CN115850520A - 新型结核病亚单位疫苗al的制备方法和应用 - Google Patents
新型结核病亚单位疫苗al的制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115850520A CN115850520A CN202211596789.2A CN202211596789A CN115850520A CN 115850520 A CN115850520 A CN 115850520A CN 202211596789 A CN202211596789 A CN 202211596789A CN 115850520 A CN115850520 A CN 115850520A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- peptide
- fragment
- optionally
- fusion protein
- terminus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明提供了一种融合蛋白和结核病亚单位疫苗。融合蛋白包括:第一肽段,所述第一肽段包含Ag85A片段;第二肽段,所述第二肽段包括LpqH片段,所述第一肽段与所述第二肽段相连;亚单位疫苗包括上述的融合蛋白。本发明的融合蛋白可同时激发机体的细胞免疫与体液免疫,提高机体杀伤结核分枝杆菌的能力,该亚单位疫苗可有效预防结核病。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,具体地,本发明涉及一种新型结核病亚单位疫苗AL的制备方法和应用,更具体地,本发明涉及一种融合蛋白、核酸分子、表达载体、重组细胞和亚单位疫苗及其应用。
背景技术
结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)引起的一种危害极大的慢性消耗性传染病,每年有900多万新发病例,死亡人数约140万。随着耐药结核分枝杆菌和艾滋病毒-结核分枝杆菌(HIV-TB)合并感染的出现,这一情况变得更加复杂,使得结核病的预后和治疗情况更加恶化。牛结核病(Bovine Tuberculosis)是由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis,M.bovis)引起的一种人兽共患的慢性传染病,以组织器官的结核结节性肉芽肿和干酪样、钙化的坏死病灶为特征。其中以奶牛多发,严重影响了畜牧业的发展以及人类健康。
卡介苗(BCG)作为WHO目前唯一批准的预防结核病的疫苗,对婴儿及青少年具有保护作用,但是对成年人的保护作用并不明确,因此,亟需开发一种有效的结核疫苗。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此,本发明提供了一种结核病亚单位疫苗,该亚单位疫苗可同时激发并提高细胞免疫与体液免疫,对结核病具有很好的预防效果。
本发明是基于发明人的下列发现而完成的:
目前针对结核病的疫苗有很多种,正在开发的新型结核疫苗包括重组BCG(rBCG)疫苗、减毒M.tb疫苗、佐剂亚单位蛋白疫苗、病毒载体疫苗、全细胞疫苗、DNA疫苗、RNA疫苗等。
亚单位疫苗由于其易于生产、安全性好、特异性强、质量控制好等特点逐渐进入人们的视野。在有关重组亚单位疫苗抗原的筛选中,更倾向于选择能够诱导强烈的细胞免疫的抗原,但是研究证明多种细胞抗原的堆积对其免疫保护效果的提高并不明显。
基于此,发明人经过大量试验对重组亚单位疫苗抗原进行筛选,最终确定了Ag85A和LpqH两种蛋白。发明人发现,Ag85A是M.tb培养滤液蛋白的主要构成成分,也是M.tb的T细胞抗原,能够诱导极强的Th1型免疫应答,对调节细胞内感染很重要;LpqH是一种大量表达与CE相关的分泌型糖蛋白。发明人发现,选择上述两种蛋白制得的融合蛋白,可同时激发细胞免疫与体液免疫,提高机体杀伤结核分枝杆菌的能力。发明人将上述的融合蛋白与佐剂制成结核病亚单位疫苗,并将其注射到小鼠体内,然后采用结核分枝杆菌对小鼠进行攻菌,结果发现小鼠脏器中的结核分枝杆菌载量显著降低,几乎达到了与BCG相同的免疫保护力,说明该结核病亚单位疫苗可极大地提高机体抵抗结核分枝杆菌的能力,可有效预防和治疗结核病。
在本发明的一个方面,本发明提出了一种融合蛋白。根据本发明的实施例,所述融合蛋白包括:第一肽段,所述第一肽段包含Ag85A片段;第二肽段,所述第二肽段包括LpqH片段,所述第一肽段与所述第二肽段相连。根据本发明实施例的融合蛋白可同时激发机体的细胞免疫与体液免疫,提高机体杀伤结核分枝杆菌的能力。
在本发明的另一方面,本发明提出了一种核酸分子。根据本发明的实施例,所述核酸分子编码前述的融合蛋白。根据本发明实施例的核酸分子可有效地表达前述的融合蛋白。
在本发明的又一方面,本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例,携带前述的核酸分子。根据本发明实施例的表达载体可有效地表达前述的融合蛋白。
在本发明的又一方面,本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例,所述重组细胞包括:携带前述的核酸分子或前述的表达载体;或,表达前述的融合蛋白。根据本发明实施例的重组细胞可用于前述的融合蛋白体外表达和大量获得。
在本发明的又一方面,本发明提出了一种前述的融合蛋白、前述的核酸分子、前述的表达载体或前述的重组细胞在制备亚单位疫苗中的用途。
在本发明的又一方面,本发明提出了一种亚单位疫苗。根据本发明的实施例,所述亚单位疫苗包括:前述的融合蛋白。根据本发明实施例的亚单位疫苗可提高机体抵抗结核分枝杆菌的能力,有效预防和治疗结核病;并且,还可有效地加强BCG的免疫效应。
在本发明的又一方面,本发明提出了一种前述的亚单位疫苗在制备药物中的用途,所述药物用于加强BCG的免疫效应或者用于预防和/或治疗结核病。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解,其中:
图1为本发明实施例1中的AL的琼脂糖凝胶电泳图;
图2为本发明实施例1中的AL纯化后的SDS-PAGE考马斯染色图(左)及WB检测结果图(右);
图3为本发明实施例3中的动物保护性试验流程图;
图4为本发明实施例3中攻菌后各组小鼠脏器细菌载量检测结果图,其中,**表示P<0.01,****表示P<0.0001;
图5为本发明实施例3中各组小鼠攻菌四周后肺部病理变化检测结果;
图6为本发明实施例3中三次免疫(2周、4周、6周)以及攻菌后四周(10周)各组小鼠血清抗体效价的变化结果;
图7为本发明实施例3中三次免疫后各组小鼠血清细胞因子的变化结果。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是,术语“第一”、“第二”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地,在本发明的描述中,除非另有说明,“多个”的含义是两个或两个以上。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值,这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说,各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间,以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围,这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
在本文中,术语“包含”或“包括”为开放式表达,即包括本发明所指明的内容,但并不排除其他方面的内容。
在本文中,术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生,并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况,以及其中未发生该事件或状况的情况。
在本文中,术语“同一性”、“同源性”或“相似性”均用于描述相对于参考序列的氨基酸序列或核酸序列时,采用通过常规的方法进行确定两个氨基酸序列或核酸序列之间的相同氨基酸或核苷酸的百分比,例如参见,Ausubel等,编著(1995),Current Protocols inMolecular Biology,第19章(Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York);和ALIGN程序(Dayhoff(1978),Atlas of Protein Sequence and Structure 5:Suppl.3(National Biomedical Research Foundation,Washington,D.C.)。关于比对序列和测定序列同一性有很多算法,包括,Needleman等(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法;Smith等(1981)Adv.Appl.Math.2:482的局部同源性算法;Pearson等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444的相似性搜索方法;Smith-Waterman算法(Meth.Mol.Biol.70:173-187(1997);和BLASTP,BLASTN,和BLASTX算法(参见Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410)。利用这些算法的计算机程序也是可获得的,并且包括但不限于:ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件,或者WU-BLAST-2(Altschul等,Meth.Enzym.,266:460-480(1996));或者GAP,BESTFIT,BLAST Altschul等,上文,FASTA,和TFASTA,在Genetics Computing Group(GCG)包,8版,Madison,Wisconsin,USA中可获得;和Intelligenetics,Mountain View,California提供的PC/Gene程序中的CLUSTAL。
在本文中,术语“至少85%相似性”指与各参考序列至少为85%,可为85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%的相似性;术语“至少90%相似性”指与各参考序列至少为95%,可为95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%的相似性。
在本文中,术语“表达载体”通常是指能够插入在合适的宿主中自我复制的核酸分子,其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述表达载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体,以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述表达载体还包括具有多种上述功能的载体。所述表达载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常,通过培养包含所述表达载体的合适的宿主细胞,所述表达载体可以产生期望的表达产物。
在本文中,术语“重组细胞”通常是指采用基因工程技术或细胞融合技术对宿主细胞的遗传物质进行修饰改造或重组,获得具有稳定遗传的独特性状的细胞。其中,术语“宿主细胞”是指可导入重组表达载体的原核细胞或真核细胞。本文所用术语“转化的”或“转染的”是指通过本领域已知的各种技术将核酸(例如载体)引入细胞。合适的宿主细胞可以用本发明的DNA序列转化或转染,并且可以用于靶蛋白的表达和/或分泌。
在本文中,术语“融合蛋白”是指至少两个蛋白质或者多肽融合而成的新型蛋白,通常可以通过基因工程等技术实现上述融合操作,例如,通过DNA重组技术得到的两个基因重组后的表达产物。在本文中是指,Ag85A片段和LpqH片段呈融合状态。
在本文中,术语“片段”是指蛋白片段,可包含蛋白的全长片段,也可包含蛋白的部分片段。示例性地,Ag85A片段可为Ag85A蛋白的全长片段、也可为Ag85A蛋白的部分片段;LpqH片段可为LpqH蛋白的全长片段、也可为LpqH蛋白的部分片段。
在本文中,术语“药学上可接受的”是指物质或组合物必须与包含制剂的其它成分和/或用其治疗的哺乳动物化学上和/或毒理学上相容。优选地,本发明所述的“药学上可接受的”是指联邦监管机构或国家政府批准的或美国药典或其他一般认可药典上列举的在动物中、特别是人体中使用的。
在本文中,术语“药学上可接受的辅料”均可包括任何溶剂、固体赋形剂、稀释剂或其他液体赋形剂等等,适合于特有的目标剂型。除了任何常规的辅料与本发明的化合物不相容的范围,例如所产生的任何不良的生物效应或与药学上可接受的组合物的任何其他组分以有害的方式产生的相互作用,它们的用途也是本发明所考虑的范围。
在本文中,术语“治疗”是指用于指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的,和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病,包括:(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病或病症发生;(b)抑制疾病,例如阻滞疾病发展;或(c)缓解疾病,例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药,包括但不限于将含本文所述化合物的药物给予有需要的个体。
本发明提出了一种融合蛋白、核酸分子、表达载体、重组细胞和亚单位疫苗及其应用,下面将分别对其进行详细描述。
融合蛋白
在本发明的一个方面,本发明提出了一种融合蛋白。根据本发明的实施例,所述融合蛋白包括:第一肽段,所述第一肽段包含Ag85A片段;第二肽段,所述第二肽段包括LpqH片段,所述第一肽段与所述第二肽段相连。根据本发明实施例的融合蛋白可同时激发机体的细胞免疫与体液免疫,提高机体杀伤结核分枝杆菌的能力。
MQLVDRVRGAVTGMSRRLVVGAVGAALVSGLVGAVGGTATAGAFSRPGLPVEYLQVPSPSMGRDIKVQFQSGGANSPALYLLDGLRAQDDFSGWDINTPAFEWYDQSGLSVVMPVGGQSSFYSDWYQPACGKAGCQTYKWETFLTSELPGWLQANRHVKPTGSAVVGLSMAASSALTLAIYHPQQFVYAGAMSGLLDPSQAMGPTLIGLAMGDAGGYKASDMWGPKEDPAWQRNDPLLNVGKLIANNTRVWVYCGNGKPSDLGGNNLPAKFLEGFVRTSNIKFQDAYNAGGGHNGVFDFPDSGTHSWEYWGAQLNAMKPDLQRALGATPNTGPAPQGA(SEQ IDNO:1)。
根据本发明的实施例,所述LpqH片段为LpqH全长肽链。
根据本发明的实施例,所述LpqH片段具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:2具有至少85%相似性的氨基酸序列。
VKRGLTVAVAGAAILVAGLSGCSSNKSTTGSGETTTAAGTTASPGAASGPKVVIDGK DQNVTGSVVCTTAAGNVNIAIGGAATGIAAVLTDGNPPEVKSVGLGNVNGVTLGYTSGT GQGNASATKDGSHYKITGTATGVDMANPMSPVNKSFEIEVTCS(SEQ ID NO:2)。
根据本发明的实施例,所述融合蛋白进一步包括连接肽。
根据本发明的实施例,所述连接肽的N端与所述第一肽段的C端相连,所述连接肽的C端与所述第二肽段的N端相连;或者,所述连接肽的N端与所述第二肽段的C端相连,所述连接肽的C端与所述第一肽段的N端相连。
根据本发明的实施例,所述连接肽的氨基酸序列为(GGGGS)n,其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10,更优选为2或3。由此,采用上述连接肽可使融合蛋白结构更加稳定,融合蛋白的抗原表位充分暴露。
根据本发明的实施例,所述连接肽包括SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:3)。
根据本发明的实施例,所述融合蛋白进一步包括标签。
根据本发明的实施例,所述第一肽段的C端与所述第二肽段的N端相连,所述标签与所述第二肽段的C端相连或所述标签与所述第一肽段的N端相连;或者,所述第二肽段的C端与所述第一肽段的N端相连,所述标签与所述第一肽段的C端相连或所述标签与所述第二肽段的N端相连。
根据本发明的实施例,所述标签为HIS标签、FLAG标签、HA标签、GST标签、Strep II标签和MBP标签中的至少之一。由此,采用上述标签可进一步提高融合蛋白结构空间的正确率。
根据本发明的实施例,所述HIS标签具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
HHHHHH(SEQ ID NO:4)。
根据本发明的实施例,所述融合蛋白具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。发明人经过实验发现,采用上述融合蛋白可同时激活机体内的体液免疫和细胞免疫,从而进一步提高机体杀伤结核分枝杆菌的能力。
MQLVDRVRGAVTGMSRRLVVGAVGAALVSGLVGAVGGTATAGAFSRPGLPVEYLQVPSPSMGRDIKVQFQSGGANSPALYLLDGLRAQDDFSGWDINTPAFEWYDQSGLSVVMPVGGQSSFYSDWYQPACGKAGCQTYKWETFLTSELPGWLQANRHVKPTGSAVVGLSMAASSALTLAIYHPQQFVYAGAMSGLLDPSQAMGPTLIGLAMGDAGGYKASDMWGPKEDPAWQRNDPLLNVGKLIANNTRVWVYCGNGKPSDLGGNNLPAKFLEGFVRTSNIKFQDAYNAGGGHNGVFDFPDSGTHSWEYWGAQLNAMKPDLQRALGATPNTGPAPQGAGGGGSGGGGSGGGGSVKRGLTVAVAGAAILVAGLSGCSSNKSTTGSGETTTAAGTTASPGAASGPKVVIDGKDQNVTGSVVCTTAAGNVNIAIGGAATGIAAVLTDGNPPEVKSVGLGNVNGVTLGYTSGTGQGNASATKDGSHYKITGTATGVDMANPMSPVNKSFEIEVTCSHHHHHH(SEQ IDNO:5)。
核酸分子、核酸分子和重组细胞
在制备或者获取这些融合蛋白的过程中,可以利用表达这些融合蛋白的核酸分子,与不同的载体连接,然后在不同细胞中表达,来获得相应融合蛋白。
在本发明的另一方面,本发明提出了一种核酸分子。根据本发明的实施例,所述核酸分子编码前述的融合蛋白。利用该核酸分子可以有效地用于表达前述的融合蛋白,尤其是在原核生物或者低等真核生物表达体系中可以有效地表达前述的融合蛋白。
根据本发明的实施例,所述核酸分子为DNA。
SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列用于编码SEQ ID NO:5。
ATGCAGCTTGTTGACAGGGTTCGTGGCGCCGTCACGGGTATGTCGCGTCGACTCGTGGTCGGGGCCGTCGGCGCGGCCCTAGTGTCGGGTCTGGTCGGCGCCGTCGGTGGCACGGCGACCGCGGGGGCATTTTCCCGGCCGGGCTTGCCGGTGGAGTACCTGCAGGTGCCGTCGCCGTCGATGGGCCGTGACATCAAGGTCCAATTCCAAAGTGGTGGTGCCAACTCGCCCGCCCTGTACCTGCTCGACGGCCTGCGCGCGCAGGACGACTTCAGCGGCTGGGACATCAACACCCCGGCGTTCGAGTGGTACGACCAGTCGGGCCTGTCGGTGGTCATGCCGGTGGGTGGCCAGTCAAGCTTCTACTCCGACTGGTACCAGCCCGCCTGCGGCAAGGCCGGTTGCCAGACTTACAAGTGGGAGACCTTCCTGACCAGCGAGCTGCCGGGGTGGCTGCAGGCCAACAGGCACGTCAAGCCCACCGGAAGCGCCGTCGTCGGTCTTTCGATGGCTGCTTCTTCGGCGCTGACGCTGGCGATCTATCACCCCCAGCAGTTCGTCTACGCGGGAGCGATGTCGGGCCTGTTGGACCCCTCCCAGGCGATGGGTCCCACCCTGATCGGCCTGGCGATGGGTGACGCTGGCGGCTACAAGGCCTCCGACATGTGGGGCCCGAAGGAGGACCCGGCGTGGCAGCGCAACGACCCGCTGTTGAACGTCGGGAAGCTGATCGCCAACAACACCCGCGTCTGGGTGTACTGCGGCAACGGCAAGCCGTCGGATCTGGGTGGCAACAACCTGCCGGCCAAGTTCCTCGAGGGCTTCGTGCGGACCAGCAACATCAAGTTCCAAGACGCCTACAACGCCGGTGGCGGCCACAACGGCGTGTTCGACTTCCCGGACAGCGGTACGCACAGCTGGGAGTACTGGGGCGCGCAGCTCAACGCTATGAAGCCCGACCTGCAACGGGCACTGGGTGCCACGCCCAACACCGGGCCCGCGCCCCAGGGCGCCGGTGGAGGCGGTTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGTGGAGGCGGTTCAGTGAAGCGTGGACTGACGGTCGCGGTAGCCGGAGCCGCCATTCTGGTCGCAGGTCTTTCCGGATGTTCAAGCAACAAGTCGACTACAGGAAGCGGTGAGACCACGACCGCGGCAGGCACGACGGCAAGCCCCGGCGCCGCCTCCGGGCCGAAGGTCGTCATCGACGGTAAGGACCAGAACGTCACCGGCTCCGTGGTGTGCACAACCGCGGCCGGCAATGTCAACATCGCGATCGGCGGGGCGGCGACCGGCATTGCCGCCGTGCTCACCGACGGCAACCCTCCGGAGGTGAAGTCCGTTGGGCTCGGTAACGTCAACGGCGTCACGCTGGGATACACGTCGGGCACCGGACAGGGTAACGCCTCGGCAACCAAGGACGGCAGCCACTACAAGATCACTGGGACCGCTACCGGGGTCGACATGGCCAACCCGATGTCACCGGTGAACAAGTCGTTCGAAATCGAGGTGACCTGTTCCCACCACCACCACCACCACTAA(SEQ ID NO:6)。
在本发明的又一方面,本发明提出了一种核酸分子。根据本发明的实施例,携带前述的核酸分子。利用该表达载体可以有效地用于表达前述的融合蛋白,尤其是在原核生物或者低等真核生物表达体系中可以有效地表达前述的融合蛋白。
根据本发明的实施例,所述表达载体为真核表达载体。
根据本发明的实施例,所述表达载体为慢病毒载体。
在本发明的又一方面,本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例,所述重组细胞包括:携带前述的核酸分子或前述的表达载体;或,表达前述的融合蛋白。本发明所述的实施例的重组细胞可用于前述的融合蛋白体外表达和大量获得。
根据本发明的实施例,所述重组细胞是通过将前述的表达载体引入至宿主细胞中而获得的。
根据本发明的实施例,所述重组细胞包括真核细胞或原核细胞。
示例性地,所述重组细胞为BL21(DE3)感受态细胞。
本领域技术人员能够理解的是,前面针对融合蛋白所描述的特征和优点,同样适用于该核酸分子、表达载体和重组细胞,在此不再赘述。
亚单位疫苗
在本发明的又一方面,本发明提出了一种亚单位疫苗。根据本发明的实施例,所述亚单位疫苗包括:前述的融合蛋白。本发明所述的实施例的亚单位疫苗可提高机体抵抗结核分枝杆菌的能力,有效预防和治疗结核病。并且,还可有效地加强BCG的免疫效应。
根据本发明的实施例,所述亚单位疫苗进一步包括药学上可接受的辅料。
根据本发明的实施例,所述辅料包括佐剂。
根据本发明的实施例,所述佐剂包括选自铝佐剂、Poly IC佐剂、弗氏佐剂、CpGODN、DDA、MPLA、IC31、AS01和AS03中的至少之一,优选为铝佐剂。发明人经过试验发现,采用上述佐剂可提高亚单位疫苗的免疫原性。
需要说明的是,“铝佐剂”通常是指包含铝的免疫佐剂,其至少包括但不限于氢氧化铝凝胶、磷酸铝、硫酸铝、铵明矾和钾明矾中的一种或多种。例如,可为氢氧化铝和氢氧化镁悬浮液。
根据本发明的实施例,所述佐剂为氢氧化铝佐剂。
根据本发明的实施例,所述融合蛋白和所述佐剂的体积比为(2~4):1,优选为3:1。由此,可进一步提高亚单位疫苗的免疫原性。
需要说明的是,融合蛋白和佐剂的混合物中,融合蛋白终浓度为(10~50)μg/100μL,优选为10~20μg/100μL;佐剂是以溶液的形式提供的,示例性地,将佐剂和PBS缓冲液混合获得佐剂溶液,佐剂溶液中的佐剂体积占比为25%。
本领域技术人员能够理解的是,前面针对融合蛋白、核酸分子、表达载体和重组细胞所描述的特征和优点,同样适用于该亚单位疫苗,在此不再赘述。
用途
在本发明的又一方面,本发明提出了一种前述的融合蛋白、前述的核酸分子、前述的表达载体或前述的重组细胞在制备亚单位疫苗中的用途。
在本发明的又一方面,本发明提出了一种前述的亚单位疫苗在制备药物中的用途,所述药物用于加强BCG的免疫效应或者用于预防和/或治疗结核病。
本领域技术人员能够理解的是,前面针对融合蛋白、核酸分子、表达载体、重组细胞和亚单位疫苗所描述的特征和优点,同样适用于该用途,在此不再赘述。
方法
在本发明的又一方面,本发明提出了一种预防和/或治疗结核病的方法。根据本发明的实施例,向受试者施用药学上可接受量的前述的融合蛋白或亚单位疫苗。根据本发明实施例的方法可提高机体抵抗结核分枝杆菌的能力,有效预防和治疗结核病。
根据本发明的实施例,所述融合蛋白或亚单位疫苗的给药剂量为10~50μg/只C57BL/6J小鼠,20μg/只C57BL/6J小鼠。
需要说明的是,不同动物与人类之间的给药剂量的换算系数均不相同,其他动物的给药量根据本领域可知的换算系数进行换算即可,本领域技术人员可根据已知的标准进行换算,以获得适合不同物种(例如人)和其他种类的小鼠的给药剂量,其也在本发明的保护范围内。例如,按照体表面积法,实验小鼠和人类之间的用药剂量存在10-12倍的换算系数。根据本发明的实施例,所述融合蛋白或亚单位疫苗的给药次数为3次,每次间隔1~2周。
根据本发明的实施例,所述方法的给药途径包括皮下注射或静脉注射。
本领域技术人员能够理解的是,前面针对亚单位疫苗所描述的特征和优点,同样适用于该方法,在此不再赘述。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解,下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
需要说明的是,本发明的BCG是通过常规方法筛选获得,其免疫效果参见图4。
实施例1:融合蛋白的制备
1、Ag85A-LpqH基因的扩增
发明人以H37Rv为模板,以P1、P2为上下游引物进行PCR扩增Ag85A(氨基酸序列为SEQ ID NO:1)+连接肽(氨基酸序列为SEQ ID NO:3),即为扩增片段1(核苷酸序列为SEQ IDNO:11);以H37Rv为模板,以P3和P4为上下游引物进行PCR扩增连接肽(氨基酸序列为SEQ IDNO:3)+LpqH(氨基酸序列为SEQ ID NO:2),即为扩增片段2(核苷酸序列为SEQ ID NO:12)。其中,P1、P2、P3和P4引物的核苷酸序列参见表1;PCR反应体系参见表2,PCR反应程序:98℃3min;98℃10s,55℃5s,72℃1min/kb,共30个循环;72℃5min。
按上述反应体系首先扩增出分别含有Ag85A与LpqH的扩增片段1和扩增片段2,然后将扩增片段1、扩增片段2和HIS标签(氨基酸序列为SEQ ID NO:4;核苷酸序列为SEQ IDNO:13)的核苷酸序列通过重叠、延伸、拼接PCR(SOE-PCR)的方法,将扩增片段1和扩增片段2连接得到融合的目的基因Ag85A-LpqH片段,分别命名为AL(氨基酸序列为SEQ ID NO:5、核苷酸序列为SEQ ID NO:6)。其中,SOE-PCR的反应体系参见表3,反应程序:98℃3min;98℃10s,55℃5s,72℃1min/kb,共5个循环。5个循环之后,按顺序依次添加表4内容于表3已循环的PCR体系中,继续进行扩增,98℃3min;98℃10s,55℃5s,72℃2min/kb,共30个循环。PCR结束后将上述步骤获得的AL进行1%琼脂糖凝胶电泳,具体参见图1,结果显示,琼脂糖凝胶电泳条带大小与理论大小一致。
按表4分别将AL产物与表4中的试剂进行混合,对Ag85A-LpqH片段进行扩增。其中,反应程序:98℃3min;98℃10s,55℃5s,72℃1min/kb,共30个循环;72℃5min。
需要说明的是,该实施例的扩增过程中所需高保真酶(PrimeSTAR HS DNAPolymerase)均购自TaKaRa(北京)有限公司。
其中,扩增片段1的核苷酸序列为:
ATGCAGCTTGTTGACAGGGTTCGTGGCGCCGTCACGGGTATGTCGCGTCGACTCGTGGTCGGGGCCGTCGGCGCGGCCCTAGTGTCGGGTCTGGTCGGCGCCGTCGGTGGCACGGCGACCGCGGGGGCATTTTCCCGGCCGGGCTTGCCGGTGGAGTACCTGCAGGTGCCGTCGCCGTCGATGGGCCGTGACATCAAGGTCCAATTCCAAAGTGGTGGTGCCAACTCGCCCGCCCTGTACCTGCTCGACGGCCTGCGCGCGCAGGACGACTTCAGCGGCTGGGACATCAACACCCCGGCGTTCGAGTGGTACGACCAGTCGGGCCTGTCGGTGGTCATGCCGGTGGGTGGCCAGTCAAGCTTCTACTCCGACTGGTACCAGCCCGCCTGCGGCAAGGCCGGTTGCCAGACTTACAAGTGGGAGACCTTCCTGACCAGCGAGCTGCCGGGGTGGCTGCAGGCCAACAGGCACGTCAAGCCCACCGGAAGCGCCGTCGTCGGTCTTTCGATGGCTGCTTCTTCGGCGCTGACGCTGGCGATCTATCACCCCCAGCAGTTCGTCTACGCGGGAGCGATGTCGGGCCTGTTGGACCCCTCCCAGGCGATGGGTCCCACCCTGATCGGCCTGGCGATGGGTGACGCTGGCGGCTACAAGGCCTCCGACATGTGGGGCCCGAAGGAGGACCCGGCGTGGCAGCGCAACGACCCGCTGTTGAACGTCGGGAAGCTGATCGCCAACAACACCCGCGTCTGGGTGTACTGCGGCAACGGCAAGCCGTCGGATCTGGGTGGCAACAACCTGCCGGCCAAGTTCCTCGAGGGCTTCGTGCGGACCAGCAACATCAAGTTCCAAGACGCCTACAACGCCGGTGGCGGCCACAACGGCGTGTTCGACTTCCCGGACAGCGGTACGCACAGCTGGGAGTACTGGGGCGCGCAGCTCAACGCTATGAAGCCCGACCTGCAACGGGCACTGGGTGCCACGCCCAACACCGGGCCCGCGCCCCAGGGCGCCGGTGGAGGCGGTTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGTGGAGGCGGTTCA(SEQ ID NO:11);
扩增片段2的核苷酸序列为:
GGTGGAGGCGGTTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGTGGAGGCGGTTCAGTGAAGCGTGGACTGACGGTCGCGGTAGCCGGAGCCGCCATTCTGGTCGCAGGTCTTTCCGGATGTTCAAGCAACAAGTCGACTACAGGAAGCGGTGAGACCACGACCGCGGCAGGCACGACGGCAAGCCCCGGCGCCGCCTCCGGGCCGAAGGTCGTCATCGACGGTAAGGACCAGAACGTCACCGGCTCCGTGGTGTGCACAACCGCGGCCGGCAATGTCAACATCGCGATCGGCGGGGCGGCGACCGGCATTGCCGCCGTGCTCACCGACGGCAACCCTCCGGAGGTGAAGTCCGTTGGGCTCGGTAACGTCAACGGCGTCACGCTGGGATACACGTCGGGCACCGGACAGGGTAACGCCTCGGCAACCAAGGACGGCAGCCACTACAAGATCACTGGGACCGCTACCGGGGTCGACATGGCCAACCCGATGTCACCGGTGAACAAGTCGTTCGAAATCGAGGTGACCTGTTCCCACCACCACCACCACCACTAA(SEQ ID NO:12);
HIS标签的核苷酸序列为:
CACCACCACCACCACCAC(SEQ ID NO:13)。
表1:P1-P4引物的核苷酸序列
表2:PCR反应体系(50μL)
表3:SOE-PCR反应体系
试剂 | 剂量 |
5×PrimeSTAR Buffer(Mg<sup>2+</sup>Plus) | 10μL |
dNTP Mixture(2.5mM each) | 4μL |
Ag85A | 2μL |
LpqH | 2μL |
ddH<sub>2</sub>O | 27.5μL |
表4:Ag85A-LpqH片段的扩增
试剂 | 剂量 |
引物P1 | 2μL |
引物P4 | 2μL |
PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μl) | 0.5μL |
2、pET-21a-AL表达载体的构建
将扩增得到的目的基因(AL)与载体pET-21a分别进行双酶切,并用T4 DNA连接酶进行连接,构建pET-21a-Ag85A-AL载体,导入DH5α感受态细胞,筛选测序后获得正确的重组载体。具体步骤如下:
将扩增得到的目的基因AL使用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(CWBIO,货号:CW2302)按照商品说明书进行酶切片段回收。回收后使用TECAN检测其浓度。
37℃,200rpm过夜培养pET-21a菌株(以1:1000转接至含有100μg/mL氨苄青霉素的5mL LB培养基中)。次日将菌液离心得到菌体,使用高纯度质粒小提试剂盒(CWBIO,货号:CW0500)按照商品说明书提取质粒备用,使用TECAN检测其浓度。
目的基因AL与载体pET-21a分别进行双酶切,双酶切所使用的酶为BamHI-HF(星选酶)(NEB,货号#R3136V)以及EcoRI-HF(星选酶)(NEB,货号#R3101V),各试剂的添加量如下所示:
使用双酶切酶进行酶切后,使用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(CWBIO,货号:CW2302)按照商品说明书进行酶切片段回收。回收后使用TECAN检测其浓度。回收后的片段使用T4 DNA连接酶(NEB,货号#M0202V)进行连接,各试剂的添加量如下所示:
试剂 | 剂量 |
酶切后的AL | 1μL(70ng) |
酶切后的pET-21a载体 | 1μL(50ng) |
T4 DNA连接酶 | 1μL |
T4 DNA连接酶反应缓冲液 | 2μL |
ddH<sub>2</sub>O | 15μL |
连接后取5μL连接后片段,按照商品说明书导入DH5α感受态细胞(CWBIO,货号:CW0808)中并涂布平板。
次日,随机挑选平板中的菌落,进行菌落PCR鉴定阳性后金唯智公司测序,测序成功后将菌液扩增,使用高纯度质粒小提试剂盒(CWBIO,货号:CW0500)按照商品说明书提取质粒备用,使用TECAN检测其浓度。
3、AL的诱导表达及纯化
分别将测序正确的AL的质粒按照商品说明书导入BL21(DE3)感受态细胞(CWBIO,CW0809)中,挑取单菌落培养冻存。表达时将其复苏后转接至含氨苄青霉素(Amp,100μg/mL)的LB液体培养基37℃震荡培养,至OD600在0.6~0.8时,加入终浓度为1mM的IPTG诱导,诱导4小时后离心获得菌体。用PBS重悬菌体后超声破碎,离心获得上清与沉淀,将所得沉淀用8M尿素4℃溶解完全后,离心取上清,使用亲和层析镍柱进行纯化。使用SDS-PAGE考马斯亮蓝染色及WB(Western Bloting)鉴定纯化后的AL,发现AL均位于包涵体中。其中,SDS-PAGE考马斯染色检测结果和WB检测结果如图2所示,SDS-PAGE考马斯染色检测结果为图2的左图,WB检测结果图为图2的右图。
实施例2:亚单位疫苗的制备
将实施例1纯化后获得的AL和佐剂制备亚单位疫苗,具体的制备方法如下所示:
AL亚单位疫苗(又称AL-Alum)的制备:将铝盐佐剂(赛默飞Thermo ScientificTM,货号:77161)与实施例1制得的AL蛋白进行混合,其中,AL蛋白与佐剂体积比为3:1。
实施例3:动物保护性试验
选取用6-8周龄雌性SPF的C57BL/6J小鼠(购自斯贝福(北京)生物技术有限公司)进行试验,具体参见图3。该试验一共分为三组,PBS组(免疫三次,每次每只小鼠免疫100μLPBS),BCG组(初始免疫一次,每只小鼠免疫5×105CFU BCG),AL组(免疫三次,每次每只小鼠免疫20μg)。上述三组的亚单位疫苗、BCG或PBS均采用皮下注射(s.c.),初始免疫在第0周进行免疫,免疫三次分别在第0、2和4周进行免疫。免疫完成后两周后进行细胞因子(图7)以及抗体效价(图6)的检测,检测完成后采用攻菌剂量为200CFU的M.bovis C68004进行攻菌,攻菌采用气溶胶感染。四周后麻醉安乐死小鼠,检测肺脏及脾脏的细菌载量(图4)以及病理组织学(图5)变化。
其中,抗体效价的检测步骤为:将各组小鼠在每次免疫完成后的第二周末、下一次免疫前,于尾静脉采取小鼠的血清,冻存-80℃备用。检测抗体效价时使用M.bovis铺板,将M.bovis高压灭菌后用H2O重悬,调整OD600为1.0,96孔板每孔加入100μL OD值为1.0的M.bovis混悬液,放置于60℃的烘箱中干燥,干燥后用冰冷的甲醇固定2h。PBS洗板三次,每次五分钟。将血清1:1000稀释,取100μL加入96孔板中,37℃孵育1h。PBS洗板三次,每次五分钟。将HRP标记的羊抗鼠IgG、IgG1、IgG2c、IgG3、IgM、IgA(Abcam)以1:10000稀释,取100μL加入96孔板中,37℃孵育1h。PBS洗板三次,每次五分钟。每孔加入100μL TMB(索莱宝,北京)显色,20min后每孔用50μL 2M H2SO4终止显色。酶标仪读取OD450,检测结果参见图6。
细胞因子的检测步骤为:在各组小鼠免疫完成后两周(均为第六周)时,处死小鼠,取脾脏,无菌分离脾细胞,将其铺于24孔板中,每孔细胞量为1×107个,用含有10μg/mL相关蛋白(AL)的1640培养基共孵育10小时,离心取上清,使用欣博盛ELISA试剂盒进行细胞因子的检测,检测结果参见图7。
由图4~7可知,与PBS组相比,AL组的小鼠肺脏及脾脏的细菌载量降低,对M.bovis的抑制能力达到了与BCG组相当的水平;并且,与PBS和BCG组相比,AL组的小鼠抗体效价和细胞因子含量也显著提高,从而可说明相较于BCG,本发明的AL具有更高的免疫原性。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种融合蛋白,其特征在于,包括:
第一肽段,所述第一肽段包含Ag85A片段;
第二肽段,所述第二肽段包括LpqH片段,所述第一肽段与所述第二肽段相连。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白,其特征在于,所述第一肽段的C端与所述第二肽段的N端相连;或者
所述第二肽段的C端与所述第一肽段的N端相连;
任选地,所述Ag85A片段为Ag85A全长肽链;
任选地,所述Ag85A片段具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:1具有至少95%相似性的氨基酸序列;
任选地,所述LpqH片段为LpqH全长肽链;
任选地,所述LpqH片段具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:2具有至少85%相似性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白,其特征在于,进一步包括连接肽;
任选地,所述连接肽的N端与所述第一肽段的C端相连,所述连接肽的C端与所述第二肽段的N端相连;或者
所述连接肽的N端与所述第二肽段的C端相连,所述连接肽的C端与所述第一肽段的N端相连;
任选地,所述连接肽的氨基酸序列为(GGGGS)n,其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10,更优选为2或3;
任选地,所述连接肽包括SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列;
任选地,所述融合蛋白进一步包括标签;
任选地,所述第一肽段的C端与所述第二肽段的N端相连,所述标签与所述第二肽段的C端相连或所述标签与所述第一肽段的N端相连;或者
所述第一肽段的N端与所述第二肽段的C端相连,所述标签与所述第一肽段的C端相连或所述标签与所述第二肽段的N端相连;
任选地,所述第一肽段的C端与所述第二肽段的N端相连,所述标签与所述第二肽段的C端相连;或者
所述第二肽段的C端与所述第一肽段的N端相连,所述标签与所述第一肽段的C端相连;
任选地,所述标签为HIS标签、FLAG标签、HA标签、GST标签、Strep II标签和MBP标签中的至少之一;
任选地,所述HIS标签具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列;
任选地,所述融合蛋白具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
4.一种核酸分子,其特征在于,所述核酸分子编码权利要求1~3任一项所述的融合蛋白;
任选地,所述核酸分子为DNA。
5.一种表达载体,其特征在于,携带权利要求4所述的核酸分子;
任选地,所述表达载体为真核表达载体,优选地,所述表达载体为慢病毒载体。
6.一种重组细胞,其特征在于,包括:
携带权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的表达载体;或,
表达权利要求1~3任一项所述的融合蛋白;
任选地,所述重组细胞是通过将权利要求5所述的表达载体引入至宿主细胞中而获得的;
任选地,所述重组细胞包括真核细胞或原核细胞。
7.权利要求1~3任一项所述的融合蛋白、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的表达载体或权利要求6所述的重组细胞在制备结核病亚单位疫苗中的用途。
8.一种亚单位疫苗,其特征在于,包括:
权利要求1~3任一项所述的融合蛋白。
9.根据权利要求1所述的亚单位疫苗,其特征在于,进一步包括佐剂;
任选地,所述佐剂包括选自铝佐剂、Poly IC佐剂、弗氏佐剂、CpG ODN、DDA、MPLA、IC31、AS01和AS03中的至少之一;
任选地,所述融合蛋白和所述佐剂的体积比为(2~4):1;
任选地,所述佐剂为氢氧化铝佐剂。
10.权利要求8或9所述的亚单位疫苗在制备药物中的用途,所述药物用于加强BCG的免疫效应或者用于预防和/或治疗结核病。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211596789.2A CN115850520A (zh) | 2022-12-12 | 2022-12-12 | 新型结核病亚单位疫苗al的制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211596789.2A CN115850520A (zh) | 2022-12-12 | 2022-12-12 | 新型结核病亚单位疫苗al的制备方法和应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN115850520A true CN115850520A (zh) | 2023-03-28 |
Family
ID=85672438
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202211596789.2A Pending CN115850520A (zh) | 2022-12-12 | 2022-12-12 | 新型结核病亚单位疫苗al的制备方法和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN115850520A (zh) |
-
2022
- 2022-12-12 CN CN202211596789.2A patent/CN115850520A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN110951756B (zh) | 表达SARS-CoV-2病毒抗原肽的核酸序列及其应用 | |
TWI638829B (zh) | 分枝桿菌抗原疫苗 | |
CN102666575B (zh) | 分枝杆菌疫苗 | |
JP7247226B2 (ja) | 水痘・帯状疱疹ウイルスの抗原バリアントおよびその使用 | |
JPH08510756A (ja) | ストレス蛋白質とその使用 | |
BR112013030963B1 (pt) | proteína de fusão, polinucleotídio, constructo, vetor, célula hospedeira, composição farmacêutica ou vacina, uso da proteína de fusão, método para modificar uma proteína alvo para melhorar sua imunogenicidade e uso do fragmento de crm197 ou um fragmento do mesmo | |
WO2021259206A1 (zh) | 针对sars-cov-2病毒的dna疫苗及其用途 | |
WO2023138334A1 (zh) | 一种重组新型冠状病毒蛋白疫苗、其制备方法和应用 | |
WO2022127825A1 (zh) | 针对新型冠状病毒感染的疫苗组合物 | |
US9925259B2 (en) | Immunogenic polypeptide surface layer-expressing bifidobacterium | |
KR20230154048A (ko) | Sbi 어쥬번트를 포함하는 조성물 및 이들의 이용 방법 | |
WO2023138333A1 (zh) | 一种重组新型冠状病毒蛋白疫苗、其制备方法和应用 | |
WO2006053485A1 (fr) | Vaccin genique contre le bacille mycobacterium tuberculosis obtenu a partir d’un gene chimere et procede de preparation dudit vaccin | |
WO2005079842A1 (fr) | Adjuvant immunologique | |
CN115850520A (zh) | 新型结核病亚单位疫苗al的制备方法和应用 | |
CN114989266B (zh) | 一种非洲猪瘟病毒pA104R蛋白免疫抑制相关氨基酸位点及其应用 | |
JP7370110B2 (ja) | 多発性硬化症耐性の組み換えタンパク質およびその調製方法並びに用途 | |
CN116082520A (zh) | 含不同截短PstS1融合蛋白AP的新型结核病亚单位疫苗的制备和应用 | |
JPWO2006126682A1 (ja) | アルツハイマー病の予防・治療用ワクチン | |
CN116568324A (zh) | 融合蛋白和疫苗 | |
CN114829608A (zh) | 融合基因及一种重组新型冠状病毒高效免疫dna疫苗及其构建方法和应用 | |
CN114632148A (zh) | 病原样抗原疫苗及其制备方法 | |
US20100055135A1 (en) | Enhancin of hepatitis b virus vaccine and its gene | |
WO2018175560A1 (en) | Nanoparticle immunogens to elicit responses against the influenza receptor binding site on the hemagglutinin head domain | |
JPH10509865A (ja) | 細菌膜上で発現される呼吸器多核体ウイルスプロテインg |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |