CN101511872A

CN101511872A - 用于抑制凋亡的药物组合物及其递送方法

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Publication number: CN101511872A
Application number: CNA2007800320510A
Authority: CN
Inventors: 李尚揆; 李承揆; 张桹洙; 黄基哲
Original assignee: ForHumanTech Co Ltd
Current assignee: ForHumanTech Co Ltd
Priority date: 2006-08-29
Filing date: 2007-08-28
Publication date: 2009-08-19
Also published as: EP2725014A1; KR20090045940A; WO2008047243A2; WO2008047243A3; JP2010503616A; EP2057195A2; EP2057195A4; US20080132450A1

Abstract

本发明涉及用于治疗因凋亡所致的心脏病、神经变性疾病和疾病与病况的药物组合物，所述药物组合物含有热休克蛋白(Hsp)与蛋白质转导结构域(PTD)的缀合物。根据本发明，PTD－Hsp70有效地在低氧条件下抑制凋亡。

Description

用于抑制凋亡的药物组合物及其递送方法

发明背景

发明领域

本发明涉及用于治疗因凋亡所致的心脏病、神经变性疾病和疾病与病况的新药物组合物，所述药物组合物含有目的分子(如热休克蛋白(Hsp)与蛋白质转导结构域(PTD)的缀合物)，并涉及用于递送该药物组合物的方法。

背景技术

凋亡，又称作“程序性细胞死亡”，是细胞自我摧毁的一种机制，此时细胞经受各种信号刺激，即此时机体不再需要所述细胞或它们已经成为对机体整体性的威胁。凋亡是有效且充分受调节的过程，其中维持成年个体生命和胚胎发生、形态发生与变态期间均需要该过程，并且凋亡与由激素及多种化学品引起的细胞死亡相关。若凋亡在不合适的时间出现，或若关键性凋亡受抑制，则各种疾病(如癌症和自身免疫性疾病)可以发生。

凋亡产生各种现象，这包括核酸浓集和DNA断裂成恒定的尺寸，以及胞内细胞器、内质网、细胞膜等改变。另外，凋亡如此进行，从而死亡细胞可以借助吞噬作用被除去，而未不良影响周围细胞。

用于移植目的而分离的器官也可以出现凋亡。防止分离的器官中的凋亡提高了器官移植成功率。用于保护分离的器官直至移植时的保存溶液是提高器官移植成功率的重要因素。当前广泛使用的器官保存溶液包括Viaspan^TM、威斯康星大学溶液、HTK^TM(组氨酸-色氨酸酮戊二酸溶液)、SGF(硅胶过滤的血浆)等。

尽管一般认为再灌注是有益的，然而再灌注通过几种机制造成组织损伤。临床上，在心内直视术、心脏移植和心脏病逆转中，保护心肌免受因缺血-再灌注所致的损伤是具有最重要临床意义的事情。在通过再灌注恢复氧合(再氧合作用)后低氧性损伤的加剧是在其它类型器官移植中和在肝、肠、脑、肾与其它缺血性综合征中细胞损伤的重要机制。

有机保存溶液的组成是重要因素，并且除用于防止器官变干并维持器官渗透压的因子之外，最近提出添加各种化合物以抑制器官凋亡的方法。

分子伴侣是细菌、植物和动物细胞中在生理条件及应激条件下辅助蛋白质折叠的一组功能相关的蛋白质(Giffard，R.G.等，J.Exp.Biol.207：3213-3220(2004))。分子伴侣也促进蛋白质复合体转运、帮助呈送底物用于降解并且抑制蛋白质聚集。高度保守性分子伴侣的一个重要亚组是ATP依赖性热休克蛋白(Hsp)。

在正常条件下，Hsp的功能是作为新合成多肽的胞内分子伴侣发挥作用，防止其在折叠及亚基装配期间以及在蛋白质跨亚细胞膜转运至它们的合适细胞区室期间聚集。一些Hsp参与清除错误折叠的蛋白质和细胞应激条件(例如氧化和高温)下因其稳定性下降而解折叠的蛋白质。除应激诱导性成员外，大部分Hsp家族也含有组成型表达的成员。

热休克蛋白70(Hsp70)是参与众多胞内机制的高度保守的蛋白质分子伴侣。Hsp70由胞内应激诱导并且抑制应激诱导的凋亡。Hsp70也具有免疫调节潜能并且已知其刺激抗炎性细胞因子产生(见Van Eden，W.等，Nat.Rev.Immunol.5：318-330(2005))。另外，Hsp70防止因肿瘤坏死因子(TNF)所致的炎性休克并且诱导抗原呈递。

也已知Hsp家族成员(包括Hsp70)在慢性炎性疾病中调节T-细胞以防止或中断因炎症所致的凋亡(见Van Eden，W.等，Nat.Rev.Immunol.5：318-330(2005))。例如，证实Hsp70衍生肽诱导针对实验诱导性关节炎的保护作用(Tanaka，S.等，J.Immunol.163：5560-5565(1999))。

神经变性疾病如阿尔茨海默病和亨廷顿病(多聚谷氨酰胺病)是可能因错误折叠及聚集的蛋白质异常堆积所致的常见疾病，并且认为这些疾病被作为分子伴侣的Hsp70的作用抑制。凋亡是在缺血后神经元死亡的途径之一。已经证实Hsp70在海马CA1神经元中的过量表达在增加神经元存活的条件下明显降低蛋白质聚集(Giffard，R.G.等，J.Exp.Biol.207：3213-3220(2004))。

缺血性和低氧性凋亡也可以因蛋白质的不良清除作用而出现，其中所述的蛋白质因在异常氧化条件下稳定性降低而不适当地折叠或解折叠。据报道Hsp70与辅助分子伴侣Hsp40一起发挥作用以抑制在缺乏葡萄糖或氧-葡萄糖时脑星形胶质细胞的缺血性或低氧性凋亡(见Giffard，R.G.等，J.Exp.Biol.207：3213-3220(2004))。这些体外损伤模型模拟了中风期间参与缺血性损害的损伤的某些方面。

此外，Hsp70在糖尿病中的作用是已知的，并且自由基诱导对胰腺β细胞的损伤受Hsp70过量表达抑制(见Burkart，V.等，JBC 275：19521-19528(2000)；和Margulis等，Diabetes 40：：1418-1422(1994))。

需要有效递送大分子如Hsp70至体外或体内细胞的方法。一般而言，活细胞不可透过大分子，如蛋白质及核酸。仅具有小尺寸的某些物质可以以低速率通过活细胞的膜并进入胞内细胞质、细胞器或细胞核。多数大分子不能进入细胞，从而为使用此类大分子的治疗、预防和诊断设置了障碍。由于制备用于治疗、预防和诊断目的物质应当以有效量递送至细胞，故已经开发了用于递送这些物质至细胞的多种方法。

用于递送大分子至体外细胞的方法包括电穿孔法、用脂质体的膜融合法、用DNA涂敷的微抛射体的高速轰击法、与磷酸钙-DNA沉淀物的孵育法、DEAE-葡聚糖介导转染法、用修饰病毒核酸感染法和对单个细胞直接微量注射法。最近，已经尝试使用纳米粒子递送大分子至体外和体外细胞，但就技术水平和临床效果而言，这些方法仍处于早期阶段。另外，这些方法一般可以递送大分子仅至一些细胞，并且递送大分子至细胞内的时间和效率没有达到可以临床应用的阶段。因此，需要用于有效递送生理活性大分子至体外和体外细胞内而不损害该细胞的一般方法。

因此，研究了蛋白质转导结构域(PTD)。在PTD的研究当中，最频繁研究的是Tat蛋白，它是人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的转录因子(见SchwarzeS.R.等，Science 285(5433)：1569-1572(1999))。当Tat蛋白由第47-57位氨基酸残基(YGRKKRRQRRR)组成且带正电荷的氨基酸密集分布时，发现这种蛋白质比作为由86个氨基酸组成的Tat蛋白完整形式更有效地通过细胞膜(见Fawell，S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：664-668(1994))。发现起到PTD作用的其它氨基酸序列包括HSV-1(单纯疱疹病毒1型)VP22蛋白的第267-300位氨基酸残基(见Elliott，G.等，Cell 88：223-233(1997))和果蝇(Drosophila)ANTP(触角足蛋白)第339-355位氨基酸残基(见Schwarze，S.R.等，Trends Pharmacol Sci.21：45-48(2000))。

用于使用PTD递送物质至细胞内的技术允许通过递送在细菌中产生的重组医用蛋白质和药用蛋白质至想要的动物细胞内而产生具有天然结构及功能的医用蛋白质。

发明简述

本发明的一个目的是通过体内递送热休克蛋白(Hsp)多肽而有效抑制凋亡和因凋亡所致疾病的发展。

为实现上述目的，本发明提供PTD与热休克多肽的缀合物(PTD-Hsp)。本发明的PTD-Hsp缀合物因PTD的胞内渗透及递送作用而容易地穿过细胞膜以递送至细胞中。

本发明的一个实施方案是减少或抑制细胞群凋亡的方法，其中将细胞群与有效量的PTD-Hsp接触。

又一个实施方案是通过如此方式治疗、预防或抑制以凋亡水平升高为特征的病理状态的方法，即向需要这种治疗的个体施用有效用于治疗该病理状态的量的PTD-Hsp。

本发明的额外实施方案是使受损细胞再生的方法，包括将所述细胞贮存在有效量的PTD-Hsp中。

本发明的另一个实施方案是用于通过将细胞与抑制量和/或遏制量的PTD-Hsp接触而延长或增加细胞群存活的方法。

本发明的又一实施方案是用于延长细胞、组织或器官生存力的方法，所述方法包括将细胞群、组织或器官与抑制量和/或遏制量的PTD-Hsp接触。

本发明也包括体外增加生物生产的方法，其中使产生目的产物的宿主细胞与PTD-Hsp接触。

对于全部的上文实施方案，也预期了PTD与Hsp的一个或多个片段、衍生物或类似物的融合物。

本发明也能够通过局部施用途径施用PTD-Hsp缀合物，因而使全身性副作用最小化或避免全身性副作用。

附图简述

图1A显示表达的HspA1A和PTD-HspA1A蛋白。将分离和纯化的HspA1A和PTD-HspA1A融合蛋白进行SDS-PAGE，并且通过考马斯兰染色法分析。HspA1A的分子量(mw)是约70kDa并且PTD-HspA1A的分子量是约72kDa。

图1B显示PTD-HspA1A在Jurkat T细胞中的表达。将1μl蛋白质添加至含Jurkat T细胞的培养基并且培养1小时。仅向该细胞导入PTD-缀合的蛋白质。

图1C显示PTD-HspA1A以浓度依赖性方式抑制凋亡。用0.5μM星形孢菌素处理细胞以诱导凋亡，添加各种浓度的PTD-HspA1A，并且分析所述细胞的凋亡程度。细胞存活随PTD-HspA1A的递增量而增加。Con代表Jurkat T细胞，并且STS代表星形孢菌素。

图2A-E代表将PTD-HspA1A在低氧条件下导入间充质干细胞(MSC)并检验其凋亡抑制效果的实验。向MSC导入各种浓度的纯化PTD-HspA1A(图2A)。

图2B显示低氧条件(缺氧)下MSC的凋亡在HspA1A存在时受到抑制，如增加的WST-1信号所示。

图2C显示MSC中胱天蛋白酶-3的相对活性在低氧条件下于HspA1A存在时受到抑制。

图2D显示ATP水平在低氧条件下于HspA1A存在时在MSC中增加。

图2E显示在低氧条件下在MSC中导入HspA1A抑制了Bax蛋白表达，并且抑制JNK(c-Jun氨基端激酶，应激活化的蛋白质激酶)蛋白的磷酸化(即活化)，同时维持其表达水平，因而抑制凋亡。

图3A-F是视网膜变性模型中视网膜细胞的图片。在具有由抗癌药MNU所诱导凋亡的视网膜变性模型中，光受体细胞层的变性总是始于视网膜的中央部分出现(图3A)。与对照组不同，视网膜的中央部分显示光受体细胞层细胞减少并变成不规则形状。细胞层在视网膜中央部分比在所述中央部分的照片中更好地得到维持，同时细胞存在少量损伤(图3B)。视网膜的周围部分几乎完全保持其样子(图3C)。

图3D-F显示施用PTD-HspA1A后的结膜。视网膜的中央部分显示光受体细胞层损伤严重，仅在光受体细胞层的一部分处得到保存，这表明与对照组相比，PTD HspA1A有效果(图3D)。在视网膜的中央部分中，光受体细胞得到更好保存，因为与视网膜中央部分的照片中相比可以更清晰地观察到正常的光受体细胞(图3E)。在视网膜的周围部分，光受体细胞层如此程度地得到保存，其几乎等同于全身性施用的状况(图3F)。周围部分在形态学上基本正常。

图4显示表达HspA1A的肠上皮细胞维持正常。将分离的肠上皮细胞分成两个组，仅其中一组给予在43℃的热休克以诱导HSPA1A蛋白表达。在其中表达HSPA1A蛋白的细胞(左边照片)维持正常，而在其中不表达HSPA1A蛋白的组的细胞显示细胞核和细胞质浓集(右边照片)。

图5显示对宿主心肌中DAPI-标记的MSC的比较，其中所述的MSC用Hph-1-HspA1A处理或不处理。

图6A-C显示向梗死的心肌植入HspA1A-MSC后对心肌修复的分析。(图6A)H&E和DAPI双重染色法显示在植入4周后，活的成熟心肌细胞已经浸润至疤痕区。(图6B)DAPI和心脏特异性标记CTn T、MHC或Cav2.1的双重染色法显示所述心脏特异性标记表达在DAPI标记的细胞中。所述心脏特异性标记以红色显示。(图6C)DAPI和连接蛋白-43或N-钙粘着蛋白的双重染色法显示MSC衍生性心肌细胞在植入的细胞与宿主肌细胞的边缘区处表达连接蛋白-43和N-钙粘着蛋白。连接蛋白-43和N-钙粘着蛋白染色以绿色显示。

图7A-B显示Hsc70的凋亡抑制效果。(图7A)Hsc70的纯化。(图7B)Hsc70以浓度依赖性方式显示的凋亡抑制效果。对照代表无任何处理的Jurkat T细胞，并且STS代表星形孢菌素处理。

图8A-B显示cvHsp的凋亡抑制效果。(图8A)cvHsp的纯化。(图8B)cvHsp以浓度依赖性方式显示的凋亡抑制效果。

图9显示含人Hsp70家族成员的表。

发明详述

凋亡型和坏死性细胞死亡以及其它程序性细胞死亡途径常常参与缺血性脑损伤、心脏病和神经变性疾病。本发明包括使用肽即蛋白质转导结构域(PTD)与热休克蛋白(Hsp)的缀合物或融合物用于治疗或预防凋亡性细胞死亡的方法。本发明的缀合物可以通过克隆法将PTD编码基因与Hsp基因融合而制备。本发明中所用的PTD能够将蛋白质、肽和化学化合物经过皮肤、眼球或气道递送至身体，并且因此若作为含多肽的缀合物提供，则可以递送该多肽至体内局部区域。

本发明的一个实施方案是使用PTD-Hsp70缀合物来治疗或预防凋亡性细胞死亡。根据本发明，Hsp70因PTD的胞内渗透和递送作用而容易地经过细胞膜并被递送至细胞内。被递送至细胞内的缀合物由胞内蛋白酶分解，并且因而分出的Hsp70显示抑制及治疗疾病和抑制凋亡的效果。

本发明的另一个实施方案是减少或抑制细胞群凋亡的方法，其中将细胞群与有效量的PTD-Hsp接触，从而经历凋亡的一个或多个细胞受到保护免于细胞死亡。所述细胞可以是分化细胞或前体细胞并且包括，但不限于神经细胞(例如神经元)、成纤维细胞、平滑肌细胞、肿瘤细胞、造血细胞、单核细胞、巨噬细胞、上皮细胞、角质形成细胞、神经细胞、内皮细胞、粒细胞、单核细胞、红细胞、淋巴细胞和血小板。术语“接触”如本文中所用，意指使细胞暴露于PTD-Hsp，因而抑制所述细胞中的凋亡并且使该细胞增殖及积聚。所述细胞可以离体或在体内与PTD-Hsp接触。

本发明的另一个实施方案是通过如此方式治疗、预防或抑制以凋亡水平升高为特征的病理状态的方法，即通过向需要这种治疗的个体施用有效用于治疗该病理状态的量的PTD-Hsp。所预期的病理状态包括，但不限于应激诱导的病理学(如缺血)和慢性变性疾病(如神经变性疾病和变性萎缩)。

缺血性病况包括，但不限于，因缺血性脑梗死所致的中风、缺血性急性肾功能衰竭、肠缺血、因心肌梗死所致的缺血性心脏病(心肌缺血)和再灌注后病症、肝缺血、脑缺血(例如因卒中所致的脑缺血等)和视网膜缺血。

神经变性疾病包括，但不限于阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、脊髓延髓萎缩、失神经萎缩、脊髓性肌萎缩(SMA)、视网膜色素变性与青光眼、小脑变性和新生儿黄疸、耳硬化、中风、痴呆和连续迟发性神经元死亡(DND)。

心脏的其它变性疾病包括，但不限于重症肌无力、病毒性心肌炎、自身免疫性心肌炎(充血性心肌病和)、因心脏肥大和心脏衰竭所致的心肌病或心肌死亡、致心律失常性右室心肌病、心脏衰竭和冠状动脉旁路移植术。

其它变性疾病包括酒精性肝炎、病毒性肝炎、肾病(例如肾小球肾炎)、溶血性尿毒综合征等、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、炎性皮肤病如中毒性表皮坏死松解症(TEN)和渗出性多形性红斑、移植物抗宿主病(GVH)、辐射病、归因于抗癌药、抗病毒药等的副作用、归因于毒物(如叠氮钠、氰化钾等)的病症、骨髓发育不良如再生障碍性贫血等、朊病毒病如克雅氏病、脊髓损伤、创伤性脑损伤、与自身免疫性疾病和抑制排斥相关的细胞毒T细胞或天然杀伤细胞介导的凋亡、线粒体药物中毒(例如因化疗或HIV疗法所致)、病毒性、细菌性或原虫性感染、炎症或炎性疾病、炎性肠病、败血症与感染性休克、从卵泡期至卵母细胞期、从卵母细胞至成熟卵期以及精子(例如卵巢组织冷冻和移植的方法、人工授精)、皮肤损害(因暴露于高水平辐射、热、烧伤、化学品、阳光和自身免疫性疾病)、骨髓增生异常综合征(MDS)(骨髓细胞死亡)、胰腺炎、骨性关节炎、类风湿性关节炎、银屑病、肾小球肾炎、动脉粥样硬化、移植物抗宿主病、视网膜周细胞凋亡、视网膜神经元凋亡青光眼、因缺血所致的视网膜损害、糖尿病性视网膜病、呼吸综合征、糖尿病(例如胰岛素依赖性糖尿病)、自身免疫性疾病、获得性多聚谷胺酰胺病、动脉中层钙化(Monckeberg’s)、与获得性免疫缺陷疾病(AIDS)相关的脑病、肌病和肌肉萎缩症、肾小球硬化症、门克伯格中动脉硬化、炎性肠病、局限性肠炎(Crohn’s disease)、自身免疫性肝炎血色素沉着病和威尔逊病、酒精性肝炎、不同病因学的急性肝衰竭、胆管疾病、动脉粥样硬化、高血压、凋亡诱导的脱发和与化疗药物使用有关的凋亡。

本发明的另一个实施方案是用于通过将细胞与抑制量和/或遏制量的PTD-Hsp接触而扩充或增加细胞群存活的方法，其中所述的PTD-Hsp抑制细胞群中的凋亡，因而扩充或增加该细胞群的存活。术语“扩充”如本文中所用，意指增加预存细胞群的细胞数目。术语“存活”指(一般是离体)维持细胞的生存力；然而，该术语也包括在体内。存活可以是从几小时至几日或更长时间。所述的细胞群可以由分化细胞或前体细胞、粒细胞、单核细胞、红细胞、淋巴细胞或血小板组成。

所述方法包括将所需的细胞与有效量的PTD-Hsp接触，其中所述PTD-Hsp抑制或遏制该细胞群中的凋亡。术语“接触”如本文中所用，意指使细胞暴露于PTD-Hsp，因而抑制该细胞中的凋亡并且使该细胞增殖及积聚。所述细胞可以离体地或在体内与PTD-Hsp接触。

本发明的额外实施方案是使受损细胞再生的方法，包括将所述细胞贮存在有效量的含有PTD-Hsp的溶液中，因而使受损细胞再生。

本发明的又一实施方案是用于延长细胞、组织或器官生存力的方法，所述方法包括将细胞群、组织或器官与一定量的PTD-Hsp接触，其中所述的量有效抑制在所述细胞群、组织或器官的一个或多个细胞中的凋亡，因而与未处理的细胞群、组织或器官相比，延长所述细胞群、组织或器官的生存力。在细胞群中的细胞可以是受损细胞，因而与PTD-Hsp的接触导致受损细胞再生。处理的细胞、组织和器官例如可以用于输注或移植。所述细胞群、组织或器官可以在输注期间或在移植该细胞群、组织或器官期间与PTD-Hsp接触。

所述细胞可以是分化细胞或前体细胞并且包括，但不限于干细胞(例如造血干细胞、间充质干细胞、间质干细胞或神经干细胞)、神经细胞(例如神经元)、成纤维细胞、平滑肌细胞、肿瘤细胞、造血细胞、单核细胞、巨噬细胞、上皮细胞、角质形成细胞、内皮细胞、粒细胞、红细胞、淋巴细胞和血小板。

造血干细胞可以移植至有需要的患者并且能够分化成血细胞。所述个体可以是白血病或血癌患者。

间充质干细胞(MSC)是能够分化成多于一种类型间充质细胞系的细胞。已经从鸟类和哺乳类物种(包括小鼠、大鼠、兔和人)鉴定并培养MSC(见美国专利号5,486,359)。在该专利中详细描述人MSC的分离、纯化及培养扩充。MSC可以移植至有需要的患者并且能够分化成骨细胞(例如骨细胞)、软骨细胞(例如软骨细胞)、脂肪细胞(例如脂肪细胞)或心肌细胞。MSC可以移植至心脏，包括梗死的心脏。

神经干细胞可以移植至有需要的患者中并且能够分化成神经细胞(如神经元)或非神经细胞(如星形胶质细胞或少突胶质细胞)。

此外，所述细胞群、组织或器官可以与PTD-Hsp接触以抑制凋亡，因而增加生物生产期间的细胞生存力。通过增强生物生产，细胞存活更长并且更长时间地产生和/或分泌想要的产物，因此导致更大的产物产量。防止凋亡的能力可以允许细胞不依赖正常所需的生长因子而生活，从而降低培养基添加物的成本。

术语“接触”如本文中所用，意指使细胞暴露于PTD-Hsp，因而抑制所述细胞中的凋亡并且使所述细胞增殖及积聚。所述细胞可以离体地或在体内与PTD-Hsp接触。

术语“延长”意指与不用PTD-Hsp处理的相似组织或器官相比，用于移植的组织或器官因使用本发明方法的处理而受到保护。据信用于移植的细胞或器官与PTD-Hsp的接触抑制凋亡，因而保护所述器官并延长生存力。

所述的细胞群、组织或器官可以在输注或移植期间离体或在体内与PTD-Hsp接触，从而减少或预防因该器官或组织的再灌注所致的损伤。所述接触可以通过在取出该细胞群、组织或器官之前或同时，向组织或器官供者施用PTD-Hsp。所述器官可以任意实质器官，包括但不限于心脏、胰脏、肾脏、肺或肝脏。

PTD-Hsp可以存在于(如低温贮存液)中，并且贮存可以在高于冰点或低于冰点的温度上进行。低温贮存的基本挑战在于将材料保存在可以逆转的状态，而不引起广泛细胞损害或细胞死亡。所述溶液还可以包含一定量的有效防止在该溶液和所述细胞、组织或器官中形成冰晶的玻璃化组合物。通过引用的方式并入本文的美国专利号6,045,990部分地证实可以通过在保存溶液或介质中包含抗凋亡物质而增强自低温保护的存活和恢复。

所述方法包括：a)将所述细胞、组织或器官与低温贮存液接触，其中该溶液包含：i)抑制凋亡的组合物；和ii)浓度足以使该溶液玻璃化的玻璃化组合物；和b)使所述细胞、组织或器官玻璃化，其中在该细胞、组织或器官中并且在包含所述细胞、组织或器官及由其包含的低温贮存液中均发生所述玻璃化。

玻璃化通过包含如此物质的低温贮存液实现，其中所述的物质防止在胞外和胞内环境中的冰晶核形成并具有比所述溶液的均质成核温度更低的玻璃化转变温度(Tg)。降低低温贮存液中样品的温度至玻璃化转变温度以下则导致该溶液和在该溶液中的细胞、组织或器官的玻璃化。在这些条件下，当样品变成固体时，在所述细胞内或其周围无晶态冰形成。包含一种或多种抗凋亡物质则有助于防止在这种类型的保护后通常出现的凋亡性细胞死亡。

在又一个实施方案中，本发明提供用于增加细胞存活的方法，其中体外培养所述的细胞用于除移植之外的用途。已经证实在发酵期间细胞死亡是凋亡性的，因此抑制凋亡将提高生物生产期间的细胞生存力。凋亡抑制可用在体外增强生物生产中，其中将产生目的产物的宿主细胞与PTD-Hsp接触，其中PTD-Hsp抑制在一个或多个细胞中的凋亡，因而增加体外细胞存活。通过增强生物生产，细胞存活更长并且更长时间地产生和/或分泌想要的产物，因此导致更大的产物产量。防止凋亡的能力可以允许细胞不依赖正常所需的生长因子而生活，从而降低培养基添加物的成本。

可以按照几种方式测量PTD-Hsp对生物生产的影响：1)在不同时间点上测定凋亡细胞在培养物中的百分数；2)就产生所需产物方面确定培养物的有用寿命；3)测量每克细胞或每体积培养物的产物产量；或4)测量该产物的最终纯度。

蛋白质转导结构域(PTD)

PTD有效地允许通过全身施用或局部施用而体内和体外递送或摄取目的蛋白、肽和化学化合物至细胞内。施用途径包括肌内、腹膜内、静脉内、口服、经鼻、皮下、皮内、粘膜途径和通过吸入进行等。因此，若产生所述PTD作为含蛋白质、肽和/或化学化合物的缀合物，则该PTD可以递送所述蛋白质、肽和/或化学化合物至局部区域，例如皮肤、眼球或气道。

本发明人将多种PTD相互比较，并且因此，发现PTD含有数目相对多的赖氨酸和精氨酸，并且精氨酸是在向细胞递送物质中特别重要的。这得到以下事实支持，即由带正电荷的氨基酸组成的人工肽也具有物质递送作用(见Laus，R.等，Nature Biotechnol.18：1269-1272(2000))。

发现某些蛋白质借助9-12个精氨酸残基或9-12个赖氨酸残基而被递送至细胞(见Rothbard，J.B.等，Nature Med.6：1253-1257(2000))，这与精氨酸残基或赖氨酸残基在PTD本身的某些位置内存在以形成通道结构的假设相矛盾。还发现仅与PTD共价或非共价结合的靶蛋白被递送至细胞内，这与PTD破坏细胞膜以递送大分子至细胞内的假设相矛盾。我们的研究结果证实物质借助PTD递送至细胞内在37℃和4℃均有效地出现。

MTS(膜转运序列)是一种新PTD，其具有与上文现存PTD的那些特征不同的特征。基于FGF(成纤维细胞生长因子)信号肽(见Jo，D.等，Nat.Biotechnol.19：929-933(2001))的氨基酸序列，合成并构建MTS。然而，该信号肽的氨基酸序列具有与上文现存PTD氨基酸的那些特征显著不同的以下特征：(a)3-5个精氨酸或赖氨酸残基以不连续方式存在，丝氨酸或苏氨酸残基以类似的方式存在，而谷氨酸或天冬氨酸不存在；(b)至少一个碱性氨基酸和6-12个疏水氨基酸存在；(c)丝氨酸、苏氨酸及小体积的疏水氨基酸为数众多而谷氨酸与天冬氨酸为数稀少；(d)羧基端部分含有大量丝氨酸、赖氨酸和亮氨酸残基；和(e)一个或两个碱性氨基酸蔟集在一起，并且10个随机氨基酸存在于这些碱性氨基酸之间。这就是说，PTD(如MTS)没有现存PTD的氨基酸组成特征。

本发明人已经发现解折叠的蛋白质远比具有复杂三维结构的蛋白质更有效地受到递送，并且在递送至细胞和胞内细胞器时，解折叠的蛋白质不从细胞或胞外细胞器释放出来。此外，PTD不利用通过受体的内吞作用和吞噬作用，不过可以使用存在于细胞表面上的通道。因此，疏水氨基酸如丙氨酸和缬氨酸应当存在于PTD中。

本发明人已经发现若使用由人转录因子Hph-1第858-868位氨基酸残基组成的肽作为递送物质至细胞内的肽，则该肽可以体内或体外递送靶蛋白、核酸、脂肪、糖类或化学化合物至真核细胞或原核细胞的细胞质、细胞器或细胞核，因而完成本发明。

为作为PTD用在本发明中，本发明人利用固相合成法构建了几种肽，不过应当理解根据所需的递送区域和所用接头的类型，可以使用其它类型的PTD。所述PTD由3-30个氨基酸、更优选5-15个氨基酸组成，其中至少30％的所述氨基酸优选地是精氨酸残基。然而，也预期了无任何精氨酸残基的PTD。

一个实施方案涉及使用Hph-1-PTD，即来自人(和小鼠)转录因子HPH-1的PTD(YARVRRRGPRR)(SEQ ID NO：1)。另一个实施方案涉及使用Sim-2的PTD(AKAARQAAR)(SEQ ID NO：2)。

其它实施方案包括，但不限于HIV-1病毒蛋白Tat的PTD(YGRKKRRQRRR)(SEQ ID NO：3)、果蝇触角足蛋白(Antp)的PTD(RQIKIWFQNRRMKWKK)(SEQ ID NO：4)、HSV-1结构蛋白Vp22的PTD(DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE)(SEQ ID NO：5)、G蛋白信号作用R7的调节蛋白的PTD(RRRRRRR)(SEQ ID NO：6)、MTS(AAVALLPAVLLALLAPAAADQNQLMP)(SEQ ID NO：7)和短两性肽载体Pep-1(KETWWETWWTEWSQPKKKRKV)(SEQ ID NO：8)与Pep-2(KETWFETWFTEWSQPKKKRKV)(SEQ ID NO：9)。

热休克蛋白(Hsp)

为实现上文目的，本发明提供PTD与多肽(如Hsp分子伴侣、辅助分子伴侣或低分子量热休克蛋白或小应激蛋白(smHsp))的缀合物。

基于单体分子量，Hsp大体分成6个家族，包括Hsp10、Hsp40、Hsp60、Hsp70、Hsp90和Hsp100家族。Hsp40是Hsp70活性的辅助分子伴侣(VanEden，W.等，Nat.Rev.Immunol.5：318-330(2005))。Hsp家族高度保守并且某些哺乳动物家族成员具有高度保守的微生物同系物，这导致哺乳动物同系物与微生物同系物之间的免疫学交叉识别(Van Eden，W.等，Nat.Rev.Immunol.5：318-330(2005))。

已经证实smHsp蛋白家族主要通过调节肌动蛋白多聚化和细胞骨架组建而在稳定蛋白质折叠及运输中发挥作用。全部smHsp的特征是在羧基末端处存在一个含约80-100个残基的进化保守的结构域。在该结构域之前是一个氨基端结构域，其大小及序列可变，并且其后是一个短的、低保守性羧基端延伸部分，已知该延伸部分经受众多修饰(包括截短)。smHsp的实例包括cvHsp、αB-晶体蛋白、αA-晶体蛋白、Hsp20、Hspβ-2、Hsp样27和Hsp27(见Krief等，J.Biol.Chem.274：36592-36600(1999))。

本发明的一个实施方案是PTD与Hsp70蛋白家族成员的缀合物。已经证实Hsp70蛋白家族抑制多种类型的细胞死亡，包括坏死性细胞死亡、经典凋亡和具有胱天蛋白酶非依赖性并不受Bc1-2阻断的其它程序性细胞死亡途径(见Giffard，R.G.等，J.Exp.Biol.207：3213-3220(2004))。Hsp70蛋白家族的成员包括，但不限于HspA1A、HspA1B、HspA1L、HspA2A、HspA2B、HspA4、HspA5、HspA6、HspA7、Hsp8A(Hsc70)、Hsp9A，并且它们也在本发明的预期之中。下文提供这些Hsp70蛋白家族成员的氨基酸序列。

HspA1A的核苷酸序列(SEQ ID NO：10)是：

atggccaaagccgcggcgatcggcatcgacctgggcaccacctactcctgcgtgggggtgttccaacacggcaaggtggagatcatcgccaacgaccagggcaaccgcaccacccccagctacgtggccttcacggacaccgagcggctcatcggggatgcggccaagaaccaggtggcgctgaacccgcagaacaccgtgtttgacgcgaagcggctgatcggccgcaagttcggcgacccggtggtgcagtcggacatgaagcactggcctttccaggtgatcaacgacggagacaagcccaaggtgcaggtgagctacaagggggacaccaaggcattctaccccgaggagatctcgtccatggtgctgaccaagatgaaggagatcgccgaggcgtacctgggctacccggtgaccaacgcggtgatcaccgtgccggcctacttcaacgactcgcagcgccaggccaccaaggatgcgggtgtgatcgcggggctcaacgtgctgcggatcatcaacgagcccacggccgccgccatcgcctacggcctggacagaacgggcaagggggagcgcaacgtgctcatctttgacctgggcgggggcaccttcgacgtgtccatcctgacgatcgacgacggcatcttcgaggtgaaggccacggccggggacacccacctgggtggggaggactttgacaacaggctggtgaaccacttcgtggaggagttcaagagaaaacacaagaaggacatcagccagaacaagcgagccgtgaggcggctgcgcaccgcctgcgagagggccaagaggaccctgtcgtccagcacccaggccagcctggagatcgactccctgtttgagggcatcgacttctacacgtccatcaccagggcgaggttcgaggagctgtgctccgacctgttccgaagcaccctggagcccgtggagaaggctctgcgcgacgccaagctggacaaggcccagattcacgacctggtcctggtcgggggctccacccgcatccccaaggtgcagaagctgctgcaggacttcttcaacgggcgcgacctgaacaagagcatcaaccccgacgaggctgtggcctacggggcggcggtgcaggcggccatcctgatgggggacaagtccgagaacgtgcaggacctgctgctgctggacgtggctcccctgtcgctggggctggagacggccggaggcgtgatgactgccctgatcaagcgcaactccaccatccccaccaagcagacgcagatcttcaccacctactccgacaaccaacccggggtgctgatccaggtgtacgagggcgagagggccatgacgaaagacaacaatctgttggggcgcttcgagctgagcggcatccctccggcccccaggggcgtgccccagatcgaggtgaccttcgacatcgatgccaacggcatcctgaacgtcacggccacggacaagagcaccggcaaggccaacaagatcaccatcaccaacgacaagggccgcctgagcaaggaggagatcgagcgcatggtgcaggaggcggagaagtacaaagcggaggacgaggtgcagcgcgagagggtgtcagccaagaacgccctggagtcctacgccttcaacatgaagagcgccgtggaggatgaggggctcaagggcaagatcagcgaggccgacaagaagaaggtgctggacaagtgtcaagaggtcatctcgtggctggacgccaacaccttggccgagaaggacgagtttgagcacaagaggaaggagctggagcaggtgtgtaaccccatcatcagcggactgtaccagggtgccggtggtcccgggcctgggggcttcggggctcagggtcccaagggagggtctgggtcaggccccaccattgaggaggtagattag

HspA1A的氨基酸序列(SEQ ID NO：11)是：

MAKAAAIGIDLGTTYSCVGVFQHGKVEIIANDQGNRTTPSYVAFTDTERLIGDAAKNQVALNPQNTVFDAKRLIGRKFGDPVVQSDMKHWPFQVINDGDKPKVQVSYKGDTKAFYPEEISSMVLTKMKEIAEAYLGYPVTNAVITVPAYFNDSQRQATKDAGVIAGLNVLRIINEPTAAAIAYGLDRTGKGERNVLIFDLGGGTFDVSILTIDDGIFEVKATAGDTHLGGEDFDNRLVNHFVEEFKRKHKKDISQNKRAVRRLRTACERAKRTLSSSTQASLEIDSLFEGIDFYTSITRARFEELCSDLFRSTLEPVEKALRDAKLDKAQIHDLVLVGGSTRIPKVQKLLQDFFNGRDLNKSINPDEAVAYGAAVQAAILMGDKSENVQDLLLLDVAPLSLGLETAGGVMTALIKRNSTIPTKQTQIFTTYSDNQPGVLIQVYEGERAMTKDNNLLGRFELSGIPPAPRGVPQIEVTFDIDANGILNVTATDKSTGKANKITITNDKGRLSKEEIERMVQEAEKYKAEDEVQRERVSAKNALESYAFNMKSAVEDEGLKGKISEADKKKVLDKCQEVISWLDANTLAEKDEFEHKRKELEQVCNPIISGLYQGAGGPGPGGFGAQGPKGGSGSGPTIEEVD

HspA1B的氨基酸序列(SEQ ID NO：12)是：

MAKAAAIGIDLGTTYSCVGVFQHGKVEIIANDQGNRTTPSYVAFTDTERLIGDAAKNQVALNPQNTVFDAKRLIGRKFGDPVVQSDMKHWPFQVINDGDKPKVQVSYKGETKAFYPEEISSMVLTKMKEIAEAYLGYPVTNAVITVPAYFNDSQRQATKDAGVIAGLNVLRIINEPTAAAIAYGLDRTGKGERNVLIFDLGGGTFDVSILTIDDGIFEVKATAGDTHLGGEDFDNRLVNHFVEEFKRKHKKDISQNKRAVRRLRTACERAKRTLSSSTQASLEIDSLFEGIDFYTSITRARFEELCSDLFRSTLEPVEKALRDAKLDKAQIHDLVLVGGSTRIPKVQKLLQDFFNGRDLNKSINPDEAVAYGAAVQAAILMGDKSENVQDLLLLDVAPLSLGLETAGGVMTALIKRNSTIPTKQTQIFTTYSDNQPGVLIQVYEGERAMTKDNNLLGRFELSGIPPAPRGVPQIEVTFDIDANGILNVTATDKSTGKASKITITNDKGRLSKEEIERMVQEAEKYKAEDEVQRERVSAKNALESYAFNMKSAVEDEGLKGKISEADKKKVLDKCQEVISWLDANTLAEKDEFEHKRKELEQVCNPIISGLYQGAGGPGPGGFGAQGPKGGSGSGPTIEEVD

HspA1L的氨基酸序列(SEQ ID NO：13)是：

MATAKGIAIGIDLGTTYSCVGVFQHGKVEIIANDQGNRTTPSYVAFTDTERLIGDAAKNQVAMNPQNTVFDAKRLIGRKFNDPVVQADMKLWPFQVINEGGKPKVLVSYKGENKAFYPEEISSMVLTKLKETAEAFLGHPVTNAVITVPAYFNDSQRQATKDAGVIAGLNVLRIINEPTAAAIAYGLDKGGQGERHVLIFDLGGGTFDVSILTIDDGIFEVKATAGDTHLGGEDFDNRLVSHFVEEFKRKHKKDISQNKRAVRRLRTACERAKRTLSSSTQANLEIDSLYEGIDFYTSITRARFEELCADLFRGTLEPVEKALRDAKMDKAKIHDIVLVGGSTR[PKVQRLLQDYFNGRDLNKSINPDEAVAYGAAVQAAILMGDKSEKVQDLLLLDVAPLSLGLETAGGVMTALIKRNSTIPTKQTQIFTTYSDNQPGVLIQVYEGERAMTKDNNLLGRFDLTGIPPAPRGVPQIEVTFDIDANGILNVTAMDKSTGKVNKITITNDKGRLSKEEIERMVLDAEKYKAEDEVQREKIAAKNALESYAFNMKSVVSDEGLKGKISESDKNKILDKCNELLSWLEVNQLAEKDEFDHKRKELEQMCNPIITKLYQGGCTGPACGTGYVPGRPATGPTIEEVD

HspA2A的氨基酸序列(SEQ ID NO：14)是：

MSARGPAIGIDLGTTYSCVGVFQHGKVEIIANDQGNRTTPSYVAFTDTERLIGDAAKNQVAMNPTNTIFDAKRLIGRKFEDATVQSDMKHWPFRVVSEGGKPKVQVEYKGETKTFFPEEISSMVLTKMKEIAEAYLGGKVHSAVITVPAYFNDSQRQATKDAGTITGLNVLRIINEPTAAAIAYGLDKKGCAGGEKNVLIFDLGGGTFDVSILTIEDGIFEVKSTAGDTHLGGEDFDNRMVSHLAEEFKRKHKKDIGPNKRAVRRLRTACERAKRTLSSSTQASIEIDSLYEGVDFYTSITRARFEELNADLFRGTLEPVEKALRDAKLDKGQIQEIVLVGGSTRIPKIQKLLQDFFNGKELNKSINPDEAVAYGAAVQAAILIGDKSENVQDLLLLDVTPLSLGIETAGGVMTPLIKRNTTIPTKQTQTFTTYSDNQSSVLVQVYEGERAMTKDNNLLGKFDLTGIPPAPRGVPQIEVTFDIDANGILNVTAADKSTGKENKITITNDKGRLSKDDIDRMVQEAERYKSEDEANRDRVAAKNALESYTYNIKQTVEDEKLRGKISEQDKNKILDKCQEVINWLDRNQMAEKDEYEHKQKELERVCNPIISKLYQGGPGGGSGGGGSGASGGPTIEEVD

HspA2B的氨基酸序列(SEQ ID NO：15)是：

HspA4的氨基酸序列(SEQ ID NO：16)是：

MSVVGIDLGFQSCYVAVARAGGIETIANEYSDRCTPACISFGPKNRSIGAAAKSQVISNAKNTVQGFKRFHGRAFSDPFVEAEKSNLAYDIVQLPTGLTGIKVTYMEEERNFTTEQVTAMLLSKLKETAESVLKKPVVDCVVSVPCFYTDAERRSVMDATQIAGLNCLRLMNETTAVALAYGIYKQDLPALEEKPRNVVFVDMGHSAYQVSVCAFNRGKLKVLATAFDTTLGGRKFDEVLVNHFCEEFGKKYKLDIKSKIRALLRLSQECEKLKKLMSANASDLPLSIECFMNDVDVSGTMNRGKFLEMCNDLLARVEPPLRSVLEQTKLKKEDIYAVEIVGGATRIPAVKEKISKFFGKELSTTLNADEAVTRGCALQCAILSPAFKVREFSITDVVPYPISLRWNSPAEEGSSDCEVFSKNHAAPFSKVLTFYRKEPFTLEAYYSSPQDLPYPDPAIAQFSVQKVTPQSDGSSSKVKVKVRVNVHGIFSVSSASLVEVHKSEENEEPMETDQNAKEEEKMQVDQEEPHVEEQQQQTPAENKAESEEMETSQAGSKDKKMDQPPQAKKAKVKTSTVDLPIENQLLWQIDREMLNLYIENEGKMIMQDKLEKERNDAKNAVREYVYEMRDKLSGEYEKFVSEDGRNSFTLKLEDTENWLYEDGEDQPKQVYVDKLAELKNLGQPIKIRFQESEERPKLFEELGKQIQQYMKIISSFKNKEDQYDHLDAADMTKVEKSTNEAMEWMNNKLNLQNKQSLTMDPVVKSKEIEAKIKELTSTCSPIISKPKPKVEPPKEEQKNAEQNGPVDGQGDNPGPQAAEQGTDTAVPSDSDKKLPEMDID

HspA5的氨基酸序列(SEQ ID NQ：17)是：

MKLSLVAAMLLLLSAARAEEEDKKEDVGTVVGIDLGTTYSCVGVFKNGRVEIIANDQGNRITPSYVAFTPEGERLIGDAAKNQLTSNPENTVFDAKRLIGRTWNDPSVQQDIKFLPFKVVEKKTKPYIQVDIGGGQTKTFAPEEISAMVLTKMKETAEAYLGKKVTHAVVTVPAYFNDAQRQATKDAGTIAGLNVMRIINEPTAAAIAYGLDKREGEKNILVFDLGGGTFDVSLLTIDNGVFEVVATNGDTHLGGEDFDQRVMEHFIKLYKKKTGKDVRKDNRAVQKLRREVEKAKRALSSQHQARIEIESFYEGEDFSETLTRAKFEELNMDLFRSTMKPVQKVLEDSDLKKSDIDEIVLVGGSTRIPKIQQLVKEFFNGKEPSRGINPDEAVAYGAAVQAGVLSGDQDTGDLVLLDVCPLTLGIETVGGVMTKLIPRNTVVPTKKSQIFSTASDNQPTVTIKVYEGERPLTKDNHLLGTFDLTGIPPAPRGVPQIEVTFEIDVNGILRVTAEDKGTGNKNKITITNDQNRLTPEEIERMVNDAEKFAEEDKKLKERIDTRNELESYAYSLKNQIGDKEKLGGKLSSEDKETMEKAVEEKIEWLESHQDADIEDFKAKKKELEEIVQPIISKLYGSAGPPPTGEEDTAEKDEL

HspA6的氨基酸序列(SEQ ID NO：18)是：

MQAPRELAVGIDLGTTYSCVGVFQQGRVEILANDQGNRTTPSYVAFTDTERLVGDAAKSQAALNPHNTVFDAKRLIGRKFADTTVQSDMKHWPFRVVSEGGKPKVRVCYRGEDKTFYPEEISSMVLSKMKETAEAYLGQPVKHAVITVPAYFNDSQRQATKDAGAIAGLNVLRIINEPTAAAIAYGLDRRGAGERNVLIFDLGGGTFDVSVLSIDAGVFEVKATAGDTHLGGEDFDNRLVNHFMEEFRRKHGKDLSGNKRALRRLRTACERAKRTLSSSTQATLEIDSLFEGVDFYTSITRARFEELCSDLFRSTLEPVEKALRDAKLDKAQIHDVVLVGGSTRIPKVQKLLQDFFNGKELNKSINPDEAVAYGAAVQAAVLMGDKCEKVQDLLLLDVAPLSLGLETAGGVMTTLIQRNATIPTKQTQTFTTYSDNQPGVFIQVYEGERAMTKDNNLLGRFELSGIPPAPRGVPQIEVTFDIDANGILSVTATDRSTGKANKITITNDKGRLSKEEVERMVHEAEQYKAEDEAQRDRVAAKNSLEAHVFHVKGSLQEESLRDKIPEEDRRKMQDKCREVLAWLEHNQLAEKEEYEHQKRELEQICRPIFSRLYGGPGVPGGSSCGTQARQGDPSTGPIIEEVD

HspA7的氨基酸序列(SEQ ID NO：19)是：

MQAPRELAVGIDLGTTYSCVGVFQQGRVEILANDQGNRTTPSYVAFTDTERLVGDAAKNQAALNPHNTVFDAKRLIGRKFADTTVQSDMKHWPFKVVSGGGKPKVRVCYRGEDKTFYPEEISSMVLTKMKETAEAYLGQPVKHAVITVPTYFSNSQRQATKDAGAIAGLKVLPIINEATAAAIAYGLDRRRAGKRNVLIFDLGGGTFDVSVLTIDAGVFEVKATAGDTHLGGEDFDNRLVNHFMEEF

Hsp8A的氨基酸序列(HSC70)(SEQ ID NO：20)是：

MSKGPAVGIDLGTTYSCVGVFQHGKVEIIANDQGNRTTPSYVAFTDTERLIGDAAKNQVAMNPTNTVFDAKRLIGRRFDDAVVQSDMKHWPFMVVNDAGRPKVQVEYKGETKSFYPEEVSSMVLTKMKEIAEAYLGKTVTNAVVTVPAYFNDSQRQATKDAGTIAGLNVLRIINEPTAAAIAYGLDKKVGAERNVLIFDLGGGTFDVSILTIEDGIFEVKSTAGDTHLGGEDFDNRMVNHFIAEFKRKHKKDISENKRAVRRLRTACERAKRTLSSSTQASIEIDSLYEGIDFYTSITRARFEELNADLFRGTLDPVEKALRDAKLDKSQIHDIVLVGGSTRIPKIQKLLQDFFNGKELNKSINPDEAVAYGAAVQAAILSGDKSENVQDLLLLDVTPLSLGIETAGGVMTVLIKRNTTIPTKQTQTFTTYSDNQPGVLIQVYEGERAMTKDNNLLGKFELTGIPPAPRGVPQIEVTFDIDANGILNVSAVDKSTGKENKITITNDKGRLSKEDIERMVQEAEKYKAEDEKQRDKVSSKNSLESYAFNMKATVEDEKLQGKINDEDKQKILDKCNEIINWLDKNQTAEKEEFEHQQKELEKVCNPIITKLYQSAGGMPGGMPGGFPGGGAPPSGGASSGPTIEEVD

Hsp9A的氨基酸序列(SEQ ID NO：21)是：

MISASRAAARLPLLLPRGGPVPAVPGLAQTFWNGLSQNVLRAASSRKYASEAIKGAVIGIDLGTTNSCVAVMEGKQAKVLENSEGARTTPSVVAFTADGERLVGMPAKRQAVTNPHNTFYATKRLIGRRFDDSEVKKDIKNVPFKIVRASNGDAWVEAHGKLYSPSQIGAFVLMKMKETAENYLGHPAKNAVITVPAYFNDSQRQATKDAGQISGLNVLRVINEPTAAALAYGLDKSEDKIIAVYDLGGGTFDISILEIQKGVFEVKSTNGDTFLGGEDFDQALLQYIVKEFKRETSVDLTKDNMALQRVREASEKAKCELSSSVQTDINLPYLTMDASGPKHLNMKLSRSQFEGIVADLIKRTVAPCQKAMQDAEVSKSDIGEVILVGGMTRMPKVQQTVQDLFGRAPSKAVNPDEAVAIGAAIQGGVLAGDVTDVLLLDVTPLSLGIETLGGVFTKLINRNTTIPTKKSQVFSTAADGQTQVEIKVCQGEREMASDNKLLGQFTLVGIPPAPRGVPQIEVTFDIDANGIVHVSAKDKGTGREQQIVIQSSGGLSKDEIENMVKNAEKYAEEDRRRKERVEAVNLAEGIIHDTESKMEEFKDQLPADECNKLKEEIAKMRELLARKDTETGENIRQAATSLQQASLKLFEMAYKKMASE6RESSGSSGDQKEEK

本发明的另一个实施方案是PTD与低分子量热休克蛋白或小应激蛋白cvHsp的缀合物。在双杂交实验和免疫共沉淀实验中，已经证实cvHsp结合心脏中的细胞骨架蛋白质α-细丝蛋白。以在心脏和骨骼肌中高表达为特征的α-细丝蛋白的组织分布与cvHsp的组织分布相关。在cvHsp中，一个含64个氨基酸的结构域(与α晶体蛋白结构域中的第56-119位氨基酸对应)对于该结构域与细丝蛋白的相互作用是重要的，表明cvHsp充当分子伴侣蛋白。此外，几种具有与cvHsp表达模式和推定功能相一致的病理生理学的遗传病定位于染色体1p36.23-p34.3(一个与心肌病相关的区域)(见Krief等，J.Biol.Chem.274：36592-36600(1999))。

cvHsp的氨基酸序列(SEQ ID NO：22)是：

MSHRTSSTFRAERSFHSSSSSSSSSTSSSASRALPAQDPPMEKALSMFSDDFGSFMRPHSEPLAFPARPGGAGNIKTLGDAYEFAVDVRDFSPEDIIVTTSNNHIEVRAEKLAADGTVMNTFAHKCQLPEDVDPTSVTSALREDGSLTIRARRHPHTEHVQQTFRTEIKI

本发明还提供PTD与Hsp多肽的片段、衍生物或类似物(如HspA1A、HspA1B、HspA1L、HspA2A、HspA2B、HspA4、HspA5、HspA6、HspA7、Hsp8A(Hsc70)、Hsp9A或cvHsp的片段、衍生物或类似物)的缀合物。

本发明的肽缀合物可以使用本领域普通技术人员已知的标准克隆技术和惯常方法，通过将PTD编码基因与Hsp基因融合并在体内或在体外表达该融合蛋白加以制备。

PTD-Hsp缀合物可以通过直接共价键、肽键或接头相互连接。具体而言，PTD-Hsp缀合物可以通过接头相互连接，其中所述的接头含有特异性地由某种酶切割的区域。接头可以根据治疗的目的和方向而变化，并且为了在局部部位使效果最大化，应当使用含有-O-或-S-S-键的容易在细胞中切割的接头。也可以使用不含切割位点的接头(非切割性接头)。接头的长度一般是1-10个氨基酸、优选1-5个氨基酸。接头可以含有氨基酸Gly-Gly-Gly。为避免全身性作用，通常优选导入含肽键的间隔物接头(spacer linker)。这种接头可以是氨基己酸。

还预期了PTD-Hsp mRNA用于全部上述指征中的用途。

定义

出于方便，在本说明书、实施例和所附权利要求书中使用的某些术语汇集与此。除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。

如本文中所用，术语“缺血”意指因供应身体某部分的血管收缩、阻塞或阻塞引起流入身体该部分的血液不足或短缺。缺血造成组织缺氧。低氧或缺血相关性损伤包括心脏损伤。

如本文中所用，术语“再灌注”意指使血液恢复流入已经中断血液供应应的先前缺血性组织或器官，如心脏病发作或中风之后那样。

如本文中所用，术语“坏死”意指细胞或组织因损伤或疾病死亡，尤其在身体局限区域(如心肌)内。

如本文中所用，术语“凋亡”意指程序性细胞死亡。

如本文中所用，术语“心脏损伤”意图包括涉及心脏和/或相关组织(例如心包膜、主动脉和其它相关血管)的任意慢性或急性病理学事件，这包括，但不限于缺血-再灌注损伤、充血性心脏衰竭、心搏骤停、心肌梗死、因化合物(如药物)所致的心脏中毒、因寄生虫感染、细菌、真菌、立克次氏体或病毒所致的心脏损害、爆发性心脏淀粉样变、心脏外科、心脏移植和创伤性心脏损伤(例如穿透性或钝性心脏损伤或者主动脉瓣破裂)。

如本文中所用，术语“神经变性疾病”意图包括涉及脑、脊柱、神经和/或相关组织的任何变性事件，包括但不限于缺血-再灌注损伤，因化合物(如药物)所致的神经中毒和因寄生虫感染所致的神经损害。

如本文中所用，术语“玻璃化”意指建立在溶液中和在悬浮于该溶液内或用该溶液灌注的细胞、组织或器官中建立玻璃态。“玻璃态”是由液体所形成的无定形固体，但无晶体形成。当在本文中使用本术语时，玻璃态更具体地指从无冰晶形成的液体中所形成的固体。通过降低溶液的温度至该溶液的玻璃化转变温度(Tg)以下来实现玻璃化，此时所述Tg低于该溶液的均质成核温度，从而对该溶液和悬浮于该溶液内或用该溶液灌注的细胞、组织或器官建立玻璃态。也就是说，如在本文中所用，当细胞、组织或器官进行玻璃化时，“玻璃化”在细胞、组织或器官内部(即在组织和器官中所包含的细胞内部)以及在周围材料中(在低温贮存液中)出现。玻璃状贮存优选地在低温贮存液的Tg以下的温度上进行。

如本文中所用，术语“低温贮存液”指其中细胞、组织或器官可以在生理学温度以下的温度贮存的溶液。用于本文中所述方法的低温贮存液具有低于均质成核温度的Tg，从而当降低温度低于所述Tg时，该溶液将形成玻璃，而不形成晶状固体。由于存在一种或多种在高于Tg的温度上抑制冰晶形成的物质，故在低温贮存液中发生玻璃化，而非晶体形成。具有这种特性的低温贮存液是本领域已知的。优选的低温贮存液在下文中描述。术语“低温贮存液”不包括单独的组织培养生长培养基。

如本文中所用，术语“抑制”意指相对于不受该抑制的活性而言，降低所述活性至少5％，并且优选更大，例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，至多到并包括100％。因此，一种物质抑制凋亡至少5％是相对于在缺少所述物质情况下接受相同凋亡性刺激的样品而言。

如本文中所用，术语“多肽”意图包括单个“多肽”以及多个“多肽”，并且包含由肽键连接在一起的两个或多个氨基酸的任意链。因此，如本文中所用，在“多肽”的定义中包括这样的术语，其包括但不限于“肽”、“”二肽、“三肽”、“蛋白质”、“氨基酸链”、“寡肽”、“低聚物”，或包括用来指含两个或多个氨基酸的链的任意其它术语，并且术语“多肽”可以替代任意这些术语或与任意这些术语相互替换地使用。该术语还包括已经受到翻译后修饰(如糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护基团/封闭基团衍生化、蛋白酶剪切或由非天然性氨基酸修饰)的多肽。术语“蛋白质”也意图包括蛋白质的片段、类似物和衍生物，其中所述片段、类似物或衍生物基本上保留与参考蛋白相同的生物学活性或功能。

所述蛋白质的“片段、衍生物或类似物”可以是(i)一种这样的片段、衍生物或类似物，其中以保守或非保守氨基酸残基(优选保守氨基酸残基)置换一个或多个氨基酸残基并且这种置换的氨基酸残基可以由或可以不由遗传密码子编码；或(ii)其中一个或多个氨基酸残基包括置换基团的一种片段、衍生物或类似物；或(iii)其中所述成熟多肽与另一种化合物(如增加所述多肽的半寿期的化合物(例如聚乙二醇))融合的一种片段、衍生物或类似物；或(iv)其中额外的氨基酸(如用于纯化所述多肽的前导序列或分泌序列)与所述成熟多肽融合的一种片段、衍生物或类似物。此类片段、衍生物和类似物被认为因本文中的教导而处于本领域技术人员的能力范围内。

特别优选是具有蛋白质的如此氨基酸序列的变体、类似物、衍生物和片段，在所述氨基酸序列中以任何组合方式置换、缺失或添加几个(例如5-10、1-5、1-3、2或1个)氨基酸残基。在这些突变中特别优选不改变本发明蛋白质特性和活性的沉默性置换、添加和缺失。在这方面也特别优选保守性置换。

除了一个或多个氨基酸用一个或多个其它氨基酸置换之外，本发明变体的实例是如上文定义的融合蛋白。技术人员明白多种氨基酸具有相似的特性。某物质的一个或多个此类氨基酸往往可以由一个或多个此类其它的氨基酸置换，而不消除该物质的所需活性。

因此，氨基酸即甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸往往可以相互置换(具有脂族侧链的氨基酸)。这些可能的置换中，优选的是使用甘氨酸和丙氨酸来相互置换(因为它们具有相对较短的侧链)并且使用缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸来相互置换(因为它们具有疏水的较大体积的脂族侧链)。往往可以相互置换的其它氨基酸包括：苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸(具有芳族侧链的氨基酸)；赖氨酸、精氨酸及组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸)；天冬氨酸及谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸)；天冬酰胺及谷氨酰胺(具有酰胺侧链的氨基酸)；和半胱氨酸及甲硫氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。这种性质的置换往往称作“保守性”或“半保守性”氨基酸置换。

如本文中所用的术语“融合蛋白”、“融合多肽”、“嵌合蛋白”和“嵌合多肽”是可相互交换的并且指包含目的多肽或目的蛋白和蛋白质转导结构域(PTD)的多肽和蛋白质。

如本文中所用的术语PTD-Hsp“缀合物”指PTD蛋白与Hsp蛋白的融合物以及PTD编码基因与Hsp基因构建体的融合物。

如本文中所用的术语“目的蛋白”、“所需多肽”、“所需蛋白质”或“靶蛋白”是可相互交换的并且指完整蛋白质分子或其部分。所述多肽或蛋白质的其它部分能够诱导细胞应答。

如本文中所用，术语“治疗物”指这样的分子，如蛋白质、脂类、糖、核酸或化学化合物，其中所述分子在被递送至受试者时治疗即治愈、改善或减轻受试者中给定疾病或病况(例如缺血或凋亡)的症状或抑制所述疾病或病况，或备选地通过减缓晚期疾病或病况的进程而延长此受试者的生命。

如本文中所用，术语“治疗性融合蛋白”指这样的多肽，其中所述多肽在被递送至受试者时治疗即治愈、改善或减轻受试者中给定疾病或病况(例如缺血或凋亡)的症状或抑制所述疾病或病况，或备选地通过减缓晚期疾病或病况的进程而延长此受试者的生命。

多肽

本发明的治疗性多肽是热休克蛋白(Hsp)。优选Hsp70家族的Hsp。Hsp70家族中的哺乳动物Hsp的实例包括，但不限于BIP(GRP78)、mHSP70(GRP75)、HspA1A、HspA1B、HspA1L、HspA2A、HspA2B、HspA4、HspA5、HspA6、HspA7、Hsp8A(Hsc70)和Hsp9A。也优选smHsp家族的Hsp。smHsp家族成员的实例包括，但不限于cvHsp、αB-晶体蛋白、αA-晶体蛋白、Hsp20、Hspβ-2、Hsp样27和Hsp27。

作为本发明的多肽还包括前述多肽的片段、衍生物、类似物或变体以及其任意组合，其中使用它们来预防或治疗即、治愈、改善、减轻凋亡状态和/或神经变性病况或疾病的严重性，或减弱凋亡状态和/或神经变性病况或疾病。

本发明的其它实施方案包括了包含如此氨基酸序列的多肽，其中所述的氨基酸序列与上述多肽的任意氨基酸序列至少90％相同，并且更优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。

作为实际例子，使用已知的计算机程序如Bestfit程序(Wisconsin序列分析软件包，用于Unix的第八版，Genetics Computer Group，UniversityResearch Park 575 Science Drive，Madison，Wis.53711)，可以常规地确定任何具体多肽是否与例如SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。Bestfit使用Smith和Waterman的局部同源性算法(Advances in Applied Mathematics 2：482-489(1981))来找到在两个序列之间的最佳同源性节段。当使用Bestfit或任何其它的序列比对程序来确定一个具体序列是否例如与本发明的参考序列相同95％时，当然设定参数，从而在参考氨基酸序列的全长范围内计算相同性百分数并且允许所述参考序列中有至多到5％总氨基酸数的同源性空位。

多核苷酸

此外，本发明涉及编码融合蛋白或嵌合蛋白的多核苷酸、含有该多核苷酸的重组表达载体、质粒及其它多核苷酸构建体(统称为“表达载体”)、用这些表达载体转化的微生物，以及用于获得这些多核苷酸及使用所述载体所转化的细胞的方法。合适的宿主细胞可以用所述表达载体转化。

如本文中所用，术语“表达载体”指由遗传物质(即核酸)构成的构建体。通常而言，表达载体含有在细菌宿主细胞(例如大肠杆菌)中有功能的复制起点和用于检测包含所述表达载体的细菌宿主细胞的选择标记。本发明的表达载体含有启动子序列并且包括如本文中所述的遗传元件，其中所述的遗传元件这样排列，从而可以使插入的编码序列在真核细胞中转录并翻译。在本文中所述的某些实施方案中，表达载体是闭合的环状DNA分子。

术语“表达”指生物地产生由编码序列所编码的产物。在大多数情况下，转录包括所述编码序列的DNA序列以形成信使RNA(mRNA)。随后翻译该RNA以形成具有相关生物学活性的多肽产物。另外，表达过程可以包括针对RNA转录产物的其它加工步骤，如旨在除去内含子的剪接和/或多肽产物的翻译后加工过程。

本发明的融合蛋白或嵌合蛋白可以通过重组DNA方法制备。根据本发明，分离、合成或通过其它方式获得编码所需蛋白质的基因序列并且将其有效地与编码PTD肽的DNA序列连接。这种杂合基因称作嵌合基因，其中所述的杂合基因含有与编码PTD肽的编码DNA序列有效连接的编码所需蛋白质的基因。可选地，编码所需蛋白质的基因序列可以通过接头序列与编码PTD肽的DNA序列有效连接。

术语“接头肽”意图定义氨基酸残基的任何序列，其中所表达的蛋白质中包含所述序列时，此序列优选地提供疏水区。这种疏水区可以帮助酶在蛋白酶水解位点处的切割。

将所述嵌合基因插入允许所需嵌合蛋白在合适转化宿主内表达的表达载体中。所述的表达载体为插入的嵌合基因提供必需的调节序列以控制在合适转化宿主中的表达。

核酸构建体可以为载体形式，例如表达载体，并且可以包括染色体载体、附加体载体和病毒衍生载体等等，例如，衍生自细菌质粒、噬菌体、转座子、酵母附加体、插入元件、酵母染色体元件、病毒(如杆状病毒、乳多空病毒(如SV40)、痘苗病毒、腺病毒、鸡痘病毒、伪狂犬病毒和逆转录病毒)的载体和衍生自它们组合的载体，如衍生自质粒和噬菌体遗传元件的那些载体，如粘粒和噬菌粒。通常，适于在宿主细胞中维持、增殖或表达核酸以表达多肽的任何载体可以就此方面用于表达。

控制本发明的融合蛋白表达的调节元件包括启动子区、5′非翻译区、信号序列、嵌合编码序列、3′非翻译区和转录终止位点。从宿主中待分泌至培养基内的融合蛋白也含有信号序列。

类似地，多种翻译控制元件是本领域技术人员已知的。这些翻译控制元件包括，但不限于核糖体结合位点和翻译起始密码子与终止密码子。

用于制备重组载体并使用所述重组载体转化宿主细胞、在宿主细胞中复制该载体并表达生物活性外来多肽和蛋白质的方法与材料在Old和Primrose的Principles of Gene Manipulation，第二版(1981)，和Sambrook等，Molecular Cloning，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory(2001)中描述，所述两份参考文献均通过引用的方式并入本文。

如本文中所用，术语“DNA多核苷酸”可以是环状或线性质粒，或其它线性DNA，后者也可以非感染性和非整合型的(即不整合至脊椎动物的基因组内)。线性化质粒是先前呈环状而现已线性化(例如通过用限制核酸内切酶消化)的质粒。线性DNA可以在某些情况下是有利的，如在例如Cherng，J.Y.等，J.Control.Release 60：343-353(1999)和Chen，Z.Y.等，Mol.Ther.3：403-410(2001)中所讨论，所述两份参考文献均通过引用的方式并入本文。

本发明的其它实施方案包括包含嵌合基因的载体，其中所述嵌合基因包含这样的核苷酸，其与包含上述嵌合基因的载体的任意核苷酸序列至少90％相同，并且更优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。

本发明的其它实施方案包括嵌合基因，其包含与上所述嵌合基因的任意核苷酸序列至少90％相同，并且更优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列。

作为实际例子，使用已知的计算机程序如Bestfit程序(Wisconsin序列分析软件包，用于Unix的第八版，Genetics Computer Group，UniversityResearch Park 575 Science Drive，Madison，Wis.53711)，可以常规地确定任何载体或嵌合基因是否与本发明的核苷酸序列至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。Bestfit使用Smith和Waterman的局部同源性算法(Advances in Applied Mathematics 2：482-489(1981))来找到在两个序列之间的最佳同源性节段。当使用Bestfit或任何其它的序列比对程序来确定一个具体序列是否例如与本发明的参考序列95％相同时，当然设定参数，从而在参考核苷酸序列的全长范围内计算相同性百分数并且允许所述参考序列中有至多到5％总核苷酸数的同源性空位。

密码子优化

“密码子优化”定义为通过如此方式修饰核酸序列以增强在目的受试者(如人)细胞中的表达，即把天然序列中至少一个、多于一个或巨大数目的密码子替换为在该受试者的基因中使用更频繁或最频繁的密码子。多个物种对特定氨基酸的某些密码子表现出特殊偏好。

在一个方面，本发明涉及多核苷酸表达构建体或载体和宿主细胞，其包含编码治疗性多肽及其片段、变体或衍生物的密码子优化编码区的核酸片段，并涉及使用所述多核苷酸表达构建体、载体、宿主细胞来治疗或预防受试者中的疾病的多种方法。

如本文中所用，术语“密码子优化编码区”意指这样的核酸编码区，其已经通过将至少一个或多于一个或巨大数目的密码子替换为在给定受试者的基因中使用更频繁或最频繁的一个或多个密码子而适于在该受试者的细胞中表达。

在包含密码子的核苷酸序列中的偏差为编码基因的序列中的变异创造条件，其中所述的密码子编码任意多肽链的氨基酸。因为每个密码子由三个核苷酸组成，并且组成DNA的核苷酸限于四种特定碱基，故存在64种可能的核苷酸组合，其中63个核苷酸组合编码氨基酸(剩余三个密码子编码结束翻译的信号)。众多氨基酸由多于一个的密码子指定。例如，丙氨酸和脯氨酸由4种三联体编码，丝氨酸和精氨酸由6种三联体编码，而色氨酸和甲硫氨酸仅由1种三联体编码。这种简并性为DNA碱基组成在广大范围内变化而不改变由该DNA编码的蛋白质的氨基酸序列创造条件。

共有序列

本发明还涉及含有嵌合基因的表达质粒，其中所述的嵌合基因表达具有特定共有序列的治疗性融合蛋白及其片段、衍生物和变体。“共有序列”例如是这样的理想化序列，其代表最经常出现在相互加以比较的两个或多个序列的每个位置内的氨基酸。共有序列是这样的理论性典型氨基酸序列，其中每个氨基酸是最经常出现在天然存在的不同序列中的该位点处的一种氨基酸。该术语还指接近于理论性共有序列的实际序列。共有序列可以衍生自具有例如共享功能性或结构性目的序列。通过比对尽可能多的已知特定结构性或功能性结构域的实例以使同源性最大化，可以定义共有序列。通常在下列情况中认为某序列是共有序列，此时每个具体氨基酸在其位置处适度地占据优势，并且形成所述比较基础的大部分序列通过相当少的置换(例如0-约100个置换)而与所述共有序列相关。通常而言，野生型比较序列与共有序列至少约50％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。因此，本发明的多肽与共有序列约50％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。

“共有氨基酸”是所选出以占据共有蛋白质中给定位置的氨基酸。为选择共有氨基酸而组织起来的系统可以是计算机程序，或是一个或多个计算机程序与“手工”分析及计算的组合。当共有氨基酸对比对的氨基酸序列的每个位置获得时，则将这些共有氨基酸“排队”以获得共有蛋白质的氨基酸序列。

治疗用途

凋亡性和坏死性细胞死亡和其它程序性细胞死亡途径常参与缺血性脑损伤、心脏病和神经变性疾病。上述的治疗性融合蛋白可以用在药物制造中，其中所述的药物有效抑制凋亡及因凋亡所致疾病的发展。

本发明的治疗性融合蛋白也可以与一种或多种化合物或构建体共同施用。其它化合物包括，但不限于抗血小板药、抗凝血药或抗血栓药、胱天蛋白酶抑制剂，以及其它多肽(包括Hsp家族成员(例如辅助分子伴侣Hsp40))。

本发明的治疗性融合蛋白可以靶向以下细胞或细胞类型：干细胞(例如造血干细胞、间充质干细胞、间质干细胞或神经干细胞)、心血管细胞、如心肌细胞、心室肌细胞、动脉肌细胞、心脏干细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞、起搏细胞、肌成纤维细胞或成纤维细胞、神经细胞如神经元(也叫做神经细胞(nerve cell)或神经元(neurocyte))、肿瘤细胞、巨噬细胞、上皮细胞、角质形成细胞、粒细胞、红细胞、淋巴细胞或血小板。所述细胞可以是分化细胞或前体细胞。

本文中披露了适用于间充质干细胞(MSC)以诱导心脏特异性基因表达的一系列具体疗法。所述情况在大鼠、犬和人MSC上有效。MSC疗法包括(1)将MSC与胚性、新生性和成年大鼠心脏细胞共培养；(2)适用化学融合剂(fusigen)(例如聚乙二醇或仙台病毒)以产生MSC与胚性、新生性及成年心肌细胞的异核体；(3)将MSC孵育与哺乳动物心脏提取物(包含胞外基质和心脏组织中存在的相关分子)孵育；(4)用生长因子和分化剂处理MSC；(5)对MSC进行机械刺激和/或电刺激；和(6)使MSC以机械方式或电学方式与心肌细胞偶联。发育成心肌细胞的MSC首先表达在胚性心脏组织中存在的蛋白质并且随后进展至成人形式。使用例如针对肌球蛋白重链单克隆抗体MF2的抗体、肌浆网钙ATP酶(SERCA1)(mnAb 10D1)实现心肌细胞特异性蛋白表达的检测或使用针对连接蛋白43的抗体实现检测缝隙连接的检测。

心脏损伤促进组织应答，后者增强了使用所植入MSC的肌形成。因此，将MSC导入梗死区以减少疤痕形成程度并增进心室功能。新的肌肉因而在梗死的心肌节段内形成。MSC直接浸润至梗死组织区。表征了这些细胞的整合及随后分化，并且设计介入的时限以模拟临床环境，其中急性心肌梗死患者将首先进行医学观察、接受一线疗法，尔后是稳定化，并且随后根据需要以心肌替换疗法介入。

就心脏的四个腔室而言，左心室主要负责将血液在压力下泵送至身体循环系统内。左心室具有最厚的壁并且是因充血性心脏衰竭所致心肌损伤的最频发部位。充血性心脏衰竭的进展或严重程度包括其中一旦可获得合适供者器官就需要心脏移植的那些病例至很少或没有观察到永久损伤而治疗主要起预防作用的那些病例。

所致心肌梗死的严重性(即受累的左心室肌肉质量的百分数)可以是约5-约40％。这代表受影响的组织区域，无论作为一个连续性缺血损伤或较小的缺血损伤的总和，该区域具有受影响的水平面积约2cm²-约6cm²和1-2mm至1-1.5cm厚度。梗死的严重性明显受波及哪个(些)血管和在治疗介入开始前已经过去多少时间的影响。

本发明所用的间充质干细胞根据优选顺序是自体的、同种异体的或异源的，并且这种选择可能大多取决于需要治疗的急迫性。可以在心/肺机上维持表现严重生命威胁状况的患者，同时培养足够数目的自体MSC，或可以使用除自体MSC之外的MSC提供初步治疗。

方法和施用

本发明提供用于递送与一种或多种可药用载体或赋形剂掺合的治疗性融合蛋白或其片段、变体或衍生物的方法。所述治疗性融合蛋白作为重组蛋白(尤其融合蛋白)或纯化的亚单位提供，这包括向受试者施用一种或多种本文中所述的组合物；从而在施用组合物(如本文中所述的那些组合物)时，在受试者中产生治疗应答。所述递送可以例如通过皮肤、鼻、眼，进入肌肉、脑或心脏内，或通过静脉内注射进行。

术语“受试者”意图包括活生物，如人、猴、奶牛、山羊、绵羊、马、猪、牛、犬、小鼠、大鼠、来自其中的培养细胞或其转基因物种。在优选的实施方案，所述受试者是人。

术语“脊椎动物”意图包括单个“脊椎动物”以及多个“脊椎动物”并且包括哺乳动物和鸟，以及鱼、爬行动物和两栖动物。

术语“哺乳动物”意图包括单个“哺乳动物”以及多个“哺乳动物”，并且包括，但不限于人；灵长类如猿、猴(例如枭猴、松鼠猴、卷尾猴、猕猴、非洲绿猴、赤猴、食蟹猴和长尾猴)、猩猩、狒狒、长臂猿和黑猩猩；犬科动物如犬和狼；猫科动物如猫、狮和虎；马科动物如马、驴和斑马；家畜如奶牛、猪和绵羊；有蹄类如鹿和长颈鹿；熊类如熊；和其它动物如兔、小鼠、雪貂、海豹、鲸。尤其，所述哺乳动物可以是人受试者、家畜或伴侣动物。

术语“鸟”包括单只“鸟”以及多只“鸟”，并且包括，但不限于野生水鸟，如野鸭、野鹅、燕鸥、海鸥和欧类；以及家禽物种如火鸡、肉鸡、鹌鹑、雉、家鹅和家鸭。术语“鸟”还包括燕雀类鸟，如椋鸟和虎皮鹦鹉。

本发明还提供用于产生、增强或调节治疗应答的方法，所述方法包括向人施用一种或多种本文中所述的组合物。在该方法中，所述组合物可以包括一种或多种多肽或其片段、变体或衍生物，其中将所述蛋白质作为重组蛋白(尤其融合蛋白)或纯化的亚单位提供提供。

如本文中所用，“治疗应答”指在组合物(如本文中所披露的组合物)递送至受试者时，该受试者产生针对该组合物的阳性反应的能力。

如上文提及，本发明的组合物可以用来治疗性地治疗和预防疾病或疾病状况。如本文中定义，“治疗”指使用本发明的一种或多种组合物来预防、治愈、延缓或降低受试者中疾病或疾病状况的严重性，和/或导致该疾病不恶化。

预期作为本发明部分的由凋亡所致或引起凋亡的疾病或疾病状况包括，但不限于、缺血/缺氧、如心脏缺氧、心脏缺氧-再氧合、心脏缺血-再灌注损伤、缺血性心脏病、心脏衰竭、心脏肥大、心脏外科、创伤性心脏损伤、冠状动脉血管成形术、脉管缺损或阻塞(血流的阻塞)、先天性心脏病、充血性心脏衰竭、心肌细胞再生、化疗诱导性心肌病、心肌梗死、心搏骤停、心脏中毒、因寄生虫感染所致的心脏损害、爆发性心脏淀粉样变、心脏移植，或创伤性心脏损伤或脑损伤、因缺血性脑梗死所致的中风、缺血或出血性中风、缺血性急性肾功能衰竭、肠缺血、因心肌梗死所致的缺血性心脏病(心肌缺血和再灌注后病症、肝缺血、脑缺血(例如因卒中所致的脑缺血等)、冻伤和视网膜缺血、颅内出血(蛛网膜下腔出血、溶栓剂诱导性出血等)、血块、缺氧诱导性凋亡和缺血-再灌注后的组织损害。

额外的心脏变性疾病包括，但不限于、病毒性心肌炎、自身免疫性心肌炎(充血性心肌病和慢性心肌炎)、因心脏肥大和心脏衰竭所致的心肌病或心肌死亡心肌病或心肌死亡、致心律失常性右室心肌病、心脏衰竭和冠状动脉旁路移植术。

神经视网膜和视神经的缺血可以在视网膜分支静脉阻塞、视网膜分支动脉阻塞、视网膜中央动脉阻塞、视网膜中央静脉阻塞期间、在玻璃体内手术期间、在视网膜变性如色素性视网膜炎和年龄相关性黄斑变性中出现。

预期作为本发明部分的由凋亡所致或引起凋亡的神经变性疾病或疾病状况包括，但不限于重症肌无力、阿尔茨海默病、帕金森综合征(包括帕金森病)、亨廷顿病、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化或运动神经元病(ALS)、脊髓延髓萎缩、失神经萎缩、脊髓性肌萎缩(SMA)、视网膜色素变性与青光眼、小脑变性和新生儿黄疸、耳硬化、中风、痴呆、连续迟发性神经元死亡(DND)。运动神经元病(ALS)、弥散性大脑皮质萎缩、路易体痴呆、皮克病、中脑肢体皮层痴呆、丘脑变性、延髓性麻痹、皮质-纹状体-脊髓变性、皮质-基底神经节变性、皮层小脑变性、具有痉挛性下肢轻瘫的家族性痴呆、葡聚糖体病(polyglucosan body disease)、Shy-Drager综合征、橄榄体脑桥小脑萎缩、进行性核上性麻痹、变形性肌张力障碍、哈勒沃登-施帕茨病、Meige综合征、家族性震颤、抽动秽语综合征、棘状红细胞增多伴舞蹈症(acanthocytic chorea)、Friedreich共济失调、Holme家族性皮质小脑萎缩(Holmes familial cortical cerebellar atrophy)、吉斯特曼-施特劳斯病(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease)、进行性脊髓性肌萎缩、进行性延髓麻痹、原发性侧索硬化、遗传性肌萎缩、痉挛性截瘫、腓骨肌萎缩、间质肥大性多神经病、多神经炎型遗传性共济失调、视神经病、糖尿病性视网膜病和眼肌麻痹。技术人员理解这些和其它轻度、中度和重度的神经变性病况可以根据本发明的方法进行治疗。

由凋亡所致或引起凋亡的其它变性疾病包括，但不限于、变性萎缩、酒精性肝炎、病毒性肝炎、肾病(例如肾小球肾炎)、溶血性尿毒综合征等、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、炎性皮肤病如中毒性表皮坏死松解症(TEN)和渗出性多形性红斑、移植物抗宿主病(GVH)、辐射病、归因于抗癌药、抗病毒药等的副作用、归因于毒物(如叠氮钠、氰化钾等)的病症、骨髓发育不良如再生障碍性贫血等、朊病毒病如克雅氏病、脊髓损伤、创伤性脑损伤、与自身免疫性疾病和抑制排斥相关的细胞毒T细胞或天然杀伤细胞介导的凋亡、线粒体药物中毒(例如因化疗或HIV疗法所致)、病毒性、细菌性或原虫性感染、炎症或炎性疾病、炎性肠病、败血症和感染性休克、从卵泡期至卵母细胞期、从卵母细胞至成熟卵期以及精子(例如卵巢组织冷冻和移植的方法、人工授精)、皮肤损害(因暴露于高水平辐射、热、烧伤、化学品、阳光和自身免疫性疾病)、骨髓增生异常综合征(MDS)(骨髓细胞死亡)、胰腺炎、骨性关节炎、类风湿性关节炎、银屑病、肾小球肾炎、动脉粥样硬化和移植物抗宿主病、视网膜周细胞凋亡、视网膜神经元凋亡青光眼、因缺血所致的视网膜损害、糖尿病性视网膜病、呼吸综合征、糖尿病(例如胰岛素依赖性糖尿病)、自身免疫性疾病、获得性多聚谷胺酰胺病、动脉中层钙化(Monckeberg’s)、与获得性免疫缺陷疾病(AIDS)相关的脑病、肌病和肌肉萎缩症、肾小球硬化症、门克伯格动脉硬化、炎性肠病、局限性肠炎(Crohn’s disease)、自身免疫性肝炎、血色素沉着病和威尔逊病、酒精性肝炎、不同病因学的急性肝衰竭、胆管疾病、动脉粥样硬化、高血压、凋亡诱导的脱发和与化疗药物使用有关的凋亡。

术语“预防”指使用本发明的一种或多种组合物旨在受试者中产生治疗应答。不需要本发明的任意组合物完全治愈或消除全部疾病症状。

在某些实施方案中，本发明的一种或多种组合物通过本文中所述的方法递送至受试者，因而实现存效的治疗应答。更具体地，本发明的组合物可以施用至受试者的任何组织，所述组织包括，但不限于皮肤、肌肉、脑组织、肺组织、肝组织、脾组织、骨髓组织、胸腺组织、心脏组织例如(心肌、心内膜和心包膜)、淋巴组织、血液组织、骨组织、胰组织、肾组织、胆囊组织、胃组织、肠组织、睾丸组织、卵巢组织、子宫组织、阴道组织、直肠组织、神经系统组织、眼组织、腺组织、舌组织、结缔组织(例如软骨)。优选的组织是心脏组织和脑组织。

可以通过包括下文所述的几种施用途径提供本发明的间充质干细胞(MSC)疗法。首先，可以使用不需要开放手术操作的心内肌肉注射法，其中MSC位于可注射的液体混悬制品中或它们位于生物兼容性介质中，其中所述的生物兼容性介质可以以液体形式注射并且在受损心肌部位变成半固体。可以使用常规心内注射器或可调关节镜递送装置，只有针腔或针孔的直径足够大(例如30号或更大)，从而剪切力将不破坏MSC即可。可注射的液体混悬液MSC制品也可以静脉内施用，通过连续滴注或作为大丸剂施用。在涉及直接物理接近心脏的开放手术操作期间，全部所述MSC递送制品形式均是可用选项。

含有10-40×10⁶个MSC/ml的可注射混悬液的约20-约50μl体积作为剂量范围的代表性实例。无论载体介质是液体或固体，每单位体积的细胞浓度保持在基本上相同的范围内。当开放操作期间实施固态“贴剂”型应用时，所递送的MSC的量通常将更大，但是通过注射的后续疗法将如同上文所述那样进行。然而，治疗的频率和持续期将根据组织累及的程度(百分数)(例如5-40％左心室质量)变动。

在具有5-10％组织累及的情况下，有可能用小到单次施用在20-50μl注射制品中一百万个MSC进行治疗。注射介质可以任意的可药用等张液体。实例包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)、培养基如DMEM(优选地无血清)、生理盐水或5％葡萄糖水溶液。

在具有更大约20％组织累及严重性水平的情况下，预期多次注射20-50μl(10-40×10⁶个MSC/ml)。后续疗法可以包括额外的给药剂量。

在极严重的情况下，例如在约40％组织累及严重性水平时，完全有指征采用多个等效剂量延续更为延长的时间段，并给予疾病治疗后的长期(至多到几个月)维持剂量。

此外，本发明的组合物可以施用至受试者的任意内腔，所述内腔包括但不限于肺、口、鼻腔、胃、腹膜腔、肠、任意心房、静脉、动脉、毛细管、淋巴管腔、子宫腔、阴道腔、直肠腔、关节腔、脑内室、脊髓中的脊椎管、眼部腔室、唾液腺或肝脏的导管腔。当本发明的组合物施用至唾液腺或肝脏的导管管腔时，所需的多肽在唾液腺和肝脏中表达，从而该多肽分别从唾液腺和肝脏被递送至受试者的血流中。美国专利号5,837,693和6,004,944中披露针对胃肠道系统分泌器官的利用唾液腺、肝脏和胰脏将所需多肽释放至血流的某些施用模式在，所述两份专利通过完整引用的方式并入本文中。

根据所披露的方法，本发明的组合物可以通过静脉内、肌内(i.m.)、皮下(s.c.)或肺内注射途径施用。其它合适的施用途径包括，但不限于气管内滴注、经皮的、眼内的、鼻内、吸入、腔内、导管内(例如至胰脏)和实质内(即至任意组织中)施用。对于静脉内施用，可以使用适宜的可药用载，如磷酸盐缓冲盐水、盐水或用于静脉内施用药物的其它材料。经皮递送包括，但不限于皮内(例如，至真皮或或表皮)、经皮(例如透皮)和经粘膜施用(即，至或通过皮肤或粘膜组织)。腔内施用包括，但不限于施用至口腔、阴道腔、直肠腔、鼻腔、腹膜腔或肠腔以及鞘内(即，至脊椎管)、室内(即，至脑室或心室)、心房内(即，至心房)以及蛛网膜下(即，至脑的蛛网膜下腔)施用。

可以使用任何施用模式，只要该模式导致所需肽或蛋白质在所需的组织中以足以在个人中产生针对疾病状况的治疗应答的量递送或表达，其中所述的人需要这这种应答。

本发明的施用手段包括针头注射(例如作为无菌水质分散体，优选地是等张的)、经皮导管输注、生物射弹注射器、粒子加速器(例如“基因枪”或气动“无针”注射器)、Med-E-Jet(Vahlsing，H.等，J.Immunol.methods 171：11-22(1994))、Pigjet(Schrijver，R.等，Vaccine 15：1908-1916(1997))、Biojector(Davis，H.等，Vaccine 12：1503-1509(1994)；Gramzinski，R.等，Mol.Med.4：109-118(1998))、AdvantaJet(Linmayer，I.等，Diabetes Care 9：294-297(1986))、Medi-jector(Martins，J.和Roedl，E.J.，Occup.Med.21：821-824(1979))、明胶泡沫海绵积存材料(gelfoam sponge depot)、其它市售积存材料(例如水凝胶)、渗透泵(例如Alza微泵)、口服或栓剂用固体药物制剂，如片剂、丸剂、软胶囊剂或硬胶囊剂、液体剂、混悬剂、糖浆剂、颗粒剂和酏剂、局部用皮肤乳膏剂或凝胶剂，和滗析法(decanting)、手术期间使用多核苷酸涂渍缝线(Qin，Y.等，Life Sciences 65：2193-2203(1999))或局部应用。

某些施用模式是基于针头的肌内注射和借助导管输注的肺部应用。能量辅助的质粒递送(EAPD)方法也可以用来施用本发明的组合物。这样的一种方法包括施加短暂电脉冲至已注射的组织，该方法通常称作电穿孔法。通常参见Mir，L.M.等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 96：4262-7(1999)；Hartikka，J.等，Mol.Ther.4：407-15(2001)；Mathiesen，I.，Gene Ther.6：508-14(1999)；Rizzuto G.等，Hum.Gen.Ther.11：1891-900(2000)。在本段落中提及的每篇参考文献通过完整引用的方式并入本文中。

确定本发明的一种或多种组合物的有效量依赖于众多因素，所述因素包括例如融合蛋白、所表达或直接使用的所述融合蛋白的变体或衍生物、受试者的年龄、重量和性别，需要治疗的确切病况及其严重性、施用途径、该融合蛋白的体内半衰期、摄取效率、待治疗的区域。基于临床判断，考虑患者反应，治疗可以根据需要进行重复。

“药物有效量”或“治疗有效量”是足以产生针对疾病状况的治疗性或临床应答。术语“药物有效量”或“治疗有效量”是可相互交换的。基于上述因素，确定精确量、给药次数和给药时间属于本领域普通技术人员的能力范围并且将轻易地由主治医生或兽医决定。

对于施用至哺乳动物并且尤其是人，期望所述活性物质的每日量是始于0.01mg/kg体重，一般在1mg/kg左右。上述剂量是平均情况的示例。当然存在其中应当使用更高或更低剂量(包括皮摩尔和纳摩尔浓度)的例子，并且这类情况属于本发明的范围。

本发明还涉及包含如本文中所披露的融合蛋白和额外药物活性物质的组合物。该融合蛋白和相关药物活性物质可以与一种或多种可药用的载体或赋形剂组合。此类载体可以包括，但不限于稀释剂(例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素和/或甘氨酸)、润滑剂(例如二氧化硅、滑石、硬脂酸和聚乙二醇)、结合剂(例如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮)和崩解剂(如淀粉、琼脂、藻酸或其钠盐)和/或吸附剂、着色剂、香料和甜味剂、盐水、缓冲盐水、脂质体、水、甘油、乙醇以及其组合。

本发明的组合物可以增溶于任意的多种缓冲剂内。合适的缓冲剂包括例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)、生理盐水、Tris缓冲液和磷酸钠(例如150mM磷酸钠)。不溶性多核苷酸可以在弱酸或弱碱中增溶，并且随后用缓冲剂稀释至所需提及。所述缓冲剂的pH可以按照需要调节。此外，可药用的添加剂添加剂可以用来提供合适宜的渗透压。此类添加剂属于本领域技术人员的能力范围。对于体内使用的水质组合物，可以使用无热原的无菌水。此类制剂将含有有效量的多核苷酸连同合适量的水溶液以便制备适合施用至人的可药用组合物。

本发明的组合物可以根据已知的方法配制。合适的制备方法例如在Remington’s Pharmaceutical Sciences，第十六版，A.Osol编辑，MackPublishing Co.，Easton，PA(1980)，和Remington’s Pharmaceutical Sciences，第十九版，A.R.Gennaro编辑，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1995)中描述，所述两份参考文献通过完整引用的方式并入本文中。虽然所述组合物可以作为水溶液施用，它也可以配制为乳剂、凝胶剂、溶液剂、混悬剂、冻干形式或本领域已知的任意其它形式。

包括以下实施例，其目的仅在于说明并且部意图限制本发明的范围，其中本发明范围由所附带的权利要求书定义。在所述实施例中提及的全部参考文献通过完整引用的方式并入本文中。

实施例

实施例1：制备含有PTD-HspA1A的表达载体

为连接编码HSPA1A的碱基序列与编码从人转录因子Hph-1(GenBank登录号U63386)氨基端第858位氨基酸(酪氨酸)至第868位氨基酸(精氨酸)的肽区域的碱基序列，合成具有以下碱基序列的引物：与用于向pET28B(+)载体进行克隆的限制酶EcoRI相对应的碱基序列，其中所述的pET28B(+)载体具有Hph-1氨基端第858位氨基酸(酪氨酸)至第868位氨基酸(精氨酸)的碱基序列；和与限制酶HindIII相对应的碱基序列，其中所述的限制酶HindIII用于与HSPA1A的碱基序列5’-末端和3’-末端对应的序列克隆。使用上述引物、作为模板的含有HSPA1A蛋白的完整基因的pRS载体(从Invitrogen可商业地获得)以及pfu turbo DNA聚合酶(Stratagene，目录号600252-51)开展PCR。

PCR反应产物用限制酶EcoRI和HindIII切割，并且用Quiaquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN，目录号28104)纯化。将纯化的产物克隆至pET28B(+)(可从Invitrogen商业地获得，目录号V360-20B)的BglII位点内。制备的重组载体命名为“pHph-2-Hsp70”。

实施例2：大肠杆菌转化体的制备及融合蛋白的表达与纯化

大肠杆菌BL21-DE3(ATCC No.53863)通过热休克转化法用实施例1中制备的表达载体pHph-2-HSP70转化，并且将转化的大肠杆菌株接种至4ml LB培养基中并且在37℃预培养14小时，伴以搅拌。随后，将预培养物培养基接种至250ml LB培养基(10g/l酪蛋白胰酶消化物，5g/l酵母提取物，10g/l氯化钠)并且在37℃培养3小时。随后将1mM IPTG(异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷；GibcoBRL目录号15529-019)添加至该培养基中，并且将混合物在37℃培养4小时以诱导融合蛋白的表达。将培养基在4℃和6,000转/分钟上离心20分钟，并除去上清液，留下沉淀物。将该沉淀物溶解在10ml缓冲液1(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，10mM咪唑，pH8.0)中并且用超声处理仪器(Heat systems，超声处理仪器XL)在冰上以300W强度进行超声处理6秒并随后冷却。重复超声处理步骤和冷却步骤，从而超声处理总时间达8分钟。裂解物在4℃和12,000转/分钟上离心10分钟，并且除去破裂的大肠杆菌细胞并仅收集纯的裂解物。向收集的裂解物添加0.5ml的50％Ni²⁺-NTA琼脂糖浆液(Qiagen，目录号30230)，并该混悬液在4℃以200转/分钟上搅拌1小时，从而所述融合蛋白与Ni²⁺-NTA琼脂糖相互结合。混合物通过0.8×4cm层析柱(BioRad，目录号731-1550)。所得材料用4ml缓冲液2(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，20mM咪唑，pH7.9)洗涤两次并且用1ml缓冲液3(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，300mM咪唑，pH8.0)处理，因此获得融合蛋白级分。该级分用PD-10脱盐柱(Amersham-Pharmacia Biotech目录号17-0851-01)脱盐。分离且纯化的PTD-HSPA1A融合蛋白进行SDS-PAGE，并随后通过考马斯兰染色法分析。

实施例3：PTD-HspA1A的凋亡抑制效果

纯化了HSPA1A蛋白和PTD-缀合的HSPA1A蛋白(图1A)，将1μl每种蛋白质添加至含Jurkat T细胞的培养基并且培养1小时。因此，可以观察到仅PTD-缀合的蛋白质被导入所述细胞(图1B)。另外，用0.5μM星形孢菌素(STS)处理细胞以诱导凋亡，添加各种浓度的PTD-HspA1A，并且分析该细胞的凋亡程度。结果显示PTD-Hsp70以浓度依赖性方式表现凋亡抑制效果(图1C)。在图1C中，con代表仅Jurkat T细胞，并且STS代表星形孢菌素。

实施例4：在低氧条件下PTD-HspA1A的凋亡抑制效果

将PTD-HspA1A在低氧条件下导入间充质干细胞(MSC)并检验它的凋亡抑制效果。图2A显示将各种浓度的纯化PTD-HspA1A导入MSC。可观察到在低氧条件下MSC的凋亡在HspA1A存在时受到抑制(图2B、2C和2D)。具体而言，如增加的WST-1信号所示，低氧条件(缺氧)下MSC的凋亡在HspA1A存在时受到抑制。四唑盐(WST-1)由属于线粒体呼吸链的琥珀酸酯-四唑鎓还原酶系统切割成甲

。当细胞群增大时，存在于培养上清液内的还原酶的量增加引起WST-1至甲

染料的转化同步增加。还显示HspA1A的导入抑制Bax蛋白的表达，并且抑制JNK(c-Jun氨基端激酶，应激活化的蛋白质激酶)蛋白的磷酸化(即活化)，同时维持其表达水平，因而抑制凋亡(图2E)。

实施例5：PTD-HspA1A在视网膜变性模型中的凋亡抑制效果

Sprague-Dawley大鼠(每组n＝3)接受腹膜内注射60mg/kgMNU(N-甲基-N-亚硝基脲)，随后接受腹膜内注射1mg PTD-hspA1A。这种注射以24小时间隔(紧接在视网膜电图后，直至72小时)重复，持续6日。

在实验开始后24小时、48小时、72小时和6日，实施ERG(视网膜电图)。在第7日，诱导深度麻醉并打开大鼠胸腔并将大鼠通过用4％PFA(多聚甲醛)经颈动脉灌注而固定，并且随后分离出眼球并将其浸泡在4％PFA中。此后，切下眼前节并将后眼窝包埋在石蜡块内并切成6μm厚度，并将切片用H&E(苏木精和伊红)染色并观察视网膜层中的变化。

在具有由抗癌药MNU诱导的凋亡的视网膜变性模型，光受体细胞层的变性总是始于视网膜的中央部分出现。因此，可以发现与对照组不同，视网膜的中央部分显示光受体细胞层细胞减少并变成不规则形状(图3A)。

细胞层在视网膜中央部分比在所述中央部分的照片中更好地得到维持。然而，可以看到存在对细胞的少量损伤(图3B)。

可以看到视网膜的周围部分几乎完全维持其外观(图3C)。

PTD-HspA1A在结膜下局部地施用，并且在第7日局部施用后进行观察。所述的局部施用距第一次施用仅3日而进行。

视网膜的中央部分显示光受体细胞层损伤严重，但是在光受体细胞层的一部分处得到保护。这清楚地表明与对照组相比，PTD HspA1A有效果(图3D)。

参考视网膜中央部分的照片，可以看到当光受体细胞涉及该照片的周围部分时，所述光受体细胞得到更好保护，与视网膜中央部分的照片中相比可以更清晰地观察到正常的光受体细胞(图3E)。

在视网膜的周围部分，光受体细胞层如此程度地得到保护，其几乎等同于全身性施用的状况。此外，可以看到周围部分在形态学上实质正常(图3F)。

所述结果表明PTD-HspA1A在视网膜变性模型中抑制凋亡。

实施例6：含PTD-HspA1A的器官保存溶液中的器官保护效果

将分离的肠上皮细胞分成两个组，仅其中一组给予在43℃的热休克以诱导HSPA1A蛋白表达。将所述细胞在37℃孵育2小时，恢复并随后在4℃贮存于Wisconsin University溶液中24小时。随后，将细胞在37℃孵育2小时。将细胞用10％福尔马林固定，用苏木精与伊红染色并观察。观察到HSPA1A蛋白在其中表达的组的细胞(图4，左边照片)维持正常，而在其中不表达HSPA1A蛋白的组的细胞显示细胞核和细胞质浓集(图4，右边照片)。所述结果显示HspA1A在器官保存溶液中显示器官保护效果。

实施例7：在梗死的心肌中PTD-HspA1A对MSC移植的凋亡抑制影响

已知针对心肌损伤的间充质干细胞(MSC)疗法具有内在局限，其原因在于细胞移植后间充质细胞的低劣生存力。据报道移植细胞在未受损的小鼠心脏中的存活在移植4日后小于1％(Toma，C.等，Circulation 105：93-98(2002))。因此，需要改善所移植干细胞在梗死的心脏中的存活。

MSC的产生。从4周龄Sprague-Dawley雄性大鼠(约100g)的股骨和胫骨，用10ml MSC培养基通过抽吸而收获骨髓衍生的间充质干细胞(MCS)，其中所述的MSC培养基由补加有10％胎牛血清和1％抗生素-青霉素与链霉素溶液的低葡萄糖Dulbecco改良Eagle培养基组成。以Percoll分离法分离骨髓并回收单核细胞。将回收的细胞洗涤两次并重悬于10％FBS-DMEM中，并且以1×10⁶个细胞/100cm²铺种在培养瓶内。培养物在37℃于含有5％CO₂的增湿大气中维持。在48或72小时后，弃去非贴壁细胞并将贴壁细胞用PBS洗涤两次。将培养物每隔3或4日用新鲜的完全培养基补充，持续约10日。为进一步纯化，使MSC经过Isolex磁力细胞选择系统(NexellTherapeutics Inc.CA，USA)。简而言之，将细胞混悬液与抗CD34单克隆抗体孵育，洗涤数次以除去未结合的抗体，并且与山羊抗小鼠IgG包被的M-450混合，其中所述的山羊抗小鼠IgG识别小鼠衍生的抗CD34抗体。向腔室施加磁场，从而磁力地使CD34+细胞-珠复合体与细胞混悬液的剩余部分分开。随后进一步增殖剩下的CD34阴性部分。细胞以0.25％胰蛋白酶和1mM EDTA在37℃持续5分钟收获，并再铺种在100cm²平板上。再铺种后第10日，细胞通过非放射性比色测定法WST-1(Boehringer Mannheim)定量以估计增殖率。如制造商推荐，所述定量基于四唑盐的切割，并且显示该方法产生纯度95％的3×106个细胞。

手术操作。在雄性Sprague-Dawley大鼠(200±30g)中通过手术阻塞冠状动脉左前降支(n＝8每组)产生心肌梗死。该手术过程在共聚焦显微镜下进行。简而言之，将大鼠用氯胺酮(10mg/kg)和甲苯噻嗪(5mg/kg)镇静并麻醉用于该操作，并且切除大鼠的第三肋和第四肋以使其心脏经肋间空间暴露出来。随后将左冠状动脉距其起点2-3mm用5-0聚丙烯缝线(ETHICON，UK)结扎。在阻塞60分钟后，移去止血钳并松开绳套(snare)用于再灌注，同时任由结扎线在心脏表面上松弛。伤口以荷包缝合术闭合。在整个手术期间，使用Harvard呼吸机，用95％O₂和5％CO₂对动物通气。类似地处理模拟操作的动物，除了不对冠状动脉缝线打结之外。在48小时中的手术死亡率是10％。

MSC移植。在诱导梗死后第48日，从梗死中存活的动物接受MSC移植。在移植当日，活的MSC用DAPI标记。将无菌的DAPI溶液以50μg/ml终浓度添加至培养基。允许这种染料在培养碟中停留30分钟，并且将细胞用PBS淋洗6次以除去过量未结合的DAPI。随后用0.25％(w/v)胰蛋白酶使标记的细胞脱离并将所述细胞悬浮在用于移植的无血清培养基中。对于细胞移植，将MSC(2.0×10⁵个细胞)悬浮在10μl无血清培养基中并使用带30号针头的Hamilton注射器注射至梗死区。

检测植入的MSC。植入MSC四日后，将动物安乐死并通过用10％中性缓冲的甲醛经颈动脉灌注进行固定。随后将心脏分离并在10％中性缓冲的甲醛中浸泡24小时。随后将每个心脏包埋在石蜡块中并以6μm厚度切片。切片随后接受H&E和/或多种免疫组织化学染色法处理。如在图5中可以见到，H&E和DAPI双重染色法显示与未处理的心脏相比，Hph-1-HspA1A-处理的心脏更多地聚居有活的干细胞，这表明在植入4日后，活的成熟心肌细胞已经浸润至疤痕区。H&E染色的切片显示了植入细胞与宿主心肌细胞的边缘区。

为证实植入的细胞分化成心肌细胞样细胞，我们通过免疫组织化学证实心脏特异性标记CTn T、MHC和Cav2.1是在DAPI着色区域中可检测到的。也证实在宿主心肌细胞区域中DAPI染色的HspA1A-MSC表达连接蛋白-43和N-钙粘着蛋白(图6)。

在表1中给出通过经胸超声心动图所测量的心脏尺度和性能参数，在基线(即梗死后和细胞移植前)处，超声心动图参数在组间无显著差异。左室舒张末期内径(LVEDD)，左室收缩末期内径(LVESD)，左室舒张末期容量(LVEDV)和左室收缩末期容量(LVESV)在HSPA1A-MSC组中相对于对照组显著下降。与对照组相比，％缩短分数(FS)和％射血分数(EF)在HSPA1A-MSC组中得到显著改善。与MSC相比，HSPA1A-MSC的移植导致收缩性能进一步增加(％FS方面37.7％增量和％EF方面8.7％增量)。与任何其它组相比，在梗死区上的周向应变峰值和径向应变峰值在HspA1A-MSC组中增加。与任何其它组相比，周向和径向总体应变也在HspA1A-MSC组中显著增加。这些数据表明PTD-HspA1A的转导对凋亡的抑制性机制具有显著影响。

表1.在未处理对照大鼠、MSC处理的大鼠和HSPA1A-MSC处理的大鼠上的超声心动图数据。

变量	对照(n＝8)	MSC(n＝8)	HspA1A-MSC(n＝8)
变量	对照(n＝8)	MSC(n＝8)	HspA1A-MSC(n＝8)	LVEDD，mm	7.21±0.50	6.72±0.52	5.62±0.40
LVESD，mm	6.11±0.38	5.35±0.50	3.71±0.36	LVEDD，mm	7.21±0.50	6.72±0.52	5.62±0.40
LVESD，mm	6.11±0.38	5.35±0.50	3.71±0.36	FS，％	14.63±2.22	20.33±1.95	27.99±3.04
LVEDV，ml	0.84±0.07	0.69±0.19	0.53±0.08	FS，％	14.63±2.22	20.33±1.95	27.99±3.04
LVEDV，ml	0.84±0.07	0.69±0.19	0.53±0.08	LVESV，ml	0.54±0.08	0.37±0.12	0.21±0.07
LVEF，％	35.5±4.8	47.0±3.7	60.5±4.1	LVESV，ml	0.54±0.08	0.37±0.12	0.21±0.07
LVEF，％	35.5±4.8	47.0±3.7	60.5±4.1	Peak S cir，％(梗死区)	-1.90±0.40	-4.31±1.72	-6.60±1.25
Peak S rad，％(梗死区)	3.91±1.07	16.33±1.40	20.04±1.84	Peak S cir，％(梗死区)	-1.90±0.40	-4.31±1.72	-6.60±1.25
Peak S rad，％(梗死区)	3.91±1.07	16.33±1.40	20.04±1.84	Global S cir，％	-4.23±1.63	-7.64±1.27	-12.05±1.40
Global S rad，％	5.58±2.42	25.14±3.65	31.81±3.75	Global S cir，％	-4.23±1.63	-7.64±1.27	-12.05±1.40

给出的值为平均数±S.D。LVEDD＝左室舒张末期内径，LVESD＝左室收缩末期内径，FS＝缩短分数，LVEDV＝左室舒张末期容量，LVESV＝左室收缩末期容量，S cir＝周向应变和S rad＝径向应变。

实施例8：PTD-Hsc70的凋亡抑制效果

HSC70(也称作HSP8A)是高度保守的热休克蛋白70家族的组成成员，该家族通常占据约1％的细胞总蛋白，在转化细胞中水平可能更高(Bakkenist，C.J.等，Cancer Res.59：4219-4221(1999))。

PTD-缀合的Hsc70蛋白如图7A中所示加以纯化。通过用0.5μM星形孢菌素(STS)处理Jurkat T细胞而在Jurkat T细胞中诱导凋亡。随后，添加各种浓度的PTD-Hsc70，并分析细胞的凋亡程度。结果表明PTD-Hsc70以浓度依赖性方式显示凋亡抑制效果(图7B)。

实施例9：PTD-cvHsp的凋亡抑制效果

cvHsp是心血管热休克蛋白(Krief等，J.Bio.l Chem.274(51)：36592-36600(1999))。

如图8A中所示纯化PTD-缀合的cvHsp蛋白。在Jurkat T细胞中通过用0.5μM星形孢菌素(STS)处理Jurkat T细胞而诱导凋亡。随后，添加各种浓度的PTD-Hsc70，并分析细胞的凋亡程度。结果表明PTD-cvHsp以浓度依赖性方式显示凋亡抑制效果(图8B)。

应当理解详述部分而非简述部分和摘要部分意图用来解释权利要求书。简述部分和摘要部分可以阐述一个或多个但非全部如本发明人所预期的本发明示例性实施方案，并且因此不意图以任何方式限制本发明和所附权利要求书。

序列表

<110>为人技术株式会

<120>用于抑制凋亡的药物组合物及其递送方法

<130>2435.004PC01/EKs/GLL

<150>60/840,697

<151>2006-08-29

<160>22

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>11

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>1

<210>2

<211>9

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>2

<210>3

<211>11

<212>PRT

<213>HIV

<400>3

<210>4

<211>16

<212>PRT

<213>Drosophila sp.

<400>4

<210>5

<211>34

<212>PRT

<213>HSV

<400>5

<210>6

<211>7

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>6

<210>7

<211>26

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>7

<210>8

<211>21

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>8

<210>9

<211>21

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>9

<210>10

<211>1926

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>10

<210>11

<211>641

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>11

<210>12

<211>641

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<213>Homo sapiens

<400>12

<210>13

<211>641

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>13

<210>14

<211>639

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>14

<210>15

<211>639

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>15

<210>16

<211>840

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>16

<210>17

<211>654

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>17

<210>18

<211>643

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>18

<210>19

<211>247

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>19

<210>20

<211>646

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>20

<210>21

<211>674

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>21

<210>22

<211>170

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>22

Claims

1.一种融合蛋白，其包含蛋白质转导结构域(PTD)和热休克蛋白(Hsp)，其中所述的Hsp是Hsp70或cvHsp。

2.权利要求1的融合蛋白，其中所述的Hsp70选自由HSPA1A、HSPA1B、HSPA1L、HSPA2A、HSPA2B、HSPA4、HSPA5、HSPA6、HSPA7、HSP8A和HSP9A组成的组。

3.权利要求1的融合蛋白，其中所述的Hsp70是HSPA1A。

4.权利要求1的融合蛋白，其中所述的融合蛋白包含选自由以下序列组成的组中的Hsp70氨基酸序列：

(i)SEQ ID NO：11；

(ii)SEQ ID NO：12；

(iii)SEQ ID NO：13；

(iv)SEQ ID NO：14；

(v)SEQ ID NO：15；

(vi)SEQ ID NO：16；

(vii)SEQ ID NO：17；

(viii)SEQ ID NO：18；

(ix)SEQ ID NO：19；

(x)SEQ ID NO：20；和

(xi)SEQ ID NO：21。

5.权利要求1的融合蛋白，其中所述的融合蛋白包含cvHsp氨基酸序列SEQ ID NO：22。

6.权利要求1的融合蛋白，其中所述的融合蛋白包含HspA1A氨基酸序列SEQ ID NO：11。

7.权利要求1的融合蛋白，其中所述的PTD包含选自由以下序列组成的组中的氨基酸序列：

(i)SEQ ID NO：1；

(ii)SEQ ID NO：2；

(iii)SEQ ID NO：3；

(iv)SEQ ID NO：4；

(v)SEQ ID NO：5；

(vi)SEQ ID NO：6；

(vii)SEQ ID NO：7；

(viii)SEQ ID NO：8；和

(ix)SEQ ID NO：9。

8.权利要求1的融合蛋白，其中所述的PTD和所述的热休克蛋白通过直接共价键、肽键或接头相互连接。

9.权利要求8的融合蛋白，其中所述的接头是包含1-5个氨基酸的非切割性接头。

10.权利要求8的融合蛋白，其中所述的接头包含Gly-Gly-Gly。

11.权利要求8的融合蛋白，其中所述的接头是切割性接头。

12.一种药物组合物，其包含与一种或多种可药用赋形剂相掺合的权利要求1的融合蛋白。

13.权利要求12的药物组合物，还包含至少一种抗血小板药、抗凝血药、抗血栓药或Hsp辅助分子伴侣。

14.一种融合蛋白，其包含PTD和氨基酸序列，所述的氨基酸序列与选自由以下序列组成的组中的氨基酸序列至少95％相同：

(i)SEQ ID NO：11；

(ii)SEQ ID NO：12；

(iii)SEQ ID NO：13；

(iv)SEQ ID NO：14；

(v)SEQ ID NO：15；

(vi)SEQ ID NO：16；

(vii)SEQ ID NO：17；

(viii)SEQ ID NO：18；

(ix)SEQ ID NO：19；

(x)SEQ ID NO：20；

(xi)SEQ ID NO：21；和

(xii)SEQ ID NO：22。

15.一种用于延长细胞、组织或器官生存力的方法，包括将细胞群、组织或器官与PTD-Hsp接触，所述PTD-Hsp的量有效抑制所述细胞群、组织或器官的一个或多个细胞凋亡，因而与未处理的细胞群、组织或器官相比，延长所述细胞群、组织或器官的生存力。

16.权利要求15的方法，其中所述的细胞群、组织或器官与PTD-Hsp溶液离体地或体内接触。

17.权利要求15的方法，其中在所述细胞群中的细胞是分化细胞或前体细胞。

18.权利要求15的方法，其中在所述细胞群中的细胞是干细胞。

19.权利要求18的方法，其中所述的干细胞是造血干细胞、间充质干细胞、基质干细胞或神经干细胞。

20.权利要求19的方法，其中将所述的造血干细胞移植至有需要的个体，并且其中所述的造血干细胞能够分化成血细胞。

21.权利要求20的方法，其中所述的个体是白血病或血癌患者。

22.权利要求19的方法，其中将所述的间充质干细胞移植至有需要的个体，并且其中所述的间充质干细胞能够分化成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞或心肌细胞。

23.权利要求19的方法，其中将所述的间充质干细胞移植至心脏。

24.权利要求23的方法，其中所述的心脏是梗死的心脏。

25.权利要求23或24的方法，其中其中所述的间充质干细胞能够分化成心肌细胞。

26.权利要求19的方法，其中将所述的神经干细胞移植至有需要的患者，并且其中所述的神经干细胞能够分化成神经细胞或非神经细胞。

27.权利要求26的方法，其中所述的非神经细胞是星形胶质细胞或少突胶质细胞。

28.权利要求15的方法，其中在所述细胞群中的细胞选自由神经细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、肿瘤细胞、造血细胞、单核细胞、巨噬细胞、上皮细胞、角质形成细胞、神经细胞、内皮细胞、粒细胞、红细胞、淋巴细胞和血小板组成的组。

29.权利要求28的方法，其中所述的神经细胞是神经元。

30.权利要求15的方法，其中在所述细胞群中的细胞是受损细胞并且所述的接触导致所述受损细胞的再生。

31.权利要求15的方法，其中在所述细胞群中的细胞产生目的产物，因而增加所述目的产物体外方式的生物生产。

32.权利要求15的方法，其中所述的接触在输注期间出现。

33.权利要求15的方法，其中所述的接触在移植所述细胞群、组织或器官期间出现。

34.权利要求30的方法，其中因所述器官或组织的再灌注所致的所述受损细胞中的损伤减少。

35.权利要求15的方法，其中所述的接触通过在取出所述细胞群、组织或器官之前或同时，给所述细胞群、组织或器官的供者施用PTD-Hsp而进行。

36.权利要求35的方法，其中所述的器官是实质器官。

37.权利要求36的方法，其中所述的实质器官选自心脏、胰脏、肾脏、肺或肝脏。

38.权利要求37的方法，其中所述的器官是心脏。

39.权利要求15的方法，其中所述的PTD-Hsp处在溶液中。

40.权利要求39的方法，其中所述的溶液是低温贮存液。

41.权利要求40的方法，其中所述的溶液还包含一浓度的玻璃化组合物，其中所述的玻璃化在所述细胞群、组织或器官内和在所述溶液中发生。

42.一种治疗以凋亡水平升高为特征的病理状态的方法，包括对需要这种治疗的个体施用有效用于治疗该病况的量的PTD-Hsp。

43.权利要求42的方法，其中所述的病理状态是应激诱导的病理学。

44.权利要求43的方法，其中所述的应激诱导病理学是缺血事件的结果。

45.权利要求44的方法，其中所述的缺血事件选自由下列项组成的组：因缺血性脑梗死所致的中风、缺血性急性肾功能衰竭、肠缺血、归因于心肌梗死、心肌缺血和再灌注后病症的缺血性心脏病、肝缺血、脑缺血和视网膜缺血。

46.权利要求42的方法，其中所述的病理状态是慢性变性疾病。

47.权利要求46的方法，其中所述的慢性变性疾病是选自由下列疾病组成的组中的神经变性疾病：阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、脊髓延髓萎缩、失神经萎缩、脊髓性肌萎缩(SMA)、视网膜色素变性与青光眼、小脑变性与新生儿黄疸、耳硬化、中风、痴呆和连续迟发性神经元死亡(DND)。

48.权利要求46的方法，其中所述的慢性变性疾病是变性萎缩。