KR20080084937A

KR20080084937A - 융합 폴리펩타이드를 세포로 전달하는 방법

Info

Publication number: KR20080084937A
Application number: KR1020087013498A
Authority: KR
Inventors: 이상규; 이승규; 최제민
Original assignee: 포휴먼텍(주)
Priority date: 2005-11-04
Filing date: 2006-11-03
Publication date: 2008-09-22
Also published as: ATE478676T1; WO2007052172A3; EP1942925B1; US20070105775A1; WO2007052172A2; CN101355957A; WO2007052172A8; JP2010509181A; EP1942925A2; DE602006016468D1; EP1942925A4; US7723299B2

Abstract

본 발명은 융합 폴리펩타이드를 세포 내로 전달하는 방법에 관한 것이다. 융합 폴리펩타이드를 예를 들면 피부, 눈 및 기도를 통해 국소 전달하여 알레르기성 염증과 기도 과-반응성을 방지하고 T 세포 활성화를 차단하는 방법이 제공된다. 또한 융합 폴리펩타이드를 전달하여 이식편 거부를 억제하는 방법이 제공된다.

생체분자 전달 복합체, 융합 폴리펩타이드, 단백질 전달 도메인.

Description

융합 폴리펩타이드를 세포로 전달하는 방법{METHODS FOR FUSION POLYPEPTIDE DELIVERY INTO A CELL}

본 발명은 생체분자 전달 복합체(BTC), 예를 들면 융합 폴리펩타이드를 세포로 전달하는 방법에 관한 것이다. 생체분자 전달 복합체(BTC)는 단백질 전달 도메인(PTD)과 대상 분자, 예를 들면 폴리펩타이드를 포함한다.

일반적으로, 살아있는 세포는 단백질과 핵산과 같은 거대 분자에 대해서 불투과성이다.　 작은 물질들만이 매우 낮은 비율로 살아있는 세포의 세포막을 통과할 수 있다는 사실은, 단백질 또는 핵산과 같은 거대분자를 이용하여 질병을 치료, 예방 및 진단하는 약제를 개발하고자 하는 연구에 대한 제한 요인이 되고 있다.　 따라서, 생물학적 활성 거대분자를 해로운 부작용 없이 살아있는 세포의 사이토졸과 핵으로 효과적으로 전달하는 방법이 요구된다.

단백질 전달 도메인(PTD)은 생물학적 활성 분자의 전달에 이용되어 왔다 [빌(Viehl C.T.) 등, Ann. Surg. Oncol. 12:517-525 (2005); 노구치(Noguchi H.) 등, Nat. Med. 70:305-309 (2004); 및 후(Fu A.L.) 등, Neurosci. Lett. 355:258- 62 (2004)]. 그러나, 수용체 단백질의 세포질 도메인을 전달하는 방법으로서 PTD를 이용하고자 한 시도는 없었다. 또한 생물학적 분자를 이용하여 PTD를 비강내 전달시키고자 한 시도도 없었다.

CTLA-4(세포독성 T 림프구 항원-4)는 T-세포 상의 활성화-유도된 표면 분자이고, T-세포 활성화의 부정적 조절에 필수적이다. 이는 T 세포 활성화에 대한 긍정적 보조-자극 분자인 CD28에 비해 10 내지 20배 더 높은 친화도로 항원 제시 세포(antigen presenting cells: APC) 상의 B7-1 또는 B7-2에 결합한다[곡(Ngoc L.P.) 등, Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 5:161-166 (2005); 노엘(Noel P.J.) 등, Adv. Exp. Med. Biol. 406:209-217 (1996); 및 퍼킨스(Perkins D.) 등, J. Immunol. 156:4154- 4159 (1996)].

면역수용체 타이로신-계 억제 모티프(ITIM)를 함유하는 CTLA-4의 세포질 도메인은 여러가지 다른 종들 사이에서 100% 보존되는 것으로 발견되어 왔고, 이러한 사실로부터 이 도메인이 세포내 신호 분자를 포획함으로써 T 세포 상의 CTLA-4의 부정적 조절에 중요한 것으로 제안된다[라베치(Ravetch, J.V.) 및 라니어(Lanier, L.L.), Science 290:84-89 (2000); 및 제이(Jay, C.U.) 및 지(Jie, J.), Curr. Opin. Immunol. 9:338-343 (1997)]. 따라서, CTLA-4의 세포질 도메인은 천식, 자가면역 질환 및 이식 거부에 대한 면역치료제의 개발에 있어 탁월한 분자 대상이다. 이제까지, PTD를 이용하여 수용체 단백질, 특히 CTLA-4를 세포로 전달하고자 하는 시도는 어려웠다. 본 발명자들은 이제 단지 수용체 단백질의 세포질 도메인을 PTD와 융합시킴으로써 CTLA-4를 PTD의 짐(cargo)으로서 전달하는 방법을 제시하 고자 한다. CTLA-4의 세포질 도메인은 활성화된 T 세포에 특이적이고, 따라서 PTD의 짐 단백질로서 이용되는 경우, 양이온성 PTD의 생체내 이용성을 제한하는 단점인 조직 특이성 결핍 문제가 해결된다.

발명의 요약

본 발명의 한가지 목적은 단백질 전달 도메인과 수용체 단백질의 세포질 도메인을 포함하는 융합 단백질 치료 효과량을 자가면역 질환 또는 염증 질환으로 고통받는 척추동물에 투여함을 포함하는, 상기 척추동물에서 T 세포 활성화를 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적은 생체분자 전달 복합체(BTC)를 척추동물로 비강내 투여함을 포함하는, 생체분자 전달 복합체를 기관지 또는 폐 세포로 전달하는 방법을 제공하는 것이다. 생체분자 전달 복합체는 단백질 전달 도메인(PTD)과 대상 분자를 포함한다.

다른 바람직한 실시양태는 PTD의 짐 단백질로서 활성화된 T 세포에 특이적인 CTLA-4의 세포질 도메인(서열 번호: 11)을 이용하는 것이다. PTD-ctCTLA-4 융합 단백질을 이용하면 양이온성 PTD의 생체내 이용성을 제한하는 단점이었던 이의 조직 특이성 결핍 문제를 극복할 수 있다.

본 발명은 높은 세포 또는 조직 특이성을 갖는 Hph-1과 같은 일부 단백질의 단백질 전달 도메인을 포함하는 새로운 치료 단백질 약물의 개발을 가능하게 한다. 본 발명은 또한 생성된 융합 폴리펩타이드를 국소 투여 경로를 통해 투여하는 것을 가능하게 함으로써, 행동 이상, 세포독성 및 면역원성과 같은 전신 부작용을 최소화시키거나 피할 수 있게 한다.

도 1A는 Hph-1-PTD β-gal 또는 eGFP 컨쥬게이트된 융합 단백질의 구조를 보여준다. Hph-1-PTD는 인간 전사 인자 Hph-1으로부터 확인된 11개 아미노산으로 구성된 단백질 전달 도메인이다(YARVRRRGPRR)(서열 번호: 1).

도 1B는 배양된 저캣(Jurkat)(E6.1) T 세포에서의 웨스턴 블럿에 의해 분석된 Mph-1-β-gal의 전달 활성 및 동력학을 보여주는 사진이다.

도 1C는 HeLa, HepG2, HaCat 및 NIH3T3을 포함하는 여러 세포 주에서 Hph-1 의 전달 효율을 보여주는 사진이다. Hph-1-β-gal과 함께 1시간동안 배양한 후, 세포를 고정시키고 X-gal 용액으로 염색하였다. 그런 다음, 형광 현미경으로 상을 찍었다.

도 1D는 공초점 현미경에 의해 분석된, Hph-1-FITC의 세포내 국소화를 보여주는 사진이다. Hph-1-eGFP와 대조용 eGFP 단백질을 HeLa 세포와 함께 1시간동안 배양하고, 세포를 고정시키고, DAPI로 염색시켰다.

도 1E는 Hph-1-PTD의 생체내 전달 효율을 보여준다. 각각 5mg의 Hph-1-β-gal 또는 대조용 β-gal을 마우스에 복강내 주사하였다. 간, 신장, 비장, 폐, 심장 및 뇌를 절제하고, 고정시키고, X-gal 용액을 첨가하여 각각의 전체 기관(상부 열) 및 얇은 절편(바닥 열)의 β-gal 활성을 분석하였다.

도 2A는 피부를 통해 표피 뿐만 아니라 진피로 Hph-1-PTD를 전달할 수 있음을 보여준다. Hph-1-FITC와 연고의 혼합물을 무모(hairless) 마우스의 벗겨진 피부에 2시간동안 도포하였다. 공초점 현미경을 이용하여 형광 물질의 존재에 대해 피부 시료를 분석하였다.

도 2B는 Hph-1-PTD-FITC가 눈의 공막을 통해 망막과 신경절 세포 층으로 전달되는 것을 보여준다. Hph-1-FITC 용액을 30분 또는 120분동안 눈에 떨어뜨린다. 공초점 현미경을 이용하여 눈의 냉동 절편에서 FITC 형광을 조사하였다.

도 2C는 비강 경로를 통한 Hph-1-PTD-FITC의 전달을 보여준다. 기관지 내 주입에 의해 FITC 컨쥬게이트된 Hph-1-PTD 용액을 기관지와 폐로 국소 전달하였다. 기관지와 폐의 혈관 내피 영역 그리고 기관지의 기저막에서 FITC 형광을 조사하였다.

도 3A는 Hph-1-ctCTLA-4 및 Hph-l-ctCTLA-4YF 돌연변이 구축물의 개략도이다.

도 3B 및 3C는 (표면에서 CTLA-4를 발현하지 않는 것으로 알려진) 저캣 T 세포에서의 Hph-1-ctCTLA-4의 전달 효율과 동력학 결과를 보여주는데, 항-HA-플루오레세인 mAb를 이용한 세포내 염색에 의해 이를 분석하였다.

도 3D 및 3E는 Hph-1-ctCTLA-4가 활성화된 T 세포의 표면 상에서 CD69 및 CD25 발현의 유도를 억제함을 보여준다.

도 3F 및 3G는 활성화된 저캣 T 세포와 1차(primary) 인간 CD4⁺ T 세포에서 Hph-1-ctCTLA-4에 의한 IL-2 분비의 억제를 보여준다.

도 4A 내지 4C는 마우스에서 기관내 주입 후에 기관지 폐포 세포로 Hph-l-ctCTLA-4-eGFP가 전달됨을 보여준다. Hph-l-ctCTLA-4-eGFP 또는 ctCTLA-4-eGFP를 비강 경로를 통해 투여한 후, 총 기관지폐포 세척(BAL) 세포 중의 eGFP 수준 또는 BAL 유체 중의 CD3⁺ T 세포의 수준을 FACS에 의해 분석하였다.

도 4D는 Hph-l-ctCTLA-4 또는 Hph-1-ctCTLA-4YF 돌연변이체로 비강내 전처리한 후에 관찰된 BAL 유체(OVA 항원투여 시험 후) 중의 다양한 염증 세포의 수를 보여준다.

도 4E는 비강 기도를 통해 Hph-1-ctCTLA-4 또는 Hph-1-ctCTLA-4YF 돌연변이체를 투여한 후 ELISA에 의해 분석된, OVA-유도된 염증성 사이토카인과 케모카인의 BAL 유체로의 분비 수준을 보여준다.

도 4F는 Hph-1-ctCTLA-4로 전처리된 OVA-항원투여된 마우스에서 말단기관지 염증의 심각성에 대한 반-정량 분석을 보여준다.

도 4G는 Hph-1-ctCTLA-4로 처리된 마우스와 대조군 마우스에서 OVA-항원투여 후의 폐 조직의 조직학 검사 결과를 보여준다.

도 5A 및 5B는 메타콜린(MCh)에 대한 항원-유도된 기도 과-반응성에 대한 Hph-1-ctCTLA-4의 억제 효과를 보여준다.

도 6은 Tat-ctCTLA-4 처리에 의한 IL-2 분비 억제 결과를 보여준다.

도 7 내지 도 9는 제2형 콜라겐의 복강내 주사에 의해 유도된 류마티스 관절 염 동물 모델에 미치는 Mph-l-ctCTLA-4의 억제 효과를 보여준다.

도 10은 Hph-1-ζ쇄 처리에 의해 IL-2 분비가 억제되는 결과를 보여준다.

도 11은 피부염 점수로 측정된, 대조군 래트에 비해 Mph-l-ctCTLA4로 처리된 아토피 래트에서 염증이 억제됨을 보여준다.

도 12는 g/m².H 단위로 표현되는 표피를 통한 물의 손실(TEWL) 양에 의해 측정되는 바와 같은, 대조군 래트와 비교하였을 때 Mph-l-ctCTLA4로 처리된 아토피 래트에서 감염이 억제됨을 보여준다.

본 발명은 단백질 전달 도메인(PTD)와 대상 분자, 예를 들면 폴리펩타이드를 포함하는 생체분자 전달 복합체(BTC)를 전달하는 방법을 제공한다. PTD는 전신 또는 국소 투여에 의해 대상 분자를 세포로 생체내 및 생체외 전달 또는 흡수시키는 것을 효과적으로 가능하게 한다. 투여 경로는 근육내, 복강내, 정맥내, 경구, 비강, 피하, 피내, 점막 및 흡입 경로를 포함한다. 본 발명은 생성된 융합 폴리펩타이드가 국소 투여 경로를 통해 투여되는 것을 가능하게 하고, 이에 의해 전신 독성을 최소화시킨다.

한 실시양태는 인간 전사 인자인 Hph-1에서 나온 PTD인 Hph-1-PTD(YARVRRRGPRR) (서열 번호: 1)의 사용을 포함한다. 다른 실시양태는 마우스 전사 인자인 Mph-1의 PTD(YARVRRRGPRR)(서열 번호: 2), Sim-2의 PTD(AKAARQAAR)(서열 번호: 3), HIV-1 바이러스 단백질 Tat의 PTD(YGRKKRRQRRR)(서열 번호: 4), 초파리의 안테나페디아(Antennapedia) 단백질(Antp)의 PTD(RQIKIWFQNRRMKWKK)(서열 번호: 5), HSV-I 구조 단백질 Vp22의 PTD(DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE)(서열 번호: 6), G 단백질 신호 R7의 조절자의 PTD(RRRRRRR)(서열 번호: 7), MTS의 PTD(AAVALLPAVLLALLAPAAADQNQLMP)(서열 번호: 8), 및 짧은 양친매성 펩타이드 담체 Pep-1의 PTD(KETWWETWWTEWSQPKKKRKV)(서열 번호: 9) 및 Pep-2의 PTD(KETWFETWFTEWSQPKKKRKV)(서열 번호: 10)를 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다.

PTD에 연결된 바람직한 폴리펩타이드는 수용체 단백질의 세포질 도메인일 수 있다. PTD의 짐 단백질로서 수용체 단백질의 세포질 도메인을 이용하는 본 발명은 양이온성 PTD의 생체내 이용성을 제한하는 단점인 조직 특이성의 결핍 문제를 해결한다. 본 발명의 한 양태는 대상 단백질, 예를 들면 ctCTLA-4(서열 번호: 11) 및 ζ-쇄(이는 또한 제타 또는 z쇄로도 언급된다)(서열 번호: 12)에 융합된 PTD를 포함하는 새로운 치료제의 개발을 가능하게 한다. ζ-쇄는 T 세포 수용체의 세포질 도메인이고, 이는 3개의 면역수용체 타이로신계 활성 모티프(ITAM)를 함유한다. 이는 3쌍의 타이로신 잔기의 동종이량체로서 존재한다. 3쌍은 본 발명에서 A1A2(서열 번호: 13), B1B2(서열 번호: 14) 및 C1C2(서열 번호: 15) 도메인으로 언급된다. 본 발명의 수용체 단백질의 세포질 도메인은 전체 ζ-쇄, 타이로신 잔기중 한 쌍(즉, A1A2, B1B2 또는 C1C2)을 함유하는 개별적인 ITAM 또는 도메인중 둘의 임의의 조합, 즉 A1A2-B1B2, A1A2-C1C2 또는 BlB2-ClC2일 수 있다.

PTD에 연결될 수 있는 다른 대상 단백질은 PD-1(프로그래밍된 죽음-1 수용체)의 세포질 도메인(서열 번호: 16)이다.

일부 실시양태에서, PTD에 연결된 목적하는 폴리펩타이드는 수용체 단백질, 예를 들면 eGFP(서열 번호: 17) 또는 β-Gal(서열 번호: 18)이다.

상기 언급된 단백질의 아미노산 서열은 다음과 같다:

수용체 단백질의 세포질 도메인은 당분야의 숙련자에게 공지된 일상적인 방법을 이용하여 PTD에 융합될 수 있다. 생성된 치료용 융합 폴리펩타이드는 피코몰의 농도에서 IL-2의 생산과 같은 활성화-유도된 표면 단백질의 유도를 효과적으로 억제할 수 있다.

정의

본원에서 사용되는 용어 "세포질 도메인" 또는 "세포질 부분"은 호환될 수 있고, 대상 폴리펩타이드 또는 단백질의 전체 세포질 도메인 또는 세포질 도메인의 일부를 의미한다. 본 발명은 PTD에 융합된 대상 폴리펩타이드 또는 단백질의 세포질 도메인만으로 제한되지 않고, 실제로 대상 폴리펩타이드 또는 단백질의 다른 도메인 또는 부분 또한 PTD에 융합될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "폴리펩타이드"는 단수형과 복수형을 모두 포함하고자 하며, 펩타이드 결합에 의해 함께 연결된 2개 이상의 임의의 아미노산의 쇄를 포함한다. 따라서 본원에서 사용되는 "펩타이드", "다이펩타이드", "트라이펩타이드", "단백질", "아미노산 쇄", "올리고펩타이드", "올리고머" 또는 2개 이상의 아미노산의 쇄를 의미하기 위해 사용되는 임의의 다른 용어를 포함하지만 이들로 한정되지는 않는 용어는 "폴리펩타이드"의 정의에 포함되고, 용어 "폴리펩타이드"는 이들 임의의 용어 대신 또는 이들과 호환성 있게 사용될 수 있다. 상기 용어는 또한 번역후 개질, 예를 들면 글라이코실화, 아세틸화, 포스포릴화, 아미드화, 공지된 보호/블록킹 기에 의한 유도체화, 단백질분해 분리, 또는 비-천연 아미노산에 의한 개질을 거친 폴리펩타이드를 추가로 포함한다. 용어 "단백질"은 또한 기준 단백질과 본질적으로 동일한 생물학적 활성 또는 기능을 보유하는 단백질의 단편, 동족체 및 유도체를 포함한다.

단백질의 "단편, 유도체 및 동족체"는 (i) 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존되거나 비-보존된 아미노산 잔기(바람직하게는 보존된 아미노산 잔기)로 치환되고, 이런 치환된 아미노산 잔기가 유전자 코드에 의해 암호화될 수 있거나 될 수 없는 것; 또는 (ii) 아미노산 잔기중 하나 이상이 치환기를 포함하는 것; 또는 (iii) 성숙한 폴리펩타이드가 다른 화합물, 예를 들면 폴리펩타이드의 반감기를 증가시키는 화합물(예를 들면 폴리에틸렌 글리콜)에 융합되어 있는 것; 또는 (iv) 추가의 아미노산, 예를 들면 폴리펩타이드의 정제에 이용되는 리더(leader) 또는 분비 서열이 성숙된 폴리펩타이드에 융합되어 있는 것일 수 있다. 이런 단편, 유도체 및 동족체는 본원에 개시된 양태로부터 당분야의 숙련자가 인지하고 있는 범위 이내인 것으로 간주된다.

여러, 예를 들면 5 내지 10, 1 내지 5, 1 내지 3, 2 또는 1개의 아미노산 잔기가 임의의 조합으로 치환되거나, 결실되거나, 첨가된 단백질의 아미노산 서열을 갖는 변이체, 동족체, 유도체 및 단편이 특히 바람직하다. 이들 중에서 본 발명의 단백질의 성질 및 활성을 변화시키지 않는 침묵 치환, 추가 및 결실이 특히 바람직하다. 이런 면에서 보존성 치환이 또한 특히 바람직하다.

본 발명의 변이체의 예는, 하나 이상의 다른 아미노산을 사용한 하나 이상의 아미노산의 치환을 별개로 하고, 상기 정의된 바와 같은 융합 단백질이다. 당 분야의 숙련자는 다양한 아미노산이 유사한 성질을 갖고 있음을 알고 있다. 물질의 하나 이상의 이런 아미노산은 종종 물질의 바람직한 활성을 없애지 않고 하나 이상의 다른 이런 아미노산으로 치환될 수 있다.

따라서, 아미노산인 글라이신, 알라닌, 발린, 류신 및 아이소류신은 종종 서로 치환될 수 있다(지방족 측쇄를 갖는 아미노산). 이들 가능한 치환중에서 글라이신과 알라닌이 서로에 대해 치환되도록 사용되고(이들이 비교적 짧은 측쇄를 갖고 있기 때문에), 발린, 류신과 아이소류신이 서로에 대해 치환되도록 사용되는(이들이 소수성인 더 큰 지방족 측쇄를 갖고 있기 때문에) 것이 바람직하다. 서로에 대해 종종 치환될 수 있는 다른 아미노산은 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판(방향족 측쇄를 갖는 아미노산); 라이신, 아르기닌 및 히스티딘(염기성 측쇄를 갖는 아미노산); 아스파테이트와 글루타메이트(산성 측쇄를 갖는 아미노산); 아스파라긴과 글루타민(아미드 측쇄를 갖는 아미노산); 및 시스테인과 메티오닌(황 함유 측쇄를 갖는 아미노산)을 포함한다. 이 성질의 치환은 종종 "보존성" 또는 "반-보존성" 아미노산 치환으로 언급된다.

용어 "생체분자 전달 복합체" 또는 BTC는 PTD와 대상 분자의 복합체를 의미한다. 대상 분자는 단백질, 핵산, 지질, 탄수화물 또는 화학적 화합물일 수 있다. 대상 분자가 단백질인 경우, BTC는 또한 융합 단백질 또는 융합 폴리펩타이드로 언급된다.

본원에서 사용되는 용어 "융합 단백질", "융합 폴리펩타이드", "키메라 단백질" 및 "키메라 폴리펩타이드"는 호환될 수 있고, 대상 폴리펩타이드 또는 단백질과 PTD를 포함하는 폴리펩타이드 및 단백질을 의미한다.

용어 "대상 단백질", "목적하는 폴리펩타이드", "목적하는 단백질" 또는 "목표 단백질"은 본원에서 호환될 수 있고, 전체 단백질 분자 또는 이의 일부, 즉, 단백질의 세포질 도메인 또는 다른 도메인을 의미한다. 폴리펩타이드 또는 단백질의 세포질 도메인 또는 다른 부분은 세포 반응을 유도할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "치료제"는, 척추동물로 전달되었을 때, 그 척추동물을 치료, 즉 주어진 질병 또는 증후(예를 들면 이식 거부)의 증상을 치료, 경감 또는 감소시키거나, 또는 다르게는 말기 질병 또는 증후의 진행을 느리게 함으로써 척추동물의 수명을 연장시킬 수 있는 분자, 예를 들면 단백질, 지질, 탄수화물, 핵산 또는 화학적 화합물을 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "치료용 융합 폴리펩타이드"는 척추동물로 전달되었을 때 그 척추동물을 치료, 즉 주어진 질병 또는 증후(예를 들면 이식 거부)의 증상을 치료, 경감 또는 감소시키거나, 또는 다르게는 말기 질병 또는 증후의 진행을 느리게 함으로써 척추동물의 수명을 연장시킬 수 있는 폴리펩타이드를 의미한다.

폴리펩타이드

본 발명의 치료용 폴리펩타이드는 사이토카인, 케모카인, 림포카인, 리간드, 수용체, 호르몬, 세포사멸-유도 폴리펩타이드, 효소, 항체 및 성장 인자를 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 예는 세포독성 T-림프구-관련된 단백질 4(ctCTCA-4)의 세포질 도메인, zA1A2의 세포질 도메인, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF), 콜로니 자극 인자(CSF), 인터루킨 2(IL-2), 인터루킨-3(IL-3), 인터루킨 4(IL-4), 인터루킨 5(IL-5), 인터루킨 6(IL-6), 인터루킨 7(IL-T), 인터루킨 8(IL-8), 인터루킨 10(IL-IO), 인터루킨 12(IL-12), 인터루킨 15(IL-15), 인터루킨 18(IL-18), 인터페론 알파(IFNα), 인터페론 베타(IFNβ), 인터페론 감마(IFNγ), 인터페론 오메가(IFNω), 인터페론 타우(IFNτ), 인터페론 감마 유도 인자 I(IGIF), 형질전환 성장 인자 베타(TGF-β), RANTES(활성화시 조절되고, 정상 T 세포 발현되고 아마도 분비된), 대식세포 염증 단백질(예를 들면, MIP-I 알파 및 MIP-I 베타), 레이쉬마니아(Leishmania) 연장 개시 인자(LEIF), 혈소판 유래된 성장 인자(PDGF), 종양 괴사 인자(TNF), 성장 인자, 예를 들면 표피 성장 인자(EGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 신경 성장 인자(NGF), 뇌 유래된 향신경성 인자(BDNF), 뉴로트로핀-2(NT-2), 뉴로트로핀-3(NT-3), 뉴로트로핀-4(NT-4), 뉴로트로핀-5(NT-5), 신경교 세포주-유래된 향정신성 인자(GDNF), 모양체 향정신성 인자(CNTF), 에리쓰로포이에틴(EPO) 및 인슐린을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다.

본 발명의 치료용 융합 폴리펩타이드를 이용하여 파킨슨병, 암 및 심장 질병과 같은 질병을 치료할 수 있다. 또한, 치료용 폴리펩타이드를 이용하여 자가면역 질환, 예를 들면 다발성 경화증; 소그렌 증후군; 유육종증; 인슐린 의존성 당뇨병; 자가면역 갑상선염; 관절염, 예를 들면 골관절염, 류마티스 관절염, 반응성 관절염 및 건선 관절염; 강직성 척추염; 및 피부 경화증을 치료할 수 있다. 또한, 본 발명의 치료용 폴리펩타이드를 이용하여 급성 및 만성 염증 질환(예를 들면 천식)을 치료하고, 상처 치료를 촉진시키고, 세포, 조직 또는 기관의 이식(예를 들면 섬 이식) 후 이식 거부반응을 예방할 수 있다.

본 발명의 치료용 융합 폴리펩타이드, 예를 들면 향정신성 인자(NTF)를 이용하여 뇌, 척수 및 말단 신경에서 세포의 생존, 유지, 분화, 보수, 재생 및 성장을 촉진할 수 있다. 적합한 NTF는 NGF, BDNF, 뉴로트로핀, 또는 NT, 예를 들면 NT-2, NT-3, NT-4, NT-5, GDNF, CNTF, 및 다른 것들을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 정제된 재조합 NTF의 투여는 이러한 급성 및 만성 신경계 질환의 치료를 위한 임상 전략을 대표한다. 이런 질환은 기계적 또는 화학적 뇌 또는 척수 손상, 파킨슨병, 알츠하이머병 및 다른 치매, 근위축성 측삭 경화증 및 다발성 경화증을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다.

본 발명의 치료용 융합 폴리펩타이드, 예를 들면, 성장 인자를 이용하여 상처 치료를 촉진시킬 수 있다. 유용한 성장 인자는 FGF 및 EGF를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

본 발명의 치료용 융합 폴리펩타이드를 이용하여 세포 자살("세포사멸"로 일컬어짐)을 촉진할 수 있다. 적합한 세포사멸 폴리펩타이드는 BAX 단백질을 포함한다. 다르게는, 본 발명의 치료용 융합 폴리펩타이드를 이용하여 세포사멸을 방지할 수 있다. 적합한 세포사멸 길항물질은 BAX 길항물질 Bcl-2를 포함한다. 세포사멸-억제 폴리펩타이드를 이용하여 치료될 수 있는 질병은 근위축증(MD)이고, 여기서 환자는 다이스트로핀(Dystrophin)이라 불리는 결함 단백질을 갖고 있다. 다이스트로핀은 적절한 근육 기능에 요구된다. 결함이 없는 정상 다이스트로핀이 플라스미드 DNA를 통해 MD 환자에게 전달되는 경우 항원으로 작용할 수 있다. 이 경우, 정상 다이스트로핀을 암호화하는 DNA가 형질도입된 근육 세포는 면역계에 의해 인식되고 다이스트로핀-특이적 T 세포계 반응에 의해 죽는다. 이런 T 세포에 근거한 죽음은 세포사멸을 유도함으로써 세포를 죽이는 것으로 알려져 있다. 정상적이고 잠재적으로 면역원성인 다이스트로핀이 Bcl-2 또는 다른 세포사멸 방지 단백질과 함께 근육 세포로 전달될 수 있는 경우, CTL이 근육 세포를 죽일 수 없을 것으로 예상된다. 이 추론은 치료가 "정상", 따라서 잠재적으로 면역원성인 단백질의 복사물의 전달을 포함하는 많은 유전적 질병에 적용된다.

본 발명의 폴리펩타이드로서 전술된 폴리펩타이드의 단편, 유도체, 동족체 또는 변이체 및 이의 임의의 조합이 또한 포함된다. 본 발명의 폴리펩타이드 및 이의 단편, 유도체, 동족체 또는 변이체는 항원성 및 면역원성 폴리펩타이드일 수 있고, 이는 질병의 예방 또는 치료, 즉 질병을 치료하거나, 약화시키거나, 심각성을 감소시키거나, 예방하거나, 감소시킨다.

본 발명의 추가의 실시양태는 전술된 폴리펩타이드의 아미노산 서열중 임의의 것에 95% 이상, 보다 바람직하게는 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다.

실제적인 문제로서, 임의의 특정한 폴리펩타이드가 예를 들면 서열번호 11 내지 18에 도시된 아미노산 서열과 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한지의 여부는 공지된 컴퓨터 프로그램, 예를 들면 베스트핏 프로그램(Bestfit program)(위스콘신주 53711 매디슨 유니버시티 리써치 파크 575 사이언스 드라이브 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹, 유닉스용 버젼 8, 위스콘신 서열 분석 패키지(Wisconsin Sequence Analysis Package))을 이용하여 결정될 수 있다. 베스트핏은 스미쓰(Smith)와 와터만(Waterman)의 문헌[Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)]의 국소 동종성 알고리듬을 이용하여 2개의 서열 사이에서 최상의 동종성을 갖는 분획을 발견한다. 베스트핏 또는 임의의 다른 서열 정렬 프로그램을 이용하여 특정한 서열이 예를 들면 본 발명의 따른 기준 서열과 95% 동일한지의 여부를 결정하는 경우, 변수는 물론 동일성 백분율이 기준 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 계산되고 기준 서열의 총 아미노산 수의 5% 이하의 동종성 차이가 허용되도록 설정된다.

폴리뉴클레오타이드

또한, 본 발명은 융합 단백질 또는 키메라 단백질, 재조합 발현 벡터, 플라스미드 및 이를 함유하는 다른 폴리뉴클레오타이드 구축물(집합적으로 "발현 벡터"로 언급된다)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 이들 발현 벡터로 형질전환된 미생물, 및 이들 폴리뉴클레오타이드를 수득하는 방법 및 상기 벡터를 이용하여 형질전환된 세포에 관한 것이다. 적합한 숙주 세포는 발현 벡터로 형질전환될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "발현 벡터"는 유전 물질(즉, 핵산)로 구성된 구축물을 의미한다. 전형적으로, 발현 벡터는 박테리아 숙주 세포, 예를 들면 대장균에서 작용하는 복제 기원 및 발현 벡터를 포함하는 박테리아 숙주 세포를 검출하기 위한 선택적 마커(marker)를 함유한다. 본 발명의 발현 벡터는 프로모터 서열을 함유하고 삽입된 암호화 서열이 진핵세포에서 전사되고 번역될 수 있도록 본원에 개시된 바와 같이 배열된 유전 요소를 포함한다. 본원에 개시된 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 닫힌 환상 DNA 분자이다.

용어 "발현"은 암호화 서열에 의해 암호화되는 생성물의 생물학적 생산을 의미한다. 대부분의 경우, 암호화 서열을 포함하는 DNA 서열은 전사되어 m-RNA를 형성한다. 그런 다음 m-RNA는 번역되어 관련된 생물학적 활성을 갖는 폴리펩타이드 생성물을 형성한다. 또한 발현 과정은 전사의 RNA 생성물에 대한 추가 가공 단계, 예를 들면 인트론을 제거하는 스플라이싱(splicing) 및/또는 폴리펩타이드 생성물의 번역 후 가공을 포함할 수 있다.

본 발명의 융합 단백질 또는 키메라 단백질은 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다. 본 발명에 따르면, 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자 서열은 단리되거나, 합성되거나, 달리 수득되고, PTD 펩타이드를 암호화하는 DNA 서열에 작용적으로 연결(operably linked)될 수 있다. PTD 펩타이드를 암호화하는 DNA 서열에 작용적으로 연결되는 목적하는 단백질을 위한 유전자를 함유하는 하이브리드 유전자는 키메라 유전자로 언급된다. 선택적으로 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자 서열은 연결자 펩타이드를 통해 PTD 펩타이드를 암호화하는 DNA 서열에 작용적으로 연결될 수 있다.

용어 "연결자 펩타이드"는 발현된 단백질에 함유되는 경우 바람직하게는 친수성 영역을 제공하는 아미노산 잔기의 임의의 서열로 정의되고자 한다. 이런 친수성 영역은 단백질분해효소 분해 부위에서 효소에 의한 분해를 용이하게 할 수 있다.

키메라 유전자는 적합한 형질전환된 숙주에서 목적하는 키메라 단백질의 발현을 가능하게 하는 발현 벡터로 삽입된다. 발현 벡터는 적합한 형질전환된 숙주에서의 발현을 제어하기 위해 필요한 조절 서열을 갖는 삽입된 키메라 유전제를 제공한다.

핵산 구축물은 벡터, 예를 들면 발현 벡터의 형태일 수 있고, 다른 것들 중에서도 크로모좀, 에피좀 및 바이러스-유래된 벡터, 예를 들면 박테리아 플라스미드로부터 유래된 벡터, 박테리오파지로부터 유래된 벡터, 트랜스포손으로부터 유래된 벡터, 효모 에피좀으로부터 유래된 벡터, 삽입 요소로부터 유래된 벡터, 효모 크로모좀 요소로부터 유래된 벡터, 바이러스, 예를 들면 바큘로바이러스, 파포바 바이러스(예를 들면 SV 40), 박시니아 바이러스, 아데노바이러스, 계두 바이러스, 위광견병 바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 벡터, 및 이의 조합으로부터 유래된 벡터, 예를 들면 플라스미드와 박테리오파지 유전자 요소로부터 유래된 벡터, 예를 들면 코스미드 및 파지미드를 포함할 수 있다. 일반적으로 핵산을 유지시키거나, 진행시키거나, 발현시켜 숙주에서 폴리펩타이드를 발현시키는데 적합한 임의의 벡터를 발현을 위해 이용할 수 있다.

본 발명의 융합 단백질의 발현을 제어하는 조절 요소는 프로모터 영역, 5' 번역되지 않은 영역, 신호 서열, 키메라 암호화 서열, 3' 번역되지 않은 영역 및 전사 말단 부위를 포함한다. 숙주로부터 배지로 분비되는 융합 단백질은 또한 신호 서열을 함유한다.

유사하게, 다양한 번역 제어 요소가 당 분야의 숙련자에게 공지되어 있다. 이들은 리보좀 결합 부위 및 번역 개시 및 말단 코돈을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다.

재조합 벡터를 제조하고, 이를 이용하여 숙주 세포를 형질전환시키고, 숙주 세포에서 벡터를 복제하고, 생물학적 활성 외래 폴리펩타이드 및 단백질을 발현시키기 위한 방법 및 물질은 본원에 참고로 인용되어 있는 문헌[Principles of Gene Manipulation, by Old and Primrose, 2nd edition (1981), 및 샘브룩(Sambrook) 등, Molecular Cloning, 3^rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (2001)]에 개시되어 있다.

본원에서 사용되는 용어 "DNA 폴리뉴클레오타이드"는 환상 또는 선형화된 플라스미드이거나, 또는 비-감염성이고 비-통합성(즉, 척추동물 세포의 게놈으로 통합되지 않는)일 수 있는 다른 선형 DNA일 수 있다. 선형화된 플라스미드는 이전에는 환상이었지만, 예를 들면 제한 엔도뉴클레아제를 이용한 분해에 의해 선형화된 플라스미드이다. 선형 DNA는 예를 들면 본원에 참고로 인용된 문헌[청(Cherng, J. Y.) 등, J. Control. Release 60:343-53 (1999), 및 첸(Chen, Z. Y.) 등, Mol. Ther. 3:403-10 (2001)]에 개시된 바와 같은 일부 상황에서 유리할 수 있다.

본 발명의 추가의 실시양태는 전술된 키메라 유전자를 포함하는 벡터의 임의의 뉴클레오타이드 서열에 95% 이상, 보다 바람직하게는 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 키메라 유전자를 포함하는 벡터를 포함한다.

본 발명의 다른 실시양태는 전술된 키메라 유전자의 임의의 뉴클레오타이드 서열에 95% 이상, 더욱 바람직하게는 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 키메라 유전자를 포함한다.

실제적인 문제로서, 임의의 특정한 벡터 또는 키메라 유전자가 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열과 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한지의 여부는 공지된 컴퓨터 프로그램, 예를 들면 베스트핏 프로그램(위스콘신주 53711 매디슨 유니버시티 리써치 파크 575 사이언스 드라이브 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹, 유닉스용 버젼 8, 위스콘신 서열 분석 패키지)을 이용하여 결정될 수 있다. 베스트핏은 스미쓰와 와터만의 문헌[Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)]의 국소 동종성 알고리듬을 이용하여 2개의 서열 사이에서 최상의 동종성을 갖는 분획을 발견한다. 베스트핏 또는 임의의 다른 서열 정렬 프로그램을 이용하여 특정한 서열이 예를 들면 본 발명의 따른 기준 서열과 95% 동일한지의 여부를 결정하는 경우, 변수는 물론 동일성 백분율이 기준 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 계산되고 기준 서열에서의 총 뉴클레오타이드 수의 5% 이하의 동종성 차이가 허용되도록 설정된다.

코돈 최적화

"코돈 최적화"는 천연 서열의 하나 이상 또는 유의한 수의 코돈을 그 척추동물의 유전자에서 보다 흔하게 또는 가장 흔하게 사용되는 코돈으로 대체함으로써, 대상 척추동물, 예를 들면 인간의 세포에서의 발현이 개선되도록 핵산 서열을 개질시키는 것으로 정의된다. 다수의 종이 특정한 아미노산의 일부 코돈에 대해 특정한 선호도를 나타낸다.

한 양태에서, 본 발명은 치료용 폴리펩타이드, 및 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 암호화하는 코돈-최적화된 암호화 영역의 핵산 단편을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 발현 구축물 또는 벡터 및 숙주 세포, 및 폴리뉴클레오타이드 발현 구축물, 벡터, 숙주 세포를 이용하여 척추동물의 질병을 치료 또는 예방하는 다양한 방법에 관한 것이다.

본원에서 사용되는 용어 "코돈-최적화된 암호화 영역"은 하나 이상 또는 유의한 수의 코돈을 그 척추동물의 유전자에서 보다 흔히 이용되는 하나 이상의 코돈으로 대체함으로써 주어진 척추동물의 세포에서 발현되도록 적응된 핵산 암호화 영역을 의미한다.

임의의 폴리펩타이드 쇄의 아미노산을 암호화하는 코돈을 포함하는 뉴클레오타이드 서열에서의 변이는 유전자를 암호화하는 서열에서의 변이를 허용한다. 각각의 코돈이 3개의 뉴클레오타이드로 구성되어 있고, DAN를 구성하는 뉴클레오타이드가 4개의 특정한 염기로 제한되어 있기 때문에, 64개의 가능한 뉴클레오타이드 조합이 있고, 이중 61개가 아미노산을 암호화한다(나머지 3개의 코돈은 번역을 끝내는 신호를 암호화한다). 많은 아미노산이 하나 이상의 코돈에 의해 지정된다. 예를 들면 아미노산인 알라닌과 프롤린은 4가지 트리플렛(triplet)에 의해 암호화되고, 세린과 아르기닌은 6가지 트리플렛에 의해 암호화되는 반면, 트립토판과 메티오닌은 단지 1가지 트리플렛에 의해 암호화된다. 이 디제너러시(degeneracy)는 DNA에 의해 암호화되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않으면서 DNA 염기 조성이 넓은 범위에 걸쳐 변화할 수 있도록 한다.

컨센서스 ( consensus ) 서열

본 발명은 또한 특정한 컨센서스 서열, 및 이의 단편, 유도체 및 변이체를 이용하여 치료용 융합 단백질을 발현하는 키메라 유전자를 함유하는 발현 플라스미드에 관한 것이다. "컨센서스 서열"은 예를 들면 서로에 대해 비교하였을 때 2가지 이상의 서열의 각각의 위치에서 가장 흔하게 존재하는 아미노산을 나타내는 이상화된 서열이다. 컨센서스 서열은, 각각의 아미노산이 자연에 존재하는 서로 다른 서열의 그 위치에서 가장 흔하게 발생하는 아미노산인, 이론적으로 대표적인 아미노산 서열이다. 이 용어는 또한 이론적인 컨센서스에 근접하는 실제 서열을 지칭한다. 컨센서스 서열은 예를 들면 공유된 작용 또는 구조 목적을 갖는 서열로부터 유래될 수 있다. 이는 가능한 한 동종성을 최대화하기 위해 특정한 구조적 또는 기능적 도메인의 많은 공지된 예를 배열함으로써 정의될 수 있다. 각각의 특정한 아미노산이 그 위치에서 상당히 우세한 경우, 그리고 비교의 근거를 형성하는 서열의 대부분이 소수의 치환, 예를 들면 0 내지 약 100개의 치환에 의해 컨센서스와 관련되는 경우, 서열이 일반적으로 컨센서스인 것으로 허용된다. 일반적으로 야생-형 비교 서열은 컨센서스 서열과 약 50% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95%이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일하다. 따라서 본 발명의 폴리펩타이드는 컨센서스 서열과 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다.

"컨센서스 아미노산"은 컨센서스 단백질에서 주어진 위치를 차지하도록 선택된 아미노산이다. 컨센서스 아미노산을 선택하도록 조직된 시스템은 컴퓨터 프로그램이거나, "수동" 분석 및 계산과 하나 이상의 컴퓨터 프로그램의 조합일 수 있다. 배열된 아미노산 서열의 각각의 위치에 대해 컨센서스 아미노산이 수득된 후, 이들 컨센서스 아미노산을 "정렬"하여 컨센서스 단백질의 아미노산 서열을 수득한다.

치료 용도

염증 및 면역 질환, 예를 들면 천식, 류마티스 관절염, 건초열, 알레르기성 비염, 건선 및 다른 피부병을 치료하고 이식편 거부, 예를 들면 섬 이식에서의 이식편 거부를 억제하기 위한 약제의 제조에 치료용 융합 단백질을 사용하는 것이 고려된다.

면역 반응을 조절하기 위하여, 즉 자가면역 질환 환자에게서 T 세포 활성화를 방지하거나, 염증 세포(기도 염증)의 침윤을 감소시키거나, Th2 형 사이토카인 분비를 감소시키거나, 또는 기도 과-반응성을 감소시키기 위해서 치료용 융합 단백질을 이용하는 것이 추가로 고려된다. 자가면역 질환의 예는 다발성 경화증; 소그렌 증후군; 유육종증; 인슐린 의존성 당뇨병; 자가면역 갑상선염; 관절염, 예를 들면 골관절염, 류마티스 관절염, 반응성 관절염 및 건선 관절염; 강직성 척추염; 및 피부 경화증을 포함한다.

또한 염증 질환, 예를 들면 천식, 기종, 건초열(아토피), 알레르기성 비염, 건선 및 다른 피부병을 치료하거나, 예를 들면 섬 이식에서의 이식편 거부 반응을 억제하기 위하여 치료용 융합 단백질을 사용하는 것이 고려된다.

방법 및 투여

본 발명은 치료용 융합 폴리펩타이드 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 전달하는 방법을 제공하고, 여기서 단백질은 재조합 단백질, 특히 융합 단백질 또는 정제된 서브유니트로 제공되고, 이는 상기 개시된 바와 같은 조성물의 투여시 척추 동물에서 치료 반응이 생성되도록 본원에 개시된 하나 이상의 조성물을 척추동물에 투여함을 포함한다. 전달은 예를 들면 피부, 코, 눈 또는 기관내를 통해 일어날 수 있다. 기관내 주입을 통한 비강내 투여가 일어날 수 있다.

용어 "척추동물"은 하나의 "척추동물"과 여러 "척추동물"을 포함하고, 어류, 파충류 및 양서류 뿐만 아니라 포유동물과 조류를 포함한다.

용어 "포유동물"은 하나의 "포유동물"과 여러 "포유동물"을 포함하고, 인간; 영장류, 예를 들면 유인원, 원숭이(예를 들면, 올빼미 원숭이, 다람쥐 원숭이, 세부스(cebus) 원숭이, 레수스(rhesus) 원숭이, 아프리칸 그린(African green) 원숭이, 파타스(patas) 원숭이, 시노몰구스(cynomolgus) 원숭이 및 세코피테쿠스(cercopithecus) 원숭이), 오랑우탄, 비비, 긴팔원숭이 및 침팬지; 개류, 예를 들면 개와 늑대; 고양이과 동물, 예를 들면 고양이, 사자 및 호랑이; 말과 동물, 예를 들면 말, 당나귀 및 얼룩말; 식용 동물, 예를 들면 소, 돼지 및 양; 유제류, 예를 들면 사슴과 기린; 곰과 동물, 예를 들면 곰; 및 기타, 예를 들면 토끼, 마우스, 페릿, 물개, 고래를 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 특히 포유동물은 인간, 식용 동물 및 반려 동물일 수 있다.

용어 "조류"는 하나의 "조류"와 여러 "조류"를 포함하고자 하고, 야생 물새류, 예를 들면 오리, 거위, 제비갈매기, 섬새 및 갈매기; 또한 가정용 조류 종, 예를 들면 칠면조, 닭, 메추라기, 꿩, 거위 및 오리를 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 용어 "조류"는 또한 연작류 조류, 예를 들면 찌르레기와 잉꼬를 포함한다.

본 발명은 또한 인간에게 본원에 개시된 하나 이상의 조성물을 투여함으로써 면역 반응을 생성하거나, 개선하거나, 또는 조절하는 방법을 제공한다. 이 방법에서 조성물은 하나 이상의 폴리펩타이드, 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함할 수 있고, 여기서 단백질은 재조합 단백질, 특히 융합 단백질 또는 정제된 서브유니트로서 제공된다.

본원에서 이용되는 "치료 반응"은 본원에 개시된 조성물이 그 척추동물에 전달되었을 때 조성물에 대한 긍정적인 반응을 이끌어낼 수 있는 척추동물의 능력을 의미한다. 치료 반응의 예는 면역 반응, 상처 치료, 염증 반응 및 이식편 거부 억제를 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다.

본원에서 사용되는 "면역 반응"은 조성물이 척추동물에 전달되었을 때 면역 반응을 이끌어낼 수 있는 척추동물의 능력을 의미한다. 면역 반응의 예는 항체 반응 또는 세포(예를 들면 세포독성 T 세포) 반응을 포함한다.

상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 조성물을 이용하여 질병을 치료적으로 치료하고 예방할 수 있다. 본원에서 정의된 "치료"는 척추동물의 질병 또는 질병 증상의 심각성을 방지하거나, 치료하거나, 지연시키거나 또는 감소시키고/시키거나 결과적으로 질병을 악화시키지 않기 위해 본 발명의 하나 이상의 조성물을 이용하는 것을 의미한다.

용어 "예방"은 척추동물에서 치료 반응을 생성하기 위해 본 발명의 하나 이상의 조성물을 이용하는 것을 의미한다. 본 발명의 임의의 조성물이 모든 질병 증상을 전적으로 고치거나 없앨 필요는 없다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 하나 이상의 조성물은 본원에 개시된 방법에 의해 척추동물에 전달되고, 이에 의해 효과적인 치료 및/또는 효과적인 예방적 면역 반응이 달성된다. 보다 구체적으로, 본 발명의 조성물은 근육, 피부, 뇌 조직, 폐 조직, 간 조직, 비장 조직, 골수 조직, 흉선 조직, 심장 조직, 예를 들면 심근, 심장 내막 및 심막, 림프 조직, 혈관 조직, 골 조직, 췌장 조직, 신장 조직, 담낭 조직, 위 조직, 내장 조직, 고환 조직, 난소 조직, 자궁 조직, 질 조직, 직장 조직, 신경계 조직, 눈 조직, 선 조직, 혀 조직 및 연결 조직, 예를 들면 연골을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는 척추 동물의 임의의 조직으로 투여될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 폐, 입, 비강, 위, 복강, 내장, 임의의 심실, 혈관, 동맥, 모세관, 림프강, 자궁강, 질강, 직장강, 관절강, 뇌실, 척수의 척추관, 안강, 침샘 또는 간의 관의 루멘을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 척추동물의 임의의 내부 강으로 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물이 침샘 또는 간의 관의 루멘으로 투여되는 경우, 목적하는 폴리펩타이드는 각각의 침샘 또는 간에서부터 척추동물의 혈류로 이동되도록 침샘과 간에서 발현된다. 목적하는 폴리펩타이드를 혈류로 방출하기 위해 침샘, 간 및 췌장을 이용하여 위장계의 분비 기관으로 투여하기 위한 일부 모드는 본원에 참고로 인용되어 있는 미국 특허 제 5,837,693 호 및 제 6,004,944 호에 개시되어 있다.

일부 실시양태에서, 조성물은 골격근 또는 심근중 하나인 근육 또는 폐 조직으로 투여된다.

개시된 방법에 따르면, 본 발명의 조성물은 근육내(i.m.), 피하(s.c.) 또는 폐내 경로에 의해 투여될 수 있다. 다른 적합한 투여 경로는 기관내 주입, 경피, 안내, 비내, 흡입, 강내, 정맥내(i.v.), 관내(예를 들면 췌장으로) 및 연조직내(즉, 임의의 조직) 투여를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 정맥내 투여의 경우, 적절한 약학적으로 허용가능한 담체, 예를 들면 인산염 완충된 염수, 염수 또는 약물의 정맥내 투여를 위해 사용될 수 있는 다른 물질을 사용할 수 있다. 경피 전달은 피내(예를 들면 진피 또는 표피로), 경피(예를 들면 피하) 및 점막 투여(즉, 피부 또는 점막 조직으로 또는 이를 통해)를 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 강내 투여는 경구, 질, 직장, 비강, 복강 또는 내장 강, 및 기관내(즉, 척추관으로), 심실내(즉, 뇌실 또는 심실로), 심방내(즉, 심장으로) 및 거미 망막하(즉, 뇌의 거미 망막하 공간으로) 투여를 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다.

결과적으로 질병 상태에 대한 치료 반응이 필요한 인간에서 이런 치료 반응을 생성하기에 충분한 양의 목적하는 펩타이드 또는 단백질을 목적하는 조직 내에 전달시키거나 발현시키는 한, 임의의 투여 모드를 이용할 수 있다.

본 발명의 투여 수단은 주사기 주사(예를 들면 멸균 수성 분산액으로서, 바람직하게는 등장성의), 카테터 주입, 바이올리스틱(biolistic) 주입기, 입자 가속기(예를 들면 "유전자 총" 또는 폐 "무주사기" 주입기), 메드-이-제트(Med-E-Jet)[발싱(Vahlsing, H.) 등, J. Immunol. Methods 171:11-22 (1994)], 피그제트(Pigjet)[슈리버(Schrijver, R.) 등, Vaccine 15: 1908-1916 (1997)], 바이오젝터(Biojector)[데이비스(Davis, H.) 등, Vaccine 12: 1503-1509 (1994); 그람진스키(Gramzinski, R.) 등, Mol. Med. 4: 109-118 (1998)], 어드밴타제트(AdvantaJet)[린메이여(Linmayer, L.) 등, Diabetes Care 9:294-297 (1986)], 메디-젝터(Medi-jector)[마틴스(Martins, J.) 및 로들(Roedl, E. J.), Occup. Med. 27:821-824 (1979)], 겔포움 스폰지 저장소(gelfoam sponge depots), 다른 상업적으로 이용가능한 저장소 물질(예를 들면 하이드로겔(hydrogel)), 삼투압 펌프(예를 들면 알자 미니펌프(Alza minipumps)), 경구 또는 좌약 고형물(정제 또는 환제) 약학 제제, 국소 피부 크림 또는 겔, 디캔팅(decanting), 폴리뉴클레오타이드 코팅된 봉합사의 사용[퀸(Qin, Y.) 등, Life Sciences 65: 2193-2203 (1999)] 또는 수술동안의 국소 도포를 포함한다. 일부 투여 모드는 근육내 주사기 주사 및 카테터 주입을 통한 폐 적용이다. 또한, 에너지-보조되는 플라스미드 전달(EAPD) 방법을 이용하여 본 발명의 조성물을 투여할 수 있다. 한가지 이런 방법은 주입된 조직에 간단한 전기 펄스를 적용하는 것을 포함하고, 이 방법은 흔히 전기천공법으로 알려져 있다. 일반적으로 문헌[머(Mir, L.M.) 등, Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:4262-7 (1999); 하티카(Hartikka, J.) 등, Mol. Ther. 4:407-15 (2001); 마티센(Mathiesen, I.), Gene Ther. 6:508-14(1999); 리즈토(Rizzuto G.) 등, Hum. Gen. Ther. 11:1891-900 (2000)]을 참조할 수 있다. 본 단락에서 언급된 각각의 인용문헌은 본원에 전체가 참고로 인용되어 있다.

본 발명의 하나 이상의 조성물의 효과량을 결정하는 것은 예를 들면 발현되거나 직접 투여되는 융합 폴리펩타이드, 이의 변이체 또는 유도체, 대상의 연령, 체중 및 성별, 치료를 요구하는 정확한 상태 및 이의 심각성, 투여 경로, 융합 폴리펩타이드의 생체내 반감기, 섭취 효율 및 치료 영역을 포함하는 다수의 인자에 의존한다. 치료는 환자의 반응을 고려한 임상 판단에 근거하여 필요한 대로 반복될 수 있다.

"약학 효과량" 또는 "치료 효과량"은 질병 상태에 대한 치료 또는 임상 반응을 생성하기에 충분한 양이다. 용어 "약학 효과량" 또는 "치료 효과량"은 호환될 수 있다. 상기 인자에 의존하여, 정확한 양, 투여 횟수 및 투여 시기를 결정하는 것은 당 분야의 숙련자의 기술 범위 이내이고, 담당 의사 또는 수의학자에 의해 쉽게 결정될 것이다.

포유동물, 특히 인간에게 투여하는 경우, 활성 성분의 1일 투여량은 0.01mg/체중kg, 전형적으로 약 1mg/kg일 것으로 예상된다. 상기 투여량은 평균적인 사례의 예이다. 물론 피코몰 및 나노몰 농도를 포함하는 더 높거나 더 낮은 투여량이 이익이 되는 경우가 있고, 이런 경우도 본 발명의 범위 이내이다.

본 발명은 또한 본원에 개시된 바와 같은 융합 폴리펩타이드, 및 추가의 약학 활성제를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 따라서, 융합 폴리펩타이드(들) 및 관련된 약학 활성제는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 사용될 수 있다. 이런 담체는 염수, 완충된 염수, 덱스트로즈, 리포좀, 물, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜, 에탄올 및 이의 조합을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다.

본 발명의 조성물은 임의의 다양한 완충액 중에서 용해될 수 있다. 적합한 완충액은 예를 들면 인산염 완충된 염수(PBS), 일반 염수, 트리스(Tris) 완충액 및 인산 나트륨(예를 들면 150mM 인산 나트륨)을 포함한다. 불용성 폴리뉴클레오타이드는 약산 또는 약염기에 용해된 후 완충액을 이용하여 목적하는 부피까지 희석될 수 있다. 완충액의 pH는 적절하게 조절될 수 있다. 또한, 약학적으로 허용가능한 첨가제를 이용하여 적절한 삼투성을 제공할 수 있다. 이런 첨가제는 당 분야의 숙련자의 권한에 포함된다. 수성 조성물이 생체내에 사용되는 경우, 멸균된, 발열원이 없는 물을 사용할 수 있다. 이런 제제는 인간에게 투여하기에 적합한 약학적으로 허용가능한 조성물을 제조하기 위해 적합한 양의 수용액과 함께 효과량의 폴리뉴클레오타이드를 함유할 것이다.

본 발명의 조성물은 공지된 방법에 따라 배합될 수 있다. 적합한 제조 방법은 예를 들면 본원에 참고로 인용되어 있는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition, A. Osol, ed., Mack Publishing Co., 펜실베이니아주 이스턴 (1980), 및 Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., 펜실베이니아주 이스턴 (1995)]에 개시되어 있다. 조성물이 수용액으로 투여될 수 있기는 하지만, 이는 또한, 유화액, 겔, 용액, 현탁액, 동결건조 형태 또는 당 분야에 공지된 임의의 다른 형태로 배합될 수 있다. 또한, 조성물은 예를 들면 희석제, 결합제, 안정화제 및 방부제를 포함하는 약학적으로 허용가능한 첨가제를 함유할 수 있다.

하기 실시예는 단지 예시 목적이고, 첨부된 특허청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 범위를 제한하고자 하지 않는다. 실시예에 언급된 모든 문헌은 본원에 전체가 참고로 인용되어 있다.

재료 및 방법

하기 재료 및 방법은 일반적으로 본원에 개시된 모든 실시예에 적용된다. 구체적인 재료와 방법은 필요에 따라 각각의 실시예에 개시되어 있다.

본 발명의 실시는, 달리 지시되어 있지 않은 한, 당 분야의 숙련자의 기술 범위 이내인 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학(PCR 포함), 백신학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 종래의 기법을 이용할 것이다. 이런 기법은 문헌에 완전히 설명되어 있고, 예를 들면 문헌[Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., Sambrook et al., ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press: (1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); 뮬리스(Mullis) 등의 미국 특허 제 4,683,195 호; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); 퍼벌(B. Perbal), A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N. Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, VoIs. 154 and 155 (Wu et al eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); 및 오스벨(Ausubel) 등, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)]을 참고할 수 있다. 이 단락에 언급된 각각의 참고 문헌은 본원에 전체가 참고로 인용되어 있다.

유전자 구축물

본 발명의 구축물은 표준 분자 생물학 기법을 이용하여 본원 또는 당 분야에 제공된 서열 정보에 근거하여 구축된다.

본 발명의 구축물은 pRSET-B 발현 벡터(인비트로겐(Invitrogen))로부터 유래된다. 그러나, 플라스미드인 pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFl/His, pIKD/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAXl, 및 pZeoSV2(캘리포니아주 샌디에고 소재의 인비트로겐 제품), 및 플라스미드 pCI(위스콘신주 매디슨 소재의 프로메가(Promega) 제품)을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 다른 상업적으로 이용가능한 표준 진핵 세포 발현 벡터를 본 발명에서 사용할 수 있다.

상기 개시된 벡터 골격을 이용하여 본원에 개시된 융합 단백질을 발현하는 발현 벡터를 제조한다. 발현 벡터는 추가의 프로모터를 함유할 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 벡터 골격은 그중에서도 본원에 개시된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 미생물 암호화 서열 및 프로모터를 포함하는 여러 개의 발현 카세트를 함유할 수 있다. 발현 카세트는 동일하거나 상이한 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다. 추가로, 발현 카세트는 서로에 대해 동일하거나 반대의 배향일 수 있다. 따라서, 각각의 카세트로부터의 이러한 전사가 동일하거나 다른 배향을 가질 수 있다(즉, 양쪽 발현 카세트 모두에서 5'에서 3'으로 전사되거나, 또는 다르게는 하나의 발현 카세트에서는 5'에서 3'으로 전사되고, 다른 발현 카세트에서는 3'에서 5'으로 전사된다).

플라스미드 DNA 정제

플라스미드 DNA는 적절한 에스케리치아 콜리(Escherichia coli) 균주(DH5α 균주를 포함하지만 이로 제한되지는 않는다)의 컴피튼트(competent) 세포로 형질전환될 수 있고, 매우 정제된 공유결합적으로 닫힌 환상의 플라스미드 DNA를 개질된 세포용해 방법을 이용하여 단리하거나, 키트 설명서에 따라 퀴아겐(Qiagen, 캘리포니아주 발렌시아 소재)의 기가(Giga) 컬럼을 이용하여 정제할 수 있다. 모든 플라 스미드 제제에는 겔 분석에 근거하여 검출가능한 크로모좀 DNA, RAN 및 단백질 불순물이 없었다. 플라스미드를 에탄올 침전시키고, 적절한 용액, 예를 들면 150mM 나트륨에 다시 현탁시켰다. DNA를 -20℃에서 사용할 때까지 저장하였다. DNA를 목적하는 염 용액에 목적하는 몰 농도로 희석시켰다.

포유동물 세포주에서의 플라스미드 발현

플라스미드를 헬라 세포 또는 저캣 T 세포로 형질감염시킴으로써 발현 플라스미드를 생체외 분석하였다. ATCC 수납 번호 CCL-171인 MRC-5 세포 또는 인간 평활근 조직 악성 종양 세포주 RD(ATCC CCL-136)와 같은 다른 잘 특징화된 인간 세포주 또한 사용할 수 있다. 당 분야의 숙련자에게 잘 공지된 양이온성 지질계 형질감염 방법을 이용하여 형질감염을 수행하였다. 예를 들면 전기 천공 및 염화칼슘 매개된 형질감염과 같은 다른 형질감염 방법이 당 분야에 잘 공지되어 있고, 이를 이용할 수 있다[그라함(Graham F.L.) 및 반 데르 에브(A.J. van der Eb), Virology 52:456-67 (1973)]. 형질감염 후에, 형질감염된 세포의 세포 용해물 및 배양 상층액을 평가하여 항원의 상대적인 발현 수준을 비교하였다. 발현된 항원의 품질 및 양 모두를 비교하기 위해 상업적으로 이용가능한 다클론 및/또는 단클론 항체를 이용하여 웨스턴 블럿(western blot) 및 ELISA에 의해 시료를 분석하였다.

T 세포 활성화 분석

1차 인간 CD4⁺ T 세포를 건강한 기증자의 연막으로부터 정제하였다. 히스토파크(Histopaque)(시그마(Simgma))를 이용하여 밀도 구배 원심분리에 의해 PMBC를 단리하였다. 림프구 층을 수집하고, CD4 미세비드(밀테니 바이오텍(Biltenyi Biotec))를 이용한 MACS 컬럼에 의해 CD4⁺ T 세포를 단리하였다[부쉬(Busch R.) 등, J. Immunol. Methods 286:97-109 (2004)].

백만개의 저캣(E6.1) 세포 또는 1차 인간 CD4⁺ T 세포를 Hph-l-ctCTLA-4로 1시간동안 처리한 후, PBS로 세척하고, 0.25㎍의 항-CD28 mAb(파민겐(Pharmingen))와 함께 4℃에서 20분동안 항온처리하였다. 항-CD28 mAb 결합된 세포를 0.05㎍의 항-CD3 mAb(파민겐) 코팅된 플레이트에서 추가로 20시간동안 활성화시켰다. 각각의 세포를 항-CD69-PE 및 항-CDE25-FITC 항체(파민겐)로 염색하고, FACS 캘리버(calibur)(벡톤 디킨슨(Becton Dickinson))로 분석하였다. 각각의 웰중의 상층액 중에 분비된 IL-2 수준을 ELISA(R&D 시스템(system))에 의해 분석하였다.

OVA -유도된 알레르기성 천식 모델

6주령의 수컷 BALB/c 마우스(찰스 리버 테크놀로지(Charles River Technology))를 병원균이 없는 조건하에서 유지시켰다. 마우스를 12시간동안 조명하면서 22℃ 및 20 내지 50%의 상대 습도에서 유지시켰다. 총 200㎕의 부피 중의 20mg의 수산화알루미늄(시그마)에 현탁된 100㎍의 OVA(시그마)를 복강내 주사함으로써 OVA-항원투여된 마우스를 제1일 및 제14일에 감작시켰다. 초기 감작시킨지 15일, 16일 및 17일 후에, 10% 글리세롤 무-내독소 PBS 0.1ml에 용해된 1.5mg의 OVA를 비강내 주입함으로써 마우스에 항원투여하였다[반 리트(Van Rijt L.S.) 등, Blood 100:3663-3671 (2002); 오(Oh S.W.) 등, J. Immunol. 168:1992-2000 (2002); 및 장(Zhang Y.) 등, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 155:661-669 (1997)]. CTLA-4 처리의 경우, OVA 항원투여 30분 전에 마우스에게 50㎕의 10% 글리세롤 무-내독소 PBS중의 25㎍의 Hph-l-ctCTLA-4 재조합 단백질을 비강내 경로로 투여하였다.

기도에서의 염증 분석

1실 맥파계(올 메디쿠스(ALL Medicus))로 기도 저항을 측정하고, PBS 항원투여후 Penh 값과 비교하여 MCh(메타콜린)의 각각의 농도에 대한 증가 배수로 표현하였다. Penh 값은 분당 호흡 빈도로 표현되는 호흡계 저항(Rrs) 값이다. 마지막으로 항원투여한 지 2일 후에, 펜토바비탈 나트륨(100mg/kg)을 복강내 주사하여 마우스를 죽이고, 1ml의 인산염 완충된 염수를 4회 주입하고 부드럽게 회수하여 기관지 폐포 세척(BAL)을 수행하였다. 혈구 계산기를 이용하여 세포 수를 측정하고, 세포-원심분리 및 디프-퀵(Diff-Quick) 염색(사이언스 프로덕츠(Science Products))에 의해 제조된 슬라이스 상에서 시차 세포 계수를 수행하였다. BAL 직후, 기관 및 좌측 주 폐를 PBS 중의 4% 파라포름알데하이드로 고정시키고, 파라핀에 매립시켰다. 형태 계측 분석할 수 있게 조직을 H&E(헤마톡실린 및 에오신) 염색하였다.

기관지 주변 염증의 심각성을 전술된 바와 같이 반정량적으로 등급화하였다: 0: 정상; 1: 더 적은 세포; 2: 세포 하나 층 깊이를 갖는 염증 세포의 고리; 3: 4개 이상의 세포 깊이를 갖는 염증 세포 고리[뮤(Myou S.) 등, J. Exp. Med. 795:1573-1582 (2003); 및 뮤 등, J. Immunol. 177:4379-4384 (2003)].

정량적인 샌드위치 효소-연결된 면역분석 방법(ELISA)를 이용하여 BAL 유체 중의 내독소, IL-5(BD 바이오사이언스), IL-6 및 IL-13(R&D 시스템)의 수준을 측정하였다. 검출 하한은 각각 약 15.6pg/ml였다. 이 한계 미만의 값은 통계적 분석의 경우 0으로 간주된다. 분석간 및 분석내 편차 계수가 10% 미만으로 측정되었다.

실시예 1

발현 벡터의 생산

TAT와 단백질이 세포질에서 세포내 기관으로 향하게 하는 섭취-대상 서열 사이에 공통적인 구조적 및 기능적 특징에 근거하여, 11개 아미노산(YARVRRRGPRR) (서열 번호: 1)의 Hph-1 단백질 전달 도메인(PTD)을 인간 전사 인자인 Hph-1으로부터 확인하였다. 용어 "Hph-1-PTD" 및 "Hph-1"은 이 11개의 아미노산 서열을 의미하고, 이들은 호환가능하다.

Hph-l-PTD-ctCTLA-4, Hph-1-PTD-β-gal, Hph-l-PTD-ctCTLA-4-eGFP 및 Hph-1-PTD와 융합되지 않은 상응하는 유전자는, PCR 단편을 생성하고, 각각의 PCR 단편을 pRSET-B 벡터(인비트로겐)로 삽입함으로써 생성된다(도 1A).

실시예 2

재조합 단백질의 제조

CTLA-4YF 돌연변이체를 생성하기 위해 부위-지향적 돌연변이를 수행하였다. 리딩 프레임의 충실도는 서열분석에 의해 입증되었다. 각각의 DNA 구축물로 형질전환된 BL21 star(노바겐(Novagen))를 1mM IPTG와 함께 5시간동안 유도시켰고, 세포용해 완충액(6M 유레아, 20mM 트리스-HCl, pH 8.0 및 500mM NaCl)에서 초음파처 리하였다. 세포용해물을 원심분리(20℃에서 30분동안 20,000rpm)하여 청정화시키고, 10mM 이미다졸(트리스-HCl, pH 8.0)로 조절하고, 히스트랩(HisTrap) 킬레이팅 컬럼(퀴아겐) 상에 부하하였다. 트리스-HCl 완충액 중의 50, 100, 250mM 또는 3M 이미다졸을 이용하여 결합된 단백질을 95% 이상의 순도로 용출시켰다. 각각의 분획에 함유된 재조합 단백질을 PD-10 세파덱스 G-25(아머샴 파마시아(Amersham Pharmacia)) 상에서 탈염시켰다. 정제된 단백질에 10% 글리세롤을 보충하고, 분획화하고, -80℃에서 급속 동결시켰다[베커-하팍(Becker-Hapak M.) 등, Methods 24:247-256 (2001)].

실시예 3

Hph-1-PTD의 생체외 및 생체내 전달 효율 분석

Hph-1-β-gal 구축물을 각각의 세포주에 1시간동안 전달한 후, 세포를 PBS로 세척하고, 즉각 고정시켰다. 그런 다음, 고정된 세포를 37℃에서 1 내지 3시간동안 X-gal 용액과 함께 항온처리하였다. Hph-1-β-gal을 복강내 주입한 지 12시간 후에 간, 신장, 심장, 폐, 비장 및 뇌에서 나온 마우스 조직 시료를 단리하고, 절편화하고(10㎛ 및 50㎛ 절편), X-Gal 염색 키트(로슈)를 이용하여 분석하였다[슈바츠(Schwarze S.R.) 등, Science 285:1569-1572 (1999)]. 형광 현미경(니콘(Nikon))을 이용하여 이미지를 기록하였다. 또한 웨스턴 블럿 분석에 의해 Hph-1-β-gal의 전달 능을 분석하였다. 동일한 수의 세포를 SDA-PAGE 시료 완충액에 용해시키고, 단백질을 12% 겔 상에 용해시키고, PVDF 상으로 블럿팅하였고, β-gal에 대한 단클론 항체(1:1000)(셀 시그날링(Cell Signaling))를 프로브로 처리하였 다. 결합된 항체를 마우스 IgG에 대한 서양고추냉이 퍼옥시다제-컨쥬게이트된 항체(1:5000)를 이용하여 검출한 후, 화학발광(피어스(Pierce))에 의해 개선시켰다. Hph-1-PTD-eGFP 융합 단백질의 국소화를 모니터링하기 위해 헬라 세포를 30분동안 10μM의 Hph-1-PTD-eGFP 융합 단백질과 함께 항온처리하고, eGFP의 형광을 공초점 현미경(바이오래드(Bio Rad))을 이용하여 분석하였다.

HA-플루오레세인 mAB(셀 시그날링)을 이용한 세포내 염색에 의해 Hph-l-HA-ctCTLA-4의 전달 효율을 분석하였다. 사이토픽스/사이토펌(cytofix/cytoperm) 용액(파민겐)을 이용하여 세포가 투과성이 되게 한 후, 4℃에서 30분동안 HA-플루오레세인 mAB와 함께 항온처리하였다. FACS 캘리버(벡톤 디킨슨)를 이용하여 세포내 형광을 측정하였다.

정제된 Hph-1-β-gal 융합 단백질 또는 대조군 β-gal 단백질을 이용하여, 저캣(E6.1) 세포에서의 전달 효율을 웨스턴 블롯 분석에 의해 분석하였다. 도 1B에 나타난 바와 같이, 10μM의 Hph-1-β-gal은 배양된 세포로 쉽게 전달되고, 15분에 처음 검출되고, 60분 미만 이내에 거의 최대의 세포내 농도에 도달하였다. 전달된 단백질의 분해는 전달후 120분까지 검출되지 않았고, 반면 대조군 β-gal 단백질은 심지어 20mM에서도 전달되지 않았다. Hph-1-PTD의 단백질 전달성은 농도 의존성 방식으로 입증되는 것으로 보이고, 전달 효율은 4℃에서 40% 만큼 감소되었다(도 1B).

저캣 T 세포에서 Hph-1-PTD를 이용한 단백질 전달에 대한 전달 동력학 및 최적 농도가 결정된 후, Hph-1-PTD의 전달 효율을 다양한 세포주를 이용하여 측정하 였다. 도 1C에 도시된 바와 같이, 1시간동안 배양한 후 거의 100%의 세포가 서로 다른 전달 효율로 β-gal 효소 활성에 대해 양성이 되었다.

세포 내에서 Hph-1-PTD 융합된 단백질의 세포내 국소화를 모니터링하기 위해서 헬라 세포를 10μM의 Hph-1-eGFP 융합 단백질과 함께 30분동안 항온처리하고, eGFP의 형광을 공초점 현미경으로 분석하였다(도 1D). 항온처리한지 몇분 후에 Hph-1-eGFP가 핵내에 축적되고, 내부화된 융합 단백질이 처리된 세포의 핵 및 세포질 둘 모두에서 발견되었다(도 1C).

Hph-1-PTD가 단백질의 생체내 전달을 촉진시키는지의 여부를 결정하기 위해, Hph-1-β-gal 또는 대조군 β-gal 단백질을 마우스에 복강내 주사하고, 주사한 지 4 내지 6시간 후에 간, 심장, 신장, 폐, 비장 및 뇌를 단리하였다. 그런 다음, 전체 기관과 이들의 얇은 절편을 β-gal 효소 활성에 대해 분석하였다(도 1E). Hph-1-β-gal이 주입된 마우스로부터 단리된 모든 조직은 심지어 뇌 절편에서조차 강하고 균일한 β-gal 활성을 나타내었고, 이는 Hph-1-PTD가 혈관-뇌 장벽을 가로질러 큰 단백질을 전달할 수 있음을 나타낸다. 대조군 단백질이 주입된 마우스에서는 β-gal이 검출되지 않거나, 드문드문한 약한 염색이 관찰되었고, 이는 아마도 식세포가 대조군 β-gal 단백질을 일시적으로 비특이적으로 섭취하였기 때문인 것으로 보인다[슈바츠 등, Science 235:1569-1572 (1999)].

실시예 4

Hph-1-FITC의 국소 투여

피부: 무모 마우스의 피부를 아세톤으로 닦고, Hph-1-FITC와 연고의 혼합물 을 마우스의 등에 도포하였다. 2시간 후에, 마우스의 피부 시료를 절편화하고, 공초점 현미경에 의해 형광의 존재를 분석하였다.

눈: PBS 용액중의 Hph-1-FITC를 래트의 눈에 떨어뜨리고, 투여한 지 30분 및 120분 후에, 눈의 냉동된 절편에서 FITC 형광을 공초점 현미경으로 조사하였다.

비강: FITC 컨쥬게이트된 Hph-1-FITC 용액을 기관내 주입에 의해 기관지와 폐로 전달하였다. 30분 후에, 좌측 주 폐와 기관을 절제하고, PBS중의 4% 포름알데하이드로 고정시키고, 파라핀 중에 매립하였다. 파라핀 블록으로부터 나온 이 얇은 절편을 공초점 현미경으로 분석하였다.

국소 질병의 치료를 위한 단백질 치료에 Hph-1-PTD를 이용하기 위해서, 본 발명자들은 FITC-표지된 Hph-1-PTD를 피부, 눈 또는 비강 기도를 통해 투여하고자 하였다(도 2). 연고와 혼합된 FITC 컨쥬게이트된 Hph-1-PTD를 무모 마우스의 피부에 국소 도포하였다. 그런 다음, 공초점 현미경으로 형광의 존재를 분석하였다(도 2A). Hph-1-PTD-FITC로 처리되었을 때에는 표피뿐 아니라 진피에서도 강한 FITC 형광이 검출되었지만, 대조군 펩타이드로 처리된 마우스의 피부에서는 기본 수준의 형광이 관찰되었다.

도 2B에서는, PBS 중의 Hph-1-PTD-FITC를 래트의 눈에 떨어뜨렸다. 눈에 국소 도포한 지 30분 및 120분 후에, 눈의 냉동된 절편에서의 FITC 형광을 공초점 현미경으로 조사하였다. Hph-1-FITC는 공막을 통해 망막과 신경절 세포로 침투할 수 있는 반면, 대조군 펩타이드로 처리된 눈 시료에는 형광이 없었다. 다음 단계에서, FITC 컨쥬게이트된 Hph-1-PTD를 기관내 주입에 의해 기관과 폐로 국소 전달하 였다(도 2C). Hph-1-PTD-FITC는 미세기관지 및 폐 내의 혈관의 내피 영역에서 검출되었고, 기관지의 기저막으로 침투되었다.

이를 조합하면, 이들 결과는 Hph-1-PTD가 큰 단백질을 생체외 및 생체내 둘 모두에서 세포의 핵뿐만 아니라 세포질로 전달할 수 있음을 명확하게 보여준다. 다양한 국소 투여 경로를 통한 큰 단백질의 전달이 효율적이기 때문에, 이는 Hph-1-PTD와 기능적 융합 단백질의 조합이 국소 투여를 통한 치료 단백질 약물로서 유용할 것임을 나타낸다.

실시예 5

CTLA-4의 세포질 도메인과 융합된 Hph-1-PTD에 의한 T 세포 활성화의 억제

Hph-1-PTD가 비강 기도를 통해 생체내에서 세포 또는 기관으로 큰 대상 단백질을 전달할 수 있는 능력을 갖고 있는 이점을 이용하여, 천식 모델에서 면역 반응을 국소 억제하기 위해 이용될 Hph-1-PTD와 CTLA-4의 세포질 도메인의 융합 단백질(Hph-l-PTD-ctCTLA-4)을 도 3A에 개시된 바와 같이 구축하였다. Hph-l-PTD가 없는 ctCTLA-4 및 Hph-l-ctCTLA-4YF(여기에서는 이의 부정적 기능에 필수적인 2개의 타이로신 잔기가 페닐알라닌으로 돌연변이되었다)를 포함하는 대조군 단백질을 구축하였다. Hph-l-ctCTLA-4의 전달 효율을 저캣 T 세포(이는 표면 상에서 CTLA-4를 발현하는 것으로 알려져 있다)에서 시험하였다. 이들 세포를 서로 다른 기간동안 서로 다른 농도의 Hph-l-ctCTLA-4로 처리하였고, 전달 효율 및 동력학 모두를 세포내 염색에 의해 분석하였다. 도 3B 및 3C에 도시된 바와 같이, Hph-l-ctCTLA-4의 세포로의 전달은 농도-의존적인 것으로 측정되었고, 항온처리한 지 60분 후에 Hph- l-ctCTLA-4의 세포내 최대 수준이 달성된 반면, Hph-l-PTD가 없는 CTLA-4는 전혀 전달되지 않았다.

전달된 Hph-l-ctCTLA-4가 T 세포 활성화를 억제하는지를 조사하기 위해 저캣 T 세포 또는 1차 인간 CD4⁺ T 세포를 Hph-l-ctCTLA-4로 처리하고 항-CD28 mAb 및 플레이트-결합된 항-CD3 mAb로 자극하였다. 활성-유도된 표면 단백질, 예를 들면 CD69와 CD25의 수준을 FACS로 분석하였다. 도 3D 및 3E에 도시된 바와 같이, 이들 표면 마커 단백질의 유도는 Hph-l-ctCTLA-4의 세포내 존재에 의해 상당히 억제되었다. Hph-l-PTD가 없는 ctCTLA-4 또는 Hph-l-ctCTLA-4YF 돌연변이체는 이들 표면 마커의 유도 억제를 나타내지 않았다. 저캣 T 세포와 1차 인간 CD4⁺ T 세포 둘 모두 항-CD3 및 항-CD28 mAb를 이용한 자극에 반응하여 상당한 양의 IL-2를 생성하고, 10nM의 CsA(사이클로스포린 A) 또는 FK506은 예상된 바와 같이 IL-2 분비를 억제하였다. Hph-l-ctCTLA-4를 저캣 또는 인간 CD4⁺ T 세포로 세포내 전달하여 피코몰 범위에서 농도 의존적인 방식으로 IL-2 분비의 유도를 억제할 수 있었고, 10pM의 Hph-l-ctCTLA-4에 의한 억제 수준은 10nM의 CsA보다 더 우수하거나 이와 동일하였다(도 3F 및 3G). CsA보다 1000배 더 낮은 농도의 Hph-l-ctCTLA-4에 의해 T 세포 활성화가 유사한 수준으로 억제되었다. TcR 자극 후, Zap70, ERK 및 JNK을 포함하는 다양한 세포내 신호 매개제의 타이로신 인산화의 유도는 이전에 보고된 바와 같이 Hph-l-ctCTLA-4가 T 세포로 전달되자 현저히 억제되었다[리(Lee K.M.) 등, Science 282:2263-2266 (1998); 리 등, J. Immunol. 165:4420-4429 (2002); 칼 보(Calvo C.R.) 등, J. Exp. Med. 186: 1645-1653 (1997); 권(Kwon H.J.) 등, J. Immunol. 173:6645-6653 (2004); 및 브루너(Brunner M.C.) 등, J. Immunol. 162:5813-5820 (1999)]. 그러나, Hph-1-PTD가 없는 ctCTLA-4 또는 Hph-1-ctCTLA-4YF 중 어떤 것도 IL-2 분비를 차단하지 못하였다. 이들 결과는 (1) Hph-1-PTD에 의한 CTLA-4의 세포질 도메인의 전달이 10pM 농도에서 T 세포 활성화를 효과적으로 차단하고, (2) CTLA-4의 세포질 도메인에서 2개의 타이로신 잔기가 억제 기능에 본질적임을 나타내었다[엠마(Emma L.M.) 등, J. Immunol. 164:5319-5321 (2000); 및 톰슨(Thompson C.B.) 및 알리슨(Allison J.P.), Immunity 7:445-450 (1997)] .

실시예 6

Hph-1-ctCTLA-4는 OVA-유도된 기도 염증을 억제하였다

Hph-1-ctCTLA-4-eGFP 융합 단백질이 마우스에서 기관내 주입에 의해 기관지와 폐로 효과적으로 전달될 수 있는지를 측정하기 위해, Hph-1-ctCTLA-4-eGFP 융합 단백질을 비강 경로를 통해 투여한 지 12시간 후에 기관지폐포 세척(BAL) 유체중의 세포를 수집하고, 이들의 형광을 FACS에 의해 분석하였다. 도 4A 및 4B에 도시된 바와 같이 상당한 수의 BAL 세포가 eGFP에 대해 양성이 되었다. 비강 기도를 통한 Hph-1-ctCTLA-4-eGFP 융합 단백질의 생체내 전달 효율은 투여량 의존적인 방식이지만, ctCTLA-4-eGFP로 처리된 마우스에서 나온 BAL 세포에서는 단지 기저 수준의 형광이 검출되었다. BAL 유체에서 Hph-1-ctCTLA-4-eGFP 융합 단백질의 CD3⁺ T 세포로의 전달이 추가로 분석되었다. Hph-1-ctCTLA-4-eGFP가 비강 주입된 마우스에서 나 온 CD3⁺ T 세포의 대부분에서 높은 수준의 eGFP가 검출되었다(도 4C). 폐 조직의 조직학 분석으로부터 Hph-1-ctCTLA-4-eGFP의 전달이 명확하다(자료는 도시되지 않음). 이들 결과는 CTLA-4의 세포질 도메인이 Hph-1-PTD에 의해 비강 기도를 통해 BAL 세포로 효과적으로 전달될 수 있음을 증명하였다.

비강 기도를 통해 전달된 Hph-1-ctCTLA-4 단백질이 생체내에서 기관지 천식의 전개를 억제할 수 있는지를 조사하기 위해서, 면역화 및 OVA를 이용한 기도 항원투여에 의해 생성된 천식에 대한 마우스 모델을 생성하였다. OVA 항원투여 후에, 호산구, 대식세포 및 호중구를 포함한 염증 세포의 수가 상당히 증가하였다. 25㎍의 Hph-1-ctCTLA-4로 비강내 전처리된 이들 마우스에서는, 이들 염증 세포가 PBS-항원처리된 대조군에서 관찰되는 수준으로 BAL 유체로 침윤되는 것이 방지되는 것으로 나타났다. 그러나, Hph-1-ctCTLA-4YF 돌연변이체는 이러한 억제 효과를 나타내지 않았다(도 4D).

OVA-유도된 염증성 사이토카인의 분비에 미치는 Hph-1-ctCTLA-4의 억제 효과를 평가하기 위해서, OVA-항원투여된 마우스의 BAL 유체 중의 에오탁신, 그리고 IL-5, IL-6, IL-13을 포함하는 Th2 사이토카인 및 Th1 사이토카인(IFN-γ, TGF-β)의 수준을 측정하였다. OVA-항원투여는 모든 사이토카인의 분비를 상당히 증가시켰다. OVA-항원투여된 마우스를 25㎍의 Hph-1-ctCTLA-4로 1회 비강내 전처리하면 에오탁신 및 Th2 유형의 사이토카인의 생산이 상당히 억제되지만, IFN-γ와 TGF-β의 생성에는 영향을 미치지 않는 것으로 발견되었다. 도 4D의 결과와 일치하게, Hph-1이 없는 CTLA4 또는 Hph-1-ctCTLA-4YF중 하나가 투여된 마우스에서는 이들 Th2 사이토카인의 생산이 억제되지 않았다. 폐에서의 염증 지수는 Hph-1-ctCTLA-4로 전처리된 OVA-항원투여된 마우스에서는 상당히 감소하였지만, Hph-1-ctCTLA-4YF로 전처리된 마우스에서는 그렇지 않았다(도 4F).

폐 조직을 이용하여 조직학 검사를 수행하였을 때, OVA 항원투여로 인해 염증 세포가 기도 부근의 기관지주변 조직과 폐 혈관으로 침윤되는 것으로 측정되었다. 많은 상피 세포를 함유하는 점막 또한 언급되었다(도 4G). Hph-1-ctCTLA-4로 처리된 마우스에서는 염증 세포가 점막을 통해 침윤할 수 없었다. 놀랍게도 Hph-1-ctCTLA-4의 이러한 생체외 및 생체내 억제 효과는 Hph-1-ctCTLA-4YF가 전달된 경우에는 관찰되지 않았다. 이는 Hph-1-ctCTLA-4의 억제 효과가 ctCTLA-4에 완전히 특이적임을 명확하게 입증한다.

염수를 흡입한 마우스에 비해, 분무된 메타콜린을 흡입한 후의 더 높은 지수의 개선된 중단에 의해 입증되는 바와 같이, OVA를 이용한 감작은 기도 과-반응성을 상당히 개선시켰다(도 5). 메타콜린에 대한 OVA-유도된 과-반응성은 Hph-1-ctCTLA-4에 의해서는 상당히 약화되었지만, Hph-1-PTD가 없는 CTLA-4 또는 Hph-1-ctCTLA-4YF에 의해서는 약화되지 않았다.

최근, Tat-PTD와 클래스 IA PI3K 조절 서브유니트(TAT-dnp85) 또는 Ras(TAT-dnRas)의 주된 음성 형태 사이의 융합 단백질을 복강내 투여하면 호산구의 항원-유도된 기도 침윤이 효과적으로 약화되고, BALF 중의 Th2 사이토카인 농도가 감소하고, 메타콜린에 대한 기도 과-반응성이 차단된다는 2가지 보고가 있었다[뮤 등, J. Exp. Med. 795:1573-1582 (2003); 및 뮤 등, J. Immunol. 171:4379-4384 (2003)]. 이들 보고에서는 TAT-dnp85(10mg/kg) 및 TAT-dnRas(10mg/kg)를 최초 OVA 감작 상으로부터 12시간마다 동물에게 복강내 주사하였다. 그러나, TAT-dnp85 및 TAT-dnRas는 항원 항원투여 후 중성구 및 거식세포의 기도로의 이동에 아무런 영향도 미치지 않았다. 이 결과와는 대조적으로, 본 발명의 Hph-1-PTD-ctCTLA-4는 다른 염증 세포뿐만 아니라 호중구와 거식 세포 둘 모두의 침윤을 효과적으로 억제하고, 이 억제 효과는 단지 최초 OVA 항원투여 상 직전에 약 1mg/kg의 Hph-1-ctCTLA-4를 비강 경로를 통해 1회 투여함으로써 달성되었다.

본 발명자들은 신규 Hph-1-PTD를 이용한 CTLA-4의 세포질 도메인의 비강 투여가 알레르기성 염증, 염증 세포, 예를 들면 호중구와 호산구의 침윤, 및 항원-감작된 마우스에서 Th2 유형 사이토카인의 분비를 효과적으로 차단한다고 결론내렸다. 이 치료는 또한 메타콜린에 대한 기도 과-반응성을 감소시키는 것으로 보인다.

실시예 7

CTLA-4의 세포질 도메인과 융합된 Tat-PTD에 의한 T 세포 활성화의 억제

CTLA-4의 세포질 도메인과 융합된 Tat-PTD(Tat-PTD-ctCTLA-4)에 의한 T 세포 활성화 억제를 조사하기 위해, 항-CD3 및 항-CD28 mAb로 자극된 저캣 T 세포를 Tat-PTD-ctCTLA-4로 처리하고, ELISA 키트(BD 바이오사이언시즈 카탈로그 번호 555190)를 이용하여 분비된 IL-2의 수준을 측정하였다. 본원에 개시된 바와 같은 용어 "Tat-PTD-ctCTLA-4" 및 "Tat-ctCTLA-4"는 호환가능하다.

항-CD3 및 항-CD28 mAb로 자극된 저캣 T 세포를 96웰 플레이트상에 2x10⁵ 세포의 밀도로 분배한 후, 각각의 웰을 10pM, 1pM 또는 0.1pM중 하나의 Tat-PTD-ctCTLA-4로 처리하였다. 플레이트를 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다.

각각의 웰에서 수집된 상층액을, 4ng/ml의 인간 IL-2에 대한 항체로 코팅되어 있고 10% FBS를 함유하는 PBS로 실온에서 1시간동안 블록킹되고 세척된 마이크로웰 플레이트에 첨가하였다. 배지를 제거하고, 1.6ng/ml의 인간 IL-12에 대한 바이오틴화된 항체 및 아비딘-서양고추냉이 퍼옥시다제 컨쥬게이트를 1시간동안 첨가하였다. 플레이트를 0.02%의 트윈(Tween)-20을 함유하는 PBS로 세척한 후, 100㎕의 기질 용액을 30분동안 첨가하였다. 반응을 중단시키기 위해 2N H₂SO₄ 용액을 첨가하고, 450nm에서의 흡광도를 측정하였다(도 6).

도 6은, Tat-ctCTLA-4의 저캣 T 세포로의 세포 내 전달이 피코몰 범위에서 농도 의존적인 방식으로 IL-2 분비 유도를 억제할 수 있고, 1pM의 Tat-ctCTLA-4에 의한 억제 수준이 10nM의 사이클로스포린에 의한 억제보다 더 우수하거나 이와 동일함을 보여준다(도 6). 따라서, 사이클로스포린에 비해 10,000배 더 낮은 농도의 Tat-ctCTLA-4에 의해 필적할만한 수준의 T 세포 활성화 억제가 달성되었다.

실시예 8

류마티스 관절염을 위한 Mph-1-PTD-ctCTLA-4

제2형 콜라겐의 복강내 주사에 의해 유도된 류마티스 관절염(RA) 모델을 이용하여 Mph-1-PTD-ctCTLA-4의 면역억제 효과를 분석하였다.

RA-유도된 마우스에게 4㎍ 또는 400ng/마우스의 Mph-1-PTD-ctCTLA-4를 매일 정맥내 주사하였고, 관절의 팽윤에 대한 관절염 지수, TNF-α, 및 CD4⁺ 및 CD8⁺ 세포의 수를 분석하였다.

처리된 마우스는 염증으로부터 회복되었다. 관절염 지수와 염증성 사이토카인인 TNF-α의 수준은 감소되었지만(각각 도 7 및 8), 비장과 폐에서의 CD4⁺ 및 CD8⁺ 세포의 수는 증가하였다(도 9). CIA는 음성 대조군이고, 치료제로 처리되지 않은 콜라겐 유도된 관절염이 있는 마우스를 나타낸다. MTS는 양성 대조군이고, 공지된 RA 치료 물질인 메토트렉세이트로 치료된 마우스를 나타낸다.

실시예 9

아토피 동물에서 염증을 억제하는 방법

아토피는 건초열의 개과 등가물로서 간주될 수 있다. 아토피는, Th2 유형의 CD4⁺ 림프구가 알레르기 질병의 발병에 중추적인 역할을 하는 자가면역질환이다. 본 실시예는 T 세포에서 사이토카인의 발현을 억제함으로써 아토피 동물에서 염증을 억제시키는 방법을 보여준다.

수컷 무모 래트(그룹당 3마리, 한국의 중앙 애니믈(Jung-Ang Animal))에게 마그네슘 결핍 식사를 제공하였다. 래트에게 마그네슘이 낮은 표준 유지 식사인 알트로민(Altromin)(독일 라제(Lage))을 먹이고, 탈이온수를 공급하였다. 일반적으로 혈청 중의 마그네슘은 식사를 개시한 지 15일 후에 가장 낮은 수준으로 떨어 지고, 8±2일에 질병의 개시가 관찰되었다. 10일 후에, 모든 동물의 등에 밀집된 홍반이 나타나고 양쪽 귓불이 팽윤되었다.

식사 11일째에 Mph-1-ctCTLA4를 적용하기 시작하였다. 국소 투여의 경우, Mph-1-ctCTLA4를 5% 글리세롤 용액에 용해시켰다.

아토피 피부염-유도된 래트에게 500㎍/래트의 Mph-1-ctCTLA4를 3주동안 한 주에 3회 경피 투여하였다. 대조군 동물에게는 비히클을 같은 방식으로 처리하였다.

임상 점수 및 TEWL(상피를 통한 물 손실)을 분석하고, 아토피 동물에서 염증 억제를 관찰하였다.

도 11은 Mph-1-ctCTLA4로 처리된 래트에서 피부염 점수가 더 낮다는 것을 보여준다. 대조군 래트에 비해 Mph-1-ctCTLA4로 처리된 래트에서 TEWL 또한 감소되었다(도 12 참조).

실시예 10

섬(islet) 이식에서 이식편 거부를 억제하는 방법

콜라게나제 효소 분해 및 피콜 정제 방법에 의해 기증자(루이스(Lewis) 래트)로부터 섬을 단리하였다. 단리된 섬을 스트렙토조토신-유도된 당뇨병 래트(피셔 디엠 래트(Fisher DM rat), 아산 의학 센터(Asan medical center))의 문맥을 통해 간으로 이식하였다.

동물(그룹당 3마리)에게 PBS(음성 대조군), 5mg/kg의 사이클로스포린, 4㎍/kg의 Mph-1-ctCTLA4, 40㎍/kg의 Mph-1-ctCTLA4, 또는 5mg/kg의 사이클로스포린 + 4㎍/kg의 Mph-1-ctCTLA4을 15일동안 매일 복강내 주사하였다.

매일, 혈액중의 글루코스 수준을 측정하였다. 글루코스 수준이 200mg/dL이었을 때 동물이 이식편 거부를 겪고 있는 것으로 간주되었다. 결과는 하기 표에 도시된다.

Mph-1-ctCTLA4에 의한 섬 동종이식(루이스에서 피셔로) 후의 이식편 생존

그룹	수	평균 생존일
음성 대조군	3	5±2
사이클로스포린(5mg/kg)	3	6.8±2.1
Mph-1-ctCTLA4(4㎍/kg)	3	14.2±6.5
Mph-1-ctCTLA4(40㎍/kg)	3	82.5±12.6
사이클로스포린(5mg/kg) + Mph-1-ctCTLA4(4㎍/kg)	3	>100

실시예 11

Hph-1-ζ-쇄에 의한 T 세포 활성화의 억제

ζ쇄는 매우 짧은 세포외 도메인, 막통과 영역 및 긴 세포질 꼬리로 구성된 16kDa의 분자이고, 이는 3개의 면역수용체 타이로신-계 활성 모티프(ITAM)를 함유한다. 이는 일반적으로 동종이량체로서 존재하고, 따라서 TCR 복합체중의 2개의 ζ쇄 상에 6개의 인산화 부위 또는 ITAM이 존재한다. CD3ζ는 T 림프구에서 막통과 신호 분자로서 작용한다.

Hph-1과 ζ-쇄를 갖는 컨쥬게이트를 활성화된 T 세포로 전달하였고, 컨쥬게이트가 TcR 복합체 상에 존재하는 ζ-쇄에 대해 경쟁하였기 때문에 ζ-쇄의 인산화를 억제하였다.

Hph-1-ζ-쇄에 의한 T 세포 활성화의 억제를 조사하기 위해, 항-CD3 및 항-CD28 mAb로 자극된 저캣 T 세포를 Hph-1-ζ-쇄로 처리하였고, ELISA 키트(BD 바이 오사이언시즈 카탈로그 번호 555190)를 이용하여 분비된 IL-2의 수준을 측정하였다.

항-CD3 및 항-CD28 mAb로 자극된 저캣 T 세포를 96웰 플레이트 상에 2x10⁵ 세포의 밀도로 분배한 후, 각각의 웰을 10nM의 Hph-1-ζ-쇄로 처리하였다. 플레이트를 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다.

각각의 웰에서 수집된 상층액을, 4ng/ml의 인간 IL-2에 대한 항체로 코팅되어 있고 10% FBS를 함유하는 PBS로 실온에서 1시간동안 블록킹되고 세척된 마이크로웰 플레이트에 첨가하였다. 배지를 제거하고, 1.6ng/ml의 인간 IL-12에 대한 바이오틴화된 항체 및 아비딘-서양고추냉이 퍼옥시다제 컨쥬게이트를 1시간동안 첨가하였다. 플레이트를 0.02%의 트윈(Tween)-20을 함유하는 PBS로 세척한 후, 100㎕의 기질 용액을 30분동안 첨가하였다. 반응을 중단시키기 위해 2N H₂SO₄ 용액을 첨가하고, 450nm에서의 흡광도를 측정하였다(도 10).

도 10은 Hph-1-ζ-쇄의 저캣 T 세포로의 세포내 전달이 나노몰 범위에서 IL-2 분비 유도를 억제할 수 있음을 보여준다.

SEQUENCE LISTING <110> ForHuman Tech Co. Ltd. <120> Methods for Fusion Polypeptide Delivery into a Cell <130> 2435.002PC01/EKS/GLL <140> To Be Assigned <141> Herewith <150> 60/733,183 <151> 2005-11-04 <160> 18 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg 1 5 10 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Mouse <400> 2 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Mouse <400> 3 Ala Lys Ala Ala Arg Gln Ala Ala Arg 1 5 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> HIV viral <400> 4 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Drosophila <400> 5 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 6 <211> 34 <212> PRT <213> virus HSV-1 <400> 6 Asp Ala Ala Thr Ala Thr Arg Gly Arg Ser Ala Ala Ser Arg Pro Thr 1 5 10 15 Glu Arg Pro Arg Ala Pro Ala Arg Ser Ala Ser Arg Pro Arg Arg Pro 20 25 30 Val Glu <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Mouse <400> 7 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 8 <211> 26 <212> PRT <213> Mouse <400> 8 Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro 1 5 10 15 Ala Ala Ala Asp Gln Asn Gln Leu Met Pro 20 25 <210> 9 <211> 21 <212> PRT <213> Mouse <400> 9 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val 20 <210> 10 <211> 21 <212> PRT <213> Mouse <400> 10 Lys Glu Thr Trp Phe Glu Thr Trp Phe Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val 20 <210> 11 <211> 36 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> ctCTLA-4 <400> 11 Lys Met Leu Lys Lys Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys 1 5 10 15 Met Pro Pro Thr Glu Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe 20 25 30 Ile Pro Ile Asn 35 <210> 12 <211> 114 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> zeta-chain <400> 12 Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln 1 5 10 15 Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu 20 25 30 Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly 35 40 45 Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu 50 55 60 Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly 65 70 75 80 Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser 85 90 95 Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro 100 105 110 Pro Arg <210> 13 <211> 34 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> ITAM A <400> 13 Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp 1 5 10 15 Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro 20 25 30 Arg Arg <210> 14 <211> 32 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> ITAM B <400> 14 Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met 1 5 10 15 Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly 20 25 30 <210> 15 <211> 29 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> ITAM C <400> 15 Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp 1 5 10 15 Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 20 25 <210> 16 <211> 95 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> PD-1 <400> 16 Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro Leu 1 5 10 15 Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly Glu 20 25 30 Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro Cys 35 40 45 Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly Met 50 55 60 Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg Ser 65 70 75 80 Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu 85 90 95 <210> 17 <211> 265 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> eGFP <400> 17 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu 195 200 205 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 210 215 220 Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ser 225 230 235 240 Gly Arg Thr Gln Ile Ser Ser Ser Ser Phe Glu Phe Cys Ser Arg Arg 245 250 255 Tyr Arg Gly Pro Gly Ile His Arg Ile 260 265 <210> 18 <211> 653 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> beta-Gal <400> 18 Met Glu Leu Trp Lys Ser Cys Ile Phe Leu Phe Leu Asn Phe Cys Ile 1 5 10 15 Gln Ser Glu Gly Ile Val Arg Thr Ser Tyr Gly Asn Trp Asn Ile Pro 20 25 30 Lys Ile Gly Asp Arg Asn Ile Pro Ser Phe Leu Ile Asp Glu Ser Lys 35 40 45 Asn Gln Phe Leu Leu Asp Gly Leu Pro Phe Arg Tyr Ile Ser Gly Ser 50 55 60 Ile His Tyr Phe Arg Ile Pro Arg Asp Arg Trp Asp Glu Arg Leu Gly 65 70 75 80 Lys Val Arg Ala Leu Gly Phe Asn Ala Ile Gln Tyr Tyr Ile Pro Trp 85 90 95 Asn Met His Glu Leu Glu Glu Gly Asn His Asp Phe Ser Gly Leu Leu 100 105 110 Asp Phe Ala Glu Phe Ser Met Met Ala Phe His Lys Tyr Gly Leu Trp 115 120 125 Thr Ile Leu Arg Val Gly Pro Tyr Ile Cys Gly Glu Leu Glu Asn Gly 130 135 140 Gly Leu Pro Trp Trp Leu Leu Asn Lys Asn Val Thr Lys Gln Arg Ser 145 150 155 160 Ser Asp Arg Val Phe Thr Arg Glu Val Glu Asn Trp Phe Glu Ile Leu 165 170 175 Leu Pro Arg Val Lys Pro Leu Leu Arg Lys Asn Gly Gly Pro Val Leu 180 185 190 Met Leu Gln Ile Glu Asn Glu Tyr Gly Ser Tyr Asp Ala Cys Asp Gln 195 200 205 Gln Tyr Leu Arg Phe Leu Arg Asp Leu Thr Arg Ser Leu Val Gly Asp 210 215 220 Asp Val Leu Leu Phe Thr Thr Asp Gly Ser Ala Glu Ser Leu Leu Lys 225 230 235 240 Cys Gly Thr Val Glu Gly Val Phe Pro Thr Val Asp Phe Gly Pro Thr 245 250 255 Asp Asp Ala Lys Glu Ile Glu Asn Asn Phe Lys Leu Gln Arg Lys Phe 260 265 270 Ala Pro Asn Gly Pro Leu Val Asn Ser Glu Tyr Tyr Pro Gly Trp Leu 275 280 285 Val Leu Trp Gly Gln Lys Lys Gln Asn Leu Pro Ser Pro Gln Thr Ile 290 295 300 Ile Asn Gly Ser Gln Thr Met Tyr Ser Leu Gly Ala Ser Phe Asn Tyr 305 310 315 320 Tyr Met Ile His Gly Gly Thr Asn Phe Gly Phe Trp Asn Gly Ala Glu 325 330 335 Thr Glu Ala Pro Cys Ile Thr Ser Tyr Asp Tyr Asp Ala Pro Ile Ser 340 345 350 Glu Ser Gly Asp Val Thr Thr Lys Tyr Leu Glu Ile Arg Lys Trp Ile 355 360 365 Lys Gly Leu Thr Asp Trp Pro Thr Pro Pro Leu Asp Val Pro Gly Asn 370 375 380 Ser Pro Lys Gly Arg Phe Gly Lys Ile Lys Met Arg Leu Val His Ser 385 390 395 400 Val Glu Lys Leu Lys Thr Leu Thr Ser Leu Gly Asp Pro Gly Asp Cys 405 410 415 Val Glu Thr Asp Lys Pro Ile Ser Phe Glu Thr Leu Lys His Pro Leu 420 425 430 Gly Leu Val Ala Tyr Gln Ala Lys Ile Asn Ser Cys Gly Asn Leu Thr 435 440 445 Ile Pro Ser Phe Gly Asp Phe Val His Val Tyr Leu Asn Gly Lys Tyr 450 455 460 Ile Asp Thr Leu Thr Arg Arg Tyr Tyr Asn Leu Thr Arg Asn Ser Val 465 470 475 480 Ile Ile Glu Gly Cys Leu Glu Asn Glu Glu Asn Arg Leu Phe Met Leu 485 490 495 Val Glu Asn Gln Gly Arg Lys Thr Phe Glu Thr Ile Asn Asp Arg Lys 500 505 510 Gly Ile Leu Ser Asp Val Phe Met Asn Gly Gln Ala Ile Gln Phe Trp 515 520 525 Thr Gln Cys Gly Ile Lys Leu Pro Leu Gln Glu Asp Phe Tyr Phe Arg 530 535 540 Lys Ala Met Arg Asn Asn Tyr Arg Lys Asn Val Lys Ser Asn Gln Lys 545 550 555 560 Gln Gly Val Phe Ile Gly Ile Leu Ser Val Asp Ala Pro Thr Asp Thr 565 570 575 Trp Leu Asp Thr Thr Gly Trp Gly Lys Gly Ile Ala Ile Val Asn Gly 580 585 590 Arg Asn Phe Gly Arg Tyr Trp Pro Thr Lys Gly Pro Gln Met Thr Leu 595 600 605 Tyr Ile Pro Ala Glu Phe Leu Lys Ile Gly Glu Asn Ser Val Met Met 610 615 620 Val Glu Leu Glu Gly Ala Glu Glu Ala Cys Thr Ser Thr Ser Ser Cys 625 630 635 640 Ile Ala Asp Phe Ile Asp His Pro Val Phe Asp Phe Gln 645 650

Claims

자가면역 질환 또는 염증 질환으로 고통받는 척추 동물에게 단백질 전달 도메인(PTD)과 수용체 단백질의 세포질 도메인을 포함하는 융합 단백질 치료 효과량을 투여함을 포함하는, 상기 척추 동물에서 T 세포 활성화를 억제하는 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 자가면역 질환이 류마티스 관절염, 골관절염, 반응성 관절염, 건선 관절염, 건초열, 아토피, 다발성 경화증, 소그렌 증후군, 유육종증, 인슐린 의존성 당뇨병, 자가면역 갑상선염, 강직성 척추염 및 피부 경화증으로 구성된 군에서 선택되는 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 염증 질환이 천식인 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 단백질 전달 도메인이 전사 인자로부터 유래되는 방법.
제 4 항에 있어서,

상기 단백질 전달 도메인이 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 단백질 전달 도메인이 (i) 서열 번호: 2; (ii) 서열 번호: 3; (iii) 서열 번호: 4; (iv) 서열 번호: 5; (v) 서열 번호: 6; (vi) 서열 번호: 7; (vii) 서열 번호: 8; (viii) 서열 번호: 9; 및 (ix) 서열 번호: 10으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 수용체 단백질의 세포질 도메인이 ctCTLA-4(서열 번호: 11), ζ-쇄(서열 번호: 12), ITAM A(서열 번호: 13), ITAM B(서열 번호: 14), ITAM C(서열 번호: 15) 및 PD-1(서열 번호: 16)로 구성된 군에서 선택되는 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 수용체 단백질의 세포질 도메인이 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 수용체 단백질의 세포질 도메인이 ζ-쇄(서열 번호: 12), ITAM A(서열 번호: 13), ITAM B(서열 번호: 14), ITAM C(서열 번호: 15) 및 PD-1(서열 번호: 16)로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 융합 폴리펩타이드를 피코몰 농도로 적용하는 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 수용체 단백질의 세포질 도메인이 서열 번호: 11의 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 수용체 단백질의 세포질 도메인이 ζ-쇄(서열 번호: 12), ITAM A(서열 번호: 13), ITAM B(서열 번호: 14), ITAM C(서열 번호: 15) 및 PD-1(서열 번호: 16)로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 융합 폴리펩타이드를 정맥내 투여하는 방법.
단백질 전달 도메인(PTD)과 수용체 단백질의 세포질 도메인을 포함하는 융합 폴리펩타이드 치료 효과량을 척추동물에게 투여함을 포함하는, 상기 척추동물에서 이식편 거부를 억제하는 방법으로서, 상기 이식편 거부가 섬(islet) 이식에서 발생되는 방법.
제 14 항에 있어서,

상기 단백질 전달 도메인이 전사 인자로부터 유래된 방법.
제 15 항에 있어서,

상기 단백질 전달 도메인이 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 방법.
제 14 항에 있어서,

상기 단백질 전달 도메인이 (i) 서열 번호: 2; (ii) 서열 번호: 3; (iii) 서열 번호: 4; (iv) 서열 번호: 5; (v) 서열 번호: 6; (vi) 서열 번호: 7; (vii) 서열 번호: 8; (viii) 서열 번호: 9; 및 (ix) 서열 번호: 10으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 방법.
제 14 항에 있어서,

상기 수용체 단백질의 세포질 도메인이 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 방법.
제 14 항에 있어서,

상기 수용체 단백질의 세포질 도메인이 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 방법.
제 14 항에 있어서,

상기 융합 폴리펩타이드를 피코몰 농도로 적용하는 방법.
제 14 항에 있어서,

상기 수용체 단백질의 세포질 도메인이 서열 번호: 11의 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 방법.
제 14 항에 있어서,

상기 수용체 단백질의 세포질 도메인이 서열 번호: 12의 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 방법.
제 22 항에 있어서,

상기 융합 폴리펩타이드를 복강내 투여하는 방법.
단백질 전달 도메인(PTD)과 대상 분자를 포함하는 생체분자 전달 복합체(BTC)를 척추 동물에게 비강내 투여함을 포함하는, 상기 생체분자 전달 복합체를 기관 또는 폐 세포에 전달하는 방법.
제 24 항에 있어서,

상기 생체분자 전달 복합체를 기관내 주입에 의해 투여하는 방법.
제 24 항에 있어서,

상기 생체분자 전달 복합체가 전사 인자로부터 유래된 단백질 전달 도메인을 포함하는 방법.
제 26 항에 있어서,

상기 단백질 전달 도메인이 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 방법.
제 24 항에 있어서,

상기 단백질 전달 도메인이 (i) 서열 번호: 2; (ii) 서열 번호: 3; (iii) 서열 번호: 4; (iv) 서열 번호: 5; (v) 서열 번호: 6; (vi) 서열 번호: 7; (vii) 서열 번호: 8; (viii) 서열 번호: 9; 및 (ix) 서열 번호: 10으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 방법.
제 24 항에 있어서,

상기 대상 분자가 수용체 단백질의 세포질 도메인인 방법.
제 29 항에 있어서,

상기 수용체 단백질의 세포질 도메인이 ctCTLA-4(서열 번호: 11), ζ-쇄(서 열 번호: 12), ITAM A(서열 번호: 13), ITAM B(서열 번호: 14), ITAM C(서열 번호: 15) 및 PD-1(서열 번호: 16)로 구성된 군에서 선택되는 방법.
제 24 항에 있어서,

상기 대상 분자가 (i) eGFP(서열 번호: 17) 및 (ii) β-gal(서열 번호: 18)로 구성된 군에서 선택되는 방법.
제 24 항에 있어서,

상기 대상 분자가 서열 번호: 11의 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 방법.
제 24 항에 있어서,

상기 대상 분자가 ζ-쇄(서열 번호: 12), ITAM A(서열 번호: 13), ITAM B(서열 번호: 14), ITAM C(서열 번호: 15) 및 PD-1(서열 번호: 16)로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 방법.