-δ1，当在低氧心肌细胞中过表达时，拯救缺血病症诱导的胞内Ca²⁺过载。

PLC-δ1的核苷酸序列(SEQ ID NO：10)是atggactcgg gccgggacttcctgaccctg cacggcctac aggatgatga ggatctacag gcgctgctga agggcagcca gctcctgaaggtgaagtcca gctcatggag gagagagcgc ttctacaagt tgcaggagga ctgcaagacc atctggcaggagtcccgcaa ggtcatgcgg accccggagt cccagctgtt ctccatcgag gacattcagg aggtgcgaatggggcaccgc acggagggtc tggagaagtt cgcccgtgat gtgcccgagg accgctgctt ctccattgtcttcaaggacc agcgcaatac actagacctc atcgccccat cgccagctga tgcccagcac tgggtgctggggctgcacaa gatcatccac cactcaggct ccatggacca gcgtcagaag ctacagcact ggattcactcctgcttgcga aaagctgaca aaaacaagga caacaagatg agcttcaagg agctgcagaa cttcctgaaggagctcaaca tccaggtgga cgacagctat gcccggaaga tcttcaggga gtgtgaccac tcccagacagactccctgga ggacgaggag attgaggcct tctacaagat gctgacccag cgggtggaga tcgaccgcaccttcgccgag gccgcgggct caggggagac tctgtcggtg gatcagttag tgacgttcct gcagcaccagcagcgggagg aggcggcagg gcctgcgctg gccctctccc tcattgagcg ctacgagcccagcgagactg ccaaggcgca gcggcagatg accaaggacg gcttcctcat gtacttactg tcggctgacggcagcgcctt cagcctggca caccgccgtg tctaccagga catgggccag ccacttagcc actacctggtgtcctcttca cacaacacct acctgctgga ggaccagcta gccgggccca gcagcactga agcctacatccgggcactgt gcaaaggctg ccgatgcctg gagcttgact gctgggacgg gcccaaccag gaaccaatcatctaccacgg ctatactttc acttccaaga tcctcttctg cgatgtgctc agggccatcc gggactatgccttcaaggcg tccccctacc ctgtcatcct atccctggag aaccactgca cactggagca gcagcgcgtgatggcgcggc acctgcatgc catcctgggc cccatgctgt tgaaccgacc actggatggg gtcaccaacagcctgccctc ccctgagcaa ctgaagggga agatcctgct gaaggggaa gaagctcggggggctcctgcc ccctggaggg gagggtggcc ctgaggccac tgtggtgtc agacgaagacgaggctgctga gatggaggat gaggcagtga ggagccgtgt gcagcacaa gcccaaggaggacaagctcag gctagcacag gagctctctg acatggtcat ttactgcaag agtgtccact ttgggggcttctccagtcct ggcacccctg gacaggcctt ctacgagatg gcgtccttct ctgagaaccg tgcccttcgactgctccaag aatcaggaaa cggctttgtc cgccacaacg tggggcacct gagcagaatc tacccggctggatggagaac agactcctcc aactacagcc ccgtggagat gtggaatggg ggctgccaga tcgtggccctgaatttccag acacctgggc cagagatgga cgtgtaccag ggccgcttcc aggacaacgg ggcctgtgggtacgtgctga agcccgcctt cctgcgagac cccaacggca cctttaaccc ccgcgccctg gctcaggggccctggtgggc acggaagcgg ctcaacatca gggtcatttc ggggcagcag ctgccaaaag tcaacaagaataagaattca attgtggacc ccaaagtgac agtggagatc catggcgtga gccgggacgt ggccagccgccagactgctg tcatcaccaa caatggtttc aacccatggt gggacacgga gtttgcgttt gaggtagttgtgcctgacct tgccctcatc cgcttcttgg tggaagatta tgatgcctcc tccaagaatg acttcattggccagagtacc atccccttga acagcctcaa gcaaggatac cgccatgtcc acctcatgtc taagaacggggaccagcatc catcagccac cctctttgtg aagatctccc tccaggacta g。

PLC-δ1的氨基酸序列(SEQ ID NO：11)是：MDSGRDFLTLHGLQDDEDLQALLKGSQLLKVKSSSWRRERFYKLQEDCKTIWQESRKVMRTPESQLFSIEDIQEVRMGHRTEGLEKFARDVPEDRCFSIVFKDQRNTLDLIAPSPADAQHWVLGLHKIIHHSGSMDQRQKLQHWIHSCLRKADKNKDNKMSFKELQNFLKELNIQVDDSYARKIFRECDHSQTDSLEDEEIEAFYKMLTQRVEIDRTFAEAAGSGETLSVDQLVTFLQHQQREEAAGPALALSLIERYEPSETAKAQRQMTKDGFLMYLLSADGSAFSLAHRRVYQDMGQPLSHYLVSSSHNTYLLEDQLAGPSSTEAYIRALCKGCRCLELDCWDGPNQEPIIYHGYTFTSKILFCDVLRAIRDYAFKASPYPVILSLENHCTLEQQRVMARHLHAILGPMLLNRPLDGVTNSLPSPEQLKGKILLKGKKLGGLLPPGGEGGPEATVVSDEDEAAEMEDEAVRSRVQHKPKEDKLRLAQELSDMVIYCKSVHFGGFSSPGTPGQAFYEMASFSENRALRLLQESGNGFVRHNVGHLSRIYPAGWRTDSSNYSPVEMWNGGCQIVALNFQTPGPEMDVYQGRFQDNGACGYVLKPAFLRDPNGTFNPRALAQGPWWARKRLNIRVISGQQLPKVNKNKNSIVDPKVTVEIHGVSRDVASRQTAVITNNGFNPWWDTEFAFEVVVPDLALIRFLVEDYDASSKNDFIGQSTIPLNSLKQGYRHVHLMSKNGDQHPSATLFVKISLQD。

另一实施方案是PTD与磷脂酶C delta 3的缀合物(PLC-δ3)。人PLC-δ3长度为789个氨基酸。

PLC-δ3的核苷酸序列(SEQ ID NO：12)是：atgctgtgcg gccgctggaggcgttgccgc cgcccgcccg aggagccccc ggtggccgcc caggtcgcag cccaagtcgcggcgccggtc gctctcccgt ccccgccgac tccctccgat ggcggcacca agaggcccgggctgcgggcg ctgaagaaga tgggcctgac ggaggacgag gacgtgcgcg ccatgctgcggggctcccgg ctccgcaaga tccgctcgcg cacgtggcac aaggagcggc tgtaccggctgcaggaggac ggcctgagcg tgtggttcca gcggcgcatc ccgcgtgcgc catcgcagca catcttcttcgtgcagcaca tcgaggcggt ccgcgagggc caccagtccg agggcctgcg gcgcttcgggggtgccttcg cgccagcgcg ctgcctcacc atcgccttca agggccgccg caagaacctg gacctggcggcgcccacggc tgaggaagcg cagcgctggg tgcgcggtct gaccaagctc cgcgcgcgcctggacgccat gagccagcgc gagcggctag accactggat ccactcctat ctgcaccggg ctgactccaaccaggacagc aagatgagct tcaaggagat caagagcctg ctgagaatgg tcaacgtgga catgaacgacatgtacgcct acctcctctt caaggagtgt gaccactcca acaacgaccg tctagagggg gctgagatcgaggagttcct gcggcggctg ctgaagcggc cggagctgga ggagatcttc catcagtact cgggcgaggaccgcgtgctg agtgcccctg agctgctgga gttcctggag gaccagggc gaggagggcgccacactggcc cgcgcccagc agctcattca gacctatgag ctcaacgaga cagccaagca gcatgagctgatgacactgg atggcttcat gatgtacctg ttgtcgccgg agggggctgc cttggacaac acccacacgtgtgtgttcca ggacatgaac cagccccttg cccactactt catctcttcc tcccacaacacctatctgactgactcccag atcggggggc ccagcagcac cgaggcctat gttagggcct ttgcccaggg atgccgctgcgtggagctgg actgctggga ggggccagga ggggagcccg tcatctatca tggccatacc ctcacctccaagattctctt ccgggacgtg gtccaagccg tgcgcgacca tgccttcacg ctgtcccctt accctgtcatcctatccctg gagaaccact gcgggctgga gcagcaggct gccatggccc gccacctctg caccatcctgggggacatgc tggtgacaca ggcgctggac tccccaaatc ccgaggagct gccatccccagagcagctga agggccgggt cctggtgaag ggaaagaagc tgcccgctgc tcggagcgaggatggccggg ctctgtcgga tcgggaggag gaggaggagg atgacgagga ggaagaagaggaggtggagg ctgcagcgca gaggcggctg gccaagcaga tctccccgga gctgtcggccctggctgtgt actgccacgc cacccgcctg cggaccctgc accctgcccc caacgcccca caaccctgccaggtcagctc cctcagcgag cgcaaagcca agaaactcat tcgggaggca gggaacagct ttgtcaggcacaatgcccgc cagctgaccc gcgtgtaccc gctggggctg cggatgaact cagccaacta cagtccccaggagatgtgga actcgggctg tcagctggtg gccttgaact tccagacgcc aggctacgag atggacctcaatgccgggcg cttcctagtc aatgggcagt gtggctacgt cctaaaacct gcctgcctgc ggcaacctgactcgaccttt gaccccgagt acccaggacc tcccagaacc actctcagca tccaggtgct gactgcacagcagctgccca agctgaatgc cgagaagcca cactccattg tggaccccct ggtgcgcatt gagatccatggggtgcccgc agactgtgcc cggcaggaga ctgactacgt gctcaacaat ggcttcaacc cccgctgggggcagaccctg cagttccagc tgcgggctcc ggagctggca ctggtccggt ttgtggtgga agattatgacgccacctccc ccaatgactt tgtgggccag tttacactgc ctcttagcag cctaaagcaa gggtaccgccacatacacct gctttccaag gacggggcct cactgtcacc agccacgctc ttcatccaaa tccgcatccagcgctcctga。

PLC-δ3的氨基酸序列(SEQ ID NO：13)是：MLCGRWRRCRRPPEEPPVAAQVAAQVAAPVALPSPPTPSDGGTKRPGLRALKKMGLTEDEDVRAMLRGSRLRKIRSRTWHKERLYRLQEDGLSVWFQRRIPRAPSQHIFFVQHIEAVREGHQSEGLRRFGGAFAPARCLTIAFKGRRKNLDLAAPTAEEAQRWVRGLTKLRARLDAMSQRERLDHWIHSYLHRADSNQDSKMSFKEIKSLLRMVNVDMNDMYAYLLFKECDHSNNDRLEGAEIEEFLRRLLKRPELEEIFHQYSGEDRVLSAPELLEFLEDQGEEGATLARAQQLIQTYELNETAKQHELMTLDGFMMYLLSPEGAALDNTHTCVFQDMNQPLAHYFISSSHNTYLTDSQIGGPSSTEAYVRAFAQGCRCVELDCWEGPGGEPVIYHGHTLTSKILFRDVVQAVRDHAFTLSPYPVILSLENHCGLEQQAAMARHLCTILGDMLVTQALDSPNPEELPSPEQLKGRVLVKGKKLPAARSEDGRALSDREEEEEDDEEEEEEVEAAAQRRLAKQISPELSALAVYCHATRLRTLHPAPNAPQPCQVSSLSERKAKKLIREAGNSFVRHNARQLTRVYPLGLRMNSANYSPQEMWNSGCQLVALNFQTPGYEMDLNAGRFLVNGQCGYVLKPACLRQPDSTFDPEYPGPPRTTLSIQVLTAQQLPKLNAEKPHSIVDPLVRIEIHGVPADCARQETDYVLNNGFNPRWGQTLQFQLRAPELALVRFVVEDYDATSPNDFVGQFTLPLSSLKQGYRHIHLLSKDGASLSPATLFIQIRIQRS。

另一实施方案是PTD与磷脂酶C delta 4的缀合物(PLC-δ4)。PLC-δ4也称为PLC-δ2。人PLC-δ4的长度是762个氨基酸。

PLC-δ4的核苷酸序列(SEQ ID NO：14)是：atggcgtccc tgctgcaagaccagctgacc actgatcagg acttgctgct gatgcaggaa ggcatgccga tgcgcaaggt gaggtccaaaagctggaaga agctaagata cttcagactt cagaatgacg gcatgacagt ctggcatgca cggcaggccaggggcagtgc caagcccagc ttctcaatct ctgatgtgga gacaatacgt aatggccatg attccgagttgctgcgtagc ctggcagagg agctccccct ggagcagggc ttcaccattg tcttccatgg ccgccgctccaacctggacc tgatggccaa cagtgttgag gaggcccaga tatggatgcg agggctccag ctgttggtggatcttgtcac cagcatggac catcaggagc gcctggacca atggctgagc gattggtttc aacgtggagacaaaaatcag gatggtaaga tgagtttcca agaagttcag cggttattgc acctaatgaa tgtggaaatggaccaagaat atgccttcag tctttttcag gcagcagaca cgtcccagtc tggaaccctg gaaggagaagaattcgtaca gttctataag gcattgacta aacgtgctga ggtgcagga actgtttgaa agtttttcagctgatgggcag aagctgactc tgctggaatt tttggatttc ctccaagagg agcagaagga gagagactgcacctctgagc ttgctctgga actcattgac cgctatgaac cttcagacag tggcaaactg cggcatgtgctgagtatgga tggcttcctc agctacctct gctctaagga tggagacatc ttcaacccag cctgcctccccatctatcag gatatgactc aacccctgaa ccactacttc atctgctctt ctcataacac ctacctagtgggggaccagc tttgcggcca gagcagcgtc gagggatata tacgggccct gaagcgggggtgccgctgcg tggaggtgga tgtatgggat ggacctagcg gggaacctgt cgtttaccac ggacacaccctgacctcccg catcctgttc aaagatgtcg tggccacagt agcacagtat gccttccaga catcagactacccagtcatc ttgtccctgg agacccactg cagctgggag cagcagcaga ccatggcccg tcatctgactgagatcctgg gggagcagct gctgagcacc accttggatg gggtgctgcc cactcagctg ccctcgcctgaggagcttcg gaggaagatc ctggtgaagg ggaagaagtt aacacttgag gaagacctgg aatatgaggaagaggaagca gaacctgagt tggaagagtc agaattggcg ctggagtccc agtttgagac tgagcctgagccccaggagc agaaccttca gaataaggac aaaaagaaga aatccaagcc catcttgtgt ccagccctctcttccctggt tatctacttg aagtctgtct cattccgcag cttcacacat tcaaaggagc actaccacttctacgagata tcatctttct ctgaaaccaa ggccaagcgc ctcatcaagg aggctggcaa tgagtttgtgcagcacaata cttggcagtt aagccgtgtg tatcccagcg gcctgaggac agactcttcc aactacaacccccaggaact ctggaatgca ggctgccaga tggtggccat gaatatgcag actgcagggc ttgaaatggacatctgtgat gggcatttcc gccagaatgg cggctgtggc tatgtgctga agccagactt cctgcgtgatatccagagtt ctttccaccc tgagaagccc atcagccctt tcaaagccca gactctctta atccaggtgatcagcggtca gcaactcccc aaagtggaca agaccaaaga ggggtccatt gtggatccac tggtgaaagtgcagatcttt ggcgttcgtc tagacacagc acggcaggag accaactatg tggagaacaa tggttttaatccatactggg ggcagacact atgtttccgg gtgctggtgc ctgaacttgc catgctgcgt tttgtggtaatggattatga ctggaaatcc cgaaatgact ttattggtca gtacaccctg ccttggacct gcatgcaacaaggttaccgc cacattcacc tgctgtccaa agatggcatc agcctccgcc cagcttccat ctttgtgtatatctgcatcc aggaaggcct ggagggggat gagtcctga。

PLC-δ4的氨基酸序列(SEQ ID NO：15)是：MASLLQDQLTTDQDLLLMQEGMPMRKVRSKSWKKLRYFRLQNDGMTVWHARQARGSAKPSFSISDVETIRNGHDSELLRSLAEELPLEQGFTIVFHGRRSNLDLMANSVEEAQIWMRGLQLLVDLVTSMDHQERLDQWLSDWFQRGDKNQDGKMSFQEVQRLLHLMNVEMDQEYAFSLFQAADTSQSGTLEGEEFVQFYKALTKRAEVQELFESFSADGQKLTLLEFLDFLQEEQKERDCTSELALELIDRYEPSDSGKLRHVLSMDGFLSYLCSKDGDIFNPACLPIYQDMTQPLNHYFICSSHNTYLVGDQLCGQSSVEGYIRALKRGCRCVEVDVWDGPSGEPVVYHGHTLTSRILFKDVVATVAQYAFQTSDYPVILSLETHCSWEQQQTMARHLTEILGEQLLSTTLDGVLPTQLPSPEELRRKILVKGKKLTLEEDLEYEEEEAEPELEESELALESQFETEPEPQEQNLQNKDKKKKSKPILCPALSSLVIYLKSVSFRSFTHSKEHYHFYEISSFSETKAKRLIKEAGNEFVQHNTWQLSRVYPSGLRTDSSNYNPQELWNAGCQMVAMNMQTAGLEMDICDGHFRQNGGCGYVLKPDFLRDIQSSFHPEKPISPFKAQTLLIQVISGQQLPKVDKTKEGSIVDPLVKVQIFGVRLDTARQETNYVENNGFNPYWGQTLCFRVLVPELAMLRFVVMDYDWKSRNDFIGQYTLPWTCMQQGYRHIHLLSKDGISLRPASIFVYICIQEGLEGDES。

其他PLC-δ酶包括但不限于PLC-δ5，也是本发明的一部分。PLC-δ5的核苷酸和氨基酸序列也见于美国专利6,958,152，包含在内作为参考。

此外，其他PLC酶包括但不限于PLC-β1(betal)，PLC-β2(beta2)，PLC-β3(beta3)，PLC-β4(beta4)，PLC-γ1(gammal)，PLC-γ2(gamma2)，PLC-ε1a(etala)，PLC-εlba(etalb)和PLC-ζ(zeta)也是本发明的一部分。

PLC-β1的氨基酸序列(SEQ ID NO：16)是：MAGAQPGVHALQLKPVCVSDSLKKGTKFVKWDDDSTIVTPIILRTDPQGFFFYWTDQNKETELLDLSLVKDARCGRHAKAPKDPKLRELLDVGNIGRLEQRMITVVYGPDLVNISHLNLVAFQEEVAKEWTNEVFSLATNLLAQNMSRDAFLEKAYTKLKLQVTPEGRIPLKNIYRLFSADRKRVETALEACSLPSSRNDSIPQEDFTPEVYRVFLNNLCPRPEIDNIFSEFGAKSKPYLTVDQMMDFINLKQRDPRLNEILYPPLKQEQVQVLIEKYEPNNSLARKGQISVDGFMRYLSGEENGVVSPEKLDLNEDMSQPLSHYFINSSHNTYLTAGQLAGNSSVEMYRQVLLSGCRCVELDCWKGRTAEEEPVITHGFTMTTEISFKEVIEAIAECAFKTSPFPILLSFENHVDSPKQQAKMAEYCRLIFGDALLMEPLEKYPLESGVPLPSPMDLMYKILVKNKKKSHKSSEGSGKKKLSEQASNTYSDSSSMFEPSSPGAGEADTESDDDDDDDDCKKSSMDEGTAGSEAMATEEMSNLVNYIQPVKFESFEISKKRNKSFEMSSFVETKGLEQLTKSPVEFVEYNKMQLSRIYPKGTRVDSSNYMPQLFWNAGCQMVALNFQTMDLAMQINMGMYEYNGKSGYRLKPEFMRRPDKHFDPFTEGIVDGIVANTLSVKIISGQFLSDKKVGTYVEVDMFGLPVDTRRKAFKTKTSQGNAVNPVWEEEPIVFKKVVLPTLACLRIAVYEEGGKFIGHRILPVQAIRPGYHYICLRNERNQPLTLPAVFVYIEVKDYVPDTYADVIEALSNPIRYVNLMEQRAKQLAALTLEDEEEVKKEADPGETPSEAPSEARTTPAENGVNHTTTLTPKPPSQALHSQPAPGSVKAPAKTEDLIQSVLTEVEAQTIEELKQQKSFVKLQKKHYKEMKDLVKRHHKKTTDLIKEHTTKYNEIQNDYLRRRAALEKSAKKDSKKKSEPSSPDHGSSTIEQDLAALDAEMTQKLIDLKDKQQQQLLNLRQEQYYSEKYQKREHIKLLIQKLTDVAEECQNNQLKKLKEICEKEKKELKKKMDKKRQEKITEAKSKDKSQMEEEKTEMIRSYIQEVVQYIKRLEEAQSKRQEKLVEKHKEIRQQILDEKPKLQVELEQEYQDKFKRLPLEILEFVQEAMKGKISEDSNHGSAPLSLSSDPGKVNHKTPSSEELGGDIPGKEFDTPL。

PLC-β2的氨基酸序列(SEQ ID NO：17)是：MSLLNPVLLPPKVKAYLSQGERFIKWDDETTVASPVILRVDPKGYYLYWTYQSKEMEFLDITSIRDTRFGKFAKMPKSQKLRDVFNMDFPDNSFLLKTLTVVSGPDMVDLTFHNFVSYKENVGKAWAEDVLALVKHPLTANASRSTFLDKILVKLKMQLNSEGKIPVKNFFQMFPADRKRVEAALSACHLPKGKNDAINPEDFPEPVYKSFLMSLCPRPEIDEIFTSYHAKAKPYMTKEHLTKFINQKQRDSRLNSLLFPPARPDQVQGLIDKYEPSGINAQRGQLSPEGMVWFLCGPENSVLAQDKLLLHHDMTQPLNHYFINSSHNTYLTAGQFSGLSSAEMYRQVLLSGCRCVELDCWKGKPPDEEPIITHGFTMTTDIFFKEAIEAIAESAFKTSPYPIILSFENHVDSPRQQAKMAEYCRTIFGDMLLTEPLEKFPLKPGVPLPSPEDLRGKILIKNKKNQFSGPTSSSKDTGGEAEGSSPPSAPAVWAGEEGTELEEEEVEEEEEEESGNLDEEEIKKMQSDEGTAGLEVTAYEEMSSLVNYIQPTKFVSFEFSAQKNRSYVISSFTELKAYDLLSKASVQFVDYNKRQMSRIYPKGTRMDSSNYMPQMFWNAGCQMVALNFQTMDLPMQQNMAVFEFNGQSGYLLKHEFMRRPDKQFNPFSVDRIDVVVATTLSITVISGQFLSERSVRTYVEVELFGLPGDPKRRYRTKLSPSTNSINPVWKEEPFVFEKILMPELASLRVAVMEEGNKFLGHRIIPINALNSGYHHLCLHSESNMPLTMPALFIFLEMKDYIPGAWADLTVALANPIKFFSAHDTKSVKLKEAMGGLPEKPFPLASPVASQVNGALAPTSNGSPAARAGAREEAMKEAAEPRTASLEELRELKGVVKLQRRHEKELRELERRGARRWEELLQRGAAQLAELGPPGVGGVGACKLGPGKGSRKKRSLPREESAGAAPGEGPEGVDGRVRELKDRLELELLRQGEEQYECVLKRKEQHVAEQISKMMELAREKQAAELKALKETSENDTKEMKKKLETKRLERIQGMTKVTTDKMAQERLKREINNSHIQEVVQVIKQMTENLERHQEKLEEKQAACLEQIREMEKQFQKEALAEYEARMKGLEAEVKESVRACLRTCFPSEAKDKPERACECPPELCEQDPLIAKADAQESRL。

PLC-β3的氨基酸序列(SEQ ID NO：18)是：MAGAQPGVHALQLEPPTVVETLRRGSKFIKWDEETSSRNLVTLRVDPNGFFLYWTGPNMEVDTLDISSIRDTRTGRYARLPKDPKIREVLGFGGPDARLEEKLMTVVSGPDPVNTVFLNFMAVQDDTAKVWSEELFKLAMNILAQNASRNTFLRKAYTKLKLQVNQDGRIPVKNILKMFSADKKRVETALESCGLKFNRSESIRPDEFSLEIFERFLNKLCLRPDIDKILLEIGAKGKPYLTLEQLMDFINQKQRDPRLNEVLYPPLRPSQARLLIEKYEPNQQFLERDQMSMEGFSRYLGGEENGILPLEALDLSTDMTQPLSAYFINSSHNTYLTAGQLAGTSSVEMYRQALLWGCRCVELDVWKGRPPEEEPFITHGFTMTTEVPLRDVLEAIAETAFKTSPYPVILSFENHVDSAKQQAKMAEYCRSIFGDALLIEPLDKYPLAPGVPLPSPQDLMGRILVKNKKRHRPSAGGPDSAGRKRPLEQSNSALSESSAATEPSSPQLGSPSSDSCPGLSNGEEVGLEKPSLEPQKSLGDEGLNRGPYVLGPADREDEEEDEEEEEQTDPKKPTTDEGTASSEVNATEEMSTLVNYIEPVKFKSFEAARKRNKCFEMSSFVETKAMEQLTKSPMEFVEYNKQQLSRIYPKGTRVDSSNYMPQLFWNVGCQLVALNFQTLDVAMQLNAGVFEYNGRSGYLLKPEFMRRPDKSFDPFTEVIVDGIVANALRVKVISGQFLSDRKVGIYVEVDMFGLPVDTRRKYRTRTSQGNSFNPVWDEEPFDFPKVVLPTLASLRIAAFEEGGKFVGHRILPVSAIRSGYHYVCLRNEANQPLCLPALLIYTEASDYIPDDHQDYAEALINPIKHVSLMDQRARQLAALIGESEAQAGQETCQDTQSQQLGSQPSSNPTPSPLDASPRRPPGPTTSPASTSLSSPGQRDDLIASILSEVAPTPLDELRGHKALVKLRSRQERDLRELRKKHQRKAVTLTRRLLDGLAQAQAEGRCRLRPGALGGAADVEDTKEGEDEAKRYQEFQNRQVQSLLELREAQVDAEAQRRLEHLRQALQRLREVVLDANTTQFKRLKEMNEREKKELQKILDRKRHNSISEAKMRDKHKKEAELTEINRRHITESVNSIRRLEEAQKQRHDRLVAGQQQVLQQLAEEEPKLLAQLAQECQEQRARLPQEIRRSLLGEMPEGLGDGPLVACASNGHAPGSSGHLSGADSESQEENTQL。

PLC-β4的氨基酸序列(SEQ ID NO：19)是：MAKPYEFNWQKEVPSFLQEGTVFDRYEEESFVFEPNCLFKVDEFGFFLTWRSEGKEGQVLECSLINSIRSGAIPKDPKILAALEAVGKSENDLEGRIVCVCSGTDLVNISFTYMVAENPEVTKQWVEGLRSIIHNFRANNVSPMTCLKKHWMKLAFMTNTNGKIPVRSITRTFASGKTEKVIFQALKELGLPSGKNDEIEPTAFSYEKFYELTQKICPRTDIEDLFKKINGDKTDYLTVDQLVSFLNEHQRDPRLNEILFPFYDAKRAMQIIEMYEPDEDLKKKGLISSDGFCRYLMSDENAPVFLDRLELYQEMDHPLAHYFISSSHNTYLTGRQFGGKSSVEMYRQVLLAGCRCVELDCWDGKGEDQEPIITHGKAMCTDILFKDVIQAIKETAFVTSEYPVILSFENHCSKYQQYKMSKYCEDLFGDLLLKQALESHPLEPGRALPSPNDLKRKILIKNKRLKPEVEKKQLEALRSMMEAGESASPANILEDDNEEEIESADQEEEAHPEFKFGNELSADDLGHKEAVANSVKKGLVTVEDEQAWMASYKYVGATTNIHPYLSTMINYAQPVKFQGFHVAEERNIHYNMSSFNESVGLGYLKTHAIEFVNYNKRQMSRIYPKGGRVDSSNYMPQIFWNAGCQMVSLNYQTPDLAMQLNQGKFEYNGSCGYLLKPDFMRRPDRTFDPFSETPVDGVIAATCSVQVISGQFLSDKKIGTYVEVDMYGLPTDTIRKEFRTRMVMNNGLNPVYNEESFVFRKVILPDLAVLRIAVYDDNNKLIGQRILPLDGLQAGYRHISLRNEGNKPLSLPTIFCNIVLKTYVPDGFGDIVDALSDPKKFLSITEKRADQMRAMGIETSDIADVPSDTSKNDKKGKANTAKANVTPQSSSELRPTTTAALASGVEAKKGIELIPQVRIEDLKQMKAYLKHLKKQQKELNSLKKKHAKEHSTMQKLHCTQVDKIVAQYDKEKSTHEKILEKAMKKKGGSNCLEMKKETEIKIQTLTSDHKSKVKEIVAQHTKEWSEMINTHSAEEQEIRDLHLSQQCELLKKLLINAHEQQTQQLKLSHDRESKEMRAHQAKISMENSKAISQDKSIKNKAERERRVRELNSSNTKKFLEERKRLAMKQSKEMDQLKKVQLEHLEFLEKQNEQLLKSCHAVSQTQGEGDAADGEIGSRDGPQTSNSSMKLQNAN

PLC-γ1的氨基酸序列(SEQ ID NO：20)是：MAGAASPCANGCGPGAPSDAEVLHLCRSLEVGTVMTLFYSKKSQRPERKTFQVKLETRQITWSRGADKIEGAIDIREIKEIRPGKTSRDFDRYQEDPAFRPDQSHCFVILYGMEFRLKTLSLQATSEDEVNMWIKGLTWLMEDTLQAPTPLQIERWLRKQFYSVDRNREDRISAKDLKNMLSQVNYRVPNMRFLRERLTDLEQRSGDITYGQFAQLYRSLMYSAQKTMDLPFLEASTLRAGERPELCRVSLPEFQQFLLDYQGELWAVDRLQVQEFMLSFLRDPLREIEEPYFFLDEFVTFLFSKENSVWNSQLDAVCPDTMNNPLSHYWISSSHNTYLTGDQFSSESSLEAYARCLRMGCRCIELDCWDGPDGMPVIYHGHTLTTKIKFSDVLHTIKEHAFVASEYPVILSIEDHCSIAQQRNMAQYFKKVLGDTLLTKPVEISADGLPSPNQLKRKILIKHKKLAEGSAYEEVPTSMMYSENDISNSIKNGILYLEDPVNHEWYPHYFVLTSSKIYYSEETSSDQGNEDEEEPKEVSSSTELHSNEKWFHGKLGAGRDGRHIAERLLTEYCIETGAPDGSFLVRESETFVGDYTLSFWRNGKVQHCRIHSRQDAGTPKFFLTDNLVFDSLYDLITHYQQVPLRCNEFEMRLSEPVPQTNAHESKEWYHASLTRAQAEHMLMRVPRDGAFLVRKRNEPNSYAISFRAEGKIKHCRVQQEGQTVMLGNSEFDSLVDLISYYEKHPLYRKMKLRYPINEEALEKIGTAEPDYGALYEGRNPGFYVEANPMPTFKCAVKALFDYKAQREDELTFIKSAIIQNVEKQEGGWWRGDYGGKKQLWFPSNYVEEMVNPVALEPEREHLDENSPLGDLLRGVLDVPACQIAIRPEGKNNRLFVFSISMASVAHWSLDVAADSQEELQDWVKKIREVAQTADARLTEGKIMERRKKIALELSELVVYCRPVPFDEEKIGTERACYRDMSSFPETKAEKYVNKAKGKKFLQYNRLQLSRIYPKGQRLDSSNYDPLPMWICGSQLVALNFQTPDKPMQMNQALFMTGRHCGYVLQPSTMRDEAFDPFDKSSLRGLEPCAISIEVLGARHLPKNGRGIVCPFVEIEVAGAEYDSTKQKTEFVVDNGLNPVWPAKPFHFQISNPEFAFLRFVVYEEDMFSDQNFLAQATFPVKGLKTGYRAVPLKNNYSEDLELASLLIKIDIFPAKENGDLSPFSGTSLRERGSDASGQLFHGRAREGSFESRYQQPFEDFRISQEHLADHFDSRERRAPRRTRVNGDNRL。

PLC-γ2的氨基酸序列(SEQ ID NO：21)是：MSTTVNVDSLAEYEKSQIKRALELGTVMTVFSFRKSTPERRTVQVIMETRQVAWSKTADKIEGFLDIMEIKFIRPGKNSKDFERAKAVRQKEDCCFTILYGTQFVLSTLSLAADSKEDAVNWLSGLKILHQEAMNASTPTIIESWLRKQIYSVDQTRRNSISLRELKTILPLINFKVSSAKFLKDKFVEIGAHKDELSFEQFHLFYKKLMFEQQKSILDEFKKDSSVFILGNTDRPDASAVYLRDFQRFLIHEQQEHWAQDLNKVRERMTKFIDDTMRETAEPFLFVDEFLTYLFSRENSIWDEKYDAVDMQDMNNPLSHYWISSSHNTYLTGDQLRSESSPEAYIRCLRMGCRCIELDCWDGPDGKPVIYHGWTRTTKIKFDDVVQAIKDHAFVTSSFPVILSIEEHCSVEQQRHMAKAFKEVFGDLLLTKPTEASADQLPSPSQLREKIIIKHKKLGPRGDVDVNMEDKKDEHKQQGELYMWDSIDQKWTRHYCAIADAKLSFSDDIEQTMEEEVPQDIPPTELHFGEKWFHKKVEKRTSAEKLLQEYCMETGGKDGTFLVRESETFPNDYTLSFWRSGRVQHCRIRSTMEGGTLKYYLTDNLTFSSIYALIQHYRETHLRCAEFELRLTDPVPNPNPHESKPWYYDSLSRGEAEDMLMRIPRDGAFLIRKREGSDSYAITFRARGKVKHCRINRDGRHFVLGTSAYFESLVELVSYYEKHSLYRKMRLRYPVTPELLERYNMERDINSLYDVSRMYVDPSEINPSMPQRTVKALYDYKAKRSDELSFCRGALIHNVSKEPGGWWKGDYGTRIQQYFPSNYVEDISTADFEELEKQIIEDNPLGSLCRGILDLNTYNVVKAPQGKNQKSFVFILEPKQQGYPPVEFATDRVEELFEWFQSIREITWKIDTKENNMKYWEKNQSIAIELSDLVVYCKPTSKTKDNLENPDFREIRSFVETKADSIIRQKPVDLLKYNQKGLTRVYPKGQRVDSSNYDPFRLWLCGSQMVALNFQTADKYMQMNHALFSLNGRTGYVLQPESMRTEKYDPMPPESQRKILMTLTVKVLGARHLPKLGRSIACPFVEVEICGAEYDNNKFKTTVVNDNGLSPIWAPTQEKVTFEIYDPNLAFLRFVVYEEDMFSDPNFLAHATYPIKAVKSGFRSVPLKNGYSEDIELASLLVFCEMRPVLESEEELYSSCRQLRRRQEELNNQLFLYDTHQNLRNANRDALVKEFSVNENQLQLYQEKCNKRLREKRVSNSKFYS。

PLC-ε1a的氨基酸序列(SEQ ID NO：22)是：MADLEVYKNLSPEKVERCMSVMQSGTQMIKLKRGTKGLVRLFYLDEHRTRLRWRPSRKSEKAKILIDSIYKVTEGRQSEIFHRQAEGNFDPSCCFTIYHGNHMESLDLITSNPEEARTWITGLKYLMAGISDEDSLAKRQRTHDQWVKQTFEEADKNGDGLLNIEEIHQLMHKLNVNLPRRKVRQMFQEADTDENQGTLTFEEFCVFYKMMSLRRDLYLLLLSYSDKKDHLTVEELAQFLKVEQKMNNVTTDYCLDIIKKFEVSEENKVKNVLGIEGFTNFMRSPACDIFNPLHHEVYQDMDQPLCNYYIASSHNTYLTGDQLLSQSKVDMYARVLQEGCRCVEVDCWDGPDGEPVVHHGYTLTSKILFRDVVETINKHAFVKNEFPVILSIENHCSIQQQRKIAQYLKGIFGDKLDLSSVDTGECKQLPSPQSLKGKILVKGKKLPYHLGDDAEEGEVSDEDSADEIEDECKFKLHYSNGTTEHQVESFIRKKLESLLKESQIRDKEDPDSFTVRALLKATHEGLNAHLKQSPDVKESGKKSHGRSLMTNFGKHKKTTKSRSKSYSTDDEEDTQQSTGKEGGQLYRLGRRRKTMKLCRELSDLVVYTNSVAAQDIVDDGTTGNVLSFSETRAHQVVQQKSEQFMIYNQKQLTRIYPSAYRIDSSNFNPLPYWNAGCQLVALNYQSEGRMMQLNRAKFKANGNCGYVLKPQQMCKGTFNPFSGDPLPANPKKQLILKVISGQQLPKPPDSMFGDRGEIIDPFVEVEIIGLPVDCCKDQTRVVDDNGFNPVWEETLTFTVHMPEIALVRFLVWDHDPIGRDFVGQRTVTFSSLVPGYRHVYLEGLTEASIFVHITINEIYGKWSPLILNPSYTILHFLGATKNRQLQGLKGLFNKNPRHSSSENNSHYVRKRSIGDRILRRTASAPAKGRKKSKMGFQEMVEIKDSVSEATRDQDGVLRRTTRSLQARPVSMPVDRNLLGALSLPVSETAKDIEGKENSLVQI。

PLC-ε1b的氨基酸序列(SEQ ID NO：23)是：MADLEVYKNLSPEKVERCMSVMQSGTQMIKLKRGTKGLVRLFYLDEHRTRLRWRPSRKSEKAKILIDSIYKVTEGRQSEIFHRQAEGNFDPSCCFTIYHGNHMESLDLITSNPEEARTWITGLKYLMAGISDEDSLAKRQRTHDQWVKQTFEEADKNGDGLLNIEEIHQLMHKLNVNLPRRKVRQMFQEADTDENQGTLTFEEFCVFYKMMSLRRDLYLLLLSYSDKKDHLTVEELAQFLKVEQKMNNVTTDYCLDIIKKFEVSEENKVKNVLGIEGFTNFMRSPACDIFNPLHHEVYQDMDQPLCNYYIASSHNTYLTGDQLLSQSKVDMYARVLQEGCRCVEVDCWDGPDGEPVVHHGYTLTSKILFRDVVETINKHAFVKNEFPVILSIENHCSIQQQRKIAQYLKGIFGDKLDLSSVDTGECKQLPSPQSLKGKILVKGKKLPYHLGDDAEEGEVSDEDSADEIEDECKFKLHYSNGTTEHQVESFIRKKLESLLKESQIRDKEDPDSFTVRALLKATHEGLNAHLKQSPDVKESGKKSHGRSLMTNFGKHKKTTKSRSKSYSTDDEEDTQQSTGKEGGQLYRLGRRRKTMKLCRELSDLVVYTNSVAAQDIVDDGTTGNVLSFSETRAHQVVQQKSEQFMIYNQKQLTRIYPSAYRIDSSNFNPLPYWNAGCQLVALNYQSEGRMMQLNRAKFKANGNCGYVLKPQQMCKGTFNPFSGDPLPANPKKQLILKVISGQQLPKPPDSMFGDRGEIIDPFVEVEIIGLPVDCCKDQTRVVDDNGFNPVWEETLTFTVHMPEIALVRFLVWDHDPIGRDFVGQRTVTFSSLVPGYRHVYLEGLTEASIFVHITINEIYGKWSPLILNPSYTILHFLGATKNRQLQGLKGLFNKNPRHSSSENNSHYVRKRSIGDRILRRTASAPAKGRKKSKMGFQEMVEIKDSVSEATRDQDGVLRRTTRSLQARPVSMPVDRNLLGALSLPVSETAKDIEGKENSLAEDKDGRRKGKASIKDPHFLNFNKKLSSSSSALLHKDTSQGDTIVSTAHMSVTGEQLGMSSPRGGRTTSNATSNCQENPCPSKSLSPKQHLAPDPVVNPTQDLHGVKIKEKGNPEDFVEGKSILSGSVLSHSNLEIKNLEGNRGKGRAATSFSLSDVSMLCSDIPDLHSTAILQESVISHLIDNVTLTNENEPGSSISALIGQFDETNNQALTVVSHLHNTSVMSGHCPLPSLGLKMPIKHGFCKGKSKSSFLCSSPELIALSSSETTKHATNTVYETTCTPISKTKPDDDLSSKAKTAALESNLPGSPNTSRGWLPKSPTKGEDWETLKSCSPASSPDLTLEDVIADPTLCFNSGESSLVEIDGESENLSLTTCEYRREGTSQLASPLKLKYNQGVVEHFQRGLRNGYCKETLRPSVPEIFNNIQDVKTQSISYLAYQGAGFVHNHFSDSDAKMFQTCVPQQSSAQDMHVPVPKQLAHLPLPALKLPSPCKSKSLGDLTSEDIACNFESKYQCISKSFVTTGIRDKKGVTVKTKSLEPIDALTEQLRKLVSFDQEDNCQVLYSKQDANQLPRALVRKLSSRSQSRVRNIASRAKEKQEANKQKVPNPSNGAGVVLRNKPSAPTPAVNRHSTGSYIAGYLKNTKGGGLEGRGIPEGACTALHYGHVDQFCSDNSVLQTEPSSDDKPEIYFLLRL。

PLC-ζ的氨基酸序列(SEQ ID NO：24)是：MEMRWFLSKIQDDFRGGKINLEKTQRLLEKLDIRCSYIHVKQIFKDNDRLKQGRITIEEFRAIYRIITHREEIIEIFNTYSENRKILLASNLAQFLTQEQYAAEMSKAIAFEIIQKYEPIEEVRKAHQMSLEGFTRYMDSRECLLFKNECRKVYQDMTHPLNDYFISSSHNTYLVSDQLLGPSDLWGYVSALVKGCRCLEIDCWDGAQNEPVVYHGYTLTSKLLFKTVIQAIHKYAFMTSDYPVVLSLENHCSTAQQEVMADNLQATFGESLLSDMLDDFPDTLPSPEALKFKILVKNKKIGTLKETHERKGSDKRGDNQDKETGVKKLPGVMLFKKKKTRKLKIALALSDLVIYTKAEKFKSFQHSRLYQQFNENNSIGETQARKLSKLRVHEFIFHTRKFITRIYPKATRADSSNFNPQEFWNIGCQMVALNFQTPGLPMDLQNGKFLDNGGSGYILKPHFLRESKSYFNPSNIKEGMPITLTIRLISGIQLPLTHSSSNKGDSLVIIEVFGVPNDQMKQQTRVIKKNAFSPRWNETFTFIIHVPELALIRFVVEGQGLIAGNEFLGQYTLPLLCMNKGYRRIPLFSRMGESLEPASLFVYVWYVR。

本发明还提供PTD和PL的片段、衍生物或类似物的缀合物。具体地，涉及PTD和PL的钙结合结构域的缀合物。PL的钙结合结构域C2对Ca²⁺活化敏感。PLC酶的C2结构域可见于以下氨基酸区域或其附近：SEQ IDNO：11(PLC-δ1)的氨基酸630-755(SEQ ID NO：25)，SEQ ID NO：13(PLC-δ3)的氨基酸661-787(SEQ ID NO：26)，SEQ ID NO：15(PLC-δ4)的氨基酸628-754(SEQ ID NO：27)，SEQ ID NO：16(PLC-β1)的氨基酸677-794(SEQID NO：28)，SEQ ID NO：17(PLC-β2)的氨基酸679-797(SEQ ID NO：29)，SEQID NO：18(PLC-β3)的氨基酸728-843(SEQ ID NO：30)，SEQ ID NO：19(PLC-β4)的氨基酸702-818(SEQ ID NO：31)，SEQ ID NO：20(PLC-γ1)的氨基酸1092-1212(SEQ ID NO：32)，SEQ ID NO：21(PLC-γ2)的氨基酸1062-1187(SEQ ID NO：33)，SEQ ID NO：22(PLC-ε1a)的氨基酸734-855(SEQ IDNO：34)，SEQ ID NO：23(PLC-ε1b)的氨基酸734-855(SEQ ID NO：35)，以及SEQ ID NO：24(PLC-ζ)的氨基酸483-606(SEQ ID NO：36)。除了C2以外，也包括PL的其他钙结合结构域。

本发明的肽缀合物可通过将PTD编码基因与PL基因融合并利用标准克隆技术和本领域技术人员已知的常规方法在体外或体内表达所述融合蛋白来制备。

PTD-PL缀合物可通过直接共价键、肽键或接头互相连接。具体地，PTD-PL缀合物可通过含有被某个酶特异性切割的区域的接头相互连接。一个实施方案中，接头DNA编码蛋白酶识别序列，由此允许在PTD和PL连接处被切割。例如，接头DNA可编码胱天蛋白酶-3识别序列(例如包含DEVD(SEQ ID NO：37)的氨基酸序列)。没有切割位点的接头(非切割接头)也可使用。接头的长度通常为1-10个氨基酸，优选1-5个氨基酸。所述接头可含有氨基酸Gly，Gly-Gly或Gly-Gly-Gly。

本发明的PTD-PL缀合物由于PTD的胞内穿透和输送作用可容易地通过细胞膜进入细胞。

也涉及PTD-PL mRNA的上述所有应用。

另一实施方案涉及利用当体内给予时阻止PTD-PL降解的抑制剂。在缺血性心脏和低氧新生儿心肌细胞中，选择性降解PTC-δ1。PLC-δ1的降解完全被钙蛋白酶抑制剂钙蛋白酶抑制蛋白以及胱天蛋白酶抑制剂zVAD-fmk抑制。因此，本发明的另一实施方案是PTD-钙蛋白酶抑制剂或PTD-胱天蛋白酶抑制剂防止PL降解的应用，由此拯救缺血性病症诱导的胞内Ca²⁺过载。所述PTD-抑制剂可单独给予或组合本发明的PTD-PL融合蛋白和/或其他化合物给予。

定义

为了方便，说明书、实施例以及所附权利要求中使用的一些术语收集在此。除非另有说明，所有技术和科学术语具有本发明所属领域技术人员通常理解的相同含义。

本发明术语“低氧”指血液或组织中的氧水平不足(例如心肌梗塞)。低氧可以是例如血管阻塞导致的血供不足造成的。

本发明术语“局部缺血”指由于供应机体某部分的血管的收缩、阻塞或阻断导致的该机体部分的血流不足或血液缺乏。局部缺血导致组织低氧。低氧或缺血相关损伤包括心脏损伤。

本发明术语“再灌注”指其血液供应中断如在心脏病发作或卒中之后先前缺血组织或器官中血液流动的恢复。

本发明术语“坏死”指细胞或组织由于损伤或疾病的死亡，特别是在身体的局部区域如心肌中。

本发明术语“凋亡”指程序性细胞死亡。

本发明术语“心脏损伤”意图包括任何与心脏和/或相关组织(例如心包、主动脉以及其他相关血管)有关的慢性或急性病理事件，包括但不限于局部缺血-再灌注损伤，充血性心衰，心跳骤停、心肌梗塞、化合物如药物(例如阿霉素，赫赛汀(herceptin)，硫利达嗪(thioridazine)和西沙必利(cisapride))导致的心脏毒性，寄生虫感染、细菌、真菌、立克次氏体或病毒(例如梅毒、慢性克鲁斯锥虫感染)导致的心脏损伤，爆发性心脏淀粉样变性病，心脏手术，心脏移植，以及创伤性心脏损伤(例如穿透性或钝性或主动脉瓣破裂)。

本发明术语“神经损伤”意图包括与脑、脊柱、神经和/或相关组织有关的任何慢性或急性病理事件，包括但不限于局部缺血-再灌注损伤，化合物如药物导致的神经毒性以及由于寄生虫感染导致的神经损伤。

本发明术语“多肽”意图包括单数或复数形式的“多肽”，并包括两或多个通过肽键连接的氨基酸的任何一或多条链。因此，本发明术语“多肽”包括但不限于“肽”、“二肽”、“三肽”、“蛋白”、“氨基酸链”、“寡肽”、“寡聚体”或任何用于指代两或多个氨基酸的一或多个链的其他术语，并且术语“多肽”可与这些术语替换或互换使用。所述术语还包括经过翻译后修饰的多肽，所述修饰例如糖基化，乙酰化，磷酸化，酰胺化，通过已知保护/阻断基团的衍生化，蛋白酶剪切，或通过非天然氨基酸的修饰。术语“蛋白”也意图包括蛋白质的片段、类似物和衍生物，其中所述片段、类似物或衍生物基本保持与参照蛋白相同的生物学活性或功能。

蛋白的“片段、衍生物或类似物”可为(i)一种蛋白质，其中一或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选保守氨基酸残基)取代并且所述取代的氨基酸残基可由遗传密码编码或不由遗传密码编码；或(ii)一种蛋白质，其中一或多个氨基酸残基包括取代基；或(iii)一种蛋白质，其中成熟多肽与另外化合物融合，如增加多肽半衰期的化合物(例如聚乙二醇)；或(iv)一种蛋白质，其中其他氨基酸与成熟多肽融合，如用于纯化所述多肽的前导或分泌序列。所述片段、衍生物和类似物认为在本发明的范围内。

具体优选这样的变体、类似物、衍生物和片段，其具有其中例如5-10、1-5、1-3、2或1个氨基酸残基以任意组合被取代、缺失或添加的蛋白质的氨基酸序列。具体优选的是沉默取代、添加或缺失，其不改变本发明蛋白的性质和活性。在这方面尤其优选保守取代。

本发明变体的实例是上文定义的融合蛋白，除了一或多个氨基酸被一或多个另外的氨基酸取代。本领域技术人员意识到各种氨基酸具有相似的形式。物质的一或多个所述氨基酸通常可被一或多个其他所述氨基酸取代而不丧失该物质的所需活性。

因此氨基酸甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸通常可互相取代(具有脂肪族侧链的氨基酸)。这些可能的取代中优选甘氨酸和丙氨酸互相取代(由于它们具有相对短的侧链)，缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸互相取代(由于它们具有较大的脂肪族疏水侧链)。其他通常可互相取代的氨基酸包括：苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸(具有芳香族侧链的氨基酸)；赖氨酸、精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸)；天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸)；天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺侧链的氨基酸)；以及半胱氨酸和蛋氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。该性质的取代通常称为“保守”或“半保守”氨基酸取代。

本发明术语“融合蛋白”、“融合多肽”、“嵌合蛋白”和“嵌合多肽”可互换使用并指代包括感兴趣的多肽或蛋白以及蛋白转导结构域(PTD)的多肽和蛋白。

本发明术语PTD-PL＂缀合物＂指代PTD蛋白与PL蛋白的融合物，以及PTD编码基因和PL基因构建体的融合物。

本发明术语“感兴趣的蛋白”、“所需多肽”、“所需蛋白”或“靶蛋白”可互换使用并指代完整蛋白分子或其部分。所述多肽或蛋白的其他部分能诱导细胞反应。

本发明术语“治疗剂”指分子，如蛋白、脂质、碳水化合物、核酸或化合物，其中当输送给对象时治疗即治愈、缓解或减轻对象中给定疾病或病症(例如局部缺血或低氧)的症状，或可任选通过减慢终末疾病或病症的进展延长对象的生命。

本发明术语“治疗性融合多肽”指这样的多肽，当输送给对象时，治疗即治愈、缓解或减轻对象中给定疾病或病症(例如局部缺血或低氧)的症状，或任选通过减慢终末疾病或病症的进展延长对象的生命。

多肽

本发明的治疗性多肽是磷脂酶蛋白(PL)，包括但不限于磷脂酶C(PLC)多肽。PLC广义上分为四类：β，γ，δ和ε，并存在总共11种同工酶。PLC-δ1在局部缺血和凋亡中通过调节线粒体通透性转换通道(mPTP)、通过钙粒子活化的蛋白酶的靶向以及胞内钙稳态而起重要作用。

本发明的多肽还包括前述多肽的片段、衍生物、类似物或变体及其任意组合，其用于预防或治疗即治愈、缓解、减轻缺血或低氧病症和/或神经损伤的严重性或预防或减轻缺血或低氧病症和/或神经损伤。

本发明的其他实施方案包括多肽，其包含与上述多肽的任意氨基酸序列至少95％相同、更优选至少96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。

实际上，任何具体多肽是否与例如SEQ ID NO：10所示氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同可利用已知计算机程序如Bestfit程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，Version 8 for Unix，GeneticsComputer Group，University Research Park 575 Science Drive，Madison，Wis.53711)常规确定。Bestfit利用Smith and Waterman，Advances in AppliedMathematics 2：482-489(1981)的局部同源性算法来发现两个序列之间同源性最高的片段。利用Bestfit或任何其他序列比对程序确定具体的序列是否与本发明的参比序列例如95％相同时，所述参数设定为使得相同性百分比针对参比氨基酸序列的全长计算并且允许同源性中的缺口可以达参比序列中氨基酸总数的5％。

多核苷酸

此外，本发明涉及编码融合蛋白或嵌合蛋白的多核苷酸，含有其的重组表达载体、质粒和其他多核苷酸构建体(总体称为“表达载体”)，用这些表达载体转化的微生物，用于获得这些多核苷酸的方法，以及利用所述载体转化的细胞。适宜的宿主细胞可用所述表达载体转化。

本发明术语“表达载体”指由遗传物质(即核酸)构成的构建体。通常表达载体含有在细菌宿主细胞例如大肠杆菌(Escherichia coli)中是功能性的复制起点以及用于检测包含所述表达载体的细菌宿主细胞的可选择标记。本发明的表达载体含有启动子序列并包括本文所述的遗传元件，其排列使得插入的编码序列可在真核细胞中转录并翻译。在本文描述的某些实施方案中，表达载体是封闭环状DNA分子。

术语“表达”指编码序列编码的产物的生物学产生。大多数情况中，包括编码序列的DNA序列被转录形成信使-RNA(mRNA)。信使-RNA随后翻译形成具有相关生物学活性的多肽产物。此外，表达过程可涉及对RNA转录产物的进一步加工步骤，如剪接去除内含子和/或多肽产物的翻译后加工。

本发明的融合蛋白或嵌合蛋白可通过重组DNA方法制备。根据本发明，编码所需蛋白的基因序列被分离、合成或以其他方式获得并与编码PTD肽的DNA序列可操纵地连接。含有与编码PTD肽的DNA序列可操纵连接的所需蛋白的基因的杂合基因称为嵌合基因。任选编码所需蛋白的基因序列通过接头序列可操纵地连接于编码PTD肽的DNA序列。

术语“接头肽”意指任何氨基酸残基序列，包含在表达的蛋白质中时优选提供亲水区的序列。所述亲水区可促进酶在蛋白酶剪切位点的切割。

嵌合基因被插入允许所需嵌合蛋白在合适的转化宿主中表达的表达载体中。所述表达载体提供具有必需调控序列以控制在适宜转化宿主中表达的插入的嵌合基因。

核酸构建体可为载体形式例如表达载体，并可包括例如染色体载体、附加型载体和病毒衍生载体例如衍生自细菌质粒、噬菌体、转座子、酵母附加体、插入元件、酵母染色体元件、病毒如杆状病毒、乳多空病毒如SV40、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、伪狂犬病毒和逆转录病毒的载体以及衍生自其组合的载体如衍生自质粒和噬菌体遗传元件的载体如粘粒或噬菌粒。通常，在这方面任何适于维持、增殖或表达核酸以在宿主中表达多肽的载体都可用于表达。

控制本发明融合蛋白表达的调节元件包括启动子区域，5′非翻译区，信号序列，嵌合编码序列，3′非翻译区以及转录终止位点。将从宿主分泌进入培养基的融合蛋白也包含信号序列。

类似地，多种翻译控制元件是本领域技术人员已知的。这些包括但不限于核糖体结合位点以及翻译起始和终止密码子。

制备重组载体以及利用其转化宿主细胞、在宿主细胞中复制所述载体并表达生物学活性异源多肽和蛋白的方法和材料在Principles of GeneManipulation，by Old and Primrose，2nd edition(1981)，和Sambrook et al.，Molecular Cloning，3rd edition，Cold Spring Harbor Laboratory(2001)中描述，其包含在内作为参考。

本发明术语“DNA多核苷酸”可为环状或线性质粒，或其他线性DNA，其也可为非感染性且非整合型(即不整合进入脊椎动物细胞基因组)。线性质粒是以前为环状但被线性化的质粒，例如用限制性内切核酸酶消化。线性DNA在某些情况下是有利的，例如Cherng，J.Y.，et al.，J.Control.Release 60：343-53(1999)，和Chen，Z.Y.，et al.，Mol.Ther.3：403-10(2001)中所述，其包含在内作为参考。

本发明的其他实施方案包括包含嵌合基因的载体，其包含与含有上述嵌合基因的载体的任何核苷酸序列至少95％相同、更优选至少96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列。

本发明的其他实施方案包括嵌合基因，其包含与上文所述嵌合基因的任何核苷酸序列至少95％相同、更优选至少96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列。

实际上，任何具体载体或嵌合基因是否与本发明的核苷酸序列至少95％，96％，97％，98％或99％相同可利用已知计算机程序如Bestfit程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，Version 8 for Unix，Genetics ComputerGroup，University Research Park 575 Science Drive，Madison，Wis.53711)常规确定。Bestfit利用Smith and Waterman，Advances in Applied Mathematics2：482-489(1981)的局部同源性算法来发现两个序列之间同源性最高的片段。利用Bestfit或任何其他序列比对程序确定特定序列是否与本发明的参比序列例如95％相同时，所述参数被设定为使得相同性百分比针对参比核苷酸序列的全长计算并且允许同源区中的缺口高达参比序列中核苷酸总数的5％。

密码子优化

“密码子优化”定义为修饰核酸序列以提高在感兴趣对象例如人的细胞中的表达，这通过用在所述对象基因中更频繁或最频繁使用的密码子取代天然序列的至少一个、超过一个或大量密码子来进行。各种物种对特定氨基酸的一些密码子显示特定偏好。

一方面，本发明涉及多核苷酸表达构建体或载体以及包含编码治疗性多肽、其片段、变体或衍生物的密码子优化的编码区的核酸片段的宿主细胞，以及利用所述多核苷酸表达构建体、载体、宿主细胞来治疗或预防对象中疾病的各种方法。

本发明术语“密码子优化的编码区”指通过用在对象基因中更频繁使用的一或多个密码子取代至少一个、超过一个或大量密码子而适于在该给定对象细胞中表达的核酸编码区。

包含编码任何多肽链的氨基酸的密码子的核苷酸序列中的衍生化造成编码所述基因的序列中的改变。由于每个密码子由三个核苷酸组成，并且包含所述核苷酸的DNA被限于四种特异碱基，存在64种可能的核苷酸组合，其中61种编码氨基酸(其余三个密码子编码翻译终止信号)。许多氨基酸通过超过一个的密码子指定。例如，丙氨酸和脯氨酸通过4种三联体编码，丝氨酸和精氨酸通过6种编码，而色氨酸和甲硫氨酸通过仅仅一种三联体编码。这种简并性允许DNA碱基组合物在广泛范围内变化而不改变DNA编码的蛋白的氨基酸序列。

共有序列

本发明进一步涉及含有嵌合基因的表达质粒，其表达具有特异共有序列的治疗性融合蛋白及其片段、衍生物或变体。“共有序列”指例如理想化的序列，其代表互相比较的两或多个序列的每个位置中最常存在的氨基酸。共有序列是理论上的代表性氨基酸序列，其中每个氨基酸都是在天然存在的不同序列中在那个位置最常出现的氨基酸。该术语也指接近理论共有序列的实际序列。共有序列可衍生自具有例如共享功能或结构目的的序列。其可通过比对尽可能多的已知特定结构或功能结构域的实例以最大化同源性来定义。当每个特定氨基酸在其位置中合理地处于优势时，序列通常被认为是共有序列，并且大多数形成比较基础的序列通过相当少的取代例如0-大约100个取代而与共有序列相关。通常，野生型比较序列与共有序列至少约50％，75％，80％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同。相应地，本发明的多肽与共有序列至少约50％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相同。

“共有氨基酸”是被选择占据共有蛋白中给定位置的氨基酸。被组织用于选择共有氨基酸的系统可为一个计算机程序或一或多个计算机程序与“by hand”分析和计算的组合。当获得比对的氨基酸序列的每个位置的共有氨基酸时，这些共有氨基酸被“排列”以获得共有蛋白的氨基酸序列。

治疗应用

本发明涉及上述治疗性融合蛋白在制备用于缓解或治疗缺血性疾病或病症和/或神经损伤的药物中的应用。导致心脏和脑中低氧的缺血性疾病或病症可通过给予PTD-PLC融合蛋白有效缓解。

通常，钙离子在缺血事件中的内流导致线粒体通道开放，由此进一步增加胞内钙浓度并活化许多胞质蛋白如蛋白酶和核酸内切酶。钙活化的蛋白酶降解通常调节胞内钙水平的蛋白，由此降低蛋白对钙的反应性。这导致心肌肥大、心衰、凋亡或坏死，PLC-δ1发挥功能抑制钙内流，而过量钙存在细胞质中。

本发明治疗性融合蛋白可与一或多种化合物或构建体共同给予。其他化合物包括但不限于抗血小板药物，抗凝药物或抗血栓药物。其他构建体包括但不限于PTD-钙蛋白酶或PTD-胱天蛋白酶抑制剂以防止PLC的降解。

本发明的治疗性融合蛋白可靶向以下细胞或细胞类型：心血管细胞如心肌细胞，心室肌细胞，心房肌细胞，心脏干细胞，内皮细胞，血管平滑肌细胞，起搏细胞，肌成纤维细胞或成纤维细胞和神经细胞如神经元(也称为神经细胞)。

方法和施用

本发明提供输送治疗性融合多肽或其片段、变体或衍生物的方法，其与一或多种药学可接受载体或赋形剂混合。治疗性融合多肽作为重组蛋白特别是融合蛋白或纯化的亚基提供，其包含给予对象一或多种本文所述的组合物；从而在给予如本发明所述的组合物时，在对象中产生治疗性反应。所述输送可例如通过皮肤、鼻、眼、肌肉内、脑或心脏、或通过静脉内注射进行。

术语“对象”意图涵盖活生物体如人、猴、母牛、绵羊、马、猪、牛、山羊、犬、猫、小鼠、大鼠、来自其的培养细胞以及其转基因物种。优选实施方案中，所述对象是人。

术语“脊椎动物”意图涵盖一或多种“脊椎动物”并包括哺乳动物和鸟类以及鱼类、爬行动物和两栖动物。

术语“哺乳动物”意图涵盖一或多种“哺乳动物”并包括但不限于人；灵长类如猿，猴(例如枭猴，松鼠猴，cebus，恒河猴，非洲绿猴，patas，食蟹猴以及猕猴)，猩猩，狒狒，长臂猿和黑猩猩；犬科动物如狗和狼；猫科动物如猫，狮子和虎；马科动物如马，驴和斑马，食品动物如母牛，猪和绵羊；有蹄类动物如鹿和长颈鹿；熊科动物如熊；以及其他如兔，小鼠，雪貂，海豹，鲸鱼。特别地，所述哺乳动物可为人对象，食品动物或陪伴动物。

术语“鸟”意图包括一或多种鸟并包括并不限于野生水鸟如鸭，鹅，燕鸥，鹱和鸥；以及家禽如火鸡、鸡、鹌鹑、雉鸡、鹅和鸭。术语“鸟”也涵盖雀形目鸟类如八哥和虎皮鹦鹉。

本发明还提供产生、增强或调节治疗反应的方法，包括给予人一或多种本文所述的组合物。在该方法中，所述组合物可包括一或多种多肽或其片段、变体或衍生物，其中所述蛋白作为重组蛋白特别是融合蛋白或纯化的亚基提供。

本发明中“治疗反应”指当将本发明的组合物输送给对象时引发该对象对所述组合物的阳性反应的能力。

如上所述，本发明的组合物可用于治疗性治疗并预防疾病或疾病病症。如上所述，“治疗”指利用一或多种本发明的组合物预防、治愈、延缓或减轻对象中疾病或疾病症状的严重性和/或使得疾病不再恶化。

作为本发明一部分的由局部缺血/低氧导致或导致局部缺血/低氧的疾病或疾病病症包括但不限于钙过载，心脏缺氧，心脏缺氧-再氧化，心脏缺血-再灌注损伤，缺血性心脏病，心衰，心脏肥大，心脏手术，创伤性心脏损伤，冠状动脉血管成形术，血管缺陷或阻塞(血流阻塞)，先天性心脏病，充血性心衰，心脏细胞肌肉再生，化疗诱导的心肌病，心肌梗塞，心跳骤停，心脏毒性，由于寄生虫感染导致的心脏损害、暴发性心脏淀粉样变性病，心脏移植或创伤性心脏损伤。

作为本发明一部分的由局部缺血/低氧导致或导致局部缺血/低氧的其他疾病或疾病病症包括但不限于创伤性脑损伤，神经学疾病或损伤，神经疾病或损伤(例如脊髓)，冻伤性损害，缺血或出血性卒中，颅内出血(蛛网膜下出血，溶栓诱导的等)，血液凝结，低氧诱导的凋亡以及缺血-再灌注后组织损伤。

术语“预防”指利用本发明的一或多种组合物产生对象中的治疗反应。不需要本发明的任何组合物完全治愈或消除所有疾病症状。

一些实施方案中，本发明的一或多种组合物通过上述方法输送到对象，由此实现有效的治疗反应。更特别地，本发明的组合物可给予对象的任何组织，包括但不限于皮肤、肌肉、脑组织、肺组织、肝组织、脾组织、骨髓组织、胸腺组织、心脏组织例如心肌、心内膜以及心包膜，淋巴组织，血液组织、骨组织、胰腺组织、肾组织、胆囊组织、胃组织、肠组织、睾丸组织、卵巢组织、子宫组织、阴道组织、直肠组织、神经系统组织、眼组织、腺组织、舌组织和结缔组织例如软骨。优选的组织是心脏和脑组织。

此外，本发明的组合物可给予对象的任何内部腔，包括但不限于肺、口、鼻腔、胃、腹膜腔、肠、任何心室、静脉、动脉、毛细血管、淋巴腔、子宫腔、阴道腔、直肠腔、关节腔、脑室、脊髓中的脊椎管、眼腔、唾液腺或肝的导管腔。当本发明的组合物给予唾液腺或肝的导管腔，所需的多肽在唾液腺和肝中表达，使得所述多肽从唾液腺或肝之一输送到对象的血流中。利用唾液腺、肝和胰腺释放所需多肽进入血流从而给予胃肠系统的分泌器官的一些模式在美国专利5,837,693和6,004,944中公开，其均全文包含在内作为参考。

根据揭示的方法，本发明的组合物

根据揭示的方法，本发明的组合物可通过注射，静脉内(i.v.)，肌内(i.m.)，皮下(s.c.)或肺内途径给予。给予的其他适宜途径包括但不限于气管内滴注，透皮、眼内、鼻内、吸入、腔内、导管内(例如进入胰腺)和实质内(例如进入任何组织)给予。对于静脉内给予，可使用适宜的药学可接受载体如磷酸盐缓冲盐水，盐水或其他用于静脉内给予的材料。透皮输送包括但不限于皮内(例如进入真皮或表皮)，透皮(例如经皮)和透粘膜给予(即进入或通过皮肤或粘膜组织)。腔内给予包括但不限于给予口、阴道、直肠、鼻、腹膜或肠腔内以及鞘内(即进入脊椎管)，室内(即进入脑室或心室)，房内(即进入心房)以及蛛网膜下(即进入脑的蛛网膜下空间)给予。

给予的任何模式均可使用，条件是所述模式导致所需肽或蛋白在所需组织中以这样的量输送或表达，所述量足以产生对人的疾病病症的治疗反应，所述人需要所述反应。

本发明的给予方式包括针头注射(例如无菌含水分散液，优选等张的)，透皮，导管输注，生物射弹注射器，粒子加速器(例如“基因枪”或气动“无针”注射器)Med-E-Jet(Vahlsing，H.，et al.，J.Immunol.Methods 171：11-22(1994))，Pigjet(Schrijver，R.，et al.，Vaccine 15：1908-1916(1997))，Biojector(Davis，H.，et al.，Vaccine 12：1503-1509(1994)；Gramzinski，R.，et al.，Mol.Med.4：109-118(1998))，AdvantaJet(Linmayer，I.，et al.，Diabetes Care 9：294-297(1986))，Medi-jector(Martins，J.，and Roedl，E.J.，Occup.Med.21：821-824(1979))，明胶海绵库(gelfoam sponge depots)，其他可商购的贮存材料(例如水凝胶)，渗透泵(例如Alza微型真空泵)，口服或栓剂固体药物配制剂，如片剂，丸剂，软胶囊和硬胶囊，液体，悬液，糖浆，颗粒和酏剂，局部皮肤油膏或凝胶，以及利用多核苷酸包被缝线进行的倾析(Qin，Y.，et al.，Life Sciences 65：2193-2203(1999))或者在手术过程中的局部应用。

给予的某些模式是肌内针头注射和通过导管输注的肺应用。能量辅助质粒输送(energy-assisted plasmid delivery，EAPD)法也可用于给予本发明的组合物。一种所述方法涉及对注射组织利用短电脉冲，这种方法通常已知为电穿孔。参见Mir，L.M.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA 96：4262-7(1999)；Hartikka，J.，et al.，Mol.Ther.4：407-15(2001)；Mathiesen，I.，Gene Ther.6：508-14(1999)；Rizzuto G.，et al.，Hum.Gen.Ther.11：1891-900(2000)。本段中的每篇文献都全文包含在内作为参考。

确定本发明的一或多种组合物的有效量有赖于多种因素，包括例如被表达或直接给予的融合多肽、其变体或衍生物，对象的年龄、体重和性别，需要治疗的具体病症及其严重度，给予途径，融合多肽的体内半衰期，摄取效率以及待治疗区域。基于临床判断，根据患者反应，如需要可重复治疗。

“药物有效量”或“治疗有效量”指足以产生对疾病病症的治疗或临床反应的量。术语“药物有效量”或“治疗有效量”可互换使用。基于上述因素，确定精确的量，剂量数以及给予时间是本领域技术人员能力范围内的并可通过临床医师或兽医容易确定。

对于给予哺乳动物，特别是人，预期活性药物的日剂量为从0.01mg/kg体重起，通常大约1mg/kg。上述剂量是平均病例的示例。当然，可存在更高或更低剂量有利的情况，包括皮摩尔和纳摩尔浓度，并且这在本发明的范围内。

本发明还涉及包含本文所述融合多肽以及其他药学活性物质的组合物。所述融合多肽和结合的药学活性物质可与药学可接受的一或多种载体或赋形剂联用。所述载体可包括但不限于稀释剂(例如乳糖，葡萄糖，蔗糖，甘露糖，山梨醇，纤维素和/或甘氨酸)，润滑剂(例如二氧化硅，滑石，硬脂酸和聚乙二醇)，粘合剂(例如硅酸镁铝，淀粉糊，明胶，黄蓍胶，甲基纤维素，羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮)和崩解剂如淀粉，琼脂，藻酸或其钠盐，和/或吸收剂，着色剂，香味剂和甜味剂，盐水，缓冲盐水，脂质体，水，甘油，乙醇，及其组合。

本发明的组合物可在任何不同的缓冲液中溶解。适宜缓冲液包括例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)，生理盐水，Tris缓冲液和磷酸钠(例如150mM磷酸钠)。不溶多核苷酸可溶于弱酸或弱碱，然后用缓冲液稀释至所需体积。缓冲液的pH可适当调节。此外，药学可接受添加剂可用于提供适宜的渗透性。所述添加剂在本领域技术人员的范围内。对于体内使用的含水组合物，可使用无菌无热原水。所述配制剂含有有效量的多核苷酸以及适宜量的含水溶液以制备适合给予人的药学可接受组合物。

本发明的组合物可根据已知方法配制。适宜的制备方法可在例如以下文献中描述：Remington′s Pharmaceutical Sciences，16th Edition，A.Osol，ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1980)，和Remington′s PharmaceuticalSciences，19th Edition，A.R.Gennaro，ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1995)，其均全文包含在此作为参考。尽管所述组合物可作为含水溶液给予，其也可配制为乳剂、凝胶、溶液、悬液、冻干形式或本领域已知的其他形式。

以下实施例仅仅为了举例说明并非意图限制权利要求限定的本发明的范围。所有在实施例中引用的参考文献都全文包含在此作为参考。

实施例

实施例1

包含PTD-PLC-δ1的表达载体的制备

为了将编码HSP-70的碱基序列与编码人转录因子Hph-1(GenBank登录号U63386)N末端的858位酪氨酸到868位氨基酸的肽区域的碱基序列相连，合成具有以下碱基序列的引物：对应用于克隆进pET28B(+)载体的限制酶BamHI的碱基序列，所述载体具有Hph-1的N末端的858位酪氨酸到868位精氨酸的碱基序列；以及对应限制酶HindIII的碱基序列，所述酶用于利用对应所述碱基序列的5’-末端以及PTD-PLC-δ1的3’末端的序列进行克隆。PCR利用上述引物、利用含有PTD-PLC-δ1蛋白的整个基因的pRS载体(可购自Invitrogen)作为模板以及pfu turbo DNA聚合酶(Stratagene，cat.#600252-51)进行。

PCR反应产物利用限制酶EcoRI和HindIII切割，并用Quiaquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN，cat.# 28104)纯化。纯化的产物克隆入利用凝胶提取方法纯化的pET28B(+)的BamHI和HindIII位点。制备的重组载体命名为＂pPTD-PLC-δ1.＂

实施例2

大肠杆菌转化体的制备以及融合蛋白的表达和纯化

大肠杆菌BL21-DE3(ATCC No.53863)用实施例1中制备的表达载体pPTD-PLC-δ1转化，通过热休克转化进行，并且将转化的大肠杆菌菌株接种4ml LB培养基并在37℃搅拌下预培养14小时。然后将预培养培养基接种250ml LB培养基(10g酪蛋白胰消化物，5g酵母提取物，10g氯化钠)并在37℃培养3小时。然后将1mM IPTG(异丙基β-D-硫代半乳糖苷；GibcoBRLcat.#15529-019)加入培养基，将混合物在22℃培养8小时以诱导融合蛋白的表达。培养基在4℃、6000rpm离心20分钟，去除上清，留下沉淀。将沉淀溶于10ml缓冲液1(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，10mM咪唑，pH8.0)中，用超声处理器(Heat systems，ultrasonic processor XL)在冰上以强度300W超声6秒，然后冷却。重复超声和冷却步骤使得总超声时间达8分钟。裂解物在4℃、12000离心10分钟，去除破坏的大肠杆菌细胞，仅仅收集纯裂解物。向收集的裂解物中加入0.5ml50％Ni²⁺-NTA琼脂糖糖浆(Qiagen，cat# 30230)，悬液在4℃、200rpm搅拌1小时，使得融合蛋白和Ni²⁺-NTA琼脂糖互相结合。所述混合物通过0.8 x 4cm层析柱(BioRad，cat.#731-1550)。所得材料利用4ml缓冲液2(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，20mM咪唑，pH7.9)洗涤两次，用1ml缓冲液3(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，250mM咪唑，pH8.0)和1ml缓冲液4(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，500mM咪唑，pH8.0)处理，由此获得融合蛋白级分。所述级分用PD-10脱盐柱(Amersham-Pharmacia Biotech cat.# 17-0851-01)脱盐。对分离纯化的PTD-PLC-δ1融合蛋白进行SDS-PAGE，随后用考马斯蓝染色分析，结果示于图1。

实施例3

PTD-PLC-δ1预防心肌细胞局部缺血

分离每只1-3天大的白色大鼠的心脏并置于PBS中，仅仅分离左心室并随后用显微解剖剪切成约1mm³的大小，加入5ml胶原蛋白酶II(0.8mg/ml，262单位/mg，Gibco BRL)。将悬液置于5％CO₂培养箱在37℃放置5分钟，去除漂浮的胶原蛋白酶II。将5ml新鲜胶原蛋白酶II加入其中并混悬，使所述悬液再放置5分钟，将上清转移入新鲜试管。加入5ml细胞培养基(含10％FBS的α-MEM，Gibco BRL)，1200rpm离心细胞溶液4分钟，收集细胞。上述方法重复7-9次，直到基本上没有残留的组织，将分离为单个细胞的细胞悬液收集在一个试管中。所述细胞在100-mm组织培养板上培养1-3小时，仅仅允许成纤维细胞附着于所述板，收集不附着于所述板的细胞，以浓度5×10⁵细胞/ml接种并培养。4-6小时后，置换为新鲜培养基，然后加入0.1mMBrdU抑制成纤维细胞生长，同时将各种浓度的(对照组浓度0μM，受试组浓度为0.1μM，0.5μM和1.0μM)的PTD-PLC-δ1蛋白加入培养的心肌细胞。随后将细胞在低氧条件下培养12小时。在低氧条件下的培养在密封加湿小室(Anaerobic Environment，ThermoForma，Marietta，OH，USA)中进行，其保持在37℃并持续供给10％CO₂，5％H₂和85％N₂混合气的条件下。作为培养步骤中的培养基，可使用仅含1％胎牛血清的培养基。培养的细胞利用抗-PTD-PLC-δ1抗体通过Western印迹分析。

结果显示PTD-PLC-δ1蛋白的输送效应以浓度依赖方式增加。可见低氧条件下培养12小时的心肌细胞中的PTD-PLC-δ1蛋白保持浓度梯度0-500nM，并且细胞存活随剩余的PTD-PLC-δ1蛋白的浓度梯度增加(见图2A)。此外，细胞存活随剩余PTD-PLC-δ1蛋白的浓度梯度增加(见图2B)。

实施例4

PTD-PLC-δ1抑制缺血心肌细胞中的钙过载

细胞质中游离Ca²⁺浓度的测定通过共聚焦显微镜分析进行。对于低氧条件下的心肌细胞，加入1μM浓度的纯化PTD-PLC-δ1，随后培养细胞12小时并测定钙浓度。为此，在用层粘连蛋白(5g/cm²)包被的玻璃薄切片上，新生白色大鼠的心肌细胞培养在包含0.1mM BrdU的细胞培养基(含10％FBS的MEM，Gibco BRL)培养1天。培养结束之后，用改良的Tyrode’s溶液洗涤细胞，所述溶液由0.265g/l CaCl₂，0.214g/l MgCl₂，0.2g/l KCl，8.0g/l NaCl，1g/l葡萄糖，0.05g/l NaH₂PO₄和1.0g/l NaHCO₃组成。改良的Tyrode′s溶液与2μM氟代-4乙酰氧甲基酯(氟代-4AM，Molecular Probes，Eugene，OR)在暗室在室温加载20分钟。荧光图像利用氩激光共聚焦显微镜(Leica，Solms，德国)捕获。荧光染料利用设置在488nm的氩激光激发，荧光的发射通过。510-560nm带通滤波器收集。胞内游离Ca²⁺的相对改变通过测定荧光强度来确定。

结果显示在低氧条件下培养12小时的心肌细胞中的钙过载比氧气条件下保温的对照组中的高大约3倍。然而，低氧条件下的心肌细胞用100nM的PTD-PLC-δ1蛋白处理时，胞内钙过载恢复到与对照组大约相等的水平(见图3)。

实施例5

PTD-PLC-δ1对心肌梗塞动物模型中心脏缺血区的治疗的作用

白色大鼠中的心肌梗塞通过左前降冠状动脉结扎后再灌注诱导。常规麻醉之后，对8周龄Sprague-Dawley雄性大鼠(每只体重大约205g)气管内插管，随后正压通气(180ml/min)，通气利用Harvard呼吸机用含氧(2L/min)室内空气保持。大鼠心脏通过左胸廓切开术暴露，左前降冠状动脉用5-0丝线结扎，然后保持1小时。左前降冠状动脉结扎1小时之后，静脉内注射100nM的PTD-PLC-δ1到大鼠中，同时松开结扎。

在一组中(n＝3)，为了确定心脏缺血区域中PLC-δ1的量，再灌注3小时，分析组织中PLC-δ1蛋白的残余量。另一组中(n＝3)，为了测定PTD-PLC-δ1对缺血区域中心肌细胞存活的作用，再灌注在结扎松开之后持续2周。松开结扎之后，动物饲养在饲养房其正常环境中2周，然后分离心脏。

分离的心脏用10％(v/v)中性缓冲甲醛灌注，在甲醛中固定，横切成厚度相同的四个切片，根据常规方法包埋在石蜡中。将2-μm厚的切片置于凝胶涂覆的载玻片上，使得染料在移植组织区域的连续切片上起作用。去除石蜡并再水化之后，用苏木精和伊红染色切片以观察细胞学细节如细胞核，细胞质以及结缔组织。

PLC-δ1量的分析显示在肾和肝中，注射了PTD-PLC-δ1的受试组与对照组没有区别。但在心脏中，注射的PTD-PLC-δ1蛋白大量存在，蛋白激酶C的磷酸化大大提高(见图4)。

PTD-PLC-δ1对心肌细胞存活的作用的分析显示静脉内注射了PTD-PLC-δ1的组中心肌细胞的存活率大大高于对照组的(见图5)。

应理解说明书部分而非摘要意图用于解释权利要求书。摘要部分可能提到本发明一或多个示例性的实施方案但并非全部，因此并非意图以任何方式限制本发明和以及所附的权利要求书。

序列表

<110>为人技术株式会社

<120>用于缓解和治疗缺血性病症的药物组合物及其输送方法

<130>2435.003PC01/EKS/GLL

<140>To Be Assigned

<141>Herewith

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>11

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>1

<210>2

<211>9

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>2

<210>3

<211>11

<212>PRT

<213>HIV

<400>3

<210>4

<211>16

<212>PRT

<213>Drosophila sp.

<400>4

<210>5

<211>34

<212>PRT

<213>HSV

<400>5

<210>6

<211>7

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>6

<210>7

<211>26

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>7

<210>8

<211>21

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>8

<210>9

<211>21

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>9

<210>10

<211>2271

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>10

<210>11

<211>756

<212>PRT

<213>Homo Sapien

<400>11

<210>12

<211>2370

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>12

<210>13

<211>789

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>13

<210>14

<211>2289

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>14

<210>15

<211>762

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>15

<210>16

<211>1216

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>16

<210>17

<211>1181

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>17

<210>18

<211>1234

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>18

<210>19

<211>1194

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>19

<210>20

<211>1290

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>20

<210>21

<211>1265

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>21

<210>22

<211>1002

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>22

<210>23

<211>1693

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>23

<210>24

<211>608

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>24

<210>25

<211>127

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>25

<210>26

<211>129

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>26

<210>27

<211>135

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>27

<210>28

<211>540

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>28

<210>29

<211>503

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>29

<210>30

<211>507

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>30

<210>31

<211>493

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>31

<210>32

<211>199

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>32

<210>33

<211>204

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>33

<210>34

<211>269

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>34

<210>35

<211>960

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>35

<210>36

<211>126

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>36

<210>37

<211>4

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>37

Claims

1.融合多肽，其包含蛋白转导结构域(PTD)和磷脂酶C多肽。

2.权利要求1的融合多肽，其中所述磷脂酶C多肽包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列。

3.权利要求1的融合多肽，其中所述磷脂酶C多肽包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列。

4.权利要求1的融合多肽，其中所述磷脂酶C多肽包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列。

5.权利要求1的融合蛋白，其中所述蛋白转导结构域(PTD)包含选自下组的氨基酸序列：

(i)SEQ ID NO：1；

(ii)SEQ ID NO：2；

(iii)SEQ ID NO：3；

(iv)SEQ ID NO：4；

(v)SEQ ID NO：5；

(vi)SEQ ID NO：6；

(vii)SEQ ID NO：7；

(viii)SEQ ID NO：8；和

(ix)SEQ ID NO：9。

6.权利要求1的融合蛋白，其中所述PTD和磷脂酶C多肽通过直接的共价键、肽键或接头相互连接。

7.权利要求6的融合蛋白，其中所述接头是包含1-5个氨基酸的非切割接头。

8.权利要求7的融合蛋白，其中所述接头包含Gly-Gly-Gly。

9.权利要求6的融合蛋白，其中所述接头是切割接头。

10.药物组合物，其包含权利要求1的融合蛋白与一或多种药学可接受赋形剂的混合物。

11.权利要求10的药物组合物，还包含至少一种抗血小板药物，抗凝药物或抗血栓药物。

12.融合多肽，其包含蛋白转导结构域(PTD)以及与磷脂酶C多肽至少90％相同的氨基酸序列。

13.减轻或预防对象中钙过载的方法，包括给予需要的对象治疗有效量的融合多肽，所述融合多肽包含蛋白转导结构域(PTD)和磷脂酶C多肽。

14.权利要求13的方法，其中所述磷脂酶C多肽是磷脂酶C-δ多肽。

15.权利要求13的方法，其中所述钙过载由低氧、局部缺血、心血管疾病、心血管损伤、神经疾病或神经损伤引起。

16.权利要求15的方法，其中所述低氧或局部缺血是血供缺乏的结果。

17.权利要求16的方法，其中所述血供缺乏是血管阻塞的结果。

18.权利要求13的方法，其中所述钙过载在心脏或脑中。

19.权利要求15的方法，其中所述低氧由心肌梗塞造成。

20.权利要求13的方法，其中所述方法减轻或抑制神经细胞死亡。

21.权利要求20的方法，其中所述神经细胞是神经元。

22.权利要求15的方法，其中所述神经疾病是缺血性或出血性卒中。

23.权利要求15的方法，其中所述方法减轻或抑制低氧诱导的心血管细胞的细胞死亡。

24.权利要求23的方法，其中所述心血管细胞是心肌细胞，心室肌细胞，心房肌细胞，心脏干细胞，内皮细胞，血管平滑肌细胞，起搏细胞，肌成纤维细胞或成纤维细胞。

25.权利要求15的方法，其中所述心血管疾病或损伤选自由心脏缺氧、心脏缺氧-再氧化，心脏缺血后再灌注，缺血性心脏病，心衰，心脏肥大，心脏手术，冠状动脉血管成形术，血管缺陷，先天性心脏病，充血性心衰，心脏细胞肌肉再生，化疗诱导的心肌病，心肌梗塞，心跳骤停，心脏毒性，由于寄生虫感染导致的心脏损害，暴发性心脏淀粉样变性病，心脏移植和创伤性心脏损伤组成的组。

26.权利要求25的方法，其中所述融合多肽在缺血后再灌注之前、缺血后再灌注开始时或缺血后再灌注期间给予。

27.权利要求25的方法，其中所述心血管损伤是心肌梗塞。

28.权利要求25的方法，其中所述心脏毒性是阿霉素造成的。

29.权利要求25的方法，其中所述寄生虫感染导致的心脏损害来自梅毒或慢性克鲁斯锥虫感染。

30.权利要求25的方法，其中所述创伤性心脏损伤是通过穿透性或钝性心脏损伤或主动脉瓣破裂造成。

31.权利要求25的方法，其中在患有心衰的对象中预防卒中的出现。

32.权利要求13的方法，其中钙过载限于所述对象的机体部分。

33.权利要求32的方法，其中所述机体部分是脑、脊髓、心脏或移植的器官或肢体。

34.权利要求13的方法，其中所述融合多肽以皮摩尔浓度应用。

35.权利要求13的方法，其中所述融合多肽静脉内给予。

36.权利要求35的方法，其中所述给予靶向心脏。

37.权利要求13的方法，其中所述融合多肽通过注射给予。

38.权利要求37的方法，其中所述注射是直接注入心脏或肌肉组织。

39.权利要求13的方法，其中所述融合多肽透皮给予。

40.权利要求20的方法，其中所述细胞死亡是坏死或凋亡。

41.预防患有低氧的对象中局部缺血-再灌注损伤的方法，包括用治疗有效量的融合多肽对所述对象进行预治疗，所述融合多肽包含蛋白转导结构域(PTD)和磷脂酶C多肽。

42.权利要求41的方法，其中所述磷脂酶C多肽是磷脂酶C-δ多肽。

43.降低细胞中游离钙离子浓度的方法，包括给予细胞有效量的融合多肽，所述融合多肽包含蛋白转导结构域(PTD)和磷脂酶C多肽。

44.权利要求43的方法，其中所述磷脂酶C多肽是磷脂酶C-δ多肽。

45.预防器官或组织移植过程中器官或组织损伤的方法，包括将包含蛋白转导结构域(PTD)和磷脂酶C多肽的融合多肽与一或多个器官或组织在再灌注之前、期间或之后接触。

46.权利要求45的方法，其中所述磷脂酶C多肽是磷脂酶C-δ多肽。

47.权利要求45的方法，其中所述接触是在取出所述器官之前或同时通过给予器官供体包含蛋白转导结构域(PTD)和磷脂酶C多肽的融合多肽来进行。

48.权利要求45的方法，其中所述器官是供体心脏。

49.减轻或抑制心血管细胞的低氧诱导的细胞死亡的方法，包括静脉内给予需要的对象治疗有效量的包含蛋白转导结构域(PTD)和磷脂酶C-δ1多肽的融合多肽，其中所述低氧由心肌梗塞导致，并且其中所述给予在缺血后再灌注之前、缺血后再灌注开始时或缺血后再灌注期间。

50.权利要求1的融合多肽，其中所述磷脂酶多肽包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列。

51.权利要求1的融合多肽，其中所述磷脂酶多肽包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列。

52.权利要求1的融合多肽，其中所述磷脂酶多肽包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列。

53.权利要求1的融合多肽，其中所述磷脂酶多肽包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列。

54.权利要求1的融合多肽，其中所述磷脂酶多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列。

55.权利要求1的融合多肽，其中所述磷脂酶多肽包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列。

56.权利要求1的融合多肽，其中所述磷脂酶多肽包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列。

57.权利要求1的融合多肽，其中所述磷脂酶多肽包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列。

58.权利要求1的融合多肽，其中所述磷脂酶多肽包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列。

59.融合多肽，其包含蛋白转导结构域(PTD)以及磷脂酶C多肽的钙结合结构域(C2)。

60.权利要求59的融合多肽，其中所述钙结合结构域包含SEQ IDNO：25的氨基酸序列。

61.权利要求59的融合多肽，其中所述钙结合结构域包含SEQ IDNO：26的氨基酸序列。

62.权利要求59的融合多肽，其中所述钙结合结构域包含SEQ IDNO：27的氨基酸序列。

63.权利要求59的融合多肽，其中所述钙结合结构域包含SEQ IDNO：28的氨基酸序列。

64.权利要求59的融合多肽，其中所述钙结合结构域包含SEQ IDNO：29的氨基酸序列。

65.权利要求59的融合多肽，其中所述钙结合结构域包含SEQ IDNO：30的氨基酸序列。

66.权利要求59的融合多肽，其中所述钙结合结构域包含SEQ IDNO：31的氨基酸序列。

67.权利要求59的融合多肽，其中所述钙结合结构域包含SEQ IDNO：32的氨基酸序列。

68.权利要求59的融合多肽，其中所述钙结合结构域包含SEQ IDNO：33的氨基酸序列。

69.权利要求59的融合多肽，其中所述钙结合结构域包含SEQ IDNO：34的氨基酸序列。

70.权利要求59的融合多肽，其中所述钙结合结构域包含SEQ IDNO：35的氨基酸序列。

71.权利要求59的融合多肽，其中所述钙结合结构域包含SEQ IDNO：36的氨基酸序列。

72.权利要求9的融合多肽，其中所述接头包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列。