KR101574630B1 - 허혈성 질환의 완화 및 치료를 위한 약학 조성물 및 그를 전달하기 위한 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 허혈에 의해 야기되는 질환 및 질병을 치료하기 위한 약학 조성물에 관한 것이다. 상기 약학 조성물은 포스포리파제(PL) 폴리펩티드 및 단백질 형질도입 영역(PTD)의 결합체를 함유한다. PLC-δ는 세포질내 칼슘 수준의 조절에 주요한 역할을 한다. 심근 허혈시에, 세포질내 칼슘 축적은 병원성 변화를 매개한다. 본 발명에 따르면, 심장 및 뇌와 같은 조직에서 저산소증을 야기하는 허혈성 질환 또는 질병이 PTD-PL 결합체의 투여에 의해 예방되거나 완화될 수 있다.
Description
본 발명은 포스포리파제 폴리펩티드와 같은 중요한 분자 및 단백질 형질도입 영역(protein transduction domain, PTD)의 결합체를 함유하는, 허혈의 치료를 위한 신규 약학 조성물, 및 그를 전달하기 위한 방법에 관한 것이다.
신체는 혈액을 펌핑하는 심장에 결정적으로 의존한다. 건강한 심장은 산소 및 영양분의 전달 및 유해한 대사 산물의 제거를 위해 신체 전체에 혈액을 펌핑한다. 허혈은 심근 대사 및 심장 및 세포 손상에서 급속한 변화를 야기한다. 손상의 정도는 허혈의 중증도 및 적절한 치료의 적시성에 따라 달라진다. 지속되는 허혈은 수시간내에 전체 조직 괴사를 야기할 수 있다.
재관류는, 일반적으로 유리한 것으로 간주되지만, 여러 메카니즘에 의해 조직 손상을 야기한다. 임상적으로, 개심술, 심장 이식, 및 심장 질환의 역전에서, 허혈-재관류에 의한 손상에 대한 심근의 보호가 최대의 임상적 관심을 끄는 문제이 다. 재관류에 의한 산소화(재산소화)의 회복후에 저산소성 손상의 악화는 다른 유형의 장기 이식에서 및 간, 장, 뇌, 신장 및 기타 허혈성 증후군에서 세포 손상의 중요한 메카니즘이다.
허혈 및 자극성 허혈성 질환은 활성 산소종의 증가 및 칼슘 이온(Ca2+)의 과부하를 야기한다[Bolli, R., et al., Physiol. Rev., 79:609-634, 1999]. 세포질내 칼슘 축적은 심근 허혈시에 일어나는 병리학적 변화의 매개인자로서 제안되었다[Moraru, I.I., et al., Biochim. Biophys. Acta, 1268:1-8, 1995]. 세포내 칼슘의 증가는 미토콘드리아 투과 전이 기공(mPTP)의 개방을 야기한다. 세포내 칼슘의 증가는 또한 또 다른 mPTP의 개방을 증대시키며, 또한 많은 세포질내 단백질, 예를 들면, 포스포리파제, 단백질 키나제, 프로테아제 및 엔도뉴클레아제를 활성화시킨다[Bolli, R., et al., Physiol. Rev., 79:609-634, 1999]. mPTP 억제제인 사이클로스포린 A 및 상글리페린 A를 사용한 치료를 허혈후 재관류에서 수행하는 경우, 세포질 기능의 회복 및 세포의 생존율이 각각 약 20% 및 62% 증가하는 것으로 보고되었다[Javadov, S.A. et al., J. Physiol., 549:513-524, 2003].
포스포리파제 C(PLC)와 같은 포스포리파제는 칼슘 항상성의 조절에 중요한 역할을 한다. 지금까지, 11개의 포유동물 PLC 동위효소가 확인되었다. 이들은 다음 4가지 유형으로 분류될 수 있다: PLC-β, PLC-γ, PLC-δ 및 PLC-ε. PLCδ1 및 γ1이 정상적인 심장 세포에서 우세한 형태들이다[Hansen, C.A., et al., J. Mol. Cell. Cardiol., 27:471-484, 1995; and Schnabel, P., et al., J. Mol. Cell. Cardiol., 28:2419-2427, 1996].
모든 PLC 동위효소들은 Ca2+ 활성화에 민감한 C2 영역을 함유한다[Hwang, K.C., et al., J. Steroid Biochem., 91:131-138, 2004]. PLC 아이소폼(isoform)중에서, PLC-δ1이 세포내 Ca2+에 의한 활성화에 가장 민감하다[Hwang, K.C., et al., J. Steroid Biochem., 91:131-138, 2004].
PLC는 막 인지질인 포스파티딜이노시톨 4,5-비스포스페이트(PIP2)를 가수분해시켜 다이아실글리세롤(DAG) 및 이노시톨 1,4,5-트라이포스페이트(IP3)를 생성한다[Hwang, K.C., et al., J. Steroid Biochem., 91:131-138, 2004]. DAG 및 IP3은 단백질 키나제 C(PKC)의 활성 및 세포내 저장소로부터 세포질로의 칼슘 이온의 방출을 자극한다[Hwang, K.C., et al., J. Steroid Biochem., 91:131-138, 2004]. PLC의 활성화 메카니즘은, G-단백질-커플링된 수용체, 수용체 티로신 키나제 및 ras 경로에 의해 각각 활성화되는 PLC-β를 통해 잘 공지되어 있다[Rhee, S.G., et al., Annu. Rev. Biochem., 70:281-312, 2001].
최근의 연구를 근거로, 과량의 칼슘이 세포질에 존재하는 경우, 간 세포의 미토콘드리아 막에 존재하는 PLC-δ1은 칼슘의 유입을 억제하는 작용을 하는 것으로 보고되었다[Hwang, K.C., et al., J. Steroid Biochem., 91:131-138, 2004]. 또한, PLC-δ1은 다른 동위원소들보다 7배 이상 많은 양으로 정상 심근 세포에 존재하며, 허혈 상태에서 PLC-δ1의 양은 시험관내 및 생체내 모두에서 감소되는 것으로 밝혀졌다[Hwang, K.C., et al., J. Steroid Biochem., 91:131-138, 2004]. 칼페인 억제제 칼파스타틴 및 카스파제 억제제 zVAD-fmk로 치료할 때, PLC-δ1의 분해가 억제되었다[Hwang, K.C., et al., J. Steroid Biochem., 91:131-138, 2004]. 또한, PLC-δ1이 심근세포에서 과발현되는 경우, 허혈성 질환에 의해 유도된 세포내 Ca2+ 과부하가 현저하게 감소되었다[Hwang, K.C., et al., J. Steroid Biochem., 91:131-138, 2004].
이러한 결과는 PLC-δ1이 정상 심장에서의 세포질내 칼슘 항상성 및 심근경색후 칼슘 균형에 대한 그의 영향에서 중요한 역할을 함을 입증한다. 명백하게, PLC-δ1을 살아있는 세포의 세포질 및 핵내로 형질도입하여, 유해한 부작용 없이 허혈 또는 허혈성 질환을 치료 또는 예방하는 효과적인 방법이 필요하다.
단백질 형질도입 영역(PTD)은 생물학적으로 활성인 분자의 전달을 위해 사용되어 왔다[Viehl C.T., et al., Ann. Surg. Oncol., 12:517-525, 2005; Noguchi H., et al., Nat. Med., 10:305-309, 2004; and Fu A.L., et al., Neurosci. Lett., 368:258-262, 2004]. PTD는 생리학적으로 활성인 분자를 세포내로 침투시키는데 사용되어 온 저분자량 펩티드이다. 그러나, 지금까지 생체내에서 포스포리파제 C를 전달시키는 방법으로 PTD를 사용하기 위한 시도가 시행된 적은 없었다.
발명의 요약
본 발명의 한 목적은 단백질 형질도입 영역(PTD)을 사용하여 생체내에서 폴리펩티드를 전달함으로써 허혈성 질환 및 질병을 효과적으로 치료하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 PTD 및 포스포리파제(PL) 폴리펩티드(PTD-PL)의 결합체를 제공한다. 상기 결합체는 PTD-암호화 유전자를 포스포리파제 유전자와 융합시키고, 당해 분야에 숙련된 자에게 공지된 표준 클로닝 기술 및 통상적인 방법을 이용하여 시험관내 또는 생체내에서 융합 단백질을 발현시키고 분리함으로써 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 PTD-PL 결합체는 세포로 전달되기 위해, PTD의 세포내 투과 및 전달 효과로 인해 막을 용이하게 통과한다.
본 발명의 한 태양은 허혈 또는 재관류에 의해 야기되는 세포내 칼슘 과부하를 치료, 감소 또는 예방하기 위한 PTD-PL 결합체의 용도이다.
또 다른 태양은 세포에서 유리 칼슘 이온의 농도를 감소시키기 위한 PTD-PL 결합체의 용도이다.
본 발명은 또한 저산소증 또는 허혈에 의해 야기되는 심장 손상(예를 들면, 심부전 및 심근경색)을 경감, 치료, 예방 또는 제거하기 위해 PTD-PL 결합체를 이용하는 방법을 포함한다.
본 발명은 또한 심혈관 질환, 심근 저산소증 또는 허혈성 손상을 예방하고/하거나 치료하기 위해 PTD-PL 결합체를 이용하는 방법을 포함한다.
본 발명은 또한 심부전시 뇌졸중을 예방하기 위해 PTD-PL 결합체를 이용하는 방법을 포함한다.
또 다른 태양은 저체온증을 앓고 있는 대상에서 허혈-재관류 손상을 예방하거나 경감시키기 위한 PTD-PL 결합체의 용도이다.
또 다른 태양은 장기 또는 조직 이식시에 장기 또는 조직 손상을 예방하기 위한 PTD-PL 결합체의 용도이다. 바람직한 태양은 심장 이식을 위한 PTD-PLC-δ의 용도이다.
본 발명의 또 다른 태양은 하나 이상의 치료 화합물 또는 구조물과 함께 PTD-PL 결합체의 용도이다.
상기 태양들 모두에 있어서, PTD와, PL의 하나 이상의 단편, 유도체 또는 유사체와의 융합도 또한 고려된다.
본 발명은 국소 투여 경로에 의한 PTD-PL 결합체의 투여를 가능케 하여 전신 부작용을 최소화하거나 배제할 수 있다.
도 1은 니켈 비드를 이용한 PTD-PLC-δ1의 정제를 나타낸 것이다. 제 1 열은 표준 분자량 단백질을 나타내고, 제 2 열은 융합 단백질 PTD-PLC-δ1을 나타낸다. 인간 PLC-δ1은 길이가 756개 아미노산이고 약 85 kDa이다.
도 2A 및 2B는 저산소증-유도된 심근 세포내로의 본 발명에 따른 PTD-PLC-δ1의 침투를 나타낸 것이다. 도 2A는 저-산소 조건하에서 12시간동안 배양된 심근 세포에서 0 내지 500 nM의 농도 구배하에서의 PTD-PLC-δ1 단백질의 양을 나타낸다. 도 2B는 이러한 조건하에서 세포 생존율을 나타낸다. CTL은 대조군이다.
도 3은 산소 조건하에서 배양한 대조군(제 1 열)과 비교하여서, 및 100 nM의 PTD-PLC-δ1 단백질로 처리했을 때(제 3 열), 12시간동안 저-산소 조건(저산소증) 하에서(제 2 열) 배양된 심근 세포내 칼슘의 과부화를 나타낸다. 세포내 유리 Ca2+의 상대적 변화는 형광 강도를 측정함으로써 측정하였다.
도 4는 내부 장기(심장, 신장 및 간)로의 PTD-PLC-δ1의 전달 및 침투를 나타낸다. 심장에서, 단백질 키나제 C(PKC)의 포스포릴화가 나타난다. 제 1 열: 정상; 제 2 열: 저산소(1시간) 및 재관류(3시간); 제 3 열: 저산소(1시간) 및 재관류(3시간) 및 PTD-PLC-δ1.
도 5는 동물 심근경색 모델에서 심장 허혈 부위의 치료에 대한 PTD-PLC-δ1의 영향을 나타낸다. 심근 세포의 생존은 PTD-PLC-δ1의 부재 및 존재하에서 가시화된다. I/R은 허혈후 재관류를 의미한다.
칼슘 및 유리 라디칼은 급성 외상, 예를 들면, 허혈 및 척수 손상에서 심장 및 신경 손상을 유도하기 위해 함께 작용한다. 본 발명은 세포, 예를 들면, 심근 세포에서 허혈 또는 재관류-유도된 허혈을 PTD-PL 결합체를 사용하여 치료 또는 예방하는 방법을 포함한다.
본 발명의 한 태양은 칼슘 과부하를 치료, 감소 또는 예방하여 심장, 심혈관 또는 신경 세포 사멸(예를 들면, 근세포, 뉴런)을 감소시키거나 억제하기 위한 PTD-PL 결합체의 용도이다. 칼슘 과부하는, 예를 들면, 저산소증, 허혈, 재관류, 심혈관(심장) 질환 또는 손상, 예를 들면, 심근경색, 또는 신경학적(뇌) 질환 또는 손상, 예를 들면, 허혈성 또는 출혈성 뇌졸중에 의해 야기될 수 있다. 칼슘 과부하는 뇌, 척수, 심장, 이식된 장기 또는 이식된 사지를 포함하여(이로 한정되지는 않는다) 다양한 신체 부위 또는 장기에서 일어날 수 있으며, 이들 신체 부위중 하나로 국한될 수 있다. 바람직한 태양은 칼슘 과부하를 치료하거나 감소시키거나 예방하기 위한 PTD-PLC-δ 결합체의 용도이다.
또 다른 태양은 세포에 효과량의 PTD-PL을 투여함으로써 세포에서 유리 칼슘 이온의 농도를 감소시키기 위한 PTD-PL 결합체의 용도이다.
본 발명은 또한 대상에서, 저산소증 또는 허혈에 의해 야기된 바와 같이, 심근 산화적 스트레스를 치료, 예방 또는 최소화하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 산화적 스트레스의 표적인 심근 세포가 세포 사멸로부터 보호되도록 심근 산화적 스트레스를 조절하는 PTD-PL 치료 효과량을 그를 필요로 하는 대상에게 투여함으로써 수행된다. 세포 사멸은, 예를 들면, 괴사 또는 아포토시스(apoptosis)에 기인할 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양은 심혈관 또는 신경 세포 사멸을 감소 또는 억제하기 위한 PTD-PLC-δ 결합체의 용도이다. 심혈관 세포는, 예를 들면, 심장 근육세포, 심실 근육세포, 심방 근육세포, 심장 줄기 세포, 내피 세포, 혈관 평활근 세포, 심장박동기 세포, 근섬유아세포 또는 섬유아세포일 수 있다. 신경 세포는, 예를 들면, 뉴런일 수 있다.
본 발명은 또한 저산소증 또는 허혈-관련 손상이 치료, 예방, 감소 또는 제거되도록 PTD-PL을 그를 필요로 하는 대상에게 투여하는, 대상에서 저산소증 또는 허혈에 의해 야기되는 심장 또는 신경 손상을 치료, 예방, 감소 또는 제거하는 방법을 포함한다.
본 발명의 방법 및 조성물에 의해 치료, 예방, 감소 또는 제거될 수 있는 심장 손상으로는 저산소증 및/또는 허혈에 의해 야기되거나 유발된 모든 심장 손상이 포함된다. 상기 손상으로는 심장 허혈후 재관류, 울혈성 심부전, 심근경색, 약물(예를 들면, 독소루비신)과 같은 화합물에 의해 야기되는 심장독성, 감염(예를 들면, 매독, 만성 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi) 감염)으로 인한 심장 손상, 돌발성 심장 아밀로이드증, 심장 수술, 심장 이식, 및 외상성 심장 손상(예를 들면, 관통성 또는 둔기 손상, 또는 대동맥 판막 파열)이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 연결된 혈관 및/또는 조직, 예를 들면, 심낭을 포함하여, 심장 전체 또는 일부가 손상될 수 있다. 본 발명 화합물의 투여는 임상적으로 필요하거나 바람직한 경우, 예를 들면, 허혈후 재관류 이전에, 허혈후 재관류 개시때에, 또는 허혈후 재관류시에 수행될 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성물에 의해 치료, 예방, 감소 또는 제거될 수 있는 신경 손상으로는 저산소증 및/또는 허혈에 의해 야기되거나 유발된 모든 신경 손상이 포함된다. 상기 손상으로는 허혈-재관류 손상, 약물과 같은 화합물에 의해 야기되는 신경독성, 및 기생충 감염으로 인한 신경 손상이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.
본 발명은 또한 심혈관 질환, 심근 저산소증 또는 허혈성 손상을 예방하고/하거나 치료하기 위해 PTD-PL 결합체를 사용하는 방법을 포함한다.
본 발명은 또한 장기 또는 조직 제거전에 또는 그와 동시에 기증자에게 PTD-PL을 투여하여, 상기 장기 또는 조직의 재관류에 의해 야기되는 손상을 감소시키거나 예방함으로써, 장기 또는 조직 이식시 상기 장기 또는 조직 손상을 예방하는 방법을 포함한다. 특히, 본 발명은 저체온증을 앓고 있는 대상을 단백질 형질도입 영역(PTD) 및 포스포리파제 폴리펩티드를 함유하는 융합 폴리펩티드 치료 효과량으로 미리 치료하는, 저체온증을 앓고 있는 대상에서 허혈성-재관류 손상을 예방하는 방법을 포함한다.
바람직한 태양에서, 이식될 장기 또는 조직은 심장 또는 심장 조직이다. PTD-PL은 또한 기증자로부터 장기 또는 조직의 수술적 제거 후에 장기 또는 조직과 접촉될 수 있다. 일부 태양에서, PTD-PL은 공지되어 있는 장기 또는 조직 보존액, 예를 들면, 위스콘신 대학 용액 또는 셀시오(Celsior) 용액(예를 들면, 문헌 [Thabut et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 164:1204-1208, 2001; 및 Faenza et al., Transplantation, 72:1274-1277, 2001] 참조) 이외에 첨가된다.
본 발명은 또한 심부전을 앓고 있는 대상(예를 들면, 인간)을 PTD-PL 및 약학적으로 허용되는 담체로 치료함으로써, 상기 대상에서 뇌졸중 또는 뇌졸중의 개시를 예방하는 방법을 포함한다. PTD-PL은 환자에서 뇌졸중의 가능성을 증가시킬 수 있는 수술 절차에 앞서 또는 그와 동시에 투여될 수 있다. 한 태양에서, 상기 절차는 풍선 혈관성형술이다. 다른 절차로는 관상 동맥 우회술 및 판막 교체술이 포함된다. PTD-PL은 혈전형성 방지제(예를 들면, 쿠마딘)에 앞서, 또는 그와 동시에 또는 그 후에 투여될 수 있다.
본 발명은 PTD-PL을 단독으로 또는 하나 이상의 부가적인 치료 화합물과 함께 투여함으로써 대상에서 심부전을 치료하는 방법을 포함한다. 일부 태양에서, 상기 부가적인 치료 화합물로는 항혈소판 약물, 항응고 약물 및 항혈전 약물, 또는 이의 혼합물이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.
본 발명은 또한 저체온증을 앓고 있는 대상을 PTD-PL 및 약학적으로 허용되는 담체로 치료함으로써, 저체온증을 앓고 있는 대상(예를 들면, 인간)에서 재관류 손상을 예방하는 방법을 포함한다. 상기 대상은 당해 분야에 일반적으로 알려져 있는 바와 같이 저체온증을 앓고 있는 대상을 치료하기 위한 표준 재가온 절차에 앞서 또는 그와 동시에 PTD-PL로 치료될 수 있다.
단백질 형질도입 영역(PTD)
PTD는 전신 또는 국소 투여에 의해 생체내 및 시험관내에서 세포내로의 문제의 단백질, 펩티드 및 중요한 화학적 화합물의 전달 또는 흡수를 효과적으로 가능케 한다. 투여 경로로는 특히 근육내, 복강내, 정맥내, 경구, 코, 피하, 피내, 점막 및 흡입 경로가 포함된다. 따라서, PTD가 단백질, 펩티드 및/또는 화합물과의 결합체로 제공되는 경우, PTD는 단백질, 펩티드 및/또는 화합물을 국소 부위, 예를 들면, 피부, 안구 또는 기도로 전달할 수 있다.
본 발명에서 PTD로 사용하기 위해, 본 발명자들은 고체 합성 방법을 이용하여 여러 펩티드를 구성하였지만, 목적하는 전달 부위 및 사용되는 링커의 종류에 따라 다른 종류의 PTD를 사용할 수 있음을 주지해야 한다. PTD는 3 내지 30개의 아미노산, 바람직하게는 5 내지 15개의 아미노산으로 이루어지며, 그 중 10 내지 30% 이상은 바람직하게는 아르기닌 잔기이다. 그러나, 어떤 아르기닌 잔기도 갖지 않은 PTD도 또한 포함된다.
한 태양은 인간(및 마우스) 전사 인자 HPH-1로부터의 PTD인 Hph-1-PTD(YARVRRRGPRR)(서열번호: 1)의 사용을 포함한다. 또 다른 태양은 Sim-2의 PTD(AKAARQAAR)(서열번호: 2)의 사용을 포함한다.
다른 태양에는 HIV-1 바이러스 단백질 Tat의 PTD(YGRKKRRQRRR)(서열번호: 3), 드로소필라(Drosophila)의 안테나페디아(Antennapedia) 단백질(Antp)(RQIKIWFQNRRMKWKK)(서열번호: 4), HSV-1 구조 단백질 Vp22(DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRRRRPVE)(서열번호: 5), R7을 신호전달하는 G 단백질의 조절인자(RRRRRRR)(서열번호: 6), MTS(막 투과 서열)(AAVALLPAVLLALLAPAAADQNQLMP)(서열번호: 7), 및 짧은 양친매성 펩티드 운반체 Pep-1(KETWWETWWTEWSQPKKKRKV)(서열번호: 8) 및 Pep-2(KETWFETWFTEWSQPKKKRKV)(서열번호: 9)가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.
포스포리파제(PL)
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 PTD 및 폴리펩티드, 예를 들면, 효소 포스포리파제, 보다 특히는 포스포리파제 C(PLC)의 결합체를 제공한다. PLC 효소의 4가지 주요 유형이 존재한다: PLC-β(베타), PLC-γ(감마), PLC-δ(델타), PLC-ε(에타) 및 PLC-ζ(제타). 각각의 PLC 유형은 또한 여러 아형, 예를 들면, β1, β3, β4, δ1, δ3로 이루어진다.
한 태양은 PTD와 포스포리파제 C-델타1(PLC-δ1)의 결합체이다. PLC-δ1은 저산소성 심근세포에서 과발현될 때, 허혈성 상태에 의해 유도된 세포내 Ca2+ 과부하를 배제시킨다.
PLC-δ1의 뉴클레오티드 서열(서열번호: 10)은 다음과 같다:
PLC-δ1의 아미노산 서열(서열번호: 11)은 다음과 같다:
또 다른 태양은 PTD와 포스포리파제 C 델타3(PLC-δ3)과의 결합체이다. 인간 PLC-δ3은 789개 아미노산의 길이를 갖는다.
PLC-δ3의 뉴클레오티드 서열(서열번호: 12)은 다음과 같다:
PLC-δ3의 아미노산 서열(서열번호: 13)은 다음과 같다:
또 다른 태양은 PTD와 포스포리파제 C-델타4(PLC-δ4)와의 결합체이다. PLC-δ4는 또한 PLC-δ2로도 지칭된다. 인간 PLC-δ4는 762개 아미노산의 길이를 갖는다.
PLC-δ4의 뉴클레오티드 서열(서열번호: 14)은 다음과 같다:
PLC-δ4의 아미노산 서열(서열번호: 15)은 다음과 같다:
PLC-δ5를 포함하나 이로 한정되지는 않는 또 다른 PLC-δ도 또한 본 발명의 일부로 포함된다. PLC-δ5의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제 6,958,152 호에 기재되어 있다.
또한, PLC-β1(베타1), PLC-β2(베타2), PLC-β3(베타3), PLC-β4(베타4), PLC-γ1(감마1), PLC-γ2(감마2), PLC-ε1a(에타1a), PLC-ε1b(에타1b) 및 PLC-ζ(제타)를 포함하나 이로 한정되지는 않는 또 다른 PLC 효소도 또한 본 발명의 일부로 포함된다.
PLC-β1의 아미노산 서열(서열번호: 16)은 다음과 같다:
PLC-β2의 아미노산 서열(서열번호: 17)은 다음과 같다:
PLC-β3의 아미노산 서열(서열번호: 18)은 다음과 같다:
PLC-β4의 아미노산 서열(서열번호: 19)은 다음과 같다:
PLC-γ1의 아미노산 서열(서열번호: 20)은 다음과 같다:
PLC-γ2의 아미노산 서열(서열번호: 21)은 다음과 같다:
PLC-ε1a의 아미노산 서열(서열번호: 22)은 다음과 같다:
PLC-ε1b의 아미노산 서열(서열번호: 23)은 다음과 같다:
PLC-ζ의 아미노산 서열(서열번호: 24)은 다음과 같다:
본 발명은 또한 PTD, 및 PL의 단편, 유도체 또는 유사체의 결합체를 제공한다. 구체적으로, PTD와 PL의 칼슘 결합 영역의 결합체가 포함된다. PL의 칼슘 결합 영역, C2는 Ca2+ 활성화에 민감하다. PLC 효소의 C2 영역은 다음 아미노산 영역들에서 또는 상기 영역들 부근에서 찾을 수 있다: 서열번호: 11(PLC-δ1)의 630 내지 755번째 아미노산(서열번호: 25), 서열번호: 13(PLC-δ3)의 661 내지 787번째 아미노산(서열번호: 26), 서열번호: 15(PLC-δ4)의 628 내지 754번째 아미노산(서열번호: 27), 서열번호: 16(PLC-β1)의 677 내지 794번째 아미노산(서열번호: 28), 서열번호: 17(PLC-β2)의 679 내지 797번째 아미노산(서열번호: 29), 서열번호: 18(PLC-β3)의 728 내지 843번째 아미노산(서열번호: 30), 서열번호: 19(PLC-β4)의 702 내지 818번째 아미노산(서열번호: 31), 서열번호: 20(PLC-γ1)의 1092 내지 1212번째 아미노산(서열번호: 32), 서열번호: 21(PLC-γ2)의 1062 내지 1187번째 아미노산(서열번호: 33), 서열번호: 22(PLC-ε1a)의 734 내지 855번째 아미노산(서열번호: 34), 서열번호: 23(PLC-ε1b)의 734 내지 855번째 아미노산(서열번호: 35), 및 서열번호: 24(PLC-ζ)의 483 내지 606번째 아미노산(서열번호: 36). C2 이외에, PL의 또 다른 칼슘 결합 영역도 또한 고려된다.
본 발명의 펩티드 결합체는, PTD 암호화 유전자를 PL 유전자와 융합시키고, 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자에게 공지된 표준 클로닝 기술 및 통상적인 방법을 이용하여 시험관내 및 생체내에서 상기 융합 단백질을 발현시킴으로써 제조할 수 있다.
PTD-PL 결합체는 직접 공유 결합, 펩티드 결합, 또는 링커에 의해 서로 연결될 수 있다. 특히, PTD-PL 결합체는 특정 효소에 의해 특이적으로 절단되는 영역을 함유하는 링커에 의해 서로에 연결될 수 있다. 한 태양에서, 링커 DNA는 프로테아제 인지 서열을 암호화하여, PTD와 PL의 결합부에서의 절단을 가능케한다. 예를 들면, 링커 DNA는 카스파제-3 인지 서열(예를 들면, DEVD를 포함하는 아미노산 서열(서열번호: 37))을 암호화할 수 있다. 절단 부위를 갖지 않는 링커(비-절단 링커)도 또한 사용할 수 있다. 링커의 길이는 전형적으로 1 내지 10개의 아미노산, 바람직하게는 1 내지 5개의 아미노산이다. 링커는 아미노산 Gly, Gly-Gly, 또는 Gly-Gly-Gly를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 PTD-PL 결합체는 PTD의 세포내 투과 및 전달 효과로 인해 용이하게 세포막을 통과하여 세포내로 이동한다.
상기 개시된 것들 모두에 있어 PTD-PL mRNA의 사용도 또한 고려된다.
또 다른 태양은 생체내로 투여되는 경우 PTD-PL의 분해를 방지하는 억제제의 사용을 포함한다. 허혈성 심장 및 저산소성 신생아 심근세포에서, PLC-δ1이 선택적으로 분해된다. PLC-δ1의 분해는 칼페인 억제제, 칼파스타틴 및 카스파제 억제제 zVAD-fmk에 의해 완전히 억제된다. 따라서, 본 발명의 또 다른 태양은 PL의 분해를 방지하여, 허혈성 상태에 의해 유도된 세포내 Ca2+ 과부하를 배제하기 위한 PTD-칼페인- 또는 PTD-카스파제-억제제의 용도이다. 상기 PTD-억제제는 단독으로, 또는 본 발명의 PTD-PL 융합 단백질 및/또는 다른 화합물과 함께 투여될 수 있다.
정의
편의상, 명세서, 실시예 및 첨부된 청구의 범위에 사용된 특정 용어들을 여기에 망라한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 관련되는 분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 주지되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "저산소증"은 혈액 또는 조직에서 불충분한 산소 수준(예를 들면, 심근경색)을 의미한다. 저산소증은, 예를 들면, 혈관 폐색에 의해 야기되는 혈액 공급의 부족의 결과일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "허혈"은 혈액을 공급하는 혈관의 수축, 폐색 또는 차단에 의해 야기되는, 신체 부위로 혈액의 부적절한 유입 또는 부족을 의미한다. 허혈은 조직 저산소증을 야기한다. 저산소증 또는 허혈-관련 손상은 심장 손상을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "재관류"는 심장 발작 또는 뇌졸중 이후와 같이, 혈액 공급이 차단된, 이미 허혈성인 조직 또는 장기로의 혈액 흐름의 복원을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "괴사"는, 특히 심장근육과 같은 신체의 국소 부위에서 손상 또는 질환을 통해 세포 또는 조직의 사멸을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "아포토시스(apoptosis)"는 계획된(programmed) 세포 사멸을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "심장 손상"은 허혈-재관류 손상, 울혈성 심부전, 심장 마비, 심근경색, 약물(예를 들면, 독소루비신, 헤르셉틴, 티오리다진 및 시사프리드)과 같은 화합물에 의해 야기되는 심장독성, 기생충 감염, 세균, 진균, 리케챠 또는 바이러스(예를 들면, 매독, 만성 트리파노소마 크루지 감염)로 인한 심장 손상, 돌발성 심장 아밀로이드증, 심장 수술, 심장 이식, 및 외상성 심장 손상(예를 들면, 관통성 또는 둔기 심장 손상, 또는 대동맥 판막 파열)을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는, 심장 및/또는 연결 조직(예를 들면, 심낭, 대동맥 및 다른 연결 혈관)을 수반하는 임의의 만성 또는 급성 병리학적 상태를 포함하는 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "신경 손상"은 허혈-재관류 손상, 약물과 같은 화합물에 의해 야기되는 신경독성 및 기생충 감염으로 인한 신경 손상을 포함하나 이로 한정되지는 않는, 뇌, 척추, 신경 및/또는 연결 조직을 수반하는 임의의 만성 또는 급성 병리적 상태를 포함하는 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩티드"는 단일 "폴리펩티드" 뿐 아니라 다수의 "폴리펩티드들"을 포함하는 것이며, 펩티드 결합에 의해 서로 결합된 하나 이상의 아미노산의 쇄 또는 쇄들을 포함한다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같이, "펩티드", "다이펩티드", "트라이펩티드", "단백질", "아미노산 쇄", "올리고펩티드", "올리고머" 또는 2개 이상의 아미노산의 쇄 또는 쇄들을 언급하기 위해 사용된 임의의 다른 용어들을 포함하나 이로 한정되지는 않는 용어들이 "폴리펩티드"의 정의에 포함되며, 용어 "폴리펩티드"는 임의의 상기 용어들 대신 또는 그와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 상기 용어는 또한 해독후 변형, 예를 들면, 글라이코실화, 아세틸화, 포스포릴화, 아마이드화, 공지된 보호/차단기에 의한 유도체화, 단백질분해 절단, 또는 비-천연 아미노산에 의한 변형을 가진 폴리펩티드를 포함한다. 용어 "단백질"은 또한 기준 단백질과 본질적으로 동일한 생물 활성 또는 기능을 보유하는, 단백질의 단편, 유사체 및 유도체를 포함하는 것이다.
단백질의 "단편, 유도체 또는 유사체"는 (i) 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존성 또는 비-보존성 아미노산 잔기(바람직하게는, 보존성 아미노산 잔기)로 치환되고 상기 치환된 아미노산 잔기가 유전 코드에 의해 암호화된 것이거나 아닐 수 있는 것; 또는 (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환기를 포함하는 것; 또는 (iii) 성숙 폴리펩티드가 또 다른 화합물, 예를 들면, 폴리펩티드의 반감기를 증가시키기 위한 화합물(예를 들면, 폴리에틸렌 글라이콜)과 융합된 것; 또는 (iv) 또 다른 아미노산이 성숙 폴리펩티드, 예를 들면, 폴리펩티드의 정제에 사용되는 리더(leader) 또는 분비 서열과 융합된 것일 수 있다. 상기 단편, 유도체 및 유사체는 본원의 교지내용으로부터 당업자의 범위에 속하는 것으로 간주된다.
여러개, 예를 들면, 5 내지 10개, 1 내지 5개, 1 내지 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 잔기가 임의의 조합으로 치환, 결실 또는 부가된 단백질의 아미노산 서열을 갖는 변이체, 유사체, 유도체 및 단편이 특히 바람직하다. 이들 중에서 본 발명의 단백질의 성질 및 활성을 변화시키지 않는 침묵 치환, 부가 및 결실이 특히 바람직하다. 이와 관련하여 보존성 치환이 또한 특히 바람직하다.
본 발명의 변이체의 한 예는 하나 이상의 아미노산이 하나 이상의 다른 아미노산으로 치환된 것 이외에, 상기 정의한 바와 같은 융합 단백질이다. 당업자라면 다양한 아미노산이 유사한 성질을 가짐을 인지할 것이다. 물질의 하나 이상의 상기 아미노산은 종종 상기 물질의 바람직한 활성을 배제하지 않고 하나 이상의 다른 상기 아미노산으로 치환될 수 있다.
따라서, 아미노산 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 아이소류신은 종종 서로 치환될 수 있다(지방족 쇄를 갖는 아미노산). 이들 가능한 치환중에서, 글리신 및 알라닌이 서로 치환하기 위해 사용되고(이들은 비교적 짧은 측쇄를 가지므로), 발린, 류신 및 아이소류신이 서로 치환하기 위해 사용되는 것(이들은 소수성인 보다 긴 지방족 측쇄를 가지므로)이 바람직하다. 종종 서로 치환될 수 있는 다른 아미노산으로는 다음이 포함된다: 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판(방향족 측쇄를 갖는 아미노산); 라이신, 아르기닌 및 히스티딘(염기성 측쇄를 갖는 아미노산); 아스파테이트 및 글루타메이트(산성 측쇄를 갖는 아미노산); 아스파라긴 및 글루타민(아마이드 측쇄를 갖는 아미노산); 및 시스테인 및 메티오닌(황 함유 측쇄를 갖는 아미노산). 상기 특성의 치환은 흔히 "보존성" 또는 "반-보존성" 아미노산 치환으로 지칭된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "융합 단백질", "융합 폴리펩티드", "키메라 단백질" 및 "키메라 폴리펩티드"는 상호교환적이며, 문제의 폴리펩티드 또는 단백질 및 단백질 형질도입 영역(PTD)을 포함하는 폴리펩티드 및 단백질을 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 PTD-PL "결합체"는 PTD 단백질과 PL 단백질의 융합, 및 PTD-암호화 유전자와 PL 유전자 구조물의 융합 둘 다를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "문제의 단백질", "목적 폴리펩티드", "목적 단백질" 또는 "표적 단백질"은 상호교환적이며, 전체 단백질 분자 또는 그의 일부를 말한다. 폴리펩티드 또는 단백질의 다른 부분은 세포 반응을 유도할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료제"는 대상에게 전달될 때 상기 대상에서 해당 질환 또는 질병(예를 들면, 허혈 또는 저산소증)의 증상을 치료, 즉, 치유, 개선 또는 경감시키거나, 또는 말기 질환 또는 질병의 진행을 지연시킴으로써 대상의 수명을 연장시키는 단백질, 지질, 탄수화물, 핵산 또는 화합물과 같은 분자를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료 융합 폴리펩티드"는 대상에게 전달될 때 상기 대상에서 해당 질환 또는 질병(예를 들면, 허혈 또는 저산소증)의 증상을 치료, 즉, 치유, 개선 또는 경감시키거나, 또는 말기 질환 또는 질병의 진행을 지연시킴으로써 대상의 수명을 연장시키는 폴리펩티드를 말한다.
폴리펩티드
본 발명의 치료 폴리펩티드는 포스포리파제 C(PLC) 폴리펩티드를 포함하나, 이로 한정되지는 않는 포스포리파제 단백질(PL)이다. PLC는 광범위하게 4 종류: β, γ, δ 및 ε로 분류되며, 총 11개의 동위효소로 존재한다. PLC-δ1은 미토콘드리아 투과 전이 기공(mPTP)의 개방, 칼슘 이온에 의해 활성화된 프로테아제의 표적화, 및 세포내 칼슘 항상성을 조절함으로써 허혈 및 아포토시스에서 주요한 역할을 한다.
본 발명의 폴리펩티드로서, 허혈 또는 저산소성 상태 및/또는 신경 손상을 치료, 즉, 치유하거나, 개선하거나, 그의 중증도를 경감하거나, 또는 예방하거나 또는 감소시키기 위해 사용되는, 상기 폴리펩티드의 단편, 유도체, 유사체 또는 변이체 및 그의 임의의 조합이 또한 포함된다.
본 발명의 또 다른 태양은 전술한 폴리펩티드의 임의의 아미노산 서열과 95% 이상 동일하고, 보다 바람직하게는 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
실제적인 문제로서, 임의의 특정 폴리펩티드가, 예를 들면, 서열번호: 10에 나타낸 아미노산 서열과 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한지 여부는, 통상적으로 베스트핏(Bestfit) 프로그램(위스콘신 서열 분석 패키지, 유닉스용 버전 8(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix), 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 위스콘신주 53711, 매디슨, 유니버시티 리서치 파크 575 사이언스 드라이브)과 같은 공지된 컴퓨터 프로그램을 이용하여 결정할 수 있다. 베스트핏은 두 서열간의 상동성의 가장 우수한 절편을 찾기 위해, 스미스와 워터맨의 국소 상동성 알고리듬[Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics, 2:482-489, 1981]을 이용한다. 특정 서열이 본 발명에 따른 기준 서열과, 예를 들어, 95% 동일한지 여부를 결정하기 위해 베스트핏 또는 임의의 다른 서열 정렬 프로그램을 이용하는 경우, 동일성 퍼센트가 기준 아미노산 서열의 전장(full length)에 대해 계산되고 기준 서열의 아미노산의 총 수의 5% 이하의 상동성 차이가 허용되도록 파라미터가 설정됨은 물론이다.
폴리뉴클레오티드
또한, 본 발명은 융합 단백질 또는 키메라 단백질, 재조합 발현 벡터, 플라스미드 및 이를 함유하는 다른 폴리뉴클레오티드 구조물(총칭적으로 "발현 벡터"로 지칭)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 이들 발현 벡터로 형질전환된 미생물, 및 이들 폴리뉴클레오티드를 수득하는 방법, 및 상기 벡터를 사용하여 형질전환된 세포에 관한 것이다. 적합한 숙주 세포를 발현 벡터로 형질전환시킬 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "발현 벡터"는 유전 물질(즉, 핵산)로 이루어진 구조물을 말한다. 전형적으로, 발현 벡터는 세균 숙주 세포, 예를 들면, 대장균(Escherichia coli)에서 작용성인 복제 개시점, 및 발현 벡터를 포함하는 세균 숙주 세포를 검출하기 위한 선택성 마커를 함유한다. 본 발명의 발현 벡터는 프로모터 서열을 함유하고, 삽입된 암호화 서열이 진핵 세포에서 전사 및 번역될 수 있도록 배열된, 본원에 기술된 바와 같은 유전 요소를 포함한다. 본원에 기술된 특정 태양에서, 발현 벡터는 폐쇄된 원형 DNA 분자이다.
용어 "발현"은 암호화 서열에 의해 암호화된 산물의 생물학적 생성을 말한다. 대부분의 경우에서, 암호화 서열을 포함하는 DNA 서열은 전사되어 메신저-RNA(mRNA)를 생성한다. 이어서, 메신저-RNA는 번역되어 적절한 생물 활성을 갖는 폴리펩티드 생성물을 생성한다. 또한, 발현 과정은 전사의 RNA 산물로의 추가의 처리 단계, 예를 들면, 인트론을 제거하기 위한 접합, 및/또는 폴리펩티드 생성물의 번역후 과정을 포함할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질 또는 키메라 단백질은 재조합 DNA 방법에 의해 제조할 수 있다. 본 발명에 따르면, 목적 단백질을 암호화하는 유전자 서열을 분리하고 합성하거나 달리 수득하고, PTD 펩티드를 암호화하는 DNA 서열에 작용가능하게 연결시킨다. PTD 펩티드를 암호화하는 DNA 서열에 작용가능하게 연결된 목적 단백질에 대한 유전자를 함유하는 하이브리드 유전자는 키메라 유전자로 지칭된다. 선택적으로, 목적 단백질을 암호화하는 유전자 서열은 링커 서열을 통해 PTD 펩티드를 암호화하는 DNA 서열에 작용가능하게 연결될 수 있다.
용어 "링커 펩티드"는 바람직하게는 발현된 단백질에 함유되는 경우 친수성 영역을 제공하는 아미노산 잔기의 임의의 서열을 정의하는 것이다. 상기 친수성 영역은 단백질분해 절단 부위에서 효소에 의한 절단을 촉진할 수 있다.
키메라 유전자는 발현 벡터내로 삽입되어 적당한 형질전환된 숙주에서 목적하는 키메라 단백질의 발현을 가능케한다. 발현 벡터는 삽입된 키메라 유전자에 적당한 형질전환된 숙주에서 발현을 조절하기 위한 필수 조절 서열을 제공한다.
핵산 구조물은 벡터, 예를 들면, 발현 벡터의 형태일 수 있으며, 특히 염색체, 에피솜 및 바이러스-유래 벡터, 예를 들면, 세균 플라스미드로부터, 박테리오파아지로부터, 트랜스포손으로부터, 효모 에피솜으로부터, 삽입 요소로부터, 효모 염색체 요소로부터, 바큘로-바이러스, 파포바-바이러스, 예를 들어, SV40, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스, 계두 바이러스, 가성광견병 바이러스 및 레트로바이러스와 같은 바이러스로부터 유래된 벡터, 및 그의 조합으로부터 유래된 벡터, 예를 들어, 플라스미드 및 박테리오파아지 유전 요소, 예를 들면, 코스미드 및 파지미드로부터 유래된 벡터를 포함할 수 있다. 일반적으로, 이와 관련하여, 숙주에서 폴리펩티드를 발현하는 핵산을 유지, 증식 또는 발현하기에 적합한 임의의 벡터를 발현에 사용할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질의 발현을 조절하는 조절 요소는 프로모터 영역, 5' 미번역 영역, 신호 서열, 키메라 암호화 서열, 3' 미번역 영역, 및 전사 종결 부위를 포함한다. 숙주로부터 배지내로 분비될 융합 단백질은 또한 신호 서열을 함유한다.
유사하게, 다양한 번역 조절 요소가 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자들에게 공지되어 있다. 이들로는 리보솜 결합 부위, 및 번역 개시 및 종료 코돈이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.
재조합 벡터를 제조하고 이를 이용하여 숙주 세포를 형질전환시키고, 숙주 세포에서 벡터를 복제하고 생물학적으로 활성인 외래 폴리펩티드 및 단백질을 발현시키기 위한 방법 및 물질은 본원에 참고로 인용된 문헌 [Principles of Gene Manipulation, by Old and Primrose, 2nd edition, 1981; and Sambrook et al., Molecular Cloning, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 2001]에 기술되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "DNA 폴리뉴클레오티드"는 원형 또는 선형화 플라스미드이거나, 또는 비-감염성 및 비-통합성(즉, 척추동물 세포의 게놈내에 통합되지 않는)일 수 있는 다른 선형 DNA일 수 있다. 선형화 플라스미드는 이전에 원형이었지만, 예를 들면, 제한 엔도뉴클레아제로 절단되어 선형화된 플라스미드이다. 선형 DNA는, 예를 들면, 둘 다 본원에 참고로 인용된 문헌 [Cherng, J.Y., et al., J. Control. Release, 60:343-353, 1999; and Chen, Z.Y., et al., Mol. Ther., 3:403-410, 2001]에서 논의된 바와 같이 특정 상황에서 유리할 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양은 전술한 키메라 유전자를 포함하는 벡터의 임의의 뉴클레오티드 서열과 95% 이상 동일하고, 보다 바람직하게는 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 키메라 유전자를 함유하는 벡터를 포함한다.
본 발명의 다른 태양은 전술한 키메라 유전자의 임의의 뉴클레오티드 서열과 95% 이상 동일하고, 보다 바람직하게는 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 키메라 유전자를 포함한다.
실질적인 문제로서, 임의의 특정 벡터 또는 키메라 유전자가 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열에 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한지 여부는, 통상적으로 베스트핏 프로그램(위스콘신 서열 분석 패키지, 유닉스용 버전 8, 제네틱스 컴퓨터 그룹, 위스콘신주 53711, 매디슨, 유니버시티 리서치 파크 575 사이언스 드라이브)과 같은 공지된 컴퓨터 프로그램을 이용하여 결정할 수 있다. 베스트핏은 두 서열간의 상동성의 가장 우수한 절편을 찾기 위해, 스미스와 워터맨의 국소 상동성 알고리듬[Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics, 2:482-489, 1981]을 이용한다. 특정 서열이 본 발명에 따른 기준 서열과, 예를 들어, 95% 동일한지 여부를 결정하기 위해 베스트핏 또는 임의의 다른 서열 정렬 프로그램을 이용하는 경우, 동일성 퍼센트가 기준 뉴클레오티드 서열의 전장에 대해 계산되고 기준 서열의 뉴클레오티드의 총 수의 5% 이하의 상동성 차이가 허용되도록 파라미터가 설정됨은 물론이다.
코돈 최적화
"코돈 최적화"는 천연 서열의 하나 이상, 또는 하나보다 많거나, 또는 상당수의 코돈을 대상의 유전자에서 보다 빈번히 또는 가장 빈번히 사용되는 코돈으로 대체함으로써, 문제의 대상, 예를 들면, 인간의 세포에서 증대된 발현을 위해 핵산 서열을 조절하는 것으로서 정의된다. 다양한 종이 특정 아미노산의 특정 코돈에 대해 특별한 편향을 나타낸다.
한 태양에서, 본 발명은 폴리뉴클레오티드 발현 구조물 또는 벡터, 및 치료 폴리펩티드 및 그의 단편, 변이체 또는 유도체를 암호화하는 코돈-최적화 암호화 영역의 핵산 단편을 포함하는 숙주 세포, 및 대상에서 질환을 치료 또는 예방하기 위해 폴리뉴클레오티드 발현 구조물, 벡터, 숙주 세포를 이용하는 다양한 방법에 관한 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "코돈-최적화 암호화 영역"은 코돈의 하나 이상, 또는 하나를 초과하거나, 또는 상당수의 코돈을 대상의 유전자에서 가장 빈번히 사용되는 하나 이상의 코돈으로 대체함으로써, 해당 대상의 세포에서의 발현에 적합화된 핵산 암호화 영역을 의미한다.
임의의 폴리펩티드 쇄의 아미노산을 암호화하는 코돈을 포함하는 뉴클레오티드 서열에서의 편차는 유전자를 암호화하는 서열에서 변이를 허용한다. 각각의 코돈은 3개의 뉴클레오티드로 이루어지고 DNA를 포함하는 뉴클레오티드는 4개의 특정 염기로 한정되므로, 64개의 가능한 뉴클레오티드의 조합이 존재하며, 이들중 61개는 아미노산을 암호화한다(나머지 3개 코돈은 번역을 종료하는 신호를 암호화한다). 많은 아미노산이 하나하나를 초과하는 코돈에 의해 표시된다. 예를 들면, 아미노산 알라닌 및 프롤린은 4개의 코돈에 의해 암호화되고, 세린 및 아르기닌은 6개 코돈에 의해 암호화되는 반면, 트립토판 및 메티오닌은 단지 1개의 코돈에 의해 암호화된다. 이러한 퇴화는 DNA 염기 조성이 DNA에 의해 암호화되는 단백질의 아미노산 서열은 변화시키지 않고 광범위하게 변화되도록 한다.
공통 서열(Consensus Sequence)
본 발명은 또한 특정 공통 서열을 갖는 치료 융합 단백질, 및 그의 단편, 유도체 및 변이체를 발현하는 키메라 유전자를 함유하는 발현 플라스미드에 관한 것이다. "공통 서열"은, 예를 들면, 서로 비교된 2개 이상의 서열의 각각의 위치에서 가장 흔히 존재하는 아미노산을 나타내는 이상화된 서열이다. 공통 서열은 각각의 아미노산이 천연적으로 존재하는 상이한 서열의 그 부위에서 가장 빈번히 존재하는 아미노산인, 이론상 대표적인 아미노산 서열이다. 상기 용어는 또한 이론상의 공통 서열과 가까운 실제 서열을 말한다. 공통 서열은, 예를 들면, 공유된 기능적 또는 구조적 목적을 갖는 서열로부터 유도될 수 있다. 상기 서열은 상동성을 최대화하기 위해 특정한 구조적 또는 기능적 영역의 가능한 한 많은 공지된 예를 정렬시킴으로써 정의될 수 있다. 서열은 일반적으로 각각의 특정 아미노산이 그 위치에서 합리적으로 우세할 때 공통서열로 인정되며, 비교 기준을 구성하는 서열의 대부분은 오히려 약간의 치환, 예를 들면, 0 내지 약 100개 치환에 의한 공통서열과 관련된다. 일반적으로, 야생형 비교 서열은 공통 서열과 약 50%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일하다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 공통 서열과 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다.
"공통 아미노산"은 공통 단백질에서 해당 위치를 차지하기 위해 선택된 아미노산이다. 공통 아미노산을 선택하기 위해 구성되는 시스템은 컴퓨터 프로그램, 또는 하나 이상의 컴퓨터 프로그램과 "수동" 분석 및 계산의 조합일 수 있다. 공통 아미노산이 정렬된 아미노산 서열의 각 위치에 대해 수득되면, 이들 공통 아미노산은 공통 단백질의 아미노산 서열을 수득하기 위해 "일렬로 정렬된다".
치료적 용도
허혈성 질환 또는 질병 및/또는 신경 손상의 완화 및 치료를 위한 약제의 제조에 있어 전술한 치료 융합 단백질의 용도가 포함된다. 심장 및 뇌에서 저산소증을 유발하는 허혈성 질환 또는 질병은 PTD-PLC 융합 단백질의 투여에 의해 효과적으로 완화될 수 있다.
일반적으로, 허혈성 상태중에 칼슘 이온의 유입은 미토콘드리아 기공의 개방을 야기하여, 칼슘의 세포내 농도를 더 증가시키고 많은 세포질 단백질, 예를 들면, 프로테아제 및 엔도뉴클레아제를 활성화시킨다. 칼슘-활성화된 프로테아제는 통상적으로 세포내 칼슘 수준을 조절하는 단백질을 분해시켜, 단백질과 칼슘과의 반응성을 감소시킨다. 이것은 심근 비대, 심부전, 아포토시스 또는 괴사를 야기한다. PLC-δ1은 과량의 칼슘이 세포질에 존재하는 경우 칼슘의 유입을 억제하는 작용을 한다.
본 발명의 치료 융합 단백질은 하나 이상의 화합물 또는 구조물과 함께 공투여될 수 있다. 다른 화합물로는 항혈소판 약물, 항응고 약물 또는 항혈전 약물이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 다른 구조물로는 PLC의 분해를 방지하는 PTD-칼페인 또는 PTD-카스파제 억제제가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.
본 발명의 치료 융합 단백질은 심근 세포, 예를 들면, 심장 근육세포, 뇌실 근육세포, 심방 근육세포, 심장 줄기 세포, 내피 세포, 혈관 평활근 세포, 심장박동기 세포, 근섬유아세포 또는 섬유아세포, 및 신경 세포, 예를 들면, 뉴런(신경 세포 또는 뉴로사이트(neurocyte)로도 지칭된다)와 같은 세포 또는 세포 유형들에 표적화될 수 있다.
방법 및 투여
본 발명은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께, 치료 융합 폴리펩티드, 또는 그의 단편, 변이체 또는 유도체를 전달하기 위한 방법을 제공한다. 치료 융합 폴리펩티드는, 본원에 기술된 바와 같은 조성물의 투여시 대상에서 치료 반응이 야기되도록, 본원에 기술된 하나 이상의 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 재조합 단백질, 특히 융합 단백질, 또는 정제된 서브유니트로서 제공된다. 상기 전달은, 예를 들면, 피부, 코, 눈을 통해 근육, 뇌 또는 심장으로, 또는 정맥내 주사에 의해 일어날 수 있다.
용어 "대상"은 인간, 원숭이, 암소(cow), 양, 말, 돼지, 소(cattle), 염소, 개, 고양이, 마우스, 래트, 그로부터 배양된 세포 및 그의 유전자도입 종들과 같은 살아있는 유기체를 포함하는 것이다. 바람직한 태양에서, 대상은 인간이다.
용어 "척추동물"은 단일 "척추동물" 및 다수의 "척추동물"을 포함하는 것이며, 포유동물 및 조류, 및 어류, 파충류 및 양서류도 포함한다.
용어 "포유동물"은 단일 "포유동물" 및 다수의 "포유동물"을 포함하는 것이며, 인간; 영장류, 예를 들면, 유인원, 원숭이(예를 들어, 올빼미, 다람쥐, 꼬리감기원숭이(cebus), 붉은털원숭이(rhesus), 아프리카 초록원숭이(African green), 파타스원숭이(patas), 사이노몰구스원숭이(cynomolgus) 및 긴꼬리원숭이(cercopithecus)), 오랑우탄, 비비, 긴팔원숭이 및 침팬지; 개과, 예를 들면, 개 및 늑대; 고양이과, 예를 들면, 고양이, 사자 및 호랑이; 말과, 예를 들면, 말, 당나귀 및 얼룩말; 식용동물, 예를 들면, 소, 돼지 및 양; 유제동물, 예를 들면, 사슴 및 기린; 곰류, 예를 들면, 곰; 및 기타 동물, 예를 들면, 토끼, 마우스, 흰족제비, 물개, 고래가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 특히, 포유동물은 인간 대상, 식용 동물 또는 반려 동물일 수 있다.
용어 "조류"는 단일 "조류" 및 다수의 "조류"를 포함하는 것이며, 오리, 거위, 제비갈매기, 섬새류 및 갈매기와 같은 야생 물새류; 및 칠면조, 닭, 메추라기, 꿩, 거위 및 오리와 같은 가금류종이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 용어 "조류"는 또한 찌르레기 및 잉꼬와 같은 참새목 조류도 포함한다.
본 발명은 또한 인간에게 본원에 기술된 하나 이상의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 치료 반응을 유발하거나 증대시키거나 조절하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법에서, 조성물은 하나 이상의 폴리펩티드, 또는 그의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함할 수 있으며, 이때 단백질은 재조합 단백질, 특히 융합 단백질 또는 정제된 서브유니트로서 제공된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료 반응"은 대상에게 전달시, 본원에 개시된 바와 같은 조성물에 대해 양성 반응을 유도하는 대상의 능력을 말한다.
상기에서 언급한 바와 같이, 본 발명의 조성물은 질환 또는 질환 상태를 치료하고 예방하기 위해 사용될 수 있다. 본원에서 정의된 바와 같이, "치료"는 대상에서 질환 또는 질환 증상의 중증도를 예방하거나 치료하거나 저지하거나 감소시키고/시키거나, 질환의 악화를 야기하지 않기 위한 본 발명의 하나 이상의 조성물의 사용을 말한다.
본 발명의 일부로 간주되는 허혈/저산소증에 의해 야기되거나 또는 이를 유발하는 질환 또는 질환 상태로는 칼슘 과부하, 심장 저산소증, 심장 저산소증-재산소화, 심장 허혈-재관류 손상, 허혈성 심장 질환, 심부전, 심장 비대, 심장 수술, 외상성 심장 손상, 관상동맥 조영술, 혈관 결함 또는 폐쇄(혈류의 폐색), 선천성 심장 질환, 울혈성 심부전, 심장 세포 근육 재생, 화학요법 유도성 심근병증, 심근경색, 심장마비, 심장독성, 기생충 감염으로 인한 심장 손상, 돌발성 심장 아밀로이드증, 심장 이식 또는 외상성 심장 손상이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.
본 발명의 일부로 간주되는, 허헐/저산소증에 의해 야기되거나 이를 유발하는 또 다른 질환 또는 질환 상태로는 외상성 뇌 손상, 신경학적 질환 또는 손상, 신경 질환 또는 손상(예를 들면, 척수), 동상, 허혈성 또는 출혈성 뇌졸중, 두개내 출혈(지주막하 출혈, 혈전용해제-유도성 출혈 등), 혈병, 저산소증-유도성 아포토시스, 및 허혈-재관류후 조직 손상이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.
용어 "예방"은 대상에서 치료 반응을 야기하기 위한 본 발명의 하나 이상의 조성물의 용도를 말한다. 본 발명의 임의의 조성물이 모든 질환의 증상을 완전히 치료하거나 제거할 필요는 없다.
특정 태양에서, 본 발명의 하나 이상의 조성물은 본원에 기술된 방법에 의해 대상에게 전달되어, 효과적인 치료 반응을 달성한다. 보다 특히, 본 발명의 조성물은 피부, 근육, 뇌조직, 폐조직, 간조직, 비장 조직, 골수 조직, 흉선 조직, 심장 조직, 예를 들면, 심근, 심장내막 및 심낭, 림프 조직, 혈액 조직, 뼈 조직, 췌장 조직, 신장 조직, 담낭 조직, 위 조직, 장 조직, 정소 조직, 난소 조직, 자궁 조직, 질 조직, 직장 조직, 신경계 조직, 눈 조직, 선 조직, 혀 조직, 및 결합 조직, 예를 들면, 연골을 포함하나, 이로 한정되지는 않는 대상의 임의 조직에 투여될 수 있다. 바람직한 조직은 심장 및 뇌 조직이다.
또한, 본 발명의 조성물은 폐, 입, 비강, 위, 복강, 장, 임의의 심실, 정맥, 동맥, 모세관, 림프강, 자궁강, 질강, 직장강, 관절강, 뇌실, 척수내 척추관, 안구강, 침샘 또는 간의 도관의 내강을 포함하나 이로 한정되지는 않는, 대상의 임의의 내강에 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물을 침샘 또는 간의 도관의 내강에 투여하는 경우, 목적 폴리펩티드는 침샘 및 간에서 발현되어 폴리펩티드는 침샘 또는 간 각각으로부터 대상의 혈류내로 전달된다. 혈류내로 목적 폴리펩티드를 방출하기 위해 침샘, 간 및 췌장을 이용하여 위장계의 분비 기관에 투여하기 위한 특정 방식은 본원에 그대로 참고로 인용된 미국 특허 제 5,837,693 호 및 제 6,004,944 호에 개시되어 있다.
개시된 방법에 따르면, 본 발명의 조성물은 주사, 정맥내(i.v.), 근육내(i.m.), 피하(s.c.) 또는 폐내 경로에 의해 투여될 수 있다. 다른 적당한 투여 경로로는 기관지내 적하, 경피, 안내, 비내, 흡입, 강내, 관내(예를 들면, 췌장내로) 및 뇌실질내(즉, 임의의 조직내로) 투여가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 정맥내 투여의 경우, 적절한 약학적으로 허용되는 담체, 예를 들면, 포스페이트 완충 식염수, 식염수, 또는 약물의 정맥내 투여에 사용되는 다른 물질을 사용할 수 있다. 경피 전달은 피내(예를 들면, 피부 또는 표피내로), 경피(예를 들면, 경피적) 및 경점막 투여(즉, 피부 또는 점막 조직 내로 또는 그를 통해)가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 강내 투여로는 경구, 질, 직장, 코, 복막 또는 장내 강, 및 경막내(즉, 척추관내로), 실내(즉, 뇌실 또는 심실내로), 동맥내(즉, 심장 동맥내로) 및 지주막하(즉, 뇌의 지주막하 공간내로) 투여가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.
투여방식이 목적 펩티드 또는 단백질의 전달 또는 발현을 목적하는 조직에서, 치료 반응이 필요한 인간에서 질환 상태에 대한 치료 반응을 야기하기에 충분한 양으로 야기하는 한, 어떤 투여 방식도 사용할 수 있다.
본 발명의 투여 수단은 침 주사(예를 들면, 멸균 수성 분산액으로, 바람직하게는 등장성), 경피, 카테터 주입, 바이오리스틱(biolistic) 주사기, 입자 가속기(예를 들면, "유전자 총" 또는 공압식 "무침" 주사기) Med-E-제트[Vahlsing, H., et al., J. Immunol. Methods, 171:11-22, 1994], 피그제트(Pigjet)[Schrijver, R., et al., Vaccine, 15:1908-1916, 1997], 바이오젝터(Biojector)[Davis, H., et al., Vaccine, 12:1503-1509, 1994; Gramzinski, R., et al., Mol. Med., 4:109-118, 1998], 어드반타제트(AdvantaJet)[Linmayer, I., et al., Diabetes Care, 9:294-297, 1986], 메디-젝터(Medi-jector)[Martins, J., and Roedl, E.J., Occup. Med., 21:821-824, 1979], 젤폼 스폰지 데포, 기타 상업적으로 시판하는 데포 물질(예를 들면, 하이드로겔), 삼투압 펌프(예를 들면, 알자(Alza) 미니펌프), 경구 또는 좌약 고체 약학 제형, 예를 들면, 정제, 환제, 연질 및 경질 캡슐, 액체, 현탁액, 시럽, 과립 및 엘릭시르제, 국소용 피부 크림 또는 겔, 및 디캔팅, 폴리뉴클레오티드 코팅 봉합사의 사용[Qin, Y., et al., Life Sciences, 65:2193-2203, 1999] 또는 수술시 국소 적용이 포함된다.
특정 투여 방식은 근육내 침-기재 주사 및 카테터 주입을 통한 폐 적용이다. 에너지-보조 플라스미드 전달(EAPD) 방법도 또한 본 발명의 조성물을 투여하기 위해 사용될 수 있다. 한가지 상기 방법은 전기천공으로 통상적으로 알려진 절차인 주입된 조직에 단시간의 전기 펄스를 적용하는 것을 포함한다(일반적으로 문헌 [Mir, L.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 96:4262-4267, 1999; Hartikka, J., et al., Mol. Ther., 4:407-415, 2001; Mathiesen, I., Gene Ther., 6:508-514, 1999; Rizzuto G., et al., Hum. Gen. Ther., 11:1891-1900, 2000] 참조). 본 단락에 인용된 참조문헌은 각각 본원에 그대로 참고로 인용된다.
본 발명의 하나 이상의 조성물의 효과량을 결정하는 것은, 예를 들면, 발현되거나 직접 투여되는 융합 폴리펩티드, 그의 변이체 또는 유도체, 대상의 연령, 체중 및 성별, 치료가 필요한 정확한 상태 및 그의 중증도, 투여 경로, 융합 폴리펩티드의 생체내 반감기, 흡수 효율, 및 치료될 부위를 포함하여 많은 요인들에 따라 달라진다. 치료는 환자 반응에 비추어 임상적 판단을 기준으로 필요한 대로 반복될 수 있다.
"약학적 효과량" 또는 "치료 효과량"은 질환 상태에 대한 치료 또는 임상 반응을 야기하기에 충분한 양이다. 용어 "약학적 효과량" 또는 "치료 효과량"은 상호교환적이다. 상기 요인들을 기준으로, 정확한 양, 용량의 수 및 투여 시기를 결정하는 것은 당해 분야에 통상의 기술에 속하며 주치의 또는 수의사에 의해 용이하게 결정될 것이다.
포유동물, 특히 인간에게 투여하는 경우, 활성물질의 일일 투여량은 0.01 mg/kg 체중, 전형적으로는 약 1 mg/kg일 것으로 예상된다. 상기 투여량은 평균적 경우의 예이다. 피코몰 및 나노몰 농도를 포함하여 더 높거나 낮은 투여량이 유리한 경우가 있을 수 있음은 물론이며, 상기 경우도 본 발명의 범위에 속한다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 바와 같은 융합 폴리펩티드(들) 및 또 다른 약학적 활성 물질을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 융합 폴리펩티드(들) 및 관련된 약학적 활성 물질은 약학적으로 허용되는 하나 이상의 담체 또는 부형제와 함께 사용될 수 있다. 상기 담체로는 희석제(예를 들면, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로스 및/또는 글리신), 윤활제(예를 들면, 실리카, 활석, 스테아르산 및 폴리에틸렌 글라이콜), 결합제(예를 들면, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸트, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈), 및 붕해제, 예를 들면, 전분, 아가, 알긴산 또는 그의 나트륨 염, 및/또는 흡수제, 착색제, 향료 및 감미제, 식염수, 완충 식염수, 리포솜, 물, 글리세롤, 에탄올 및 그의 혼합물이 포함될 수 있으나, 이로 한정되지는 않는다.
본 발명의 조성물은 임의의 다양한 완충제에 가용화될 수 있다. 적당한 완충제로는, 예를 들면, 포스페이트 완충 식염수(PBS), 일반 식염수, 트리스 완충액 및 인산 나트륨(예를 들면, 150 mM 인산 나트륨)이 포함된다. 불용성 폴리뉴클레오티드는 약산 또는 약염기에 가용화된 후, 완충제로 목적 부피로 희석될 수 있다. 완충제의 pH는 적절한 대로 조정될 수 있다. 또한, 약학적으로 허용되는 첨가제를 사용하여 적절한 삼투질 농도를 제공할 수 있다. 상기 첨가제는 당해 분야에 숙련된 자의 권한에 속한다. 생체내 사용되는 수성 조성물의 경우, 멸균 피로겐-비함유수를 사용할 수 있다. 상기 제형은 인간에게 투여하기에 적절한 약학적으로 허용되는 조성물을 제조하기 위해 적당량의 수용액과 함께 효과량의 폴리뉴클레오티드를 함유한다.
본 발명의 조성물은 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 적당한 제조 방법은, 예를 들면, 본원에 그대로 참고로 인용된 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition, A. Osol, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1980; and Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995]에 기술되어 있다. 조성물은 수용액으로 투여할 수 있지만, 또한 유화액, 겔, 용액, 현탁액, 동결건조 형태, 또는 당해 분야에 공지된 임의의 다른 형태로도 제형화될 수 있다.
하기의 실시예는 예시를 위해서만 포함되며, 첨부된 청구의 범위로 정의되는 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다. 실시예에 인용된 모든 참조문헌은 본원에 그대로 참고로 인용된다.
실시예 1
PTD-PLC-δ1을 함유하는 발현 벡터의 제조
HSP-70을 암호화하는 염기 서열을 인간 전사 인자 Hph-1(진뱅크(GenBank) 수탁 번호: U63386)의 N-말단으로부터 858번째 아미노산 티로신으로부터 868번째 아미노산까지의 펩티드 영역을 암호화하는 염기 서열과 결합시키기 위해, 하기의 염기 서열을 갖는 프라이머를 합성하였다:
Hph-1의 N-말단으로부터 858번째 아미노산 티로신으로부터 868번째 아미노산 아르기닌까지의 염기 서열을 갖는 pET28B(+) 벡터내에 클로닝하기 위한 제한 효소 BamHI에 상응하는 염기 서열; 및 상기 염기 서열의 5'-말단 및 PTD-PLC-δ1의 3'-말단에 상응하는 서열을 사용하여 클로닝하기 위한 제한 효소 HindIII에 상응하는 염기 서열. PCR은 상기 프라이머, 주형으로서 PTD-PLC-δ1 단백질의 전체 유전자를 함유하는 pRS 벡터(인비트로겐(Invitrogen)사), 및 pfu 터보 DNA 폴리머라제(스트라테이진(Stratagene), cat.# 600252-51)를 사용하여 수행하였다.
PCR 반응 생성물은 제한 효소 EcoRI 및 HindIII로 절단하고 퀴아퀵(Quiaquick) PCR 정제 키트(퀴아젠(QIAGEN), cat.# 28104)로 정제하였다. 정제된 생성물을 겔 추출 방법을 이용하여 정제된 pET28B(+)의 BamHI 및 HindIII 부위내로 클로닝하여 재조합 발현 벡터를 제조하였다. 제조된 재조합 벡터는 "pPTD-PLC-δ1"으로 명명하였다.
실시예 2
대장균(
E.coli
) 형질전환체의 제조 및 융합 단백질의 발현 및 정제
대장균 BL21-DE3(ATCC No. 53863)을 열충격 형질전환에 의해 상기 실시예 1에서 제조한 발현 벡터 pPTD-PLC-δ1로 형질전환시키고, 형질전환된 대장균 균주를 4 ml의 LB 배지에 접종하고 37℃에서 14시간동안 교반하면서 예비-배양하였다. 이어서, 예비-배양 배지를 250 ml의 LB 배지(10 g 카제인 췌장 소화물, 5 g 효모 추출물, 10 g 염화 나트륨)에 접종하고 37℃에서 3시간동안 배양하였다. 이어서, 1 mM의 IPTG(아이소프로필 β-D-티오갈락토피라노시드; 깁코(Gibco)BRL cat.# 15529-019)를 배양 배지에 가하고, 상기 혼합물을 22℃에서 8시간동안 배양하여 융합 단백질의 발현을 유도하였다. 배양 배지를 4℃ 및 6,000 rpm에서 20분간 원심분리하고, 상등액을 제거하여 펠릿을 수득하였다. 상기에서 수득한 펠릿을 10 ml의 완충액 1(50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, pH 8.0)에 용해시키고 얼음상에서 300 W의 강도로 초음파 처리기(히트 시스템즈, 초음파 처리기 XL)로 6초간 초음파처리한 후 냉각하였다. 전체 초음파처리시간이 8분에 이르도록 초음파처리 및 냉각 단계를 반복하였다. 용해물을 4℃ 및 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하고, 파쇄된 대장균 세포를 제거하여 순수한 용해물만을 수거하였다. 수거한 용해물에, 0.5 ml의 50% Ni2+-NTA 아가로스 슬러리(퀴아젠, cat.# 30230)를 가하고, 상기 현탁액을 4℃ 및 200 rpm에서 1시간동안 교반하여, 융합 단백질 및 Ni2+-NTA 아가로스를 서로 결합시켰다. 혼합물을 0.8 x 4 cm 크로마토그래피 컬럼(바이오래드(BioRad), cat.# 731-1550)에 통과시켰다. 생성 물질을 4 ml의 완충액 2(20 mL 트리스-HCl, 500 mM NaCl, 20 mM 이미다졸, pH 7.9)로 2회 세척하고, 1 ml의 완충액 3(50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM 이미다졸, pH 8.0) 및 1 ml의 완충액 4(50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 500 mM 이미다졸, pH 8.0)로 처리하여 융합 단백질 분획을 수득하였다. 상기 분획을 PD-10 탈염 컬럼(아머샴-파마시아 바이오테크(Amersham-Pharmacia Biotech) cat.# 17-0851-01)을 사용하여 탈염시켰다. 분리 및 정제된 PTD-PLC-δ1 융합 단백질을 SDS-PAGE에 적용한 후 쿠마시 블루 염색으로 분석하고, 결과를 도 1에 나타내었다.
실시예 3
PTD-PLC-δ1은 심근 세포에서의 허혈을 방지한다
1 내지 3일된 흰쥐 각각의 심장을 분리하여 PBS에 넣고, 좌심실만 분리한 후 마이크로 절개 가위를 사용하여 약 1 mm3의 크기로 절단하고, 여기에 5 ml의 콜라게나제 II(0.8 mg/ml, 262 단위/mg, 깁코 BRL)를 첨가하였다. 상기 현탁액을 37℃에서 5% CO2 배양기에 5분간 방치하고, 부유하는 콜라게나제 II를 제거하였다. 5 ml의 새로운 콜라게나제 II를 가하고 현탁하고, 상기 현탁액을 5분간 더 방치한 다음, 상등액을 새로운 튜브로 옮겼다. 5 ml의 세포 배양 배지(10% FBS-함유 α-MEM, 깁코 BRL)를 가하고, 세포 용액을 1200 rpm에서 4분간 원심분리하고 세포를 수거하였다. 상기 절차를 거의 조직이 잔류하지 않을 때까지 7 내지 9회 반복하고, 단일 세포로서 분리된 세포 현탁액을 하나의 튜브에 수거하였다. 세포를 100- mm 조직 배양 플레이트 상에서 1 내지 3시간동안 배양하여 섬유아세포만이 플레이트에 부착하도록 하고, 플레이트에 부착되지 않은 세포를 수거하고 5 x 105 세포/ml의 농도로 접종하고 배양하였다. 4 내지 6시간후에, 새로운 배지로 교체한 다음, 0.1 mM BrdU를 가하여 섬유아세포의 성장을 억제하고, 동시에 다양한 농도(대조군의 경우 0 μM, 및 시험군의 경우 0.1 μM, 0.5 μM 및 1.0 μM)의 PTD-PLC-δ1 단백질을 배양된 심근 세포에 가하였다. 이어서, 세포를 저산소 조건에서 12시간동안 배양하였다. 상기 저산소 조건에서의 배양은 밀폐 가습 챔버(혐기성 환경, 써모포마(ThermoForma), 미국 오하이오주 마리에타)에서 수행하였으며, 37℃에서 유지하고 10% CO2, 5% H2 및 85% N2의 혼합 가스를 계속 공급하였다. 배양 단계에서 배지로서, 1% 소 태아 혈청만을 함유하는 배지를 사용하였다. 배양된 세포는 항-PTD-PLC-δ1 항체를 사용하여 웨스턴 블롯(Western blot)으로 분석하였다.
그 결과, PTD-PLC-δ1 단백질의 전달 효과가 농도-의존성 방식으로 증가되었음을 나타내었다. 저산소 조건하에서 12시간동안 배양된 심근 세포에서 PTD-PLC-δ1 단백질이 0 내지 500 nM의 농도 구배하에 유지되었으며, 세포 생존율이 잔류하는 PTD-PLC-δ1 단백질의 농도 구배에 따라 증가되었음을 볼 수 있다(도 2A 참조). 또한, 세포 생존율은 잔류하는 PTD-PLC-δ1 단백질의 농도 구배에 따라 증가하였다(도 2B 참조).
실시예 4
PTD-PLC-δ1은 허혈성 심근 세포에서 칼슘 과부하를 억제한다
세포질내 유리 Ca2+의 농도 측정은 공초점 현미경 분석에 의해 수행하였다. 저산소 조건하에서 심근 세포에 정제된 PTD-PLC-δ1을 1 μM의 농도로 가한 다음, 세포를 12시간동안 배양하고 칼슘 농도를 측정하였다. 이를 위해, 라미닌(5 g/cm2)으로 코팅된 얇은 유리 구획위에서, 새로 태어난 흰쥐의 심근 세포를 0.1 mM BrdU-함유 세포 배양 배지(10% FBS-함유-MEM, 깁코 BRL)에서 하루동안 배양하였다. 배양 완료후, 세포를 0.265 g/l CaCl2, 0.214 g/l MgCl2, 0.2 g/l KCl, 8.0 g/l NaCl, 1 g/l 글루코스, 0.05 g/l NaH2PO4 및 1.0 g/l NaHCO3로 이루어진 변형된 티로드(Tyrode) 용액으로 세척하였다. 상기 변형 티로드 용액을 암실에서 실온에서 2 μM 플루오-4 아세톡시메틸 에스터(플루오(Fluo)-4 AM, 모레큘라 프로브(Molecular Probes), 오리건주 유진)와 함께 20분간 부하시켰다. 아르곤 레이저 공초점 현미경(레이카(Leica), 독일 솔름스)을 사용하여 형광 영상을 수득하였다. 488 nm에서 역전되는 아르곤 레이저를 사용하여 형광색소를 여기시키고, 510 내지 560 nm 대역 통과 필터를 통해 형광 방출을 수거하였다. 또한, 세포내 유리 Ca2+의 상대적 변화를 형광 강도 측정에 의해 측정하였다.
그 결과, 저산소 조건하에서 12시간동안 배양된 심근 세포에서 칼슘의 과부 하가 산소 조건하에서 배양된 대조군에서보다 약 3배 더 높음을 나타내었다. 그러나, 저산소 조건하에서 심근 세포를 100 nM의 PTD-PLC-δ1 단백질로 처리한 경우, 세포내 칼슘 과부하가 대조군과 거의 동일한 수준으로 회복되었다(도 3 참조).
실시예 5
심근 경색 동물 모델에서 심장 허혈 부위의 치료시 PTD-PLC-δ1의 효과
좌전 하행 관상동맥 봉합후 재관류에 의해 흰쥐에서 심근경색을 유도하였다. 일반적인 마취하에, 8주된 스프래그-다우리(Sprague-Dawley) 수컷 래트(각각 약 205 g 계량)를 기관내 튜브를 사용하여 삽관한 후 양압(180 ml/분)으로 통기시키고, 하바드(Harvard) 통풍기를 사용하여 산소-함유(2 L/분) 실내 공기로 통기를 유지하였다. 래트의 심장을 좌측 개흉술에 의해 노출시키고, 좌전 하행 관상 동맥을 5-0 실크 봉합사로 봉합한 후 1시간동안 방치하였다. 좌전 하행 관상동맥을 1시간동안 봉합한 후, 100 nM PTD-PLC-δ1을 래트에게 정맥내 주사하고, 동시에 봉합을 풀었다.
하나의 군(n = 3)에서, 심장 허혈 부위에서 PLC-δ1의 양을 측정하기 위해, 재관류를 3시간동안 수행하고, 조직내 PLC-δ1 단백질의 잔류량을 분석하였다. 또 다른 군(n = 3)에서는, 허혈성 부위에서 심근 세포의 생존에 대한 PTD-PLC-δ1의 효과를 측정하기 위해, 봉합 해제후 2주동안 재관류를 계속하였다. 봉합을 풀 때, 동물을 사육실에서 그의 일반적인 환경에서 2주간 양육한 후, 심장을 분리하였다.
분리된 심장을 10%(v/v) 중성으로 완충된 폼알데하이드로 관류시키고, 폼알데하이드중에 고정시키고, 동일한 두께를 갖는 4개 부분으로 횡으로 절단한 후, 일반적인 방법에 따라 파라핀에 함침시켰다. 2 μm 두께 부분들을 젤라틴-코팅된 유리 슬라이드 위에 놓아 염료가 이식된 조직 부위의 연속 부분상에 작용할 수 있게 하였다. 이어, 파라핀 제거 및 재수화 후에, 세포학적 세부사항들, 예를 들면, 핵, 세포질 및 결합 조직을 관찰하기 위해 부분들을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다.
PLC-δ1의 양의 분석 결과, 신장 및 간에서 PTD-PLC-δ1이 주입된 시험군은 대조군과 차이가 없는 것으로 나타났다. 그러나, 심장에서는 주입된 PTD-PLC-δ1 단백질이 상당량 존재하였으며, 단백질 키나제 C의 포스포릴화가 매우 증가함을 알수 있었다(도 4 참조).
심근 세포의 생존에 대한 PTD-PLC-δ1의 효과를 분석한 결과, PTD-PLC-δ1을 정맥내 주사한 군에서 심근 세포의 생존율이 대조군보다 훨씬 더 높음을 알 수 있었다(도 5 참조).
발명의 요약 및 요약서 부분이 아니라, 상세한 설명 부분은 청구의 범위를 설명하기 위해 제공되는 것임을 인지해야 한다. 발명의 요약 및 요약서 부분은 발명자(들)가 간주하는 바와 같은 본 발명의 하나 이상, 그러나 전부는 아닌 예시적 태양들을 나타낼 수 있으므로, 본 발명 및 첨부된 청구의 범위를 어떤 방식으로든 제한하는 것이 아니다.
SEQUENCE LISTING
<110> Lee, Sang-Kyou
Lee, Seung-Kyou
Jang, Yang-Soo
Hwang, Ki-Chul
<120> Pharmaceutical Composition for Alleviation and Treatment of Ischemic
Conditions and Method for Delivering the Same
<130> 2435.003PC01/EKS/GLL
<140> To Be Assigned
<141> Herewith
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg
1 5 10
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Ala Lys Ala Ala Arg Gln Ala Ala Arg
1 5
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> HIV
<400> 3
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> Drosophila sp.
<400> 4
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
<210> 5
<211> 34
<212> PRT
<213> HSV
<400> 5
Asp Ala Ala Thr Ala Thr Arg Gly Arg Ser Ala Ala Ser Arg Pro Thr
1 5 10 15
Glu Arg Pro Arg Ala Pro Ala Arg Ser Ala Ser Arg Pro Arg Arg Pro
20 25 30
Val Glu
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5
<210> 7
<211> 26
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro
1 5 10 15
Ala Ala Ala Asp Gln Asn Gln Leu Met Pro
20 25
<210> 8
<211> 21
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys
1 5 10 15
Lys Lys Arg Lys Val
20
<210> 9
<211> 21
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Lys Glu Thr Trp Phe Glu Thr Trp Phe Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys
1 5 10 15
Lys Lys Arg Lys Val
20
<210> 10
<211> 2271
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 10
atggactcgg gccgggactt cctgaccctg cacggcctac aggatgatga ggatctacag 60
gcgctgctga agggcagcca gctcctgaag gtgaagtcca gctcatggag gagagagcgc 120
ttctacaagt tgcaggagga ctgcaagacc atctggcagg agtcccgcaa ggtcatgcgg 180
accccggagt cccagctgtt ctccatcgag gacattcagg aggtgcgaat ggggcaccgc 240
acggagggtc tggagaagtt cgcccgtgat gtgcccgagg accgctgctt ctccattgtc 300
ttcaaggacc agcgcaatac actagacctc atcgccccat cgccagctga tgcccagcac 360
tgggtgctgg ggctgcacaa gatcatccac cactcaggct ccatggacca gcgtcagaag 420
ctacagcact ggattcactc ctgcttgcga aaagctgaca aaaacaagga caacaagatg 480
agcttcaagg agctgcagaa cttcctgaag gagctcaaca tccaggtgga cgacagctat 540
gcccggaaga tcttcaggga gtgtgaccac tcccagacag actccctgga ggacgaggag 600
attgaggcct tctacaagat gctgacccag cgggtggaga tcgaccgcac cttcgccgag 660
gccgcgggct caggggagac tctgtcggtg gatcagttag tgacgttcct gcagcaccag 720
cagcgggagg aggcggcagg gcctgcgctg gccctctccc tcattgagcg ctacgagccc 780
agcgagactg ccaaggcgca gcggcagatg accaaggacg gcttcctcat gtacttactg 840
tcggctgacg gcagcgcctt cagcctggca caccgccgtg tctaccagga catgggccag 900
ccacttagcc actacctggt gtcctcttca cacaacacct acctgctgga ggaccagcta 960
gccgggccca gcagcactga agcctacatc cgggcactgt gcaaaggctg ccgatgcctg 1020
gagcttgact gctgggacgg gcccaaccag gaaccaatca tctaccacgg ctatactttc 1080
acttccaaga tcctcttctg cgatgtgctc agggccatcc gggactatgc cttcaaggcg 1140
tccccctacc ctgtcatcct atccctggag aaccactgca cactggagca gcagcgcgtg 1200
atggcgcggc acctgcatgc catcctgggc cccatgctgt tgaaccgacc actggatggg 1260
gtcaccaaca gcctgccctc ccctgagcaa ctgaagggga agatcctgct gaaggggaag 1320
aagctcgggg ggctcctgcc ccctggaggg gagggtggcc ctgaggccac tgtggtgtca 1380
gacgaagacg aggctgctga gatggaggat gaggcagtga ggagccgtgt gcagcacaag 1440
cccaaggagg acaagctcag gctagcacag gagctctctg acatggtcat ttactgcaag 1500
agtgtccact ttgggggctt ctccagtcct ggcacccctg gacaggcctt ctacgagatg 1560
gcgtccttct ctgagaaccg tgcccttcga ctgctccaag aatcaggaaa cggctttgtc 1620
cgccacaacg tggggcacct gagcagaatc tacccggctg gatggagaac agactcctcc 1680
aactacagcc ccgtggagat gtggaatggg ggctgccaga tcgtggccct gaatttccag 1740
acacctgggc cagagatgga cgtgtaccag ggccgcttcc aggacaacgg ggcctgtggg 1800
tacgtgctga agcccgcctt cctgcgagac cccaacggca cctttaaccc ccgcgccctg 1860
gctcaggggc cctggtgggc acggaagcgg ctcaacatca gggtcatttc ggggcagcag 1920
ctgccaaaag tcaacaagaa taagaattca attgtggacc ccaaagtgac agtggagatc 1980
catggcgtga gccgggacgt ggccagccgc cagactgctg tcatcaccaa caatggtttc 2040
aacccatggt gggacacgga gtttgcgttt gaggtagttg tgcctgacct tgccctcatc 2100
cgcttcttgg tggaagatta tgatgcctcc tccaagaatg acttcattgg ccagagtacc 2160
atccccttga acagcctcaa gcaaggatac cgccatgtcc acctcatgtc taagaacggg 2220
gaccagcatc catcagccac cctctttgtg aagatctccc tccaggacta g 2271
<210> 11
<211> 756
<212> PRT
<213> Homo Sapien
<400> 11
Met Asp Ser Gly Arg Asp Phe Leu Thr Leu His Gly Leu Gln Asp Asp
1 5 10 15
Glu Asp Leu Gln Ala Leu Leu Lys Gly Ser Gln Leu Leu Lys Val Lys
20 25 30
Ser Ser Ser Trp Arg Arg Glu Arg Phe Tyr Lys Leu Gln Glu Asp Cys
35 40 45
Lys Thr Ile Trp Gln Glu Ser Arg Lys Val Met Arg Thr Pro Glu Ser
50 55 60
Gln Leu Phe Ser Ile Glu Asp Ile Gln Glu Val Arg Met Gly His Arg
65 70 75 80
Thr Glu Gly Leu Glu Lys Phe Ala Arg Asp Val Pro Glu Asp Arg Cys
85 90 95
Phe Ser Ile Val Phe Lys Asp Gln Arg Asn Thr Leu Asp Leu Ile Ala
100 105 110
Pro Ser Pro Ala Asp Ala Gln His Trp Val Leu Gly Leu His Lys Ile
115 120 125
Ile His His Ser Gly Ser Met Asp Gln Arg Gln Lys Leu Gln His Trp
130 135 140
Ile His Ser Cys Leu Arg Lys Ala Asp Lys Asn Lys Asp Asn Lys Met
145 150 155 160
Ser Phe Lys Glu Leu Gln Asn Phe Leu Lys Glu Leu Asn Ile Gln Val
165 170 175
Asp Asp Ser Tyr Ala Arg Lys Ile Phe Arg Glu Cys Asp His Ser Gln
180 185 190
Thr Asp Ser Leu Glu Asp Glu Glu Ile Glu Ala Phe Tyr Lys Met Leu
195 200 205
Thr Gln Arg Val Glu Ile Asp Arg Thr Phe Ala Glu Ala Ala Gly Ser
210 215 220
Gly Glu Thr Leu Ser Val Asp Gln Leu Val Thr Phe Leu Gln His Gln
225 230 235 240
Gln Arg Glu Glu Ala Ala Gly Pro Ala Leu Ala Leu Ser Leu Ile Glu
245 250 255
Arg Tyr Glu Pro Ser Glu Thr Ala Lys Ala Gln Arg Gln Met Thr Lys
260 265 270
Asp Gly Phe Leu Met Tyr Leu Leu Ser Ala Asp Gly Ser Ala Phe Ser
275 280 285
Leu Ala His Arg Arg Val Tyr Gln Asp Met Gly Gln Pro Leu Ser His
290 295 300
Tyr Leu Val Ser Ser Ser His Asn Thr Tyr Leu Leu Glu Asp Gln Leu
305 310 315 320
Ala Gly Pro Ser Ser Thr Glu Ala Tyr Ile Arg Ala Leu Cys Lys Gly
325 330 335
Cys Arg Cys Leu Glu Leu Asp Cys Trp Asp Gly Pro Asn Gln Glu Pro
340 345 350
Ile Ile Tyr His Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Lys Ile Leu Phe Cys Asp
355 360 365
Val Leu Arg Ala Ile Arg Asp Tyr Ala Phe Lys Ala Ser Pro Tyr Pro
370 375 380
Val Ile Leu Ser Leu Glu Asn His Cys Thr Leu Glu Gln Gln Arg Val
385 390 395 400
Met Ala Arg His Leu His Ala Ile Leu Gly Pro Met Leu Leu Asn Arg
405 410 415
Pro Leu Asp Gly Val Thr Asn Ser Leu Pro Ser Pro Glu Gln Leu Lys
420 425 430
Gly Lys Ile Leu Leu Lys Gly Lys Lys Leu Gly Gly Leu Leu Pro Pro
435 440 445
Gly Gly Glu Gly Gly Pro Glu Ala Thr Val Val Ser Asp Glu Asp Glu
450 455 460
Ala Ala Glu Met Glu Asp Glu Ala Val Arg Ser Arg Val Gln His Lys
465 470 475 480
Pro Lys Glu Asp Lys Leu Arg Leu Ala Gln Glu Leu Ser Asp Met Val
485 490 495
Ile Tyr Cys Lys Ser Val His Phe Gly Gly Phe Ser Ser Pro Gly Thr
500 505 510
Pro Gly Gln Ala Phe Tyr Glu Met Ala Ser Phe Ser Glu Asn Arg Ala
515 520 525
Leu Arg Leu Leu Gln Glu Ser Gly Asn Gly Phe Val Arg His Asn Val
530 535 540
Gly His Leu Ser Arg Ile Tyr Pro Ala Gly Trp Arg Thr Asp Ser Ser
545 550 555 560
Asn Tyr Ser Pro Val Glu Met Trp Asn Gly Gly Cys Gln Ile Val Ala
565 570 575
Leu Asn Phe Gln Thr Pro Gly Pro Glu Met Asp Val Tyr Gln Gly Arg
580 585 590
Phe Gln Asp Asn Gly Ala Cys Gly Tyr Val Leu Lys Pro Ala Phe Leu
595 600 605
Arg Asp Pro Asn Gly Thr Phe Asn Pro Arg Ala Leu Ala Gln Gly Pro
610 615 620
Trp Trp Ala Arg Lys Arg Leu Asn Ile Arg Val Ile Ser Gly Gln Gln
625 630 635 640
Leu Pro Lys Val Asn Lys Asn Lys Asn Ser Ile Val Asp Pro Lys Val
645 650 655
Thr Val Glu Ile His Gly Val Ser Arg Asp Val Ala Ser Arg Gln Thr
660 665 670
Ala Val Ile Thr Asn Asn Gly Phe Asn Pro Trp Trp Asp Thr Glu Phe
675 680 685
Ala Phe Glu Val Val Val Pro Asp Leu Ala Leu Ile Arg Phe Leu Val
690 695 700
Glu Asp Tyr Asp Ala Ser Ser Lys Asn Asp Phe Ile Gly Gln Ser Thr
705 710 715 720
Ile Pro Leu Asn Ser Leu Lys Gln Gly Tyr Arg His Val His Leu Met
725 730 735
Ser Lys Asn Gly Asp Gln His Pro Ser Ala Thr Leu Phe Val Lys Ile
740 745 750
Ser Leu Gln Asp
755
<210> 12
<211> 2370
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 12
atgctgtgcg gccgctggag gcgttgccgc cgcccgcccg aggagccccc ggtggccgcc 60
caggtcgcag cccaagtcgc ggcgccggtc gctctcccgt ccccgccgac tccctccgat 120
ggcggcacca agaggcccgg gctgcgggcg ctgaagaaga tgggcctgac ggaggacgag 180
gacgtgcgcg ccatgctgcg gggctcccgg ctccgcaaga tccgctcgcg cacgtggcac 240
aaggagcggc tgtaccggct gcaggaggac ggcctgagcg tgtggttcca gcggcgcatc 300
ccgcgtgcgc catcgcagca catcttcttc gtgcagcaca tcgaggcggt ccgcgagggc 360
caccagtccg agggcctgcg gcgcttcggg ggtgccttcg cgccagcgcg ctgcctcacc 420
atcgccttca agggccgccg caagaacctg gacctggcgg cgcccacggc tgaggaagcg 480
cagcgctggg tgcgcggtct gaccaagctc cgcgcgcgcc tggacgccat gagccagcgc 540
gagcggctag accactggat ccactcctat ctgcaccggg ctgactccaa ccaggacagc 600
aagatgagct tcaaggagat caagagcctg ctgagaatgg tcaacgtgga catgaacgac 660
atgtacgcct acctcctctt caaggagtgt gaccactcca acaacgaccg tctagagggg 720
gctgagatcg aggagttcct gcggcggctg ctgaagcggc cggagctgga ggagatcttc 780
catcagtact cgggcgagga ccgcgtgctg agtgcccctg agctgctgga gttcctggag 840
gaccagggcg aggagggcgc cacactggcc cgcgcccagc agctcattca gacctatgag 900
ctcaacgaga cagccaagca gcatgagctg atgacactgg atggcttcat gatgtacctg 960
ttgtcgccgg agggggctgc cttggacaac acccacacgt gtgtgttcca ggacatgaac 1020
cagccccttg cccactactt catctcttcc tcccacaaca cctatctgac tgactcccag 1080
atcggggggc ccagcagcac cgaggcctat gttagggcct ttgcccaggg atgccgctgc 1140
gtggagctgg actgctggga ggggccagga ggggagcccg tcatctatca tggccatacc 1200
ctcacctcca agattctctt ccgggacgtg gtccaagccg tgcgcgacca tgccttcacg 1260
ctgtcccctt accctgtcat cctatccctg gagaaccact gcgggctgga gcagcaggct 1320
gccatggccc gccacctctg caccatcctg ggggacatgc tggtgacaca ggcgctggac 1380
tccccaaatc ccgaggagct gccatcccca gagcagctga agggccgggt cctggtgaag 1440
ggaaagaagc tgcccgctgc tcggagcgag gatggccggg ctctgtcgga tcgggaggag 1500
gaggaggagg atgacgagga ggaagaagag gaggtggagg ctgcagcgca gaggcggctg 1560
gccaagcaga tctccccgga gctgtcggcc ctggctgtgt actgccacgc cacccgcctg 1620
cggaccctgc accctgcccc caacgcccca caaccctgcc aggtcagctc cctcagcgag 1680
cgcaaagcca agaaactcat tcgggaggca gggaacagct ttgtcaggca caatgcccgc 1740
cagctgaccc gcgtgtaccc gctggggctg cggatgaact cagccaacta cagtccccag 1800
gagatgtgga actcgggctg tcagctggtg gccttgaact tccagacgcc aggctacgag 1860
atggacctca atgccgggcg cttcctagtc aatgggcagt gtggctacgt cctaaaacct 1920
gcctgcctgc ggcaacctga ctcgaccttt gaccccgagt acccaggacc tcccagaacc 1980
actctcagca tccaggtgct gactgcacag cagctgccca agctgaatgc cgagaagcca 2040
cactccattg tggaccccct ggtgcgcatt gagatccatg gggtgcccgc agactgtgcc 2100
cggcaggaga ctgactacgt gctcaacaat ggcttcaacc cccgctgggg gcagaccctg 2160
cagttccagc tgcgggctcc ggagctggca ctggtccggt ttgtggtgga agattatgac 2220
gccacctccc ccaatgactt tgtgggccag tttacactgc ctcttagcag cctaaagcaa 2280
gggtaccgcc acatacacct gctttccaag gacggggcct cactgtcacc agccacgctc 2340
ttcatccaaa tccgcatcca gcgctcctga 2370
<210> 13
<211> 789
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Met Leu Cys Gly Arg Trp Arg Arg Cys Arg Arg Pro Pro Glu Glu Pro
1 5 10 15
Pro Val Ala Ala Gln Val Ala Ala Gln Val Ala Ala Pro Val Ala Leu
20 25 30
Pro Ser Pro Pro Thr Pro Ser Asp Gly Gly Thr Lys Arg Pro Gly Leu
35 40 45
Arg Ala Leu Lys Lys Met Gly Leu Thr Glu Asp Glu Asp Val Arg Ala
50 55 60
Met Leu Arg Gly Ser Arg Leu Arg Lys Ile Arg Ser Arg Thr Trp His
65 70 75 80
Lys Glu Arg Leu Tyr Arg Leu Gln Glu Asp Gly Leu Ser Val Trp Phe
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Gln Arg Arg Ile Pro Arg Ala Pro Ser Gln His Ile Phe Phe Val Gln
100 105 110
His Ile Glu Ala Val Arg Glu Gly His Gln Ser Glu Gly Leu Arg Arg
115 120 125
Phe Gly Gly Ala Phe Ala Pro Ala Arg Cys Leu Thr Ile Ala Phe Lys
130 135 140
Gly Arg Arg Lys Asn Leu Asp Leu Ala Ala Pro Thr Ala Glu Glu Ala
145 150 155 160
Gln Arg Trp Val Arg Gly Leu Thr Lys Leu Arg Ala Arg Leu Asp Ala
165 170 175
Met Ser Gln Arg Glu Arg Leu Asp His Trp Ile His Ser Tyr Leu His
180 185 190
Arg Ala Asp Ser Asn Gln Asp Ser Lys Met Ser Phe Lys Glu Ile Lys
195 200 205
Ser Leu Leu Arg Met Val Asn Val Asp Met Asn Asp Met Tyr Ala Tyr
210 215 220
Leu Leu Phe Lys Glu Cys Asp His Ser Asn Asn Asp Arg Leu Glu Gly
225 230 235 240
Ala Glu Ile Glu Glu Phe Leu Arg Arg Leu Leu Lys Arg Pro Glu Leu
245 250 255
Glu Glu Ile Phe His Gln Tyr Ser Gly Glu Asp Arg Val Leu Ser Ala
260 265 270
Pro Glu Leu Leu Glu Phe Leu Glu Asp Gln Gly Glu Glu Gly Ala Thr
275 280 285
Leu Ala Arg Ala Gln Gln Leu Ile Gln Thr Tyr Glu Leu Asn Glu Thr
290 295 300
Ala Lys Gln His Glu Leu Met Thr Leu Asp Gly Phe Met Met Tyr Leu
305 310 315 320
Leu Ser Pro Glu Gly Ala Ala Leu Asp Asn Thr His Thr Cys Val Phe
325 330 335
Gln Asp Met Asn Gln Pro Leu Ala His Tyr Phe Ile Ser Ser Ser His
340 345 350
Asn Thr Tyr Leu Thr Asp Ser Gln Ile Gly Gly Pro Ser Ser Thr Glu
355 360 365
Ala Tyr Val Arg Ala Phe Ala Gln Gly Cys Arg Cys Val Glu Leu Asp
370 375 380
Cys Trp Glu Gly Pro Gly Gly Glu Pro Val Ile Tyr His Gly His Thr
385 390 395 400
Leu Thr Ser Lys Ile Leu Phe Arg Asp Val Val Gln Ala Val Arg Asp
405 410 415
His Ala Phe Thr Leu Ser Pro Tyr Pro Val Ile Leu Ser Leu Glu Asn
420 425 430
His Cys Gly Leu Glu Gln Gln Ala Ala Met Ala Arg His Leu Cys Thr
435 440 445
Ile Leu Gly Asp Met Leu Val Thr Gln Ala Leu Asp Ser Pro Asn Pro
450 455 460
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Gly Lys Lys Leu Pro Ala Ala Arg Ser Glu Asp Gly Arg Ala Leu Ser
485 490 495
Asp Arg Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Val
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Glu Ala Ala Ala Gln Arg Arg Leu Ala Lys Gln Ile Ser Pro Glu Leu
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580 585 590
Asn Ser Ala Asn Tyr Ser Pro Gln Glu Met Trp Asn Ser Gly Cys Gln
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610 615 620
Ala Gly Arg Phe Leu Val Asn Gly Gln Cys Gly Tyr Val Leu Lys Pro
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Pro Pro Arg Thr Thr Leu Ser Ile Gln Val Leu Thr Ala Gln Gln Leu
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Asp Tyr Val Leu Asn Asn Gly Phe Asn Pro Arg Trp Gly Gln Thr Leu
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Leu Pro Leu Ser Ser Leu Lys Gln Gly Tyr Arg His Ile His Leu Leu
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Arg Ile Gln Arg Ser
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<210> 14
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 14
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ctgttggtgg atcttgtcac cagcatggac catcaggagc gcctggacca atggctgagc 420
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<210> 15
<211> 762
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Met Ala Ser Leu Leu Gln Asp Gln Leu Thr Thr Asp Gln Asp Leu Leu
1 5 10 15
Leu Met Gln Glu Gly Met Pro Met Arg Lys Val Arg Ser Lys Ser Trp
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Lys Lys Leu Arg Tyr Phe Arg Leu Gln Asn Asp Gly Met Thr Val Trp
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His Ala Arg Gln Ala Arg Gly Ser Ala Lys Pro Ser Phe Ser Ile Ser
50 55 60
Asp Val Glu Thr Ile Arg Asn Gly His Asp Ser Glu Leu Leu Arg Ser
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Leu Ala Glu Glu Leu Pro Leu Glu Gln Gly Phe Thr Ile Val Phe His
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Gly Arg Arg Ser Asn Leu Asp Leu Met Ala Asn Ser Val Glu Glu Ala
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Arg Gly Asp Lys Asn Gln Asp Gly Lys Met Ser Phe Gln Glu Val Gln
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Thr Ser Glu Leu Ala Leu Glu Leu Ile Asp Arg Tyr Glu Pro Ser Asp
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Leu Cys Ser Lys Asp Gly Asp Ile Phe Asn Pro Ala Cys Leu Pro Ile
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Lys Val Asp Lys Thr Lys Glu Gly Ser Ile Val Asp Pro Leu Val Lys
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Pro Trp Thr Cys Met Gln Gln Gly Tyr Arg His Ile His Leu Leu Ser
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Lys Asp Gly Ile Ser Leu Arg Pro Ala Ser Ile Phe Val Tyr Ile Cys
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Ile Gln Glu Gly Leu Glu Gly Asp Glu Ser
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<213> Homo sapiens
<400> 16
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Asn Ile Ser His Leu Asn Leu Val Ala Phe Gln Glu Glu Val Ala Lys
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Asn Met Ser Arg Asp Ala Phe Leu Glu Lys Ala Tyr Thr Lys Leu Lys
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Thr Val Asp Gln Met Met Asp Phe Ile Asn Leu Lys Gln Arg Asp Pro
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Val Leu Ile Glu Lys Tyr Glu Pro Asn Asn Ser Leu Ala Arg Lys Gly
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Gly Val Val Ser Pro Glu Lys Leu Asp Leu Asn Glu Asp Met Ser Gln
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Pro Leu Ser His Tyr Phe Ile Asn Ser Ser His Asn Thr Tyr Leu Thr
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340 345 350
Leu Leu Ser Gly Cys Arg Cys Val Glu Leu Asp Cys Trp Lys Gly Arg
355 360 365
Thr Ala Glu Glu Glu Pro Val Ile Thr His Gly Phe Thr Met Thr Thr
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Ser Pro Lys Gln Gln Ala Lys Met Ala Glu Tyr Cys Arg Leu Ile Phe
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Gly Asp Ala Leu Leu Met Glu Pro Leu Glu Lys Tyr Pro Leu Glu Ser
435 440 445
Gly Val Pro Leu Pro Ser Pro Met Asp Leu Met Tyr Lys Ile Leu Val
450 455 460
Lys Asn Lys Lys Lys Ser His Lys Ser Ser Glu Gly Ser Gly Lys Lys
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Lys Leu Ser Glu Gln Ala Ser Asn Thr Tyr Ser Asp Ser Ser Ser Met
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Phe Glu Pro Ser Ser Pro Gly Ala Gly Glu Ala Asp Thr Glu Ser Asp
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Glu Gln Leu Thr Lys Ser Pro Val Glu Phe Val Glu Tyr Asn Lys Met
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Gly Gly Lys Phe Ile Gly His Arg Ile Leu Pro Val Gln Ala Ile Arg
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Arg Arg Arg Ala Ala Leu Glu Lys Ser Ala Lys Lys Asp Ser Lys Lys
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<213> Homo sapiens
<400> 17
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His Ser Asn Glu Lys Trp Phe His Gly Lys Leu Gly Ala Gly Arg Asp
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Gly Ala Pro Asp Gly Ser Phe Leu Val Arg Glu Ser Glu Thr Phe Val
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Ile Phe Val His Ile Thr Ile Asn Glu Ile Tyr Gly Lys Trp Ser Pro
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Arg His Ser Ser Ser Glu Asn Asn Ser His Tyr Val Arg Lys Arg Ser
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<400> 31
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Leu Ile Asn Ala His Glu Gln Gln Thr Gln Gln Leu Lys Leu Ser His
355 360 365
Asp Arg Glu Ser Lys Glu Met Arg Ala His Gln Ala Lys Ile Ser Met
370 375 380
Glu Asn Ser Lys Ala Ile Ser Gln Asp Lys Ser Ile Lys Asn Lys Ala
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Glu Arg Glu Arg Arg Val Arg Glu Leu Asn Ser Ser Asn Thr Lys Lys
405 410 415
Phe Leu Glu Glu Arg Lys Arg Leu Ala Met Lys Gln Ser Lys Glu Met
420 425 430
Asp Gln Leu Lys Lys Val Gln Leu Glu His Leu Glu Phe Leu Glu Lys
435 440 445
Gln Asn Glu Gln Leu Leu Lys Ser Cys His Ala Val Ser Gln Thr Gln
450 455 460
Gly Glu Gly Asp Ala Ala Asp Gly Glu Ile Gly Ser Arg Asp Gly Pro
465 470 475 480
Gln Thr Ser Asn Ser Ser Met Lys Leu Gln Asn Ala Asn
485 490
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 32
Ile Glu Val Leu Gly Ala Arg His Leu Pro Lys Asn Gly Arg Gly Ile
1 5 10 15
Val Cys Pro Phe Val Glu Ile Glu Val Ala Gly Ala Glu Tyr Asp Ser
20 25 30
Thr Lys Gln Lys Thr Glu Phe Val Val Asp Asn Gly Leu Asn Pro Val
35 40 45
Trp Pro Ala Lys Pro Phe His Phe Gln Ile Ser Asn Pro Glu Phe Ala
50 55 60
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65 70 75 80
Phe Leu Ala Gln Ala Thr Phe Pro Val Lys Gly Leu Lys Thr Gly Tyr
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Arg Ala Val Pro Leu Lys Asn Asn Tyr Ser Glu Asp Leu Glu Leu Ala
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Ser Leu Leu Ile Lys Ile Asp Ile Phe Pro Ala Lys Glu Asn Gly Asp
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Leu Ser Pro Phe Ser Gly Thr Ser Leu Arg Glu Arg Gly Ser Asp Ala
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Ser Gly Gln Leu Phe His Gly Arg Ala Arg Glu Gly Ser Phe Glu Ser
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Arg Tyr Gln Gln Pro Phe Glu Asp Phe Arg Ile Ser Gln Glu His Leu
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Ala Asp His Phe Asp Ser Arg Glu Arg Arg Ala Pro Arg Arg Thr Arg
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1 5 10 15
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100 105 110
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130 135 140
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Asn Leu Arg Asn Ala Asn Arg Asp Ala Leu Val Lys Glu Phe Ser Val
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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Glu Ile Lys Asn Leu Glu Gly Asn Arg Gly Lys Gly Arg Ala Ala Thr
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Leu His Ser Thr Ala Ile Leu Gln Glu Ser Val Ile Ser His Leu Ile
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Glu Pro Ser Ser Asp Asp Lys Pro Glu Ile Tyr Phe Leu Leu Arg Leu
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<210> 36
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 36
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Leu Glu Pro Ala Ser Leu Phe Val Tyr Val Trp Tyr Val Arg
115 120 125
<210> 37
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 37
Asp Glu Val Asp
1
Claims (72)
- 서열번호: 1의 아미노산 서열들로 이루어진 단백질 형질도입 영역(protein transduction domain; PTD) 및 서열번호: 11의 아미노산 서열들로 이루어진 포스포리파제 C 폴리펩티드(phospholipase C polypeptide)를 포함하는 융합 폴리펩티드.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 1 항에 있어서,상기 PTD 및 포스포리파제 C 폴리펩티드가 직접 공유 결합, 펩티드 결합 또는 링커에 의해 서로 결합된 융합 폴리펩티드.
- 제 6 항에 있어서,상기 링커가 1 내지 5개의 아미노산으로 이루어진 비-절단 링커인 융합 폴리펩티드.
- 제 7 항에 있어서,상기 링커가 Gly-Gly-Gly를 포함하는 융합 폴리펩티드.
- 제 6 항에 있어서,상기 링커가 절단 링커인 융합 폴리펩티드.
- 제 1 항의 융합 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는, 허혈성 질환 치료용 또는 예방용 약학 조성물.
- 제 10 항에 있어서,상기 약학 조성물이 하나 이상의 항혈소판 약물, 항응고 약물 또는 항혈전 약물을 추가로 포함하는 약학 조성물.
- 삭제
- 서열번호: 1의 아미노산 서열들로 이루어진 단백질 형질도입 영역(PTD) 및 서열번호: 11의 아미노산 서열들로 이루어진 포스포리파제 C 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는, 저산소증, 허혈성 질환, 및 심근 경색 중 적어도 하나를 치료하거나 허혈을 예방하기 위한 약학 조성물.
- 삭제
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- 서열번호: 1의 아미노산 서열들로 이루어진 단백질 형질도입 영역(PTD), 및 서열번호: 11의 아미노산 서열들로 이루어진 포스포리파제 C 폴리펩티드의 칼슘-결합 영역(C2)을 포함하는 융합 폴리펩티드.
- 제 59 항에 있어서,상기 칼슘-결합 영역이 서열번호: 25 내지 36의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 융합 폴리펩티드.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
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- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 9 항에 있어서,상기 링커가 서열번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드.
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