JP7370110B2

JP7370110B2 - 多発性硬化症耐性の組み換えタンパク質およびその調製方法並びに用途

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Publication number: JP7370110B2
Application number: JP2022528137A
Authority: JP
Inventors: 云霄孫; 軍華饒; 代男曹; 真彭; 礼標張; 比海李; 向陽何; 芳季
Original assignee: Guangdong Institute of Applied Biological Resources
Current assignee: Guangdong Institute of Applied Biological Resources
Priority date: 2021-07-05
Filing date: 2022-03-22
Publication date: 2023-10-27
Anticipated expiration: 2042-03-22
Also published as: WO2023279771A1; NL2030391B1; US20240197847A1; AU2021290241A1; AU2021290241B2; CN113336862A; CN113336862B; JP2023531842A

Description

本発明は、バイオ医薬の技術分野に関し、特に多発性硬化症耐性の組み換えタンパク質およびその調製方法並びに用途に関する。

多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ＭＳ）は中枢神経系の脱髄を特徴とする自己免疫性炎症性神経変性疾患である。臨床症状には、感覚喪失、筋力低下、言語障害、めまい、運動障害、さらには麻痺が含まれ、症状は、脳や脊髄の病変の位置によって異なり、現在、ＭＳの効果的な治療法はまだない。疾患修飾治療薬物（ｄｉｓｅａｓｅｍｏｄｉｆｙｉｎｇｔｈｅｒａｐｉｅｓ、ＤＭＴｓ）はＭＳの治療に臨床的に一般的に使用され、現在のＤＭＴｓ薬物については、一次薬には、インターフェロン（ＩＦＮ‐β１ｂ、ＩＦＮ‐β１ａ）、酢酸グラチラマー（ＧＡ）が含まれ、二次薬には、フマル酸塩、フィンゴリモド、テリフルノミド、ミトキサントロン、ナタリズマブ、アレムツズマブなどが含まれるが、これらの治療方法は疾患の再発率を低下させ、疾患を遅らせるだけであり、さらに、これらの薬は多発性硬化症の重症患者には効果がないことが多く、重大な副作用を引き起こす可能性がある。

ＭＳは、中枢神経系の炎症性脱髄病変を特徴とする自己免疫疾患であり、ミエリン特異的免疫寛容を誘導する抗原特異的ワクチンは、ＭＳの安全で効果的な治療法であることが期待されている。自己免疫疾患とは、自己抗原に対する体の免疫応答によって引き起こされ、自己の組織に損傷を与える病気を指す。自己免疫疾患の予防研究では、自己抗原を使ってワクチンを開発することが注目されている。ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ｍｙｅｌｉｎｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＭＯＧ）はＭＳを誘発する主要な自己抗原の１つであり、その細胞外領域には、３つの脳炎誘発性抗原エピトープがあり、そのうちに、ＭＯＧ_{３５‐５５}（３５ＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ５５）は重要な抗原性エピトープであるＭＯＧの２１アミノ酸からなるポリペプチドであり、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの典型的な慢性非寛解型実験的自己免疫性脳脊髄炎（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ、ＥＡＥ）症状を誘発し、ＭＯＧ_{３５‐５５}抗原ペプチドによって誘導されるＣ５７ＢＬ／６マウスＥＡＥモデルは、現在一般的に使用されている古典的なＭＳ動物モデルである。自己抗原は、自己免疫疾患において両刃の役割を果たし、一方で、自己抗原は、病気の発生を仲介し、病気の発生と発症に重要な役割を果たす誘因であり、適切な免疫経路、用量およびサイクルなどの適切な免疫戦略を採用し、自己抗原を免疫して、自己抗原に対する免疫応答を標的化された方法で調節して、体内の免疫寛容または良性の調節性的免疫応答をさらに誘導すると、自己免疫疾患の予防に役割を果たすことができる。

これを鑑み、既存のＤＭＴｓ薬物を置き換えることができるＭＯＧ_{３５‐５５}抗原ペプチドを研究する必要があり、免疫モードを変更し、標的免疫調節を誘導することにより、自己抗原に対する免疫寛容を発達させることができる薬物成分を抗多発性硬化症に使用することができる。

本発明の目的は、多発性硬化症耐性の組み換えタンパク質およびその調製方法並びに用途を提供することであり、この組み換えタンパク質は、ＨＳＰ６５タンパク質および抗原性エピトープポリペプチドＭＯＧ_{３５‐５５}で構成され、多発性硬化症を予防することができる。

本発明のもう１つの目的は、上記多発性硬化症耐性の組み換えタンパク質の調製方法を提供することであり、この調製方法は高い信頼性を有する。

本発明のもう１つの目的は、上記多発性硬化症耐性の組み換えタンパク質の用途を提供することであり、このタンパク質は、多発性硬化症ワクチンおよび／または多発性硬化症薬物の調製に使用され、より良い効果を達成することができる。

本発明のさらにもう１つの目的は、上記多発性硬化症ワクチンまたは多発性硬化症薬物の投与方法を提供することであり、点鼻薬として投与され、この方法は安全で効果的である。

上記の目的を達成するために、本発明は、以下の技術的解決策を採用する。

多発性硬化症耐性の組み換えタンパク質は、ＨＳＰ６５タンパク質および抗原性エピトープポリペプチドＭＯＧ_{３５‐５５}を含む。

さらに、この組み換えタンパク質は、１つのＨＳＰ６５タンパク質および６セグメント縦列反復の抗原性エピトープポリペプチドＭＯＧ_{３５‐５５}を含み、すなわち、前記組み換えタンパク質はＨＳＰ６５および６ＭＯＧ_{３５‐５５}を含む。

さらに、前記ＨＳＰ６５タンパク質と６セグメント抗原性エピトープポリペプチドＭＯＧ_{３５‐５５}間は可撓性リンカーによって接続される。

さらに、前記ＨＳＰ６５タンパク質と６セグメント縦列反復の抗原性エピトープポリペプチドＭＯＧ_{３５‐５５}間はＡｌａ‐Ｓｅｒ‐Ａｌａ可撓性リンカーによって接続される。

さらに、前記組み換えタンパク質の配列は配列番号１である。

多発性硬化症耐性の組み換えタンパク質の調製方法は、上記の多発性硬化症耐性の組み換えタンパク質を調製するために使用され、この方法は、
（１）組み換えプラスミドｐＥＴ２８ａ‐Ｈｉｓ‐ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}を構築し、この組み換えプラスミドを有するエンジニアリング菌株を取得するステップと、
（２）ＬＢ培地でエンジニアリング菌株を培養し、細菌が対数増殖期に達したら、最終濃度が５ｍｍｏｌ／Ｌになるように培地に減菌のラクトース溶液０．５ｍｏｌ／Ｌを加え、継続的に７時間培養した後細菌を収集するステップと、
（３）収集された細菌を使用して融合タンパク質を分離し、かつ融合タンパク質を精製することにより、前記多発性硬化症耐性の組み換えタンパク質を得るステップと、を含む。

さらに、前記ステップ（１）は、
６ＭＯＧ_{３５‐５５}のコドンをｐＥＴ‐２８ａ（＋）に挿入して、プラスミドｐＥＴ２８ａ‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}を取得することと、
プラスミドｐＥＴ２８ａ‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}テンプレートに対してＰＣＲを行い、増幅により６ＭＯＧ_{３５‐５５}配列をコードする標的遺伝子フラグメントを取得することと、
ｐＥＴ２８ａ‐Ｈｉｓ‐ＨＳＰ６５‐６Ｐ２７７ベクターをＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで二重酵素消化して、線形化されたクローニングベクターを取得することと、
６ＭＯＧ_{３５‐５５}配列をコードする標的遺伝子フラグメントと線形化されたクローニングベクターを組み換えて、組み換えプラスミドを取得し、組み換えプラスミドをコンピテントセルに形質転換し、陽性クローニングをＰＣＲでスクリーニングし、スクリーニングから得られた陽性クローニングを検証し、最終的にこの組み換えプラスミドを有するエンジニアリング菌株を取得することと、を含む。

さらに、前記ステップ（３）において、
収集された細菌を氷上で溶解および超音波破砕し、それぞれ上澄み液および沈殿物を分析し、融合タンパク質が封入体であると確定し、
尿素を含む封入体溶解液で封入体を処理し、上澄み液を収集し、Ｎｉ‐ＮＴＡアガロースカラムで標的タンパク質を精製して、組み換えタンパク質Ｈｉｓ‐ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}を取得する。

上記の多発性硬化症耐性の組み換えタンパク質は多発性硬化症ワクチンおよび／または多発性硬化症薬物の調製用途に使用される。

さらに、前記多発性硬化症ワクチンまたは多発性硬化症薬物は点鼻薬として投与される。

本発明の実施例は以下の有益な効果を有する。

この組み換えタンパク質は、ＨＳＰ６５タンパク質および抗原性エピトープポリペプチドＭＯＧ_{３５‐５５}を含む。ＥＡＥマウスモデルは、結核菌ＨＳＰ６５およびヒトＨＳＰ６０の免疫反応性を十分に反映することができる。ここで、ＨＳＰ６５は分子シャペロンとして機能し、分子ベクターとしてヘルパーＴ細胞エピトープとして機能し、抗原提示細胞のＭＨＣＩＩ分子によって認識され、それによって体内のＣＤ４＋細胞の分化と増殖を刺激。熱ショックタンパク質は、自然免疫を活性化し、ＤＣを刺激してＭＨＣ（クラスＩ及びＩＩ）および共刺激分子のレベルをアップレギュレートする免疫危険信号としてのＨＳＰなどの補助効果もある。さらに、マクロファージ、ＤＣ、ＮＫ細胞の表面にＨＳＰ受容体があり、ＨＳＰはＡＰＣの受容体に結合し、ＭＨＣ－Ｉ経路を介してＡＰＣの表面に抗原ペプチドを提示し、特異的な免疫応答を誘導し、免疫応答細胞を介した免疫応答において免疫調節機能を果たす。

ＭＯＧ_{３５‐５５}の免疫原性を向上させるために、本発明において、ＭＯＧ_{３５‐５５}を連続して６回繰り返し、アミノ酸フラグメントの免疫効果を完全に発揮することができる。ＨＳＰ６５と６ＭＯＧ_{３５‐５５}間に可撓性リンカーＡｌａ‐Ｓｅｒ‐Ａｌａを追加してＨＳＰ６５が正しく折りたたまれるように確保する。

ｐＥＴ２８ａ‐Ｈｉｓ‐ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}組み換えタンパク質ベクタープラスミドの構造概略図である。ｐＥＴ２８ａ‐Ｈｉｓ‐ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}陽性プラスミドＰＣＲ産物の１％アガロースゲル電気泳動画像である。組み換えプラスミドｐＥＴ２８ａ‐Ｈｉｓ‐ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}の標的タンパク質コード遺伝子の配列図である。１２％ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ電気泳動による異なる濃度のラクトース誘導後の標的タンパク質Ｈｉｓ‐ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}の発現レベルを示す図である。１２％ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ電気泳動による異なる誘導時点での標的タンパク質Ｈｉｓ‐ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}の発現レベルを示す図である。１２％ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ電気泳動によるロードタンパク質Ｈｉｓ‐ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}プラスミドの大腸菌タンパク質の発現分析図、およびタンパク質のニッケルカラム精製後のウェスタンブロット同定図である。免疫化フローチャートである。マウスのＥＡＥ発生率の変化を示す図である。マウスのＥＡＥ臨床スコアの変化を示す図である。ＥＡＥマウスのＨＥ、ＬＦＢ染色結果を示す図である。ＥＡＥマウスの炎症、脱髄スコアを示す図である。ＥＡＥマウスの炎症性サイトカインＩＦＮ‐γとＩＬ‐１７Ａの分泌レベルを示す図である。

研究によると、熱ショックタンパク質６５（ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ６５、ＨＳＰ６５）も自己免疫性疾患ＥＡＥの自己抗原の１つである。熱ショックタンパク質ＨＳＰ６０／６５ファミリーは高度に保存され、結核菌ＨＳＰ６５（ＭＴ‐ＨＳＰ６５）はヒトＨＳＰ６０と約５０％の相同性を共有し、マウスＨＳＰ６０分子とヒトＨＳＰ６０分子はアミノ酸レベルで９７％の相同性を共有しているため、本発明は、多発性硬化症耐性の組み換えタンパク質を提供し、この組み換えタンパク質は、ＨＳＰ６５タンパク質および抗原性エピトープポリペプチドＭＯＧ_{３５‐５５}を含む。ＥＡＥマウスモデルは、ＭＴ‐ＨＳＰ６５とヒトＨＳＰ６０の免疫反応性を十分に反映することができる。

ＨＳＰ６５は、分子シャペロンとして機能し、Ｔ細胞エピトープを補助する分子ベクターとしても機能し、抗原提示細胞のＭＨＣＩＩ分子によって認識され、それによって体内のＣＤ４＋細胞の分化と増殖を刺激する。熱ショックタンパク質は、自然免疫を活性化し、ＤＣを刺激してＭＨＣ（クラスＩ及びＩＩ）および共刺激分子のレベルをアップレギュレートする免疫危険信号としてのＨＳＰなどの補助効果もある。さらに、マクロファージ、ＤＣ、ＮＫ細胞の表面にＨＳＰ受容体があり、ＨＳＰはＡＰＣの受容体に結合し、ＭＨＣ－Ｉ経路を介してＡＰＣの表面に抗原ペプチドを提示し、特異的な免疫応答を誘導し、免疫応答細胞を介した免疫応答において免疫調節機能を果たす。

さらに、この組み換えタンパク質は、１つのＨＳＰ６５タンパク質および６セグメント縦列反復の抗原性エピトープポリペプチドＭＯＧ_{３５‐５５}を含み、すなわち、前記組み換えタンパク質はＨＳＰ６５および６ＭＯＧ_{３５‐５５}を含む。ＭＯＧ_{３５‐５５}の免疫原性を向上させるために、本発明において、ＭＯＧ_{３５‐５５}を連続して６回繰り返し、アミノ酸フラグメントの免疫効果を完全に発揮することができる。

さらに、前記ＨＳＰ６５タンパク質および６セグメント縦列反復の抗原性エピトープポリペプチドＭＯＧ_{３５‐５５}間は可撓性リンカーによって接続される。具体的に、隣接のＭＯＧ_{３５‐５５}間は２つのセリン（Ｓｅｒ‐Ｓｅｒ）を介在して接続される。さらにＨＳＰ６５のカルボキシル末端と融合し、それらの間に可撓性リンカーＡｌａ‐Ｓｅｒ‐Ａｌａを追加してＨＳＰ６５が正しく折りたたまれるように確保する。

さらに、前記組み換えタンパク質配列は配列番号１である。

これに対応して、本発明は多発性硬化症耐性の組み換えタンパク質の調製方法をさらに提供し、この方法は上記の多発性硬化症耐性の組み換えタンパク質の調製に使用され、この方法は、
（１）組み換えプラスミドｐＥＴ２８ａ‐Ｈｉｓ‐ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}を構築し、この組み換えプラスミドを有するエンジニアリング菌株を取得するステップと、
（２）ＬＢ培地でエンジニアリング菌株を培養し、細菌が対数増殖期に達したら、最終濃度が５ｍｍｏｌ／Ｌになるように培地に減菌のラクトース溶液０．５ｍｏｌ／Ｌを加え、継続的に７時間培養した後細菌を収集するステップと、
（３）収集された細菌を使用して融合タンパク質を分離し、かつ融合タンパク質を精製することにより、前記多発性硬化症耐性の組み換えタンパク質を得るステップと、を含む。

上記方法において、５ｍｍｏｌ／Ｌのラクトース濃度で誘導し、誘導した後継続的に７時間培養して、良好な増殖効果および標的タンパク質の大量発現を達成することができる。

上記の組み換えプラスミドを用いたエンジニアリング菌株の調製方法によれば、組み換えプラスミドｐＥＴ２８ａ‐Ｈｉｓ‐ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}を有するエンジニアリング菌株を正確に取得することができ、操作の難しさを軽減する。

上記の溶解方法と精製方法によれば、タンパク質のコンフォメーションを確保しながらより高純度の組み換えタンパク質を取得することができる。

上記の多発性硬化症耐性の組み換えタンパク質は、多発性硬化症ワクチンおよび／または多発性硬化症薬物の調製用途に使用される。

多数の研究により、ＭＯＧおよび関連する抗原ペプチドの皮下免疫がマウスのＥＡＥ症状の悪化を誘発する可能性があることが実証されている。さらに、前記多発性硬化症ワクチンまたは多発性硬化症薬物は点鼻薬として投与される。

自己抗原の粘膜投与による免疫寛容の誘導は、自己免疫疾患を予防する効果的な方法である。鼻粘膜は粘膜免疫系の重要な部分であり、鼻腔は血管が豊富であり、粘膜免疫と全身免疫の両方が鼻腔接種によって生成される可能性があるため、鼻腔はタンパク質分解性が少ない酵素、同じ少量の抗原をより効果的に送達して粘膜免疫系を刺激することができ、ワクチン接種の操作は簡単で、注射器などの特別な器具を必要とせず、多くの人に簡単に受け入れられ、交差感染を回避でき、さらに、鼻腔内注入免疫は、免疫原の量を大幅に減らすことができ、安全で効果的な免疫方法である。この研究では、ＥＡＥ／ＭＳの効果的な予防の目的を達成するために、特定の免疫寛容反応が鼻粘膜免疫によって誘発された。

以下、図１～図１２を参照して、本発明の実施例の多発性硬化症耐性の組み換えタンパク質およびその調製方法を説明する。

一、材料：
１．菌株、プラスミドと動物
宿主株ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）は遺伝子工学でよく使用されている菌株であり、プラスミドｐＥＴ２８ａは遺伝子工学でよく使用されているクローニングベクターであり、ＴｉａｎｇｅｎＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｉｊｉｎｇ）Ｃｏ．、Ｌｔｄから購入した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、６～８週齢、雌性、体重１６～２０ｇ、広東省医学実験動物セーターから購入した。

マウスＥＡＥ／ＭＳ疾患モデルの調製で使用されたＭＯＧ_{３５‐５５}ポリペプチド（ＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＷＨＬＹＲＮＧＫ）は、ＧｉｌｌＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏ．、Ｌｔｄ．によって合成され、合成純度が９９．３９％を超える。

２．酵素と主要試薬
分子クローニングツール酵素は、ＴａＫａＲａから購入し、ＰＣＲ精製試薬キットはＰｒｏｍｅｇａ会社から購入し、百日咳毒素（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓｔｏｘｉｎ、ＰＴＸ）は米国Ｅｎｚｏ会社から購入し、完全フロイントアジュバント（ｃｏｍｐｌｅｔｅＦｒｅｕｎｄ’ｓａｄｊｕｖａｎｔ、ＣＦＡ）はＳｉｇｍａから購入した。

３．プラスミドベクター
６ＭＯＧ_{３５‐５５}の合成では、上海ＪｉｅｒｕｉＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＣｏ．、Ｌｔｄ．によって６ＭＯＧ_{３５‐５５}遺伝子配列コドンを大腸菌の優性コドンに従って最適化し、合成してｐＥＴ‐２８ａ（＋）のクローニングベクターに逆挿入して、ｐＥＴ２８ａ‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}を得る。ｐＥＴ２８ａ‐ＨＳＰ６５‐６ｐ２７７は、中国薬科大学のマイクロ遺伝子実験室から寄贈された。

二、組み換えプラスミドｐＥＴ２８ａ‐Ｈｉｓ‐ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}および対応の組み換えエンジニアリング菌株の構築
組み換えプラスミドｐＥＴ２８ａ‐Ｈｉｓ‐ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}は必要に応じて適切な制限酵素切断部位を選択して構築され、具体的な構築プロセスは図１に示される。

まず、プラスミドｐＥＴ２８ａ‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}の取得：上海ＪｉｅｒｕｉＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＣｏ．、Ｌｔｄ．によって６ＭＯＧ_{３５‐５５}遺伝子配列の両側に制限酵素切断部位ＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩをそれぞれ設計し、コドンを大腸菌の優性コドンに従って最適化し、合成してｐＥＴ‐２８ａ（＋）のクローニングベクターに逆挿入し、プラスミドｐＥＴ２８ａ‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}を取得する。

Ｓａｎｇｏｎのプラスミド抽出試薬キットを使用してｐＥＴ２８ａ‐Ｈｉｓ‐ＨＳＰ６５‐６Ｐ２７７プラスミドを抽出し、プラスミドがＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで二重酵素消化され、ゲルを切断してプラスミド大きなフラグメント（線形化されたクローニングベクター）を回収し、アガロースゲルの電気泳動によって検証を行う。

小さなフラグメントを挿入して６ＭＯＧ_{３５‐５５}ＰＣＲを増幅する：プライマー５’端に線形化されたクローニングベクター末端と相同の配列を導入し、フラグメントが挿入されたＰＣＲ産物の両端にそれぞれ線形化されたクローニングベクターの両端と完全に一致する配列（１５‐２０ｂｐ）がある。ＳｈａｎｇｈａｉＳａｎｇｏｎＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＣｏ．、Ｌｔｄによってプライマーを合成し、２つのプライマーオリゴヌクレオチド配列は以下のとおりである（ＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素切断部位を黒太字で示す）：

Ｐ１を上流プライマー、Ｐ２を下流プライマー、ｐＥＴ２８ａ‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}プラスミドをテンプレートとしてＰＣＲを行い、標的遺伝子小フラグメントコード配列６ＭＯＧ_{３５‐５５}を取得した。取得した大、小フラグメントを接続して組み換え、転換した後、ＰＣＲ検出によって陽性クローニングを検証する。ＰＣＲスクリーニング陽性クローニングの上、下流プライマーはそれぞれ、上流プライマーＶ１：ＣＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＧＴＣＣＡＴ、下流プライマーＶ２：ＣＣＴＴＴＣＧＧＧＣＴＴＴＧＴＴＡＧＣＡＧである。

コロニーＰＣＲ検証が正確な陽性クローニング菌液を一晩培養し、プラスミドを抽出して二重酵素消化で検証した。正確な陽性クローニングをＳｈａｎｇｈａｉＳａｎｇｏｎＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＣｏ．、Ｌｔｄ．に送り配列を測定した。配列測定結果が図３に示され、比較した後配列が完全に正確であり、組み換えプラスミドｐＥＴ２８ａ‐Ｈｉｓ‐ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}を含む大腸菌ＢＬ２１発現菌（組み換えプラスミドを有するエンジニアリング菌株）を成功に構築した。

制限酵素切断部位に挿入上下流の約１００ｂｐに適切な同定プライマーＶ１、Ｖ２を設計し、図２Ａに示すように、陽性モノクローニング１、２のＰＣＲ産物は実際のサイズ６０５ｂｐと一致し、次の制限酵素切断の同定に使用できる。図２Ｂに示すように、ｐＥＴ２８ａ‐Ｈｉｓ‐Ｈｓｐ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}プラスミドのサイズは７３２２ｂｐであり、ＨｉｎｄＩＩＩ単一制限酵素で切断された後６０００～８０００ｋｂ間に単一バンドがあり、実際のサイズと一致し、ＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで二重酵素消化された後、４１８ｂｐのフラグメントが切断され、５００ｂｐでこのバンドがかすかに見え、二重酵素消化後の線形プラスミドはシングルカットのプラスミドよりもはるかに前の位置にあり、これは、標的遺伝子がベクターに接続されたことを意味する。その中で、図２Ａのレーン１‐２は陽性クローニングプラスミドＰＣＲ産物であり、図２Ｂのレーン１はｐＥＴ２８ａ‐Ｈｉｓ‐ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}完全プラスミドであり、レーン２はｐＥＴ２８ａ‐Ｈｉｓ‐Ｈｓｐ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}プラスミドＨｉｎｄＩＩＩ単一制限酵素切断産物であり、レーン３はｐＥＴ２８ａ‐Ｈｉｓ‐Ｈｓｐ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}プラスミドＮｈｅＩとＨｉｎｄＩＩＩ二重酵素消化産物である。

三、標的タンパク質の最適なラクトース誘導濃度を決定
組み換えプラスミドを有するエンジニアリング菌株を新鮮なＬＢ培地（５０μｇ／ｍＬＫａｎを含む）に接種し、３７℃で一定温度で振動して培養した。細菌が対数増殖期に成長したとき（約３～４時間後、ＯＤ６００ｎｍが約０．６）、それぞれ減菌の０．５ｍｏｌ／Ｌのラクトース溶液を加え、各ラクトースの最終濃度がそれぞれ１ｍｍｏｌ／Ｌ、３ｍｍｏｌ／Ｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ、７ｍｍｏｌ／Ｌ、９ｍｍｏｌ／Ｌであり、６時間誘導した後１ｍｌをサンプリングして細菌を遠心収集し、１２％ＳＤＳ‐ＰＡＧＥタンパク質電気泳動で最適なラクトース誘導濃度を決定する。ＢａｎｄＳｃａｎ５．０画像分析ソフトウェアにより電気泳動画像を分析し、図４のレーン１‐５はそれぞれ１ｍＭ、３ｍＭ、５ｍＭ、７ｍＭ、９ｍＭラクトースで誘導した後の標的タンパク質の発現レベルである。図４に示すように、最終濃度５ｍＭラクトース（レーン３、７５．９％）と９ｍＭラクトース（レーン５、７６．３％）の誘導量に有意差がなかったため、５ｍＭラクトース最終濃度をラクトースの最適誘導濃度として決定する。

四、標的タンパク質の最適誘導時間を決定する
ステップ３のエンジニアリング菌株増殖が対数増殖期に入ったら減菌の０．５ｍｏｌ／Ｌラクトース溶液を最終濃度が５ｍｍｏｌ／Ｌになるまで加え、３７℃で誘導および培養し、ラクトース誘導前と誘導後の１、２、３、４、５、６、７、８時間でそれぞれ１ｍＬサンプリングし、１２％ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ電気泳動分析を行う。図５のレーン１はラクトース誘導なしでｐＥＴ２８ａプラスミドでトランスフェクトされた大腸菌ＢＬ２１発現の総タンパク質であり、レーン２はラクトース誘導なしでＨｉｓ‐ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}プラスミドでトランスフェクトされた大腸菌ＢＬ２１の総タンパク質であり、レーン３‐１０はＨｉｓ‐ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}でトランスフェクトされた大腸菌ＢＬ２１がラクトースで誘導された後の１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間の総タンパク質発現レベルである。図５に示すように、最初の７時間の培養時間の増加に伴い、組み換えタンパク質の発現量は増加し、その後、発現量が有意に増加しない。したがって、インデューサーを加えた後継続的に７時間（レーン９）培養し細菌を収集しタンパク質を抽出する。

五、組み換えエンジニアリング菌株の発酵培養、および融合タンパク質Ｈｉｓ‐ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}の分離精製と再生
菌株活性化と移入後、対数増殖期に減菌の０．５ｍｏｌ／Ｌラクトース溶液を最終濃度が５ｍｍ／Ｌになるまで加えて誘導し、継続的に７時間培養した後、４℃、６０００ｒｐｍで２０分遠心分離し、細菌を収集し、１Ｌ培養物あたり湿った細菌の重量が約１２ｇであり、細菌を‐８０℃で凍結した。

上記の湿った細菌を１ｇ湿った細菌あたり２０ｍｌの細菌溶解緩衝液（２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ‐Ｈｃｌ緩衝液、５ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に懸濁し均一に混合した後ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００を最終濃度が０．５％になるまで加え、氷上超音波（出力９００Ｗ×６０％、超音波３ｓ、間隔３ｓ）で２０ｍｉｎ破砕し、超音波溶解液を４℃、１２０００ｒｐｍで２０ｍｉｎ遠心分離し、それぞれ上澄み液と沈殿物を取って、１２％ＳＤＳ‐ＰＡＧＥタンパク質電気泳動分析を行い、融合タンパク質の発現形態を決定する。図６Ａに示すように、標的タンパク質は主に沈殿物（レーン４）にあり、つまり封入体の形で発現された。

次に封入体を洗浄し、尿素で変性処理した。封入体の湿重量１ｇあたり２０ｍｌ洗浄液Ｉ（２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ‐ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０）、洗浄液ＩＩ（２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ‐ＨＣｌ緩衝液に溶解した２ｍｏｌ／Ｌの尿素）、および洗浄液ＩＩＩ（２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ‐ＨＣｌ緩衝液に溶解した１％ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００）で洗浄し、また封入体湿重要１ｇあたり４０ｍｌ封入体溶解液（８ｍｏｌ／Ｌ尿素、２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ‐ＨＣｌ緩衝液、５００ｍｍｏｌ／ＬＮａｃｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌイミダゾール、ｐＨ８．０）を加え、４℃で６時間以上攪拌し、沈殿物が変性し溶解した。尿素変性処理の後、標的タンパク質のほとんどが上澄み液に溶解した（図６Ａのレーン６）。１２０００ｒｐｍで２０ｍｉｎ遠心分離し、上澄み液を収集し、Ｎｉ‐ＮＴＡアガロースカラムで標的タンパク質を精製した。

Ｎｉ‐ＮＴＡアガロースカラムで標的タンパク質を精製：ｄｄＨ_２Ｏを使用して十分に洗浄し、２０％のエタノールとマトリックス中の空気を洗浄し、５倍のカラム容量の５０ｍＭＮｉＳＯ_４で充電し、５倍カラム容量のｄｄＨ_２Ｏで洗浄した後、５～１０倍のカラム容量のＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ（８Ｍ尿素、２０ｍＭＴｒｉｓ‐ＨＣｌ、０．５ＭＮａＣｌ、ｐＨ８．０）でバランスを取り、標的タンパク質の上澄み液を０．４５μｍメンブレンで濾過した後、Ｎｉ‐ＮＴＡを加え、５倍カラム容量の平衡液（ＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ）、１０ｍｍイミダゾール溶液で順次不純物タンパク質を除去した後、１００ｍＭイミダゾールで標的タンパク質を溶出し、必要な標的タンパク質溶液を取得した。上記収集された高純度標的タンパク質を含むタンパク質溶液をさらに希釈および再生し、４℃条件下で蒸留水で透析し塩を除去した。塩を除去した後のタンパク質溶液を‐２０℃で一晩予備凍結した後、凍結乾燥機に入れて粉末に凍結し乾燥する。組み換えタンパク質Ｈｉｓ‐ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}をニッケルカラムで精製した後、ウェスタンブロットで標的タンパク質を同定し、図６Ｂに示される。

そのうちに、図６Ａは標的タンパク質Ｈｉｓ‐ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}発現形式の決定であり、レーン１はタンパク質ベクタープラスミドｐＥＴ２８ａ‐Ｈｉｓ‐ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}を含む大腸菌ＢＬ２１のラクトース誘導前の総タンパク質であり、レーン２はタンパク質ベクタープラスミドｐＥＴ２８ａ‐Ｈｉｓ‐ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}を含む大腸菌ＢＬ２１のラクトース誘導後の総タンパク質であり、レーン３はｐＥＴ２８ａ‐Ｈｉｓ‐ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}で転換された大腸菌ＢＬ２１溶解液の上澄み液であり、レーン４はｐＥＴ２８ａ‐Ｈｉｓ‐ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}で転換された大腸菌ＢＬ２１溶解液の沈殿物であり、レーン５は尿素変性後の沈殿物であり、レーン６は尿素変性後の沈殿物の上澄み液である。図６Ｂは組み換えタンパク質Ｈｉｓ‐ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}のＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析であり、レーン１はプラスミドｐＥＴ２８ａを含む大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の総タンパク質であり、レーン２はＮｉ‐ＮＡＴカラムで精製した後の組み換えタンパク質Ｈｉｓ‐ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}であり、レーン３は再生後のＨｉｓ‐ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}タンパク質の凍結乾燥粉末である。

六、以上取得した組み換えタンパク質ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}の薬力学研究
６～８週齢、体重１６～２０ｇの雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスを選択し、ランダムにＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄの４組に分け、各組に１０匹を入れ、Ａ、Ｂ組はそれぞれ低用量、高用量融合タンパク質ワクチンＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}投与組であり、Ｃ組はＨＳＰ６５対照組であり、ＨＳＰ６５は対照組として投与量および方法がＡ組と同様であり、Ｄ組はＰＢＳ対照組であり、ＰＢＳは対照組として投与量および方法がＡ組と同様である。粘膜投与し、免疫化は１日おきに１回、合計５回実施し、具体的な免疫時間は図７に示される。Ａ組の低用量組（１００μｇ）では、組み換えタンパク質を減菌ＰＢＳで５ｍｇ／ｍｌ濃度に調製し、鼻腔から滴下投与し、２０μｌ／匹、両側鼻孔に各１０μｌ、合計１００μｇタンパク質を投与し、Ｂ組高用量組（２００μｇ）では、組み換えタンパク質を減菌ＰＢＳで１０ｍｇ／ｍｌ濃度に調製し、投与ステップは上記と同様であり、Ｃ組はＨＳＰ６５対照組であり、投与量がＡ組と同じであり、Ｄ組はＰＢＳ溶液２０μｌのみを滴下し、各鼻孔に１０μｌ投与した。

投与後、マウスのＭＳ／ＥＡＥモデルを構築：
ＭＯＧ_{３５‐５５}ポリペプチド（ＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＷＨＬＹＲＮＧＫ）を含むＰＢＳ溶液（３ｍｇ／ｍｌ）と同量のＣＦＡを三方弁を介して十分に混合し乳化して、エマルジョンを調製した。脇の下と鼠径部の４点で皮下注射し、各マウスに２００μｌの乳化生成物を注射し（ＭＯＧ_{３５‐５５}含有量が３００μｇ／匹）、ＥＡＥ／ＭＳ動物モデルを構築した。モデリングの日は０日目（ｄ０）として記録した。免疫の日（０時間）と２日目（４８時間）に、各組のマウスに百日咳毒素（ＰＴＸ）の腹腔内注射を行った（２００ｎｇ／匹）。百日咳毒素を使用してＭＯＧ_{３５‐５５}の免疫原性を高め、疾患モデルを作成した。

免疫後の異なる組のマウスの薬力学結果が以下のとおりである：ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}融合タンパク質ワクチンはＥＡＥマウス発生率を低下させ、図８に示すように、ＰＢＳ対照組の発生率が速く、２週目‐７週目で発生率がゆっくりと上昇し、典型的な慢性進行性ＥＡＥの臨床症状と一致する。ＰＢＳ対照組と比較すると、各投与組の発生時間が遅く、発生上昇傾向が中程度であった。ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}（１００μｇ）組はｗｅｅｋ５で発症し、ｗｅｅｋ９の発生率は１０％（１匹）であった。ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}（２００μｇ）組は７週目で発症し、発生率は２０％（２匹）であった。ＨＳＰ６５組は４週目で発症し、９週目の発生率は４４．４％（４匹）であった。実験結果から分かるように、ＰＢＳ組と比較して、ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}融合タンパク質ワクチン、ＨＳＰ６５組はいずれもマウスＥＡＥの発生を顕著に遅らせ、発生率を低下させる可能性があるが、ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}組の効果がＨＳＰ６５組よりも優れ、かつ低用量１００μｇ組の効果が最も良い。

ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}融合タンパク質ワクチンはＥＡＥマウス臨床スコアを低下させ、図９に示すように、ＰＢＳ対照組は１４日目で臨床症状が発生し、ゆっくりと上昇傾向を示し、慢性進行性ＭＳの臨床表現と一致し、最も高い臨床スコアは２．３３±０．２１であった。ＨＳＰ６５組は２１日目で臨床症状が発生し、最も高い臨床スコアは１．５８±０．１５であり、ＰＢＳ対照組と有意差がなかった。ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}（１００μｇ）組は２０日目で臨床症状が発生し、最も高い臨床スコアが０．３３±０．２１であり、ＰＢＳ対照組と有意差があり（Ｐ＜０．００１）、ＨＳＰ６５組と非常に有意差があった（Ｐ＜０．０１）。その中で、図９中、＊＊＊Ｐ＜０．００１はＰＢＳ組との比較を示し、＃Ｐ＜０．０５はＨＳＰ６５投与組との比較を示し、＃＃Ｐ＜０．０１はＨＳＰ６５投与組との比較を示した。ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}（２００μｇ））組は１７日目で臨床症状が発生し、最も高い臨床スコアは０．６７±０．３３であり、ＰＢＳ対照組と非常に有意差があり（Ｐ＜０．００１）、ＨＳＰ６５組と顕著な有意差があった（Ｐ＜０．０５）。実験結果から分かるように、ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}（１００μｇ）、ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}（２００μｇ）はいずれもマウスＥＡＥスコアを顕著に低下させ、両組間の臨床スコア平均値は統計学的差がないが、低用量ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}（１００μｇ）組の臨床スコアが最も低い。

ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}融合タンパク質ワクチンはＥＡＥマウス炎症と脱髄度合いを軽減し、図１０に示すように、実験の最後に、ＰＢＳ対照組のマウス脳組織ＨＥ染色は複数の炎症性損傷を示し、炎症性細胞浸潤が広範な血管スリーブを形成し、ＬＦＢ染色に明らかな脱髄病変が見られ、青いミエリン領域はほとんど見られなく、ＨＳＰ６５対照組の炎症性脱髄損傷はＰＢＳ対照組よりも少ないが、まだ複数の血管スリーブが形成され、ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}（２００μｇ）、ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}（１００μｇ）の炎症性および脱髄損傷度合いは徐々に減少し、両者間に統計学的差がなかった。これは、ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}融合タンパク質ワクチンはＥＡＥマウスの脳の炎症損傷および脊髄脱髄度合いを大幅に軽減し、低用量（１００μｇ）の効果がより良好であったことを示す。各組のマウス炎症、脱髄スコアをまとめて図１１に示し、図１１中、＊Ｐ＜０．０５はＰＢＳ組との比較を示し、＊＊Ｐ＜０．０１はＰＢＳ組との比較を示した。

ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}融合タンパク質ワクチンは、血清炎症性サイトカインＩＦＮ‐γおよびＩＬ‐１７Ａレベルを低下させた。図１２Ａに示すように、ＰＢＳ対照組のＩＦＮ‐γレベルは各階段でも他の投与組よりも有意に高く、１５日目で有意差がなく、２７日目、６０日目で各組と非常に有意差があり（Ｐ＜０．０１）、３７日目でＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}（１００μｇ）組と顕著な有意差があり（Ｐ＜０．０５）、４８日目でＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}（１００μｇ）組、ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}（２００μｇ）組、ＨＳＰ６５組と顕著な有意差があった（Ｐ＜０．０５）。結果から分かるように、ＰＢＳ対照組と比較して、各投与組はいずれもＩＦＮ‐γレベルを低下させることができ、その中で、ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}（１００μｇ）組の効果が最も良好である。図１２中の＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１はＰＢＳ組との比較を示し、＃＃Ｐ＜０．０１はＨＳＰ６５組との比較を示した。

ＩＬ‐１７Ａレベルは、図１２Ｂに示すように、１５日目で、ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}（１００μｇ）組、ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}（２００μｇ）組はＨＳＰ６５組、ＰＢＳ対照組と非常に有意差があり（Ｐ＜０．０１）、各階段でＨＳＰ６５組はＰＢＳ対照組と有意差がなかった。２７日目で、ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}（１００μｇ）組、ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}（２００μｇ）組はＰＢＳ対照組と顕著な有意差があった（Ｐ＜０．０５）。６０日目で、ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}（１００μｇ）組はＰＢＳ対照組と顕著な有意差があった（Ｐ＜０．０５）。結果から分かるように、ＨＳＰ６５組はＩＬ‐１７Ａレベルを顕著に低下させることができず、ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}融合タンパク質ワクチン組ＩＬ‐１７Ａは各階段でも最も低いレベルに保持され、ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}（１００μｇ）組の効果が最も良好である。

以上のように、ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}融合タンパク質ワクチンはＥＡＥマウス発生率を低下させることができ、その中で、低用量１００μｇの組のＥＡＥマウス発生率低下効果が最も良好であり、ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}融合タンパク質ワクチンはＥＡＥマウス臨床スコアを顕著に低下させることができ、低用量ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}（１００μｇ）の臨床スコアが最も低く、ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}融合タンパク質ワクチンはＥＡＥマウス炎症および脱髄を軽減し、低用量（１００μｇ）ではＥＡＥマウス炎症および脱髄降低度合いがより良好であり、ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}融合タンパク質ワクチンは血清炎症性サイトカインＩＦＮ‐γおよびＩＬ‐１７Ａレベルを低下させることができ、その中でＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}（１００μｇ）組の効果が最も良好である。上記から分かるように、本発明のＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}組み換えタンパク質は鼻腔内粘膜免疫の投与を通じて多発性硬化症を効果的に予防できる。

本発明の実施例の多発性硬化症耐性の組み換えタンパク質およびその調製方法の他の構成、および操作は、当業者にとって自明なことであるため、ここで詳細な説明を省略する。

本明細書の説明において、「実施例」、「例示」などの用語は、この実施例または例示を参照して説明される具体的な特徴、構造、材料または特性は本発明の少なくとも１つの実施例または例示に含まれることを意味する。本明細書では、上記の用語の概略的な説明は、必ずしも同じ実施例または例示を指すとは限らない。さらに、説明された具体的な特徴、構造、材料または特性は任意の１つまたは複数の実施例または例示で適切に組み合わせることができる。

本発明の実施例を示し説明したが、当業者は、本発明の原理および精神を逸脱することなく、これらの実施例に様々な変更、修正、置換および変化を加えることができ、本発明の保護範囲は特許請求の範囲およびその同等物によって定義されることを理解されたい。

［付記］
［付記１］
ＨＳＰ６５タンパク質、および抗原性エピトープポリペプチドＭＯＧ_{３５‐５５}を含む、ことを特徴とする多発性硬化症耐性の組み換えタンパク質。

［付記２］
前記組み換えタンパク質は、１つのＨＳＰ６５タンパク質、６セグメント縦列反復の抗原性エピトープポリペプチドＭＯＧ_{３５‐５５}を含み、すなわち、前記組み換えタンパク質は、ＨＳＰ６５、および６ＭＯＧ_{３５‐５５}を含む、ことを特徴とする付記１に記載の多発性硬化症耐性の組み換えタンパク質。

［付記３］
前記ＨＳＰ６５タンパク質と６セグメント抗原性エピトープポリペプチドＭＯＧ_{３５‐５５}間は可撓性リンカーによって接続される、ことを特徴とする付記２に記載の多発性硬化症耐性の組み換えタンパク質。

［付記４］
前記ＨＳＰ６５タンパク質と６セグメント抗原性エピトープポリペプチドＭＯＧ_{３５‐５５}間はＡｌａ‐Ｓｅｒ‐Ａｌａ可撓性リンカーによって接続される、ことを特徴とする付記３に記載の多発性硬化症耐性の組み換えタンパク質。

［付記５］
前記組み換えタンパク質の配列は配列番号１である、ことを特徴とする付記４に記載の多発性硬化症耐性の組み換えタンパク質。

［付記６］
（１）組み換えプラスミドｐＥＴ２８ａ‐Ｈｉｓ‐ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}を構築し、この組み換えプラスミドを有するエンジニアリング菌株を取得するステップと、
（２）ＬＢ培地でエンジニアリング菌株を培養し、細菌が対数増殖期に達したら、最終濃度が５ｍｍｏｌ／Ｌになるように培地に減菌のラクトース溶液０．５ｍｏｌ／Ｌを加え、継続的に７時間培養した後細菌を収集するステップと、
（３）収集された細菌を使用して融合タンパク質を分離し、かつ融合タンパク質を精製することにより、前記多発性硬化症耐性の組み換えタンパク質を得るステップと、を含む、ことを特徴とする付記２～５のいずれか１つに記載の多発性硬化症耐性の組み換えタンパク質の調製に使用される多発性硬化症耐性の組み換えタンパク質の調製方法。

［付記７］
前記ステップ（１）は、
６ＭＯＧ_{３５‐５５}のコドンをｐＥＴ‐２８ａ（＋）に挿入して、プラスミドｐＥＴ２８ａ‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}を取得することと、
プラスミドｐＥＴ２８ａ‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}テンプレートに対してＰＣＲを行い、増幅により６ＭＯＧ_{３５‐５５}配列をコードする標的遺伝子フラグメントを取得することと、
ｐＥＴ２８ａ‐Ｈｉｓ‐ＨＳＰ６５‐６Ｐ２７７ベクターをＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで二重酵素消化して、線形化されたクローニングベクターを取得することと、
６ＭＯＧ_{３５‐５５}配列をコードする標的遺伝子フラグメントと線形化されたクローニングベクターを組み換えて、組み換えプラスミドを取得し、組み換えプラスミドをコンピテントセルに形質転換し、陽性クローニングをＰＣＲでスクリーニングし、スクリーニングから得られた陽性クローニングを検証し、最終的にこの組み換えプラスミドを有するエンジニアリング菌株を取得することと、を含む、ことを特徴とする付記６に記載の多発性硬化症耐性の組み換えタンパク質の調製方法。

［付記８］
前記ステップ（３）において、
収集された細菌を氷上で溶解および超音波破砕し、それぞれ上澄み液および沈殿物を分析し、融合タンパク質が封入体であると確定し、
尿素を含む封入体溶解液で封入体を処理し、上澄み液を収集し、Ｎｉ‐ＮＴＡアガロースカラムで標的タンパク質を精製して、組み換えタンパク質Ｈｉｓ‐ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}を取得する、ことを特徴とする付記６に記載の多発性硬化症耐性の組み換えタンパク質の調製方法。

［付記９］
多発性硬化症ワクチンおよび／または多発性硬化症薬物の調製における、付記１～５のいずれか１つに記載の多発性硬化症耐性の組み換えタンパク質の用途。

［付記１０］
前記多発性硬化症ワクチンまたは多発性硬化症薬物は点鼻薬として投与される、付記９に記載の多発性硬化症耐性の組み換えタンパク質の用途。

Claims

多発性硬化症耐性の組み換えタンパク質であって、
前記組み換えタンパク質は、ＨＳＰ６５および６ＭＯＧ_{３５‐５５}を含み、
前記ＨＳＰ６５タンパク質と６セグメント抗原性エピトープポリペプチドＭＯＧ_{３５‐５５}間はＡｌａ‐Ｓｅｒ‐Ａｌａ可撓性リンカーによって接続され、
前記組み換えタンパク質の配列は配列番号１である、ことを特徴とする多発性硬化症耐性の組み換えタンパク質。
（１）組み換えプラスミドｐＥＴ２８ａ‐Ｈｉｓ‐ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}を構築し、この組み換えプラスミドを有するエンジニアリング菌株を取得するステップと、
（２）ＬＢ培地でエンジニアリング菌株を培養し、細菌が対数増殖期に達したら、最終濃度が５ｍｍｏｌ／Ｌになるように培地に減菌のラクトース溶液０．５ｍｏｌ／Ｌを加え、継続的に７時間培養した後細菌を収集するステップと、
（３）収集された細菌を使用して融合タンパク質を分離し、かつ融合タンパク質を精製することにより、多発性硬化症耐性の組み換えタンパク質を得るステップと、を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の多発性硬化症耐性の組み換えタンパク質の調製方法。
前記ステップ（１）は、
６ＭＯＧ_{３５‐５５}のコドンをｐＥＴ‐２８ａ（＋）に挿入して、プラスミドｐＥＴ２８ａ‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}を取得することと、
プラスミドｐＥＴ２８ａ‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}テンプレートに対してＰＣＲを行い、増幅により６ＭＯＧ_{３５‐５５}配列をコードする標的遺伝子フラグメントを取得することと、
ｐＥＴ２８ａ‐Ｈｉｓ‐ＨＳＰ６５‐６Ｐ２７７ベクターをＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで二重酵素消化して、線形化されたクローニングベクターを取得することと、
６ＭＯＧ_{３５‐５５}配列をコードする標的遺伝子フラグメントと線形化されたクローニングベクターを組み換えて、組み換えプラスミドを取得し、組み換えプラスミドをコンピテントセルに形質転換し、陽性クローニングをＰＣＲでスクリーニングし、スクリーニングから得られた陽性クローニングを検証し、最終的にこの組み換えプラスミドを有するエンジニアリング菌株を取得することと、を含む、ことを特徴とする請求項２に記載の多発性硬化症耐性の組み換えタンパク質の調製方法。
前記ステップ（３）において、
収集された細菌を氷上で溶解および超音波破砕し、それぞれ上澄み液および沈殿物を分析し、融合タンパク質が封入体であると確定し、
尿素を含む封入体溶解液で封入体を処理し、上澄み液を収集し、Ｎｉ‐ＮＴＡアガロースカラムで標的タンパク質を精製して、組み換えタンパク質Ｈｉｓ‐ＨＳＰ６５‐６ＭＯＧ_{３５‐５５}を取得する、ことを特徴とする請求項２に記載の多発性硬化症耐性の組み換えタンパク質の調製方法。
多発性硬化症ワクチンの調製における、請求項１に記載の多発性硬化症耐性の組み換えタンパク質の使用。
前記多発性硬化症ワクチンは点鼻薬として投与されるものである、請求項５に記載の多発性硬化症耐性の組み換えタンパク質の使用。