CN107365784A - 一种用于递送至中枢神经系统的融合蛋白及合成方法 - Google Patents

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吴玉龙
李波清
倪天辉
张莹
周秀芝
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Abstract

本发明属于医疗领域，公开了一种用于递送至中枢神经系统的融合蛋白及合成方法，所述合成方法包括提取信息核糖核酸mRNA，并利用反转录酶将mRNA合成互补脱氧核糖核酸cDNA，克隆GDNF基因和BDNF基因，并将穿透肽PEP‑1的编码脱氧核苷酸分别融合到神经细胞营养因子GDNF基因和BDNF基因的氨基酸末端N‑端或C‑端等，融合蛋白为M‑Y‑N化合物。本发明治疗效果明显，纯化的GDNF融合蛋白具有穿透肽和GDNF二者的功能；克服大脑的血脑屏障，使GDNF能经外周血液循环系统穿越血脑屏障进入脑组织，发挥其生物活性，达到治疗相关神经系统疾病的目的。

Description

一种用于递送至中枢神经系统的融合蛋白及合成方法
技术领域
本发明属于医疗领域，尤其涉及一种用于递送至中枢神经系统的融合蛋白及合成方法。
背景技术
人脑神经胶质细胞源性神经营养因子(GDNF，下同)是由脑组织中的神经胶质细胞产生、分泌的一种有着重要神经生物功能的神经细胞营养因子。GDNF对中枢和外周的多种神经细胞具有有较广泛的促进神经元生长和分化的神经营养作用，是目前发现的对多巴胺神经元和运动神经元作用最为显著的一类神经营养因子，尤其对多巴胺神经元作用最强。国内外对GDNF的功能进行了广泛的研究，证明GDNF通过PI3K/Akt通路介导，明显缓和6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱发的染色质浓缩和DNA断裂；启动一系列抗凋亡信号途径而保护神经元，被认为是一种有希望的神经保护治疗药物。
BDNF是于1982年由德国神经化学家Barde等人首次从动物脑中分离纯化出具有促进神经生长活性的一种蛋白质，BDNF分子单体是由119个氨基酸残基组成的分泌型成熟多肽，蛋白等电点为9199，分子量为13.15kD，主要由β折叠和无规N-级结构组成，含有3个二硫键，为一种碱性蛋白质，分析表明BDNF的氨基酸序列有相当一部分与神经生长因子(nervegrowth factor,N GF)相同,故通称为神经营养因子(neurotrop hic factor，NTF)。
BDNF可由大脑自然分泌，能够起到调节痛苦和恐惧的作用，BDNF缺乏会导致创伤后压力紊乱，也就是俗称的恐惧症。服用BDNF能够使大脑不断重写覆盖痛苦的记忆，并在重写的过程中建立信心和安全感。
与神经元损失或损伤相关的疾病是严重病症并且在世界范围内影响数百万人。尽管疗法如GDNF在治疗神经变性病如帕金森病中具有前景，但是在本发明之前，这样的疗法至脑的递送由于活性剂不能穿过(跨越或越过，cross)血脑屏障而是复杂的。事实上，涉及用于帕金森病的GDNF疗法的先前临床试验要求使用将药剂直接注入脑中，并且用于治疗肌萎缩侧索硬化的BDNF试验涉及药剂的胸内注射。这些方法是繁琐且困难的。
综上所述，现有技术存在的问题是：涉及用于帕金森病的GDNF疗法的先前临床试验要求使用将药剂直接注入脑中，用于治疗肌萎缩侧索硬化的BDNF试验涉及药剂的胸内注射，这些方法是繁琐且困难的；同时由于血脑屏障的存在，GDNF本身无法经外周血液进入脑组织发挥冶疗功效。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于将GDNF和BDNF递送至中枢神经系统的融合蛋白。
本发明是这样实现的，一种用于将GDNF和BDNF递送至中枢神经系统的融合蛋白的合成方法，包括以下步骤：
提取信息核糖核酸mRNA，并利用反转录酶将mRNA合成互补脱氧核糖核酸cDNA，然后，应用PCR技术，克隆GDNF基因和BDNF基因，并将穿透肽PEP-1的编码脱氧核苷酸分别融合到神经细胞营养因子GDNF基因和BDNF基因的氨基酸末端N-端或C-端；
将GDNF融合基因和BDNF融合基因插入原核细胞表达载体，构建成GDNF融合基因表达质粒和BDNF融合基因表达质粒；
将GDNF融合基因表达质粒和BDNF融合基因表达质粒转化感受态表达菌，形成含有GDNF融合基因表达质粒的转化子和含有BDNF融合基因表达质粒的转化子；
在适当条件下培养转化子表达菌株，并用诱导剂诱导表达菌内的表达质粒GDNF融合基因和表达质粒BDNF融合基因的转录、并合成融合蛋白。
进一步，合成融合蛋白后还需进行：通过蛋白质纯化技术、WesternBlot分析和细胞分析确定融合蛋白的生物功能活性。
本发明的另一目的在于提供一种用于将GDNF和BDNF递送至中枢神经系统的融合蛋白为M-Y-N化合物；其中M是肽载体；N包括结构相同的多种多肽；Y是结合M与N的连接物；
所述多种多肽包括：
GDNF，具有至少一种GDNF活性的片段；
GDNF类似物；
BDNF，具有至少一种BDNF活性的片段；
BDNF类似物。
进一步，所述M-Y-N化合物还包括GDNF的成熟形式或BDNF的成熟形式；所述GDNF活性的片段或为亚型1的氨基酸78-211。
进一步，所述M-Y-N化合物还包括标签tag、切割位点；所述切割位点为凝血酶切割位点。
进一步，所述Y是肽键或为至少一个氨基酸；所述M和N各自通过肽键共价地键接于Y；
所述Y连接物是柔性连接物、刚性连接物或者α-螺旋连接物nM；其中n为1、2、3、4或5；
进一步，所述肽载体存在于GDNF、BDNF或相关分子的N-或C-端。
本发明的另一目的在于提供一种编码的核酸分子，所述核酸分子为核酸载体的一部分，并可操作地operably连接于启动子。
本发明的优点及积极效果为：本发明简单且容易，治疗效果明显，纯化的GDNF融合蛋白具有穿透肽、GDNF和BDNF三者的功能克服大脑的血脑屏障，使GDNF能经外周血液循环系统穿越血脑屏障进入脑组织，发挥其生物活性，达到治疗相关神经系统疾病的目的。
附图说明
图1是本发明实施提供的用于将GDNF和BDNF递送至中枢神经系统的融合蛋白结构图。
图中：1、肽载体；2、连接物；3、GDNF、其具有至少一种GDNF活性的片段、或GDNF类似物、或BDNF、或具有至少一种BDNF活性的片段、或BDNF类似物。
图2是本发明实施提供的用于将GDNF和BDNF递送至中枢神经系统的融合蛋白的合成方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
如图1所示，本发明实施例提供的用于将GDNF和BDNF递送至中枢神经系统的融合蛋白包括：
一种化合物：M-Y-N。
其中M是肽载体1；N是与以下基本上相同(具有统一性的，identical)的多肽2，包括：(i)GDNF、其具有至少一种GDNF活性的片段、或GDNF类似物；或(ii)BDNF、其具有至少一种BDNF活性的片段、或BDNF类似物(例如本文中描述的任一种)；
以及Y是结合M与N的连接物(接头，linker)3。该化合物可以能够(例如有效地)穿过血脑屏障。该化合物可以包括GDNF的成熟形式(例如亚型1的氨基酸118-211)或BDNF的成熟形式(例如亚型M的氨基酸129-247)。GDNF片段可以包括或可以是亚型1的氨基酸78-211。该化合物可以进一步包括标签(tag)如His标签，或切割位点如凝血酶切割位点。在某些实施方式中，Y是肽键或Y是至少一个氨基酸，其中M和N各自通过肽键共价地键接于Y。在某些实施方式中，连接物是柔性连接物(例如(GGGGS)n，其中n为1、2或3)、刚性连接物(例如PMPMP和(PT)nP，其中n为2、3、4、5、6或7)，或者α-螺旋连接物(例如M(EMMMK)nM，其中n为1、2、3、4或5)。肽载体可以存在于GDNF、BDNF或相关分子的N-或C-端。
本发明还在于提供一种编码该化合物的核酸分子，其中Y是肽键、氨基酸或肽连接物。该核酸可以是载体的一部分，并且该核酸可以可操作地(operably)连接于启动子。
如图2所示，本发明实施例提供的用于将GDNF和BDNF递送至中枢神经系统的融合蛋白的合成方法，包括以下步骤：
S101:提取信息核糖核酸mRNA，并利用反转录酶将mRNA合成互补脱氧核糖核酸cDNA，然后，应用PCR技术，克隆GDNF基因和BDNF基因，并将穿透肽PEP-1的编码脱氧核苷酸分别融合到神经细胞营养因子GDNF基因和BDNF基因的氨基酸末端N-端或C-端；
S102:将GDNF融合基因和BDNF融合基因插入原核细胞表达载体，构建成GDNF融合基因表达质粒和BDNF融合基因表达质粒；
S103:将GDNF融合基因表达质粒和BDNF融合基因表达质粒转化感受态表达菌，形成含有GDNF融合基因表达质粒的转化子和含有BDNF融合基因表达质粒的转化子；
S104:在适当条件下培养转化子表达菌株，并用诱导剂诱导表达菌内的表达质粒GDNF融合基因和表达质粒BDNF融合基因的转录、并合成融合蛋白。
合成融合蛋白后还需进行：通过蛋白质纯化技术、WesternBlot分析和细胞分析确定融合蛋白的生物功能活性。
本发明的优点及积极效果为：本发明简单且容易，治疗效果明显，纯化的GDNF融合蛋白具有穿透肽、GDNF和BDNF三者的功能克服大脑的血脑屏障，使GDNF能经外周血液循环系统穿越血脑屏障进入脑组织，发挥其生物活性，达到治疗相关神经系统疾病的目的。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种用于将GDNF和BDNF递送至中枢神经系统的融合蛋白的合成方法，其特征在于，所述用于将GDNF和BDNF递送至中枢神经系统的融合蛋白的合成方法包括以下步骤：
提取信息核糖核酸mRNA，并利用反转录酶将mRNA合成互补脱氧核糖核酸cDNA，然后，应用PCR技术，克隆GDNF基因和BDNF基因，并将穿透肽PEP-1的编码脱氧核苷酸分别融合到神经细胞营养因子GDNF基因和BDNF基因的氨基酸末端N-端或C-端；
将GDNF融合基因和BDNF融合基因插入原核细胞表达载体，构建成GDNF融合基因表达质粒和BDNF融合基因表达质粒；
将GDNF融合基因表达质粒和BDNF融合基因表达质粒转化感受态表达菌，形成含有GDNF融合基因表达质粒的转化子和含有BDNF融合基因表达质粒的转化子；
在适当条件下培养转化子表达菌株，并用诱导剂诱导表达菌内的表达质粒GDNF融合基因和表达质粒BDNF融合基因的转录、并合成融合蛋白。
2.如权利要求1所述的用于将GDNF和BDNF递送至中枢神经系统的融合蛋白的合成方法，其特征在于，合成融合蛋白后还需进行：通过蛋白质纯化技术、WesternBlot分析和细胞分析确定融合蛋白的生物功能活性。
3.一种如权利要求1所述合成方法的用于将GDNF和BDNF递送至中枢神经系统的融合蛋白，其特征在于，所述用于将GDNF和BDNF递送至中枢神经系统的融合蛋白为M-Y-N化合物；其中M是肽载体；N包括结构相同的多种多肽；Y是结合M与N的连接物；
所述多种多肽包括：
GDNF，具有至少一种GDNF活性的片段；
GDNF类似物；
BDNF，具有至少一种BDNF活性的片段；
BDNF类似物。
4.如权利要求3所述的用于将GDNF和BDNF递送至中枢神经系统的融合蛋白，其特征在于，所述M-Y-N化合物还包括GDNF的成熟形式或BDNF的成熟形式；所述GDNF活性的片段或为亚型1的氨基酸78-211。
5.如权利要求3所述的用于将GDNF和BDNF递送至中枢神经系统的融合蛋白，其特征在于，所述M-Y-N化合物还包括标签tag、切割位点；所述切割位点为凝血酶切割位点。
6.如权利要求3所述的用于将GDNF和BDNF递送至中枢神经系统的融合蛋白，其特征在于，所述Y是肽键或为至少一个氨基酸；所述M和N各自通过肽键共价地键接于Y；
所述Y连接物是柔性连接物、刚性连接物或者α-螺旋连接物nM；其中n为1、2、3、4或5；
7.如权利要求3所述的用于将GDNF和BDNF递送至中枢神经系统的融合蛋白，其特征在于，所述肽载体存在于GDNF、BDNF或相关分子的N-或C-端。
8.一种编码权利要求3所述的用于将GDNF和BDNF递送至中枢神经系统的融合蛋白的化合物M-Y-N的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为核酸载体的一部分，并可操作地operably连接于启动子。
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