JP2010509181A - 融合ポリペプチドを細胞へ輸送する方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、融合ポリペプチドを細胞内へ輸送する方法に関する。融合ポリペプチドを、例えば皮膚、眼および気道を通して局所輸送して、アレルギー性の炎症、気道過敏性を防止し、またT細胞活性をブロックする方法を提供する。融合ポリペプチドを輸送して移植片拒絶を抑制する方法も提供する。

Description

発明の背景
技術分野
本発明は、生体分子導入複合体（BTC）、例えば融合ポリペプチドを細胞へ輸送する方法に関する。生体分子導入複合体（BTC）は、タンパク質導入ドメイン（PTD）およびポリペプチドなどの目的分子を含む。

一般に、生細胞は、タンパク質や核酸などの高分子に対して透過性がない。小さなサイズの分子だけが生細胞膜を通って非常に遅い速度にて透過できるという事実により、タンパク質や核酸などの高分子を用いた、疾患の治療、予防または診断のための薬物の研究が制限されている。従って、有害な副作用を伴わずに、生細胞のサイトゾルおよび核内へ生物学的に活性な高分子を導入する有効な方法が必要とされている。

タンパク質導入ドメイン（PTD）は、生物学的に活性な分子の輸送に用いられてきた（Viehl C.T., et al., Ann. Surg. Oncol. 12：517-525（2005）；Noguchi H., et al., Nat. Med. 10：305-309（2004）；およびFu A.L., et al., Neurosci. Lett. 368：258-62（2004））。しかしながら、受容体タンパク質の細胞質ドメインを輸送する方法としてPTDを用いる試みは成されていない。また、生体分子を有するPTDを鼻腔内輸送するという試みも成されていない。

CTLA-4（細胞毒性Tリンパ球抗原-4）は、T細胞上の活性化誘導性表面分子であり、T細胞活性化の負の調節に不可欠である。CTLA-4は、T細胞活性化の正の共刺激性分子であるCD28よりも10から20倍高い親和性にて、抗原掲示細胞（APC）上のB7-1またはB7-2と結合する（Ngoc L.P., et al., Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 5：161-166（2005）；Noel P.J., et al., Adv. Exp. Med. Biol. 406：209-217（1996）；およびPerkins D., et al., J. Immunol. 156：4154-4159（1996））。

免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ITIM）を含有するCTLA-4の細胞質ドメインは、様々な種の間で100％保存されていることが確認されており、このことはこのドメインが、CTLA-4の細胞内シグナル伝達分子の隔離によるT細胞活性化の負の調節に重要であることを示唆している（Ravetch, J.V. ＆ Lanier, L.L., Science 290：84-89（2000）；およびJay, C.U. ＆ Jie, J., Curr. Opin. Immunol. 9：338-343（1997））。従って、CTLA-4の細胞質ドメインは、喘息、自己免疫疾患および移植片拒絶のための免疫治療薬の開発における優れた分子標的である。これまで、受容体タンパク質、特にCTLA-4をPTDを用いて細胞へ輸送する試みは困難であった。発明者らは、まさにCTLA-4の細胞質ドメインをPTDと融合させることにより、この受容体タンパク質をPTDの積み荷として輸送する方法をここに示した。CTLA-4の細胞質ドメインは活性化T細胞に特異的であり、よってPTDの積み荷タンパク質として用いると、陽イオン性PTDのインビボにおける有用性を制限している組織特異性の欠如が克服される。

［発明の概要］
本発明の目的の１つは、自己免疫疾患または炎症性疾患に罹患した脊椎動物におけるT細胞活性化を抑制する方法であって、タンパク質導入ドメインおよび受容体タンパク質の細胞質ドメインを含む治療的有効量の融合ポリペプチドを脊椎動物に投与することを含む方法を提供することである。

本発明の別の目的は、生体分子導入複合体（BTC）を気管または肺細胞へ輸送する方法であって、その生体分子導入複合体を脊椎動物へ鼻腔内投与することを含む方法を提供することである。生体分子導入複合体は、タンパク質導入ドメイン（PTD）および目的分子を含む。

別の好ましい態様は、活性化T細胞に特異的なCTLA-4の細胞質ドメイン（配列番号11）をPTDの積み荷タンパク質として用いることである。PTD-ctCTLA 4融合タンパク質を用いると、インビボにおける有用性を制限している陽イオン性PTDの組織特異性の欠如が克服される。

本発明により、高度の細胞または組織特異性を有し、Hph-1のような特定タンパク質のタンパク質導入ドメインを含む、新規な治療タンパク質薬の開発が可能となる。また、本発明により、得られた融合ポリペプチドの局所投与経路を介した投与が可能となり、これによって行動障害、細胞障害性および免疫原性のような全身性の副作用を最小化または回避することができる。

［発明の詳細な説明］
本発明は、タンパク質導入ドメイン（PTD）およびポリペプチドなどの目的分子を含む生体分子導入複合体（BTC）を輸送する方法を提供する。PTDにより、全身性または局所性投与によりインビボおよびインビトロにおいて細胞への目的ポリペプチドの輸送または取り込みを効果的に行うことができる。投与経路には、筋肉内、腹腔内、静脈内、経口、経鼻、皮下、皮内、粘膜および吸入といった経路が含まれる。本発明により、得られる融合ポリペプチドの局所投与経路を介した投与が可能となり、これにより全身毒性を最小化することができる。

一態様は、ヒト転写因子Hph-1（YARVRRRGPRR）（配列番号1）からのPTDであるHph-1-PTDの使用に関する。他の態様は、以下からのPTDを含むがこれらに限定されない：マウス転写因子Mph-1（YARVRRRGPRR）（配列番号2）、Sim 2（AKAARQAAR）（配列番号3）、HIV-1ウイルスタンパク質Tat（YGRKKRRQRRR）（配列番号4）、ショウジョウバエのアンテナペディアタンパク質（Antp）（RQIKIWFQNRRMKWKK）（配列番号5）、HSV-1構造タンパク質Vp22（DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE）（配列番号6）、Gタンパク質シグナル伝達系調節因子R7（RRRRRRR）（配列番号7）、MTS（AAVALLPAVLLALLAPAAADQNQLMP）（配列番号8）、および短い両親媒性ペプチド担体Pep-1（KETWWETWWTEWSQPKKKRKV）（配列番号9）およびPep-2（KETWFETWFTEWSQPKKKRKV）（配列番号10）。

PTDに連結させる望ましいポリペプチドは、受容体タンパク質の細胞質ドメインであり得る。本発明は、受容体タンパク質の細胞質ドメインをPTDの積み荷タンパク質として用いることにより、インビボにおける有用性を制限している陽イオン性PTDの組織特異性の欠如を克服する。本発明の一局面により、ctCTLA-4（配列番号11）およびζ鎖（ゼータ鎖またはz鎖とも称する）（配列番号12）などの目的タンパク質に融合したPTDを含む新規な治療薬の開発が可能になる。ζ鎖は、３つの免疫受容活性化チロシンモチーフ（ITAM）を含有するT細胞受容体の細胞質ドメインである。ζ鎖は３対のチロシン残基のホモダイマーとして存在する。本発明を説明するにあたり、その３対をA1A2（配列番号13）、B1B2（配列番号14）およびC1C2（配列番号15）ドメインと称する。本発明の受容体タンパク質の細胞質ドメインは、完全なζ鎖であっても、１対のチロシン残基（つまりA1A2、B1B2またはC1C2）を含む個々のITAMであっても、それらドメインの２つのいずれかの組み合わせ、つまりA1A2-B1B2、A1A2-C1C2またはB1B2-C1C2であってもよい。

PTDに連結し得る別の目的タンパク質は、PD-1（プログラム細胞死-1受容体）の細胞質ドメイン（配列番号16）である。

いくつかの態様において、PTDに連結させる望ましいポリペプチドは、例えばeGFP（配列番号17）またはβ-Gal（配列番号18）などの受容体タンパク質である。

上述のタンパク質のアミノ酸配列は以下の通りである：
ctCTLA-4（KMLKKRSPLTTGVYVK MPPTEPECEKQFQPYFIPIN）（配列番号11）；
ζ鎖：
FLRVKFSRSAEPPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR（配列番号12）；
ITAM A（A1A2）：
NQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRR（配列番号13）；
ITAM B（B1B2）：
KNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRG（配列番号14）；
ITAM C（C1C2）：
KGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR（配列番号15）；
PD-1：
RAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL（配列番号16）；
eGFP：
MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKSGRTQISSSSFEFCSRRYRGPGIHRI（配列番号17）；および
β-Gal：
MELWKSCIFLFLNFCIQSEGIVRTSYGNWNIPKIGDRNIPSFLIDESKNQFLLDGLPFRYISGSIHYFRIPRDRWDERLGKVRALGFNAIQYYIPWNMHELEEGNHDFSGLLDFAEFSMMAFHKYGLWTILRVGPYICGELENGGLPWWLLNKNVTKQRSSDRVFTREVENWFEILLPRVKPLLRKNGGPVLMLQIENEYGSYDACDQQYLRFLRDLTRSLVGDDVLLFTTDGSAESLLKCGTVEGVFPTVDFGPTDDAKEIENNFKLQRKFAPNGPLVNSEYYPGWLVLWGQKKQNLPSPQTIINGSQTMYSLGASFNYYMIHGGTNFGFWNGAETEAPCITSYDYDAPISESGDVTTKYLEIRKWIKGLTDWPTPPLDVPGNSPKGRFGKIKMRLVHSVEKLKTLTSLGDPGDCVETDKPISFETLKHPLGLVAYQAKINSCGNLTIPSFGDFVHVYLNGKYIDTLTRRYYNLTRNSVIIEGCLENEENRLFMLVENQGRKTFETINDRKGILSDVFMNGQAIQFWTQCGIKLPLQEDFYFRKAMRNNYRKNVKSNQKQGVFIGILSVDAPTDTWLDTTGWGKGIAIVNGRNFGRYWPTKGPQMTLYIPAEFLKIGENSVMMVELEGAEEACTSTSSCIADFIDHPVFDFQ（配列番号18）。

受容体タンパク質の細胞質ドメインは、当業者に知られる日常的方法を用いてPTDに融合させることができる。生じる治療融合ポリペプチドは、ピコモーラー濃度にて、活性化誘導性表面タンパク質の誘導ならびにIL-2の生成を効果的に抑制することができる。

定義
本明細書にて用いる場合「細胞質ドメイン」または「細胞質部分」なる用語は、目的のポリペプチドまたはタンパク質の完全細胞質ドメインまたは細胞質ドメインの一部分と、互いに言い換えられる、または意味する。本発明は、単にPTDと融合する目的ポリペプチドまたはタンパク質の細胞質ドメインのみに限定されるのではなく；実際は、目的のポリペプチドまたはタンパク質の他のドメインまたは部分もPTDと融合し得る。

本明細書にて用いる場合「ポリペプチド」なる用語は、１つの「ポリペプチド」ならびに複数の「ポリペプチド」を包括することを意図し、ペプチド結合により共に連結された２以上のアミノ酸のいずれかの１つの鎖または複数の鎖を含む。このように、本明細書にて用いる場合、「ペプチド」、「ジペプチド」、「トリペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、「オリゴペプチド」、「オリゴマー」を含むがこれらに限定されない用語、または２以上のアミノ酸鎖の１つの鎖もしくは複数の鎖を意味するために用いる他のいずれかの用語は、「ポリペプチド」の定義に含まれ、「ポリペプチド」なる用語は、これらのいずれかの用語の代わりにまたは互換的に用いられ得る。この用語は、例えば以下のような翻訳後修飾を受けたポリペプチドをさらに含む：グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／封鎖基による誘導体化、タンパク質切断、または非天然アミノ酸による修飾。「タンパク質」なる用語はまた、タンパク質のフラグメント、類似体および誘導体を含むことを意図し、ここでそのフラグメント、類似体または誘導体は基本的に、元のタンパク質と同じ生体活性または機能を保持する。

タンパク質の「フラグメント、誘導体または類似体」は、（i）１以上のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）により置換されているもの（そのような置換アミノ酸残基は遺伝暗号にコードされていてもいなくてもよい）；または（ii）１以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの；または（iii）成熟ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えばポリエチレングリコール）のような別の化合物と融合しているもの；または（iv）ポリペプチドの精製に利用されるリーダー配列または分泌性配列のようなさらなるアミノ酸が、成熟ポリペプチドと融合しているもの、であり得る。そのようなフラグメント、誘導体および類似体は、本明細書の記載から当業者によって本発明の範囲内にあるとみなされるはずである。

特に好ましいものは、いくつかの、例えば5から10、1から5、1から3、2または1のアミノ酸残基の、置換、欠失、または付加をいずれかの組み合わせにて有するタンパク質のアミノ酸配列を有する、変異体、類似体、誘導体およびフラグメントである。これらのうち特に好ましいものは、本発明のタンパク質の特性および活性を変化させないサイレント置換、付加および欠失である。この観点において、保存的置換（conservative substitution）も特に好ましい。

本発明の変異体の例には、１以上のアミノ酸の１以上の他のアミノ酸による置換の他には、上記のような融合タンパク質がある。当業者は、様々なアミノ酸が同様の特性を有することを知っている。ある物質のそのような１以上のアミノ酸はしばしば、その物質の望ましい活性を失うことなく、他のそのような１以上のアミノ酸により置換され得る。

このように、アミノ酸のグリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンは、しばしば互いに置換され得る（脂肪族側鎖を有するアミノ酸）。これらの可能な置換のうち、グリシンおよびアラニンを互いに置換に用いる（比較的短い側鎖を有するため）、および、バリン、ロイシンおよびイソロイシンを互いに置換に用いる（より疎水性の大きな脂肪族側鎖を有するため）のが好ましい。互いに置換するのにしばしば用いることができる他のアミノ酸には以下などがある：フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）；リシン、アルギニンおよびヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）；アスパラギン酸およびグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）；アスパラギンおよびグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；ならびに、システインおよびメチオニン（硫黄含有側鎖をを有するアミノ酸）。この性質の置換はしばしば「保存的」または「半保存的」アミノ酸置換と称する。

「生体分子導入複合体」またはBTCなる用語は、PTDと目的分子の複合体を意味する。目的分子は、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物または化合物であり得る。目的分子がタンパク質である場合、BTCは融合タンパク質または融合ポリペプチドとも称する。

本明細書にて用いる場合「融合タンパク質」、「融合ポリペプチド」、「キメラタンパク質」および「キメラポリペプチド」なる用語は、目的のポリペプチドまたはタンパク質およびPTDを含むポリペプチドおよびタンパク質と、互いに言い換えられる、または意味する。

本明細書にて用いる場合「目的タンパク質」、「所望のポリペプチド」、「所望のタンパク質」または「標的タンパク質」なる用語は、完全タンパク質分子またはその一部、つまりタンパク質の細胞質ドメインもしくは他のドメインと、互いに言い換えられる、または意味する。ポリペプチドまたはタンパク質の細胞質ドメインまたは他の部分は、細胞応答を誘導することができる。

本明細書にて用いる場合「治療薬」なる用語は、脊椎動物へ輸送すると、その脊椎動物が罹患した疾患または状態（例えば移植片拒絶）の症状を治療する、すなわち治癒させる、寛解させる、または軽減させるか、あるいは、末期の疾患または状態の進行を遅らせることによりその脊椎動物の生存を延長する、タンパク質、脂質、炭水化物、核酸または化合物などの分子を意味する。

本明細書にて用いる場合「治療融合ポリペプチド」なる用語は、脊椎動物へ輸送すると、その脊椎動物が罹患した疾患または状態（例えば移植片拒絶）の症状を治療する、すなわち治癒させる、寛解させる、または軽減させるか、あるいは、末期の疾患または状態の進行を遅らせることによりその脊椎動物の生存を延長する、ポリペプチドを意味する。

ポリペプチド
本発明の治療ポリペプチドには、以下が含まれるがこれらに限定されない：サイトカイン、ケモカイン、リンホカイン、リガンド、受容体、ホルモン、アポトーシス誘導ポリペプチド、酵素、抗体および増殖因子。これらの例には以下が含まれるがこれらに限定されない：細胞毒性Tリンパ球接着タンパク質4の細胞質ドメイン（ctCTLA-4）、zA1A2の細胞質ドメイン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、コロニー刺激因子（CSF）、インターロイキン2（IL-2）、インターロイキン-3（IL-3）、インターロイキン4（IL-4）、インターロイキン5（IL-5）、インターロイキン6（IL-6）、インターロイキン7（IL-7）、インターロイキン8（IL-8）、インターロイキン10（IL-10）、インターロイキン12（IL-12）、インターロイキン15（IL-15）、インターロイキン18（IL-18）、インターフェロンアルファ（IFNα）、インターフェロンベータ（IFNβ）、インターフェロンガンマ（IFNγ）、インターフェロンオメガ（IFNω）、インターフェロンタウ（IFNτ）、インターフェロンガンマ誘導因子I（IGIF）、トランスフォーミング増殖因子ベータ（TGF-β）、RANTES（活性化により制御され、正常T細胞から発現されおそらく分泌される（regulated upon activation, normal T-cell expressed and presumably secreted））、マクロファージ炎症性タンパク質（例えば、MIP-1アルファおよびMIP-1ベータ）、リーシュマニア伸長開始因子（Leishmania elongation initiating factor）（LEIF）、血小板由来増殖因子（PDGF）、腫瘍壊死因子（TNF）、増殖因子、例えば、上皮増殖因子（EGF）、血管内皮増殖因子（VEGF）、線維芽細胞増殖因子（FGF）、神経成長因子（NGF）、脳由来神経栄養因子（BDNF）、ニューロトロフィン-2（NT-2）、ニューロトロフィン-3（NT-3）、ニューロトロフィン-4（NT-4）、ニューロトロフィン-5（NT-5）、グリア細胞由来神経栄養因子（GDNF）、毛様体神経栄養因子（CNTF）、エリスロポエチン（EPO）、およびインスリン。

本発明の治療融合ポリペプチドは、パーキンソン病、癌および心疾患のような疾患を処置するために用いられ得る。さらに、治療ポリペプチドは、以下のような自己免疫疾患の処置に用いられ得る：多発性硬化症；シェーグレン症候群；サルコイドーシス；インスリン依存性糖尿病；自己免疫性甲状腺炎；関節炎、例えば、変形性関節症、関節リウマチ、反応性関節炎および乾癬性関節炎；強直性脊椎炎；および強皮症など。また、本発明の治療ポリペプチドは、急性および慢性炎症性疾患（例えば喘息）を処置するため、創傷の治癒を促進するため、および、細胞、組織または器官（例えば膵島移植）の移植後の移植片拒絶を防止するために用いることができる。

本発明の治療融合ポリペプチド、例えば、神経栄養因子（NTF）は、脳、脊髄および末梢神経の細胞の生存、維持、分化、修復、再生および成長を促進するのに用いられ得る。適切なNTFには、NGF、BDNF、ニューロトロフィンまたはNT、例えばNT-2、NT-3、NT-4、NT-5、GDNF、CNTF、およびその他が含まれるが、これらに限定されない。精製組換えNTFの投与は、そのような急性および慢性神経系障害の処置のための臨床的計画を代表するものである。そのような障害には、機械的または化学的脳もしくは脊髄障害、パーキンソン病、アルツハイマー病および他の認知症、筋萎縮性側索硬化症および多発性硬化症が含まれるが、これらに限定されない。

本発明の治療融合ポリペプチド、例えば増殖因子は、創傷の治癒を促進するのに用いることができる。有用な増殖因子には、FGFおよびEGFがあるが、これらに限定されない。

本発明の治療融合ポリペプチドは、細胞自殺（「アポトーシス」と呼ばれる）を促進するのに用いられ得る。適切なアポトーシスポリペプチドには、BAXタンパク質などがある。あるいは、本発明の治療融合ポリペプチドは、アポトーシスを防ぐために用いられ得る。適切なアポトーシスアンタゴニストには、BAXアンタゴニストBcl-2などがある。アポトーシス抑制ポリペプチドにより処置され得る疾患には、筋ジストロフィー（MD）があり、その患者は不完全なジストロフィンと呼ばれるタンパク質を有する。ジストロフィンは、適切な筋機能に要求される。不完全でない、正常なジストロフィンは、プラスミドDNAを介してMDに罹患した患者に輸送すると、抗原として作用し得る。この場合、正常なジストロフィンをコードするDNAが導入された筋細胞は、免疫系に認識され、ジストロフィン特異的T細胞に基づく反応により殺されるであろう。そのようなT細胞に基づく殺しでは、アポトーシスの誘導によって細胞を殺すことが知られている。もし、正常な、潜在的に免疫原性のジストロフィンをBcl-2または他のアポトーシス防止タンパク質とともに筋細胞へ輸送できたとすると、CTLは筋細胞を殺すことができないであろうと予想される。この論理は、「正常」であるゆえに潜在的に免疫原性であるタンパク質のコピーを輸送することが治療に含まれる、多くの遺伝的疾患に当てはまる。

また、本発明のポリペプチドとしては前述のポリペプチドのフラグメント、誘導体、類似体または変異体、およびそれらのいずれかの組み合わせも含まれる。本発明のポリペプチド、それらのフラグメント、誘導体、類似体または変異体は、疾患を予防するまたは治療する、すなわち治癒させる、寛解させる、疾患の重症度を軽減する、または疾患を防止するまたは減少させるために用いられる抗原性および免疫原性ポリペプチドであり得る。

本発明のさらなる態様は、上述のポリペプチドのいずれかのアミノ酸配列と、少なくとも95％同一、より好ましくは少なくとも96％、97％、98％または99％同一の、アミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。

実際問題として、いずれかの特定のポリペプチドが、例えば配列番号11-18に示すアミノ酸配列と、少なくとも95％、96％、97％、98％または99％同一であるかどうかは、Bestfitプログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package、Unix（登録商標）用バージョン8、Genetics Computer Group, University Research Park 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711）のような既知のコンピュータプログラムを用いて従来法にて決定できる。Bestfitは、Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2：482-489（1981）の局所ホモロジーアルゴリズムを用いて、２配列間の最適なホモロジーセグメントを見付ける。Bestfitまたは他のいずれかの配列アライメントプログラムを用いて、特定の配列が本発明による参照配列と、例えば95％同一かどうかを判定する場合、当然のことながら、同一性の割合が参照アミノ酸配列の完全長にわたって計算されるように、また、参照配列のアミノ酸の合計数の5％までホモロジーのギャップが許されるように、パラメーターを設定する。

ポリヌクレオチド
さらに、本発明は、融合タンパク質またはキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチド、組換え発現ベクター、プラスミドおよびプラスミドを含有する他のポリヌクレオチドコンストラクト（総称して「発現ベクター」と称する）、これらの発現ベクターにより形質転換した微生物、およびこれらのポリヌクレオチドを得るための方法、および前記ベクターを用いた形質転換細胞に関する。適切な宿主細胞は発現ベクターにより形質転換することができる。

本明細書にて用いる場合「発現ベクター」なる用語は、遺伝物質（すなわち核酸）で構成されるコンストラクトを意味する。一般に、発現ベクターは、例えば大腸菌（Escherichia coli）などの細菌宿主細胞において機能性の複製起源、およびその発現ベクターを含む細菌宿主細胞を検出するための選択マーカーを含有する。本発明の発現ベクターは、プロモーター配列を含有し、また挿入されたコード配列が真核細胞において転写および翻訳できるように配置された本明細書に記載の遺伝要素を含む。本明細書に記載の特定の態様において、発現ベクターは閉環状のDNA分子である。

「発現」なる用語は、コード配列によりコードされる産物の生物学的産生を意味する。ほとんどの場合、コード配列を含むDNA配列は、転写されてメッセンジャーRNA（mRNA）を形成する。次いでメッセンジャーRNAは翻訳されて、関連する生物学的活性を有するポリペプチド産物を形成する。また、発現過程は、イントロンを除去するためのスプライシングのような転写RNA産物のプロセシング工程、および／またはポリペプチド産物の翻訳後プロセシングをさらに含み得る。

本発明の融合タンパク質またはキメラタンパク質は、組換えDNA法により調製できる。本発明によると、所望のタンパク質をコードする遺伝子配列は、単離され、合成され、あるいは他の方法にて得られ、そしてPTDペプチドをコードするDNA配列に作動可能に連結している。PTDペプチドをコードするDNA配列に作動可能に連結した所望のタンパク質の遺伝子を含有するハイブリッド遺伝子を、キメラ遺伝子と称する。必要に応じて、所望のタンパク質をコードする遺伝子配列は、PTDペプチドをコードするDNA配列と、リンカーペプチドを介して作動可能に連結していてもよい。

「リンカーペプチド」なる用語は、発現タンパク質に含まれると好ましくは親水性領域を提供するいずれかのアミノ酸残基配列を規定することを意図する。そのような親水性領域により、タンパク質分解切断部位における酵素による切断が促進され得る。

キメラ遺伝子は、適切な形質転換宿主において所望のキメラタンパク質の発現を可能にする発現ベクターに挿入する。挿入したキメラ遺伝子は、発現ベクターから、適切な形質転換宿主において発現を制御する必須制御配列を得る。

核酸コンストラクトは例えば発現ベクターなどのベクターの形態であってもよく、とりわけ、染色体、エピソームおよびウイルスに由来するベクター、例えば、細菌プラスミドに、バクテリオファージに、トランスポゾンに、酵母エピソームに、挿入要素に、酵母染色体要素に、例えばバキュロウイルス、パポーバウイルス、例えばSV40、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスなどのウイルスに由来するベクター、およびそれらの組み合わせに由来するベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝要素に由来する、例えば、コスミドおよびファージミドに由来するベクターなどであり得る。一般に、宿主において核酸を維持する、伝播する、または発現してポリペプチドを発現させるのに適するあらゆるベクターが、この観点において発現に用いることができる。

本発明の融合タンパク質の発現を制御する調節エレメントは、プロモーター領域、5'非翻訳領域、シグナル配列、キメラコード配列、3'非翻訳領域および転写終結部位を含む。宿主から培地へ分泌されるべき融合タンパク質も、シグナル配列を含む。

同様に、様々な翻訳制御要素が当業者に知られている。これらには、リボソーム結合部位、および翻訳開始および終止コドンあるが、これらに限定されない。

組換えベクターを調製する、そのベクターを用いて宿主細胞を形質転換する、宿主細胞においてそのベクターを複製する、および生物学的に活性な外来ポリペプチドおよびタンパク質を発現するための方法および材料は、OldおよびPrimroseの「Principles of Gene Manipulation（遺伝子操作の原理）」第2版（1981）、およびSambrookらの「Molecular Cloning（分子クローニング）」第3版、Cold Spring Harbor Laboratory（2001）、に記載されており、その両方は参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書にて用いる場合「DNAポリヌクレオチド」なる用語は、環状または直線化プラスミドまたは他の直鎖状DNAであり得、それらはまた、非感染性であり組み込みを行わない（すなわち脊椎動物細胞のゲノムに組み込まない）ものであり得る。直線化プラスミドは、もとは環状であったが、例えば制限エンドヌクレアーゼによる消化によって直線化されたプラスミドである。直鎖状DNAは、例えば、Cherng, J.Y., et al., J. Control. Release 60：343-53（1999）、およびChen, Z.Y., et al., Mol. Ther. 3：403-10（2001）（両方は参照により本明細書に組み込まれる）にて論じられているような特定の状況において有利であり得る。

本発明のさらなる態様は、キメラ遺伝子を含むベクターであって、上述のキメラ遺伝子を含むいずれかのベクターのヌクレオチド配列に対して、少なくとも95％同一の、より好ましくは少なくとも96％、97％、98％または99％同一のヌクレオチド配列を含むベクターを含む。

本発明の他の態様は、上述のいずれかのキメラ遺伝子のヌクレオチド配列に対して、少なくとも95％同一の、より好ましくは少なくとも96％、97％、98％または99％同一のヌクレオチド配列を含む、キメラ遺伝子を含む。

実際問題として、いずれかの特定のベクターまたはキメラ遺伝子が、本発明によるヌクレオチド配列に対して少なくとも95％、96％、97％、98％または99％同一であるかどうかは、Bestfitプログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package、Unix（登録商標）用バージョン8、Genetics Computer Group, University Research Park 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711）のような既知のコンピュータプログラムを用いて従来法により判定することができる。BestfitはSmith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2：482-489（1981）の局所ホモロジーアルゴリズムを用いて、２配列間の最適なホモロジーセグメントを見付ける。Bestfitまたはいずれかの他の配列アライメントプログラムを用いて、特定の配列が本発明による参照配列に対して例えば95％同一であるかどうかを判定する場合、当然ながら、同一性の割合が参照ヌクレオチド配列の完全長にわたって計算されるように、また、参照配列のヌクレオチドの合計数の5％までホモロジーのギャップが許されるように、パラメーターを設定する。

コドンの最適化
「コドンの最適化」は、少なくとも１つの、１つより多くの、または相当数の天然配列のコドンを、その脊椎動物の遺伝子において、より頻繁にまたは最も頻繁に用いられているコドンと置換することによって、目的の脊椎動物、例えばヒトの細胞における発現が促進されるように核酸配列を修飾すること、と規定する。多様な種が特定アミノ酸の特定コドンに特定のバイアスを示している。

一局面において、本発明は、治療ポリペプチド、およびそれらのフラグメント、変異体または誘導体をコードする、最適化コドンコード領域の核酸フラグメントを含む、ポリヌクレオチド発現コンストラクトまたはベクターおよび宿主細胞、ならびにそのポリヌクレオチド発現コンストラクト、ベクター、宿主細胞を用いて脊椎動物における疾患を治療または予防するための様々な方法に関する。

本明細書において用いる場合「最適化コドンコード領域」なる用語は、少なくとも１つの、１つより多くの、または相当数のコドンを、所定の脊椎動物の遺伝子において、より頻繁に用いられている１以上のコドンと置換することによって、その脊椎動物の細胞における発現に適合させた核酸コード領域を意味する。

いずれかのポリペプチド鎖のアミノ酸をコードするコドンを含むヌクレオチド配列における逸脱によって、遺伝子をコードする配列において変異が生じる。各コドンは３ヌクレオチドからなり、DNAを構成するヌクレオチドは４つの特定塩基に限定されているので、64の可能なヌクレオチドの組み合わせがあり、そのうち61がアミノ酸をコードする（残りの3コドンは翻訳終止シグナルをコードする）。多くのアミノ酸は1より多いコドンによって設定されている。例えば、アミノ酸のアラニンおよびプロリンは、４つのトリプレット、セリンおよびアルギニンは6つのトリプレットによりコードされており、一方、トリプトファンおよびメチオニンは、ただ１つのトリプレットによりコードされている。この縮重により、DNA塩基組成物は、そのDNAによりコードされるタンパク質のアミノ酸を変化させることなく、広範に変動可能である。

コンセンサス配列
本発明はさらに、特定のコンセンサス配列およびそれらのフラグメント、誘導体および変異体を有する治療融合タンパク質を発現するキメラ遺伝子を含有する発現プラスミドを対象とする。「コンセンサス配列」は、例えば、2以上の配列を互いに比較した場合にそれぞれの位置に最も頻繁に存在するアミノ酸配列を表す理想配列である。コンセンサス配列は、それぞれのアミノ酸が、天然に存在する別の配列の同じ部位に最も頻繁に現れるアミノ酸である、理論上の代表的なアミノ酸配列である。この用語はまた、理論上のコンセンサス配列に近い実際の配列も意味する。コンセンサス配列は、例えば機能的または構造的特性を共有した配列に由来し得る。コンセンサス配列は、可能な限り多くの特定の構造的または機能的ドメインの既知の例をアライニングしてホモロジーを最大化することにより規定することが出来る。それぞれの特定アミノ酸がその位置にて合理的に支配的である場合、配列は一般にコンセンサス配列と認められ、比較の基礎を成すほとんどの配列は、ごく少量のみの置換、例えば0から約100の置換の範囲にてコンセンサス配列と関係している。一般に、野生型の比較配列は、コンセンサス配列に対して少なくとも約50％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一である。従って、本発明のポリペプチドは、コンセンサス配列に対して約50％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％または100％同一である。

「コンセンサスアミノ酸」は、コンセンサスタンパク質において所定の位置を占有するものを選択したアミノ酸である。コンセンサスアミノ酸を選択するように構築したシステムは、１つのコンピュータプログラム、または「手動の」解析および計算を行う１以上のコンピュータプログラムの組み合わせであり得る。整列させたアミノ酸配列のそれぞれの位置においてコンセンサスアミノ酸が得られると、次いで、これらのコンセンサスアミノ酸を「一列に並べて（lined up）」そのコンセンサスタンパク質のアミノ酸配列を得る。

治療用途
考慮に入れるものは、例えば喘息、関節リウマチ、枯草熱、アレルギー性鼻炎、乾癬および他の皮膚疾患のような炎症性および免疫疾患を処置するため、ならびに例えば膵島移植における移植片拒絶を抑制するための医薬の製造における治療融合タンパク質の使用である。

さらに考慮に入れるものは、免疫反応を調節するための、すなわち自己免疫疾患に罹患した対象におけるT細胞活性化をブロックするため、炎症細胞の浸潤（気道の炎症）を減少させるため、Th2型サイトカインの分泌を減少させるため、または気道過敏症を軽減するための治療融合タンパク質の使用である。自己免疫疾患の例には、多発性硬化症；シェーグレン症候群；サルコイドーシス；インスリン依存性糖尿病；自己免疫性甲状腺炎；関節炎、例えば変形性関節症、関節リウマチ、反応性関節炎および乾癬性関節炎；強直性脊椎炎；および強皮症などがある。

また考慮に入れるものは、例えば喘息、肺気腫、枯草熱（アトピー）、アレルギー性鼻炎、乾癬および他の皮膚疾患のような炎症性疾患を治療するため、ならびに例えば膵島移植における移植片拒絶を抑制するための治療融合タンパク質の使用である。

方法および投与
本発明は、治療融合ポリペプチドまたはそれらのフラグメント、変異体または誘導体を輸送するための方法であって（ここでそのタンパク質は組換えタンパク質、特に融合タンパク質、または精製サブユニットとして供給される）、脊椎動物に１以上の本明細書に記載の組成物を投与することを含み；本明細書に記載のような組成物を投与するとその脊椎動物において治療的反応が生じるような方法を提供する。その輸送は、例えば皮膚、鼻、眼または気管内を介して起こり得る。鼻腔内投与は、気管内注入によって行ってもよい。

「脊椎動物」なる用語は、単一の「脊椎動物」ならびに複数の「脊椎動物」を包含することを意図し、哺乳類および鳥類ならびに魚類、爬虫類および両生類を含む。

「哺乳類」なる用語は、単一の「哺乳類」および複数の「哺乳類」を包括することを意図し、以下を含むがこれらに限定されない：ヒト；霊長類、例えば類人猿、サル（例えばフクロウザル、リスザル、オマキザル、アカゲザル、アフリカミドリザル、パタスモンキー、カニクイザルおよびオナガザル）、オランウータン、ヒヒ、テナガザルおよびチンパンジー；イヌ科、例えばイヌおよびオオカミ；ネコ科、例えばネコ、ライオンおよびトラ；ウマ科、例えばウマ、ロバおよびシマウマ、食用動物、例えばウシ、ブタおよびヒツジ；有蹄動物、例えばシカおよびキリン；クマ科、例えばクマ；およびその他、例えばウサギ、マウス、ケナガイタチ（ferret）、アザラシ（seal）、クジラ。特に、哺乳類は、ヒト対象、食用動物またはコンパニオンアニマルであり得る。

「鳥類」なる用語は、単一の「鳥類」および複数の「鳥類」を包括することを意図しており、以下を含むがこれらに限定されない：野生の水鳥、例えばアヒル、ガチョウ、アジサシ、ミズナギドリおよびカモメ；ならびに飼育鳥類種、例えばシチメンチョウ、ニワトリ、ウズラ、キジ、ガチョウおよびアヒル。「鳥類」なる用語はまた、スズメ目の鳥、例えばムクドリおよびセキセイインコも包括する。

本発明はさらに、免疫反応を創出する、促進するまたは調節する方法であって、ヒトに１以上の本明細書に記載の組成物を投与することを含む方法を提供する。この方法において、その組成物は、１以上のポリペプチドまたはそれらのフラグメント、変異体、誘導体を含んでもよく、そのタンパク質は組換えタンパク質、特に融合タンパク質または精製サブユニットとして供給する。

本明細書にて用いる場合「治療的反応」は、本明細書に記載のような組成物を脊椎動物に輸送した場合に、その組成物に対して陽性反応を誘発する脊椎動物の能力を意味する。治療的反応の例には、免疫反応、創傷の治癒、炎症反応および移植片拒絶の抑制があるが、これらに限定されない。

本明細書にて用いる場合「免疫反応」は、脊椎動物に輸送した組成物に対して免疫反応を誘発する脊椎動物の能力を意味する。免疫反応の例には、抗体反応または細胞性反応、例えば細胞障害性T細胞反応などがある。

上述のように、本発明の組成物は、疾患を治療的に処置するまたは予防するために用いることができる。本明細書にて規定する場合「処置」は、脊椎動物における疾患または病徴を予防する、治癒させる、遅らせるまたは重症度を軽減する、および／または結果として疾患が悪化しないようにするための、１以上の本発明の組成物の使用を意味する。

「予防」なる用語は、脊椎動物において治療的反応を創出するための１以上の本発明の組成物の使用を意味する。本発明のいずれかの組成物によって、あらゆる病徴を完全に治癒させるまたは除去することは必要としない。

特定の態様において、本発明の１以上の組成物を、本明細書に記載の方法によって脊椎動物に輸送し、これにより効果的な治療的および／または効果的な予防的免疫反応が達成される。より具体的には、本発明の組成物は、脊椎動物の、以下を含むがこれらに限定されないいずれかの組織に投与できる：筋肉、皮膚、脳組織、肺組織、肝臓組織、脾臓組織、骨髄組織、胸腺組織、心臓組織、例えば、心筋、心内膜および心膜、リンパ組織、血液組織、骨組織、膵臓組織、腎臓組織、胆嚢組織、胃組織、腸組織、精巣組織、卵巣組織、子宮組織、膣組織、直腸組織、神経系組織、眼組織、腺組織、舌組織および結合組織、例えば軟骨。

さらに、本発明の組成物は、脊椎動物の、以下を含むがこれらに限定されないいずれかの内部空洞に投与できる：肺、口、鼻腔、胃、腹膜腔、腸、いずれかの心腔、静脈、動脈、毛細血管、リンパ管腔、子宮腔、膣腔、直腸腔、関節腔、脳室、脊髄の脊柱管、眼球腔、唾液腺管または肝臓管の管腔。本発明の組成物を唾液腺管または肝臓管の管腔へ投与すると、所望のポリペプチドが唾液腺および肝臓において発現し、唾液腺または肝臓のそれぞれから脊椎動物の血流へポリペプチドが輸送される。所望のポリペプチドを血流へ放出するために唾液腺、肝臓および膵臓を用いる、胃腸管系の分泌器官への特定の投与様式は、米国特許番号5,837,693号および6,004,944号明細書（両方は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている。

特定の態様において、組成物は、筋肉、骨格筋または心筋のいずれか、または胚組織に投与する。

開示する方法によると、本発明の組成物は、筋肉内（i.m.）、皮下（s.c.）、または肺内経路により投与できる。他の適切な投与経路には、気管内注入、経皮、眼内、鼻腔内、吸入、腔内、静脈内（i.v.）、管内（例えば、膵臓内へ）および実質内（つまり、いずれかの組織内へ）投与があるが、これらに限定されない。静脈内投与において、例えばリン酸緩衝食塩水、生理食塩水または薬物を静脈内投与するのに用いられる他の材料のような適切な製薬的に許容される担体を用いることができる。経皮輸送には、皮内（例えば、真皮または表皮内へ）、経皮（transdermal）（例えば、経皮（percutaneous））および経粘膜投与（つまり、皮膚または粘膜組織内へまたはこれらを通して）があるがこれらに限定されない。腔内投与には、以下への投与があるがこれらに限定されない：経口、膣、直腸、経鼻、腹膜、または腸管腔、ならびに髄腔内（つまり、脊柱管へ）、室内（つまり、脳室または心室内へ）、心房内（intra atrial）（つまり、心房（heart atrium）内へ）およびくも膜下（つまり、脳のくも膜下腔内へ）投与。

所望の組織において、治療的反応が必要なヒトの疾患状態に対して治療的反応が生じるのに十分な量にて、所望のペプチドまたはタンパク質の輸送または発現が起こるならば、いずれの投与様式を用いてもよい。

本発明の投与手段には、針注射（例えば、好ましくは等張性の滅菌水分散液として）、注入カテーテル、微粒子銃注射器、粒子加速器（例えば、「遺伝子銃」または含気性の「無針」注射器）Med-E-Jet（Vahlsing、H.、et al.、J. Immunol. Methods 171：11-22（1994））、Pigjet（Schrijver、R.、et al.、Vaccine 15： 1908-1916（1997））、Biojector（Davis、H.、et al.、Vaccine 12： 1503-1509（1994）；Gramzinski、R.、et al.、Mol. Med. 4： 109-118（1998））、AdvantaJet（Linmayer、I.、et al.、Diabetes Care 9：294-297（1986））、Medi-jector（Martins、J.、and Roedl、E. J.、Occup. Med. 21：821-824（1979））、ゼルフォーム（gelfoam）スポンジデポー、他の市販のデポー材（例えば、ハイドロゲル）、浸透圧ポンプ（例えば、Alzaミニポンプ）、経口または坐薬用固体（錠剤または丸剤）医薬製剤、局所的皮膚クリームまたはゲル、およびデカンティング、ポリヌクレオチド被覆縫合術の使用（Qin、Y.、et al.、Life Sciences 65： 2193-2203（1999））または術中の局所投与などがある。投与様式の具体例は、筋肉内針注射および注入カテーテルを介した肺への投与である。本発明の組成物を投与するのにエネルギー支援プラスミド輸送（Energy-assisted plasmid delivery）（EAPD）法を利用することもできる。そのような方法の１つは、注射した組織に短電気パルスを加えることを含み、その方法は一般にエレクトロポレーションとして知られる。一般にMir, L.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 96：4262-7（1999）；Hartikka, J., et al., Mol. Ther. 4：407-15（2001）；Mathiesen, I., Gene Ther. 6：508-14（1999）；Rizzuto G., et al., Hum. Gen. Ther. 11：1891-900（2000）を参照のこと。この段落において引用したそれぞれの参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本発明の１以上の組成物の有効量の決定は、例えば、発現させるまたは直接投与する融合ポリペプチド、それらの変異体または誘導体、対象の年齢、体重および性別、処置を要する正確な状態およびその重症度、投与経路、融合ポリペプチドのインビボ半減期、取り込み効率、および処置すべき範囲などの多くの因子に依拠する。処置は、臨床診断に基づき、患者の反応を考慮して、必要に応じて繰り返すことができる。

「医薬的有効量」または「治療上有効量」は、疾患状態に対して治療的または臨床的反応を創出するのに十分な量である。「医薬的有効量」または「治療上有効量」なる用語は、互いに言い換えることができる。上記の因子に基づき、正確な量、投与回数および投与のタイミングを決定することは、当分野の通常の技術範囲であり、主治医師または獣医師により容易に決定されるであろう。

哺乳類、特にヒトへの投与において、活性薬剤の１日用量は、0.01 mg/kg（体重）から一般的に1 mg/kg前後であろうと予想される。上記の用量は平均的な場合の代表例である。当然ながら、ピコモーラーおよびナノモーラー濃度を含めて、より高いまたはより低い用量が有用である場合もあり得、そのような場合も本発明の範囲内である。

本発明はまた、本明細書に開示したような融合ポリペプチドおよびさらなる医薬的活性薬剤を含む組成物にも関する。従って、その融合ポリペプチドおよび共に含む医薬的活性薬剤は、製薬的に許容される単一の担体または複数の担体と組み合わせて用いることもできる。そのような担体には、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖、リポソーム、水、グリセロール、ポリエチレングリコール、エタノールおよびそれらの組み合わせがあるが、これらに限定されない。

本発明の組成物は、様々ないずれかの緩衝剤に可溶化させてもよい。適切な緩衝剤には、例えば、リン酸緩衝食塩水（PBS）、通常の生理食塩水、Tris緩衝液およびリン酸ナトリウム（例えば、150 mMリン酸ナトリウム）などがある。不溶性のポリヌクレオチドは、弱酸または弱塩基に可溶化させ、次いで緩衝剤により望ましい容積に希釈してもよい。緩衝剤のpHは必要に応じて調整すればよい。さらに、適切なモル浸透圧濃度を生じさせるために、製薬的に許容される添加剤を用いることができる。そのような添加剤は、当業者の認識する範囲内である。インビボに用いる水性組成物として、発熱物質不含滅菌水を用いることができる。ヒトへの投与に適した製薬的に許容される組成物を調製するために、そのような製剤は、有効量のポリヌクレオチドとともに適切な量の水溶液を含むであろう。

本発明の組成物は、既知の方法に従って製剤化することができる。適切な調製法は、例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences（レミントンの薬学）」、第16版、A. Osol編、Mack Publishing Co., Easton, PA（1980）、および「Remington's Pharmaceutical Sciences（レミントンの薬学）」、第19版、A.R. Gennaro編、Mack Publishing Co., Easton, PA（1995）に記載されており、その両方は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。組成物は水溶液として投与できるが、乳剤、ゲル、溶液剤、懸濁剤、凍結乾燥形態または当分野にて既知の他のいずれかの形態として製剤化することもできる。さらに、本組成物は、例えば、希釈剤、結合剤、安定化剤および保護剤などの製薬的に許容される添加剤を含んでもよい。

以下の実施例は、例示のみを目的として記載しており、添付の特許請求の範囲に規定する本発明の範囲を限定することを意図していない。実施例に引用した参考文献は全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

材料および方法
以下の材料および方法は、本明細書に開示する実施例の全てに一般に適用される。特別な材料および方法は、必要に応じて各実施例に記載している。

本発明の実施には、格別に示さない限りは、当分野の技術範囲である細胞生物学、細胞培養、分子生物学（PCRを含む）、ワクチン学、組換えDNAおよび免疫学の従来技術を採用する。そのような技術は、文献に完全に説明されている。例えば、「Molecular Cloning A Laboratory Manual（分子クローニング実験室マニュアル）」、第2版、Sambrookら編、Cold Spring Harbor Laboratory Press：（1989）；「DNA Cloning（DNAクローニング）」第IおよびII巻（D. N. Glover編、1985）；「Oligonucleotide Synthesis（オリゴヌクレオチド合成）」（M. J. Gait編、1984）；Mullisら、米国特許番号4,683,195号明細書；「Nucleic Acid Hybridization（核酸ハイブリダイゼーション）」（B. D. Hames ＆ S. J. Higgins編、1984）；「Transcription And Translation（転写および翻訳）」（B. D. Hames ＆ S. J. Higgins編、1984）；「Culture Of Animal Cells（動物細胞の培養）」（R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987）；「Immobilized Cells And Enzymes（固定化細胞と酵素）」（IRL Press, 1986）；B. Perbal、「A Practical Guide To Molecular Cloning（分子クローニングの実践ガイド）」（1984）；論文、「Methods In Enzymology（酵素学における方法）」（Academic Press, Inc., N.Y.）；「Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells（哺乳類細胞のための遺伝子移入ベクター）」（J. H. MillerおよびM. P. Calos編、1987, Cold Spring Harbor Laboratory）；「Methods In Enzymology（酵素学における方法）」、第154および155巻（Wuら編）、「Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology（細胞および分子生物学における免疫化学的方法）」（MayerおよびWalker著、Academic Press, London, 1987）；およびAusubelら、「Current Protocols in Molecular Biology（分子生物学における最新プロトコール）」、John Wiley and Sons、Baltimore, Maryland（1989）を参照のこと。この段落において引用した各参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

遺伝子コンストラクション
本発明のコンストラクトは、本明細書および標準的な分子生物学の技術を用いる分野において提供されている配列情報に基づいて構築する。

プラスミドベクター
本発明のコンストラクトは、pRSET-B発現ベクター（Invitrogen）に由来する。しかしながら、以下などであるがこれらに限定されない他の標準的な市販の真核生物の発現ベクターも本発明に用いることができる：プラスミドpcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1、およびpZeoSV2（Invitrogen、San Diego、CAから入手可能）、およびプラスミドpCI（Promega, Madison, WIから入手可能）。

上記に記載のベクターの基本骨格を用いて、本明細書に記載の融合タンパク質を発現する発現ベクターを創出する。発現ベクターは、さらなるプロモーターを含み得る。従って、本明細書に記載のベクター基本骨格は、プロモーターおよびとりわけ本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む微生物コード配列を含む複数の発現カセットを含有し得る。発現カセットは、同じまたは異なるポリペプチドをコードし得る。さらに、その発現カセット同士は、互いに同じまたは反対の配向であり得る。それゆえ、各カセットからの転写は同じまたは反対の方向であり得る（すなわち、両発現カセットにおいて5'から3'方向、あるいは、一方の発現カセットにおいて5'から3'方向であり、他方の発現カセットにおいて3'から5'方向）。

プラスミドDNA精製
プラスミドDNAは、適切な大腸菌株（DH5α株を含むがこれに限定しない）のコンピテント細胞へ形質転換してもよく、改変溶解法により単離するかまたは、Qiagen（Valencia, CA）のGigaカラムを用いてそのキットの指示に従って精製して、高度に純化された共有結合性の閉環状プラスミドDNAを得た。プラスミドの調製は全て、検出可能な染色体DNA、RNAおよびタンパク質不純物を含まない、ゲル分析に基づいて行った。プラスミドは、適切な溶液、例えば150 mMナトリウム溶液においてエタノール沈殿し、再懸濁した。DNAは使用するまで−20℃で保存した。DNAは望ましい塩溶液により所望のモル濃度に希釈した。

哺乳類細胞株におけるプラスミド発現
発現プラスミドは、プラスミドをHela細胞またはJurkat T細胞へトランスフェクトしてインビトロにて分析した。他のよく特徴決定されたヒト細胞株、例えばMRC-5細胞（ATCC寄託番号CCL-171）またはヒト横紋筋肉腫細胞株RD（ATCC CCL-136）を用いることもできる。トランスフェクションは、当業者に周知の陽イオン性脂質ベースのトランスフェクション法を用いて行った。例えば、エレクトロポレーションおよび塩化カルシウム媒介性トランスフェクションなどの他のトランスフェクション法も当分野においてよく知られており、用いることができる（Graham F.L. and A.J. van der Eb, Virology 52：456-67（1973））。トランスフェクション後の、トランスフェクトした細胞の細胞ライセートおよび培養上清は、抗原発現の相対レベルを比較して評価した。市販のポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体を用いてウェスタンブロットおよびELISAによりサンプルをアッセイし、発現抗原の量および質の両方を比較した。

T細胞活性化の分析
健常ドナーからのバフィーコートから初代ヒトCD4^＋T細胞を精製した。Histopaque（Sigma）を用いて密度勾配遠心分離によってPBMCを単離した。リンパ球の層を収集し、CD4ミクロビーズを用いたMACSカラムによりCD4^＋T細胞を単離した（Miltenyi Biotec）（Busch R., et al., J. Immunol. Methods 286：97-109（2004））。

100万個のJurkat（E6.1）細胞または初代ヒトCD4^＋T細胞をHph-1-ctCTLA-4により1時間処理し、次いでPBSにより洗浄し、抗CD28 mAb（Pharmingen）0.25μgとともに20分間4℃にてインキュベートした。抗CD28 mAb結合細胞を、抗CD3 mAb（Pharmingen）0.05μg被覆プレートにおいて20時間さらに活性化させた。各細胞を抗CD69-PEおよび抗CD25-FITC抗体（Pharmingen）により染色し、FACS calibur（Becton Dickinson）により分析した。各ウェルの上清を、分泌されたIL-2のレベルについてELISA（R＆D system）により分析した。

OVA誘導性アレルギー性喘息モデル
6週齢のオスのBALB/cマウス（Charles River Technology）を無病原菌状態下で維持した。そのマウスは22℃、20から50％の湿度、12時間の明条件においた。OVA曝露マウスを1日目および14日目に水酸化アルミニウム（Sigma）20 mgに乳化したOVA（Sigma）100μg（全容積は200μl）の腹腔内注射により感作した。初めの感作後15日目、16日目および17日目に、10％グリセロール内毒素不含PBS 0.1 mlに溶解したOVA 1.5 mgの鼻腔内注入によりマウスを曝露させた（Van Rijt L.S., et al., Blood 100：3663-3671（2002）；Oh S.W., et al., J. Immunol. 168：1992-2000（2002）；およびZhang Y., et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 155：661-669（1997））。CTLA-4処置の場合、鼻腔内径路によるOVA曝露の30分前に、マウスに10％グリセロール内毒素不含PBS 50μl中Hph-1-ctCTLA-4組換えタンパク質25μgを与えた。

気道における炎症の分析
気道の耐性をチャンバーが１つのプレチスモグラフィー（ALL Medicus）により測定し、各濃度のMCh（メタコリン）ついて、PBS曝露後のPenh値と比較した倍数増加として表した。Penh値は、呼吸器系抵抗（Rrs）値であり、1分間あたりの呼吸頻度として表す。最後のOVA曝露後２日目に、ペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射（100 mg/kg）によりマウスを屠殺し、リン酸緩衝食塩水1 mlを4回注入することにより気管支肺胞洗浄（BAL）を行い、穏やかに回収した。血球計数器を用いて細胞数を測定し、細胞遠心およびDiff-Quick染色（Scientific Products）により調製したスライドにおいて示差的（differential）細胞計数を行った。BAL後即座に、気管および左の残りの肺をPBS中4％パラホルムアルデヒドにより固定し、パラフィンに包埋した。その組織をH ＆ E（hematoxylin and eosin）染色に供して形態計測による解析を行った。

気管支周囲の炎症の重症度を先に報告されているように半定量的に以下の通りに等級付けした：0、正常；1、少数の細胞；2、１細胞層の深さの炎症細胞の輪；3、４細胞より多い深さの炎症細胞の輪（Myou S., et al., J. Exp. Med. 198：1573-1582（2003）；and Myou S., et al., J. Immunol. 171：4379-4384（2003））。

BAL液中のエオタキシン、IL-5（BD Biosciences）、IL-6およびIL-13（R＆D System）レベルを定量的サンドイッチ酵素結合免疫測定法（ELISA）により測定した。検出の下限はそれぞれ15.6 pg/mlであった。この限界以下の値は統計解析においてゼロとみなした。アッセイ間およびアッセイ内変動係数は10％より低かった。

［実施例１］
発現ベクターの産生
サイトゾルから細胞内オルガネラへタンパク質を導く取り込み標的指向化配列とTATとの間に共通する構造的および機能的特徴に基づき、11アミノ酸（YARVRRRGPRR）（配列番号1）のHph-1タンパク質導入ドメイン（PTD）をヒト転写因子Hph-1から同定した。「Hph-1-PTD」および「Hph-1」なる用語は、この11アミノ酸配列を意味し、互いに言い換えることができる。

Hph-1-PTD-ctCTLA-4、Hph-1-PTD-β-gal、Hph-1-PTD-ctCTLA-4-eGFP、およびHph-1-PTDと融合していない対応遺伝子の産生は、PCRフラグメントを作製し、各PCRフラグメントをpRSET-Bベクター（Invitrogen）へと挿入することにより達成した（図1A）。

［実施例2］
組換えタンパク質の調製
部位特異的な突然変異生成を行いCTLA-4YF変異体を創出した。リーディングフレームの忠実度はシークエンシングにより確認した。それぞれのDNAコンストラクトにより形質転換したBL21 star（Novagen）を1 mM IPTGにより5時間誘導し、溶解緩衝液（6 M尿素、20 mM Tris-HCl、pH 8.0および500 mM NaCl）において超音波処理した。ライセートを遠心分離（20,000 r.p.m.、20℃にて30分間）により清澄にし、10 mMイミダゾール（Tis-HCl, pH 8.0）に適応させ、HisTrap chelating column（Qiagen）に送り込んだ。結合したタンパク質を、Tris-HCl緩衝液中50、100、250mMまたは3Mイミダゾールにより溶出させた（純度＞95％）。各画分に含まれる組換えタンパク質をPD-10 Sephadex G-25（Amersham Pharmacia）において脱塩した。精製タンパク質に10％グリセロールを補足し、分注し、−80℃にて急速冷凍した（Becker-Hapak M., et al., Methods 24：247-256（2001））。

［実施例３］
インビトロおよびインビボにおけるHph-1-PTDの導入効率の分析
Hph-1-β-galコンストラクトを各細胞株に1時間導入した後、細胞をPBSにより洗浄し、即座に固定した。次いで、固定した細胞をX-Gal溶液とともに37℃にて1-3時間インキュベートした。Hph-1-β-galのi.p.注射後12時間に、マウスの肝臓、腎臓、心臓、肺、脾臓および脳からの組織サンプルを単離し、薄片化し（10および50μm切片に）、X-Gal染色キット（Roche）を用いてアッセイした（Schwarze S.R., et al., Science 285：1569-1572（1999））。画像を蛍光顕微鏡（Nikon）により撮像した。Hph-1-β-galの導入容量をウェスタンブロット分析によっても解析した。等しい数の細胞をSDS-PAGEサンプル緩衝液に可溶化し、そのタンパク質を12％ゲル上にて分離し、PVDF上にブロットし、β-galに対するモノクローナル抗体（Cell Signaling）（1：1,000）により探索した。マウスIgGに対する西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲート抗体（1：5,000）を用いて結合した抗体を検出し、高感度化学発光（Pierce）を行った。Hph-1-PTD-eGFP融合タンパク質の局在化をモニターするために、Hela細胞を10μMのHph-1- eGFP融合タンパク質とともに30分間インキュベートし、eGFPの蛍光を共焦点顕微鏡（Bio Rad）により分析した。

Hph-1-HA-ctCTLA-4の導入効率をHA-fluorescein mAb（Cell Signaling）を用いた細胞内染色により分析した。Cytofix/Cytoperm溶液（Pharmingen）により細胞を透過処理した後、HA-fluorescein mAbとともに4℃にて30分間インキュベートした。細胞内蛍光をFACS calibur（Becton Dickinson）により測定した。

精製Hph-1-β-gal融合タンパク質または対照β-galタンパク質を用いて、Jurkat（E6.1）細胞におけるウェスタンブロット分析により導入効率を解析した。図1Bに示したように、10μMのHph-1-β-galは培養細胞に素早く導入され、初めに検出されたのは15分時点であり、60分までにほぼ最大の細胞内濃度に到達した。導入されたタンパク質の分解は、導入後120分までには検出されなかったが、一方、対照β-galタンパク質は20 mMでも細胞に導入されなかった。Hph-1-PTDのタンパク質導入特性は、濃度依存的に現れるようであり、その導入効率は4℃において40％減少した（図1B）。

Jurkat T細胞におけるHph-1-PTDによるタンパク質導入についての導入動態および最適濃度を決定した後、Hph-1-PTDの導入効率を種々の細胞株において試験した。図1Cに示すように、1時間のインキュベーション後、ほぼ100％の細胞が、β-gal酵素活性について、様々な導入効率にて陽性となった。

細胞におけるHph-1-PTD融合タンパク質の細胞内局在化をモニターするために、HeLa細胞を10μMのHph-1- eGFP融合タンパク質とともに30分間インキュベートし、eGFPの蛍光を共焦点顕微鏡により分析した（図1D）。Hph-1- eGFPはインキュベーション後数分に核に蓄積し、内部に取り入れられた融合タンパク質は、処理した細胞の核と細胞質の両方に見られた（図1C）。

インビボにおいてHph-1-PTDがタンパク質輸送を促進したかどうかを判定するために、Hph-1-β-galまたは対照β-galタンパク質をマウスに腹腔内注射し、注射から4-6時間後に、肝臓、心臓、腎臓、肺、脾臓および脳を単離した。次いで、完全な器官およびそれらの薄片をβ-gal酵素活性について分析した（図1E）。Hph-1-β-galを注射したマウスから単離した全ての組織は、脳切片においてさえ強く一定のβ-gal活性を示し、このことはHph-1-PTDが血液脳関門を横切って大きなタンパク質を輸送できることを示している。対照タンパク質を注射したマウスにおいては、β-galは検出されなかったか、または、散発的な弱い染色が観察され、これは食細胞による対照β-galタンパク質の一過性の非特異的な取り込みによる可能性が高い（Schwarze S.R., et al., Science 285：1569-1572（1999））。

［実施例４］
Hph-1-FITCの局所投与
皮膚：無毛マウスの皮膚をアセトンを用いて拭き、Hph-1-FITCと軟膏の混合物をマウスの背中に塗布した。2時間後、マウスの皮膚のサンプルを薄片化し、共焦点顕微鏡により蛍光の存在について分析した。

眼：PBS溶液中Hph-1-FITCをラットの眼に滴下し、投与から30分および120分後に、眼の凍結切片においてFITC蛍光を共焦点顕微鏡により調べた。

鼻：FITCがコンジュゲートしたHph-1-FITC溶液を気管内注入により気管および肺へ輸送した。30分後、左の肺の主要部および気管を切除し、PBS中4％パラホルムアルデヒドによって固定し、パラフィンに包埋した。パラフィンのブロックからの薄片を共焦点顕微鏡によって分析した。

局所的な疾患の治療のためのタンパク質治療においてHph-1-PTDを利用するために、皮膚、眼または鼻気道を通したFITC標識化Hph-1-PTDの投与を試みた（図2）。FITCコンジュゲートHph-1-PTDと混合した軟膏を、無毛マウスの皮膚へ局所的に塗布した。その後、共焦点顕微鏡より蛍光の存在について皮膚サンプルを分析した（図2A）。Hph-1-PTD-FITCにより処置した場合、強いFITC蛍光が真皮ならびに表皮において検出されたが、一方、対照ペプチドにより処置したマウスの皮膚においては基底レベルの蛍光が観察された。

図2Bにおいて、PBS中Hph-1-PTD-FITCをラットの眼に滴下した。眼への局所投与から30分および120分後に、眼の凍結切片において共焦点顕微鏡によってFITC蛍光を調べた。Hph-1-FITCは、強膜を通して網膜および神経節細胞層へと浸透できたが、一方、対照ペプチドにより処置した眼のサンプルには蛍光がなかった。次の工程において、FITCコンジュゲートHph-1-PTDを、気管内注入により気管および肺へ局所的に輸送した（図2C）。Hph-1-PTD-FITCは、肺の血管の細気管支（microbronchi）および内皮領域において検出され、気管支の基底膜内へ浸透していた。

まとめると、これらの結果は、Hph-1-PTDが、インビトロおよびインビボの両方において細胞の細胞質ならびに核へ大きなタンパク質を輸送することができることを明らかに示している。インビボにおいて様々な局所投与経路を通した大きなタンパク質の輸送は効率的であったので、このことは、機能性融合タンパク質とHph-1-PTDの組み合わせが、局所投与による治療タンパク質薬として有用であろうことを示している。

［実施例５］
CTLA-4の細胞質ドメインと融合したHph-1-PTDによるT細胞活性化の抑制
インビボにおいて大きな標的タンパク質を鼻気道を通して細胞または気管へ輸送するHph-1-PTDの能力を活用して、喘息モデルにおける免疫反応の局所的な抑制に用いるために、Hph-1-PTDとCTLA-4細胞質ドメインの融合タンパク質（Hph-1-PTD-ctCTLA-4）を図3Aに記載のように構築した。Hph-1-PTDを持たないctCTLA-4、および抑制機能（negative function）に不可欠な２つのチロシン残基がフェニルアラニンに変異したHph-1-ctCTLA-4YFから構成される２つの対照タンパク質を構築した。Hph-1-ctCTLA-4の導入効率を、表面にCTLA-4を発現しないと知られるJurkat Tにおいて試験した。これらの細胞を種々の濃度のHph-1-ctCTLA-4により種々の期間処理し、導入効率と動態の両方を、細胞内染色によって分析した。図3Bおよび3Cに示されているように、Hph-1-ctCTLA-4の細胞への導入は、濃度依存的であることが判明し、インキュベーションから60分後に細胞内Hph-1-ctCTLA-4は最大レベルに到達したが、Hph-1-PTDを持たないCTLA-4は、全く輸送されなかった。

輸送されたHph-1-ctCTLA-4がT細胞活性を抑制できるかどうかを調べるために、Jurkat T細胞または初代ヒトCD4^＋T細胞をHph-1-ctCTLA-4により処理し、抗CD28 mAbおよびプレートに結合した抗CD3 mAbにより刺激した。CD69およびCD25といった活性化誘導性表面タンパク質のレベルをFACSにより分析した。図3Dおよび3Eに示すように、これらの表面マーカータンパク質の誘導は、Hph-1-ctCTLA-4が細胞内に存在することにより有意に抑制された。Hph-1-PTDを持たないctCTLA-4またはHph-1-ctCTLA-4YF変異体は、これらの表面マーカーの誘導の抑制を何ら示さなかった。Jurkat T細胞および初代ヒトCD4^＋T細胞の両方が、抗CD3および抗CD28 mAbsによる刺激に反応して直ちに相当量のIL-2を産生し、10 nMのCsA（シクロスポリン A）またはFK506により予想通りIL-2分泌は阻害された。JurkatまたはヒトCD4^＋T細胞へのHph-1-ctCTLA-4の細胞内輸送により、ピコモーラー単位にて濃度依存的にIL-2分泌の誘導を抑制することができ、10pMのHph-1-ctCTLA-4による抑制レベルは、10nMのCsAによる抑制レベルより高いかまたは同等であった（図3Fおよび3G）。1000倍低い濃度のHph-1-ctCTLA-4によりCsAの匹敵レベルのT細胞活性抑制が達成された。先に報告されているように、TcR刺激後の、Zap70、ERKおよびJNKなどの様々な細胞内シグナリングメディエーターのチロシンリン酸化の誘導は、Hph-1-ctCTLA-4をT細胞へ輸送すると顕著に抑制された（Lee K.M., et al., Science 282：2263-2266（1998）；Lee K.M., et al., J. Immunol. 168：4420-4429（2002）；Calvo C.R., et al., J. Exp. Med. 186：1645-1653（1997）；Kwon H.J., et al., J. Immunol. 173：6645-6653（2004）；およびBrunner M.C., et al., J. Immunol. 162：5813-5820（1999））。しかしながら、Hph-1-PTDを持たないctCTLA-4およびHph-1-ctCTLA-4YFのいずれも、IL-2分泌をブロックしなかった。これらの結果は、（1）Hph-1-PTDによるCTLA-4細胞質ドメインの輸送により、10pM濃度にてT細胞活性が効果的にブロックされ；および（2）CTLA-4細胞質ドメインの２つのチロシン残基は抑制機能に不可欠であることを示した（Emma L.M., et al., J. Immunol. 164：5319-5327（2000）；およびThompson C.B. ＆ Allison J.P., Immunity 7：445-450（1997））。

［実施例６］
Hph-1-ctCTLA-4はOVA誘導性の気道炎症を抑制した
Hph-1-ctCTLA-4-eGFP融合タンパク質を気管内注入により効果的にマウスの気管および肺へ輸送できるかどうかを判定するために、鼻腔経路を介してHph-1-ctCTLA-4-eGFP融合タンパク質を投与してから12時間後に、気管支肺胞洗浄（BAL）液の細胞を回収し、それらの蛍光をFACSにより分析した。図4Aおよび4Bに示すように、有意な数のBAL細胞がeGFPについて陽性となった。インビボにおける鼻気道を通したHph-1-ctCTLA-4-eGFP融合タンパク質の導入効率は、用量依存的に生じたが、ctCTLA-4-eGFPにより処置したマウスからのBAL細胞においては基底レベルの蛍光しか検出されなかった。Hph-1-ctCTLA-4-eGFP融合タンパク質の、BAL液中のCD3^＋T細胞への導入をさらに分析した。高レベルのeGFPがHph-1-ctCTLA-4-eGFPを経鼻注入したマウスからのCD3^＋T細胞の大多数において検出された（図4C）。肺組織の組織学的分析から、Hph-1-ctCTLA-4-eGFPの輸送は明らかであった（データ示さず）。これらの結果は、CTLA-4細胞質ドメインは、Hph-1-PTDにより鼻気道を通して効果的にBAL細胞へ輸送できることを実証している。

鼻気道を通して輸送されたHph-1-ctCTLA-4タンパク質がインビボにおいて気管支喘息の発生を抑制できるかどうかを調べるために、OVAによる免疫化および気道曝露によって喘息のマウスモデルを創出した。OVA曝露後、BAL液中の好酸球、マクロファージおよび好中球およびリンパ球を含む炎症細胞の数は、有意に増大した。これらのマウスをHph-1-ctCTLA-4 25μgにより鼻腔内にて前処理すると、これらの炎症細胞のBAL液への浸潤が、PBS曝露対照群において観察されたレベルまで阻止されたことが示された。しかしながら、Hph-1-ctCTLA-4YF変異体はこれらの抑制効果を示さなかった（図4D）。

OVA誘導性の炎症性サイトカインの分泌に対するHph-1-ctCTLA-4の抑制効果を評価するために、OVA曝露マウスのBAL液における、エオタキシンといったケモカイン、およびIL-5、IL-6、IL-13などのTh2サイトカインおよびTh1サイトカイン（IFN-γ、TGF-β）のレベルを測定した（図4E）。OVA曝露により、全てのサイトカインの分泌がかなり増加した。Hph-1-ctCTLA-4 25μgにより単回の前処理を行ったOVA曝露マウスにおいて、エオタキシンおよびTh2型サイトカインの産生は有意に抑制されたが、IFN-γおよびTGF-βへの影響はみられなかった。図4Dの結果と一致して、Hph-1を持たないCTLA4またはHph-1-ctCTLA-4YFのいずれかを投与したマウスにおいては、これらのTh2細胞サイトカインの産生に抑制はみられなかった。肺における炎症指数は、Hph-1-ctCTLA-4により前処理したOVA曝露マウスにおいて有意に減少したが、Hph-1-ctCTLA-4YFによる処置では有意に減少しなかった（図4F）。

肺組織において組織学的検査を行うと、OVA曝露により、気道周辺の気管支周囲組織および肺血管への炎症細胞の浸潤が誘導されたことが判明した。多くの粘液が上皮細胞を含有することも確認された（図4G）。炎症細胞はHph-1-ctCTLA-4により処置したマウスの粘液を通しては浸潤できていなかった。驚くべきことに、インビトロおよびインビボにおけるHph-1-ctCTLA-4のこれらの抑制効果は、Hph-1-ctCTLA-4-YFを輸送した場合は観察されなかった。これは明らかに、Hph-1-ctCTLA-4の抑制効果がctCTLA-4に完全に特異性であることを実証している。

OVAによる感作により、気道過敏性の実質的な増大が引き起こされることが、生理食塩水の吸入を受けたマウスと比較して、噴霧メタコリン吸入後の肺気流抵抗（enhanced pause）の指標がより高いことから分かった（図5）。メタコリンに対するOVA誘導過敏性のレベルは、Hph-1-ctCTLA-4により実質的に減弱したが、Hph-1-PTDを持たないCTLA4またはHph-1-ctCTLA-4YFによっては減弱しなかった。

最近、Tat-PTDと、IA PI3K調節サブユニットクラスのドミナントネガティブ型との（TAT-dnp85）またはRasのドミナントネガティブ型との（TAT-dnRas）融合タンパク質の腹腔内投与により、抗原誘導性の好酸球の気道浸潤が効果的に減弱され、BALFにおけるTh2サイトカイン濃度が減少し、メタコリンに対する気道過敏性がブロックされるという報告が２つある（Myou S., et al., J. Exp. Med. 198：1573-1582（2003）；およびMyou S., et al., J. Immunol. 171：4379-4384（2003））。これらの報告において、動物は、初めのOVA感作期から12時間毎にTAT-dnp85（10 mg/kg）およびTAT-dnRas（10 mg/kg）のi.p.注射を受けていた。しかしながら、TAT-dnp85およびTAT-dnRasは、抗原曝露後の気道への好中球およびマクロファージの遊走には影響しなかった。この結果とは対照的に、本発明のHph-1-PTD-ctCTLA-4は、好中球およびマクロファージの両方の浸潤のみならず他の炎症細胞も効果的に阻害し、また、この抑制効果は、初めのOVA曝露期の直前に鼻腔経路によってたった約1 mg/kgのHph-1-ctCTLA-4を単回投与することで達成された。

新規なHph-1-PTDを用いてCTLA-4細胞質ドメインを鼻腔投与すると、抗原感作マウスにおける、アレルギー性の炎症、好中球および好酸球などの炎症性細胞の浸潤およびTh2型サイトカインの分泌が、効果的にブロックされると結論する。この処置はまた、メタコリンに対する気道過敏性も軽減するようである。

［実施例７］
CTLA-4細胞質ドメインと融合したTat−PTDによるT細胞活性の抑制
CTLA-4細胞質ドメインと融合したTat-PTD（Tat-PTD-ctCTLA-4）によるT細胞活性の抑制を調べるために、抗CD3および抗CD28 mAbにより刺激したJurkat T細胞を、Tat-PTD-ctCTLA-4により処理し、分泌されたIL-2のレベルをELISAキット（BD Biosciencesカタログ番号555190）を用いて測定した。本明細書に記載する場合、「Tat-PTD-ctCTLA-4」および「Tat-ctCTLA-4」なる用語は、互いに言い換えることができる。

抗CD3および抗CD25 mAbにより刺激したJurkat T細胞を96ウェルプレート上に2×10⁵細胞の密度にて分配し、次いで各ウェルを、10 pM、1 pMまたは0.1 pMのいずれかのTat-PTD-ctCTLA-4により処理した。プレートを37℃にて一晩インキュベートした。

各ウェルにおいて回収した上清を、4 ng/mlのヒトIL-2に対する抗体により被覆したマイクロウェルプレートに加え、10％FBS含有PBSにより室温にて1時間ブロックし、洗浄した。培地を除去し、1.6 ng/mlのヒトIL-2に対するビオチン化抗体およびアビジン-西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲートを加えて1時間おいた。プレートを0.02％Tween-20含有PBSにより洗浄した後、100μlの基質溶液を加えて30分間おいた。反応を止めるために2N H₂SO₄溶液を加え、450 nmにおける吸光度を測定した（図6）。

図6は、Jurkat T細胞へのTat-ctCTLA-4の細胞内輸送により、IL-2分泌誘導を、ピコモーラー単位にて濃度依存的に抑制できたこと、また、1pMのTat-ctCTLA-4による抑制のレベルは、10 nMのシクロスポリンによる抑制レベルより高いかまたは等価であったことを示す（図6）。従って、10,000倍低い濃度のTat-ctCTLA-4によりシクロスポリンの匹敵レベルのT細胞活性化の抑制が達成された。

［実施例８］
関節リウマチに対するMph-1-PTD-ctCTLA-4
Mph-1-PTD-ctCTLA-4の免疫抑制効果を、II型コラーゲンの腹腔内注射により誘導した関節リウマチ（RA）動物モデルを用いて分析した。

RA誘導マウスを、4μgまたは400 ng/マウスのMph-1-PTD-ctCTLA-4の静脈注射を毎日行って処置し、関節の膨脹に関する関節炎指数、TNF-αおよび、CD4^＋およびCD8^＋T細胞の数を解析した。

マウスを処置すると炎症が回復した。関節炎指数および炎症性サイトカインであるTNF-αのレベルは減少したが（それぞれ図7および8）、脾臓および肺におけるCD4^＋およびCD8^＋T細胞の数は増加した（図9）。CIAは負の対照であり、コラーゲン誘導性関節炎を有し治療薬により処置していないマウスを表す。MTSは正の対照であり、よく知られたRA治療物質であるメトトレキサートにより処置したマウスを表す。

［実施例９］
アトピー性動物における炎症を抑制する方法
アトピーは、枯草熱のイヌ科相当物（canine equivalent）と考えることができる。アトピーは、アレルギー性疾患の病原としてTh2型のCD4^＋リンパ球が中心的な役割を行う、自己免疫疾患である。本実施例は、T細胞におけるサイトカイン発現の抑制または阻害により、アトピー性動物における炎症を抑制する方法を示す。

オスの無毛ラット（n=3/群、Jung-Ang Animal, Korea）にマグネシウムの欠乏した食餌を行った。標準的な低マグネシウムの飼育飼料であるAltromin（Lage, Germany）によりラットを飼育し、脱イオン水を与えた。一般に、血清中のマグネシウムは、食餌の開始後15日までに低いレベルに降下し、8±2日までに疾患の発症が観察された。10日後、全ての動物が背中に強い紅斑を、また両方の耳たぶの肥大を示した。

食餌の11日目にMph-1-ctCTLA4の投与を開始した。局所投与において、Mph-1-ctCTLA4は5％グリセロール溶液に溶解させた。

アトピー性皮膚炎誘導ラットを、500μg/ラットのMph-1-ctCTLA4の経皮投与を週に3回3週間行って処置した。対照動物は媒体により同様に処置した。

臨床スコアおよびTEWL（経皮水分損失）を解析し、アトピー性動物における炎症の抑制を観察した。

図11は、Mph-1-ctCTLA4により処置したラットにおいては皮膚炎スコアが低かったことを示す。TEWLも、対照ラットと比較してMph-1-ctCTLA4により処置したラットにおいて減少した。（図12を参照）。

［実施例１０］
膵島移植における移植片拒絶を抑制する方法
膵島を、ドナー（Lewisラット）からのコラゲナーゼ酵素消化およびFicoll精製の方法を用いて単離した。単離した膵島を、ストレプトゾトシン誘導性糖尿病ラット（Fisher DMラット、Asan medical center）の門脈を介して肝臓へ移植した。

動物（n＝3ラット/群）に、PBS（負の対照）、5mg/kgシクロスポリン、4μg/kg Mph-1-ctCTLA4、40μg/kg Mph-1-ctCTLA4または、5 mg/kgシクロスポリン＋4μg/kg Mph-1-ctCTLA4を、毎日15日間腹腔内注射した。

血中グルコースレベルを毎日測定した。グルコースレベルが200 mg/dLであると、その動物には移植片拒絶が起こっているとみなした。結果を以下の表に示す。

［実施例１１］
Hph-1-ζ鎖によるT細胞活性化の抑制
ζ鎖は、非常に短い細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび長い細胞質側末端からなる16-kDaの分子であり、3つの免疫受容活性化チロシンモチーフ（ITAM）を含む。ζ鎖は通常ホモダイマーとして存在し、TCR複合体の2つのζ鎖上には6つのリン酸化部位またはITAMが存在することになる。CD3ζは、Tリンパ球において膜貫通シグナル伝達分子として機能する。

Hph-1とζ鎖のコンジュゲートを活性化T細胞へ輸送すると、TcR複合体上に存在するζ鎖とそのコンジュゲートが競合するため、ζ鎖のリン酸化が阻害される。

Hph-1-ζ鎖によるT細胞活性化の阻害を調べるために、抗CD3および抗CD28 mAbにより刺激したJurkat T細胞を、Hph-1-ζ鎖により処理し、分泌されたIL-2のレベルをELISAキット（BD Biosciencesカタログ番号555190）を用いて測定した。

抗CD3および抗CD25 mAbにより刺激したJurkat T細胞を96ウェルプレートに2×10⁵細胞の密度にて分配し、次いで各ウェルを10 nMのHph-1-ζ鎖により処理した。プレートを37℃にて一晩インキュベートした。

回収した各ウェルの上清を、4 ng/mlのヒトIL-2に対する抗体により被覆したマイクロウェルプレートに加え、10％FBS含有PBSにより室温にて1時間ブロックし、洗浄した。培地を除去し、1.6 ng/mlのヒトIL-2に対するビオチン化抗体およびアビジン-西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲートを加えて1時間おいた。プレートを0.02％Tween-20含有PBSにより洗浄した後、基質溶液100μlを加えて30分間おいた。反応を止めるために2N H₂SO₄溶液を加え、450 nmにおける吸光度を測定した（図10）。

図10は、Jurkat T細胞へのHph-1-ζ鎖の細胞内輸送により、ナノモーラー単位にてIL-2分泌の誘導が抑制できたことを示す。

図1Aは、β-galまたはeGFPコンジュゲートHph-1-PTD融合タンパク質の構造を示す。Hph-1-PTDは、ヒト転写因子Hph-1から同定した１１アミノ酸のタンパク質導入ドメイン（YARVRRRGPRR）（配列番号1）である。

図1Bは、培養したJurkat（E6.1）T細胞においてウェスタンブロットにより分析したMph-1-β-galの導入活性および動態の写真である。

図1Cは、HeLa、HepG2、HaCatおよびNIH3T3などのいくつかの細胞株におけるHph-1の導入効率の写真である。細胞をHph-1-β-galとともに1時間インキュベーションした後、細胞を固定しX-gal溶液により染色した。次いで蛍光顕微鏡により撮像した。

図1Dは、共焦点顕微鏡により分析したHph-1-FITCの細胞内局在化の写真である。Hph-1-eGFPおよび対照eGFPタンパク質をHeLa細胞とともに1時間インキュベートした後、細胞を固定しDAPIにより染色した。

図1Eは、インビボにおけるHph-1-PTDの導入効率を示す。5mgのHph-1-β-galまたは対照β-galのいずれかを、マウスにi.p注射した。肝臓、腎臓、脾臓、肺、心臓および脳を切除して固定し、それぞれの完全器官（上の列）、薄片（下の列）にX-gal溶液を加えてβ-gal活性について分析した。

図2Aは、皮膚を通した表皮ならびに真皮へのHph-1-PTDの導入を示す。Hph-1-FITCと軟膏剤の混合物を無毛マウスの剥離皮膚に塗布し、2時間おいた。皮膚サンプルを共焦点顕微鏡により蛍光の存在について分析した。

図2Bは、眼の強膜を通した網膜および神経節細胞層へのHph-1-PTD-FITCの輸送を示す。Hph-1-FITC溶液を眼に滴下して30または120分間おいた。共焦点顕微鏡により眼の凍結切片におけるFITC蛍光を調べた。

図2Cは、鼻腔経路によるHph-1-PTD-FITCの導入を示す。FITCコンジュゲートHph-1-PTD溶液を気管内注入により気管および肺へ局所的に輸送した。気管支、肺の血管の内皮領域、および気管支の基底膜においてFITC蛍光を調べた。

図3Aは、Hph-1-ctCTLA-4およびHph-1-ctCTLA-4YF変異体コンストラクトの模式図である。

図3Bは、抗HA-フルオレセインmAbを用いて細胞内染色によって分析した、Jurkat T細胞（表面上にCTLA-4を発現しないことが分かっている）におけるHph-1-ctCTLA-4の導入効率および動態の結果を示す。

図3Cは、抗HA-フルオレセインmAbを用いて細胞内染色によって分析した、Jurkat T細胞（表面上にCTLA-4を発現しないことが分かっている）におけるHph-1-ctCTLA-4の導入効率および動態の結果を示す。

図3Dは、活性化T細胞の表面上におけるCD69およびCD25発現の誘導をHph-1-ct-CTLA-4が抑制することを示す。

図3Eは、活性化T細胞の表面上におけるCD69およびCD25発現の誘導をHph-1-ct-CTLA-4が抑制することを示す。

図3Fは、活性化Jurkat T細胞および初代ヒトCD4^＋T細胞におけるHph-1-ctCTLA-4によるIL-2分泌の抑制を示す。

図3Gは、活性化Jurkat T細胞および初代ヒトCD4^＋T細胞におけるHph-1-ctCTLA-4によるIL-2分泌の抑制を示す。

図4Aは、マウスにおけるHph-1-ctCTLA-4-eGFPの気管内注入後の気管支肺胞細胞への導入を示す。Hph-1-ctCTLA-4-eGFPまたはctCTLA-4-eGFPを鼻腔経路により投与した後、気管支肺胞洗浄（BAL）液中の全BAL細胞またはCD3^＋T細胞におけるeGFPレベルをFACSにより解析した。

図4Bは、マウスにおけるHph-1-ctCTLA-4-eGFPの気管内注入後の気管支肺胞細胞への導入を示す。Hph-1-ctCTLA-4-eGFPまたはctCTLA-4-eGFPを鼻腔経路により投与した後、気管支肺胞洗浄（BAL）液中の全BAL細胞またはCD3^＋T細胞におけるeGFPレベルをFACSにより解析した。

図4Cは、マウスにおけるHph-1-ctCTLA-4-eGFPの気管内注入後の気管支肺胞細胞への導入を示す。Hph-1-ctCTLA-4-eGFPまたはctCTLA-4-eGFPを鼻腔経路により投与した後、気管支肺胞洗浄（BAL）液中の全BAL細胞またはCD3^＋T細胞におけるeGFPレベルをFACSにより解析した。

図4Dは、Hph-1-ctCTLA-4またはHph-1-ctCTLA-4YF変異体により鼻腔内を前処理した後に観察されたBAL液（OVA曝露後）における種々の炎症細胞の数を示す。

図4Eは、Hph-1-ctCTLA-4またはHph-1-ctCTLA-4YF変異体を鼻気道を通して投与した後にELISAにより分析した、OVA誘導性の炎症性サイトカインおよびケモカインのBAL液への分泌レベルを示す。

図4Fは、Hph-1-ctCTLA-4により前処理したOVA曝露マウスにおける気管支周囲の炎症の重症度の半定量分析を示す。

図4Gは、対照マウスおよびHph-1-ctCTLA-4により処置したマウスにおけるOVA曝露後の肺組織の組織学的検査を示す。

図5Aは、メタコリン（MCh）に対する抗原誘導性気道過敏症に対するHph-1-ctCTLA-4の抑制効果を示す。

図5Bは、メタコリン（MCh）に対する抗原誘導性気道過敏症に対するHph-1-ctCTLA-4の抑制効果を示す。

図6は、Tat-ctCTLA-4処理によるIL-2分泌の抑制の結果を示す。

図7は、II型コラーゲンの腹腔内注射により誘導された関節リウマチ動物モデルに対するMph-1-ctCTLA-4の抑制効果を示す。

図8は、II型コラーゲンの腹腔内注射により誘導された関節リウマチ動物モデルに対するMph-1-ctCTLA-4の抑制効果を示す。

図9は、II型コラーゲンの腹腔内注射により誘導された関節リウマチ動物モデルに対するMph-1-ctCTLA-4の抑制効果を示す。

図10は、Hph-1-ζ-鎖処理によるIL-2分泌の抑制の結果を示す。

図11は、皮膚炎スコアにより測定した、Mph-1-ctCTLA4により処置したアトピー性ラットにおける対照ラットと比較した炎症の抑制を示す。

図12は、経皮水分損失量（TEWL）（g/m².H）により測定した、Mph-1-ctCTLA4により処置したアトピー性ラットにおける対照ラットと比較した炎症の抑制を示す。

Claims (33)

1. 自己免疫疾患または炎症性疾患に罹患した脊椎動物におけるT細胞活性化を抑制する方法であって、前記脊椎動物にタンパク質導入ドメイン（PTD）および受容体タンパク質の細胞質ドメインを含む融合ポリペプチドの治療上有効量を投与することを含む方法。
2. 自己免疫疾患が以下からなる群から選択される、請求項１に記載の方法：関節リウマチ、変形性関節症、反応性関節炎、乾癬性関節炎、枯草熱、アトピー、多発性硬化症、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インスリン依存性糖尿病、自己免疫性甲状腺炎、強直性脊椎炎および強皮症。
3. 炎症性疾患が喘息である、請求項１に記載の方法。
4. タンパク質導入ドメインが転写因子に由来する、請求項１に記載の方法。
5. タンパク質導入ドメインが配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の方法。
6. タンパク質導入ドメインが、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法：
   （ｉ） 配列番号2；
   （ｉｉ） 配列番号3；
   （ｉｉｉ） 配列番号4；
   （ｉｖ） 配列番号5；
   （ｖ） 配列番号6；
   （ｖｉ） 配列番号7；
   （ｖｉｉ） 配列番号8；
   （ｖｉｉｉ）配列番号9；および
   （ｉｘ） 配列番号10。
7. 受容体タンパク質の細胞質ドメインが以下からなる群から選択される、請求項１に記載の方法：ctCTLA 4（配列番号11）、ζ鎖（配列番号12）、ITAM A（配列番号13）、ITAM B（配列番号14）、ITAM C（配列番号15）およびPD-1（配列番号16）。
8. 受容体タンパク質の細胞質ドメインが配列番号11のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
9. 受容体タンパク質の細胞質ドメインが、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法：ζ鎖（配列番号12）、ITAM A（配列番号13）、ITAM B（配列番号14）、ITAM C（配列番号15）およびPD-1（配列番号16）。
10. 融合ポリペプチドをピコモーラー濃度にて投与する、請求項１に記載の方法。
11. 受容体タンパク質の細胞質ドメインが、配列番号11のアミノ酸配列に対して少なくとも95％同一である、請求項１に記載の方法。
12. 受容体タンパク質の細胞質ドメインが、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも95％同一である、請求項１に記載の方法：ζ鎖（配列番号12）、ITAM A（配列番号13）、ITAM B（配列番号14）、ITAM C（配列番号15）およびPD-1（配列番号16）。
13. 融合ポリペプチドを静脈内投与する、請求項１に記載の方法。
14. 脊椎動物における移植片拒絶を抑制する方法であって、タンパク質導入ドメイン（PTD）および受容体タンパク質の細胞質ドメインを含む治療上有効量の融合ポリペプチドを脊椎動物に投与することを含み、移植片拒絶が膵島移植におけるものである方法。
15. タンパク質導入ドメインが転写因子に由来する、請求項１４に記載の方法。
16. タンパク質導入ドメインが配列番号1のアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の方法。
17. タンパク質導入ドメインが、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の方法：
    （ｉ） 配列番号2；
    （ｉｉ） 配列番号3；
    （ｉｉｉ） 配列番号4；
    （ｉｖ） 配列番号5；
    （ｖ） 配列番号6；
    （ｖｉ） 配列番号7；
    （ｖｉｉ） 配列番号8；
    （ｖｉｉｉ）配列番号9；および
    （ｉｘ） 配列番号10。
18. 受容体タンパク質の細胞質ドメインが配列番号11のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の方法。
19. 受容体タンパク質の細胞質ドメインが配列番号12のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の方法。
20. 融合ポリペプチドをピコモーラー濃度にて投与する、請求項１４に記載の方法。
21. 受容体タンパク質の細胞質ドメインが、配列番号11のアミノ酸配列に対して少なくとも95％同一である、請求項１４に記載の方法。
22. 受容体タンパク質の細胞質ドメインが、配列番号12のアミノ酸配列に対して少なくとも95％同一である、請求項１４に記載の方法。
23. 融合ポリペプチドを腹腔内投与する、請求項２２に記載の方法。
24. 生体分子導入複合体（BTC）を気管または肺細胞へ輸送する方法であって、生体分子導入複合体を脊椎動物へ鼻腔内投与することを含み、 生体分子導入複合体がタンパク質導入ドメイン（PTD）および目的分子を含む方法。
25. 生体分子導入複合体を気管内注入により投与する、請求項２４に記載の方法。
26. 生体分子導入複合体が、転写因子に由来するタンパク質導入ドメインを含む、請求項２４に記載の方法。
27. タンパク質導入ドメインが配列番号1のアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載の方法。
28. タンパク質導入ドメインが、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の方法：
    （ｉ） 配列番号2；
    （ｉｉ） 配列番号3；
    （ｉｉｉ） 配列番号4；
    （ｉｖ） 配列番号5；
    （ｖ） 配列番号6；
    （ｖｉ） 配列番号7；
    （ｖｉｉ） 配列番号8；
    （ｖｉｉｉ）配列番号9；および
    （ｉｘ） 配列番号10。
29. 目的分子が受容体タンパク質の細胞質ドメインである、請求項２４に記載の方法。
30. 受容体タンパク質の細胞質ドメインが以下からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法：ctCTLA 4（配列番号11）、ζ鎖（配列番号12）、ITAM A（配列番号13）、ITAM B（配列番号14）、ITAM C（配列番号15）およびPD-1（配列番号16）。
31. 目的分子が以下からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法：
    （ｉ） eGFP（配列番号17）；および
    （ｉｉ）β-gal（配列番号18）。
32. 目的分子が配列番号11のアミノ酸配列に対して少なくとも95％同一である、請求項２４に記載の方法。
33. 目的分子が以下からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも95％同一である、請求項２４に記載の方法：ζ鎖（配列番号12）、ITAM A（配列番号13）、ITAM B（配列番号14）、ITAM C（配列番号15）およびPD-1（配列番号16）。

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