CN108611310A - 一种重组Hsp65与STEAP1186-193融合蛋白的基因工程菌的构建 - Google Patents

一种重组Hsp65与STEAP1186-193融合蛋白的基因工程菌的构建 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程领域，本发明公开提供了关于一种重组Hsp65与STEAP1186‑193的大肠杆菌菌株及制备方法。本发明提供的大肠杆菌菌株Escherichia coli BL21/pET28a‑HST1：pET28a‑His‑Hsp65‑STEAP1186‑193，CCTCC NO：M 2018040。该工程菌含有重组质粒pET28a‑His‑Hsp65‑STEAP1186‑193，质粒上有His‑Hsp65‑STEAP1186‑193基因，该基因具有SEQ ID NO.1所示的基因序列。BL21/HST1菌株经乳糖诱导，可高效表达重组蛋白His‑Hsp65‑STEAP1186‑193。该重组蛋白预期可以提高机体对肿瘤细胞的免疫应答，打破免疫耐受，达到识别和杀灭肿瘤细胞的目的，对于抗肿瘤治疗具有很好的临床应用前景。

Description

一种重组Hsp65与STEAP1186-193融合蛋白的基因工程菌的构建
技术领域
在基因工程领域，本发明公开了一种新型融合蛋白重组工程菌及其构建方法，以及该融合蛋白的纯化。
背景技术
质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段(＜10kb)且结构简单，质粒要比其它任何载体都要好。重组质粒是指在基因工程的基础上，将目的基因和载体连结成一个具有自我复制能力的DNA分子，继而转化或转染入宿主菌株或细胞，筛选出含目的基因的重组子。
基因工程是生物工程的一个重要分支，它和细胞工程、酶工程、蛋白质工程和微生物工程共同组成了生物工程。基因工程(genetic engineering)是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品，通过基因工程技术可构建和表达具有多种功能的新型目的蛋白。
肿瘤细胞会表达肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原，针对这些抗原发展起来的肿瘤特异性免疫治疗，是肿瘤生物治疗的重要方法。
肿瘤相关抗原(tumor-associatedantigen，TAA)：指并非某一种肿瘤所特有，在其他肿瘤细胞或正常细胞上也存在的抗原分子。正常细胞与肿瘤细胞仅在增殖中有量的差异，因此称为相关抗原。
肿瘤疫苗按抗原成分的类型可分为肿瘤细胞型疫苗、肿瘤抗原多肽及蛋白疫苗、DNA疫苗和树突状细胞疫苗等。无论何种类型的肿瘤疫苗，其研制的关键都在于选择合适的针对肿瘤的靶抗原和提高免疫原性。
热休克蛋白(heat shock protein，HSP)是所有原核生物和真核生物中高度保守的蛋白。正常的生理条件下低水平表达，当细胞受到应激刺激时，HSP的合成迅速增加，即所谓的应激反应，这些应激刺激不仅包括来自环境刺激(紫外照射、热休克和重金属)和病理刺激(病毒感染、细菌感染、寄生虫感染和细胞恶化)，而且还来自生理刺激(激素刺激、细胞分化和组织形成)。HSP的基本功能是作为新生蛋白、非正常折叠蛋白和突变蛋白的分子伴侣，阻止蛋白质的变性和聚集，协助蛋白质的折叠、伸展、组装和转运，抑制错误折叠的蛋白质的分泌，并参与细胞内对应激刺激自我保护。
HSP在肿瘤免疫中的作用主要包括：(1)HSP的一些亚型，HSP70、gp96、HSP110和grp170具有抗原递呈作用，即在专职抗原递呈细胞(APC)内将抗原与MHC结合，并递呈到细胞表面，从而活化T细胞，包括CD4+和CD8+T细胞，但主要是细胞毒性杀伤细胞(CTL)，产生特异性细胞免疫。(2)诱导DC成熟及活化免疫细胞作用。HSP70、gp96及HSP60本身具有活化抗原递呈细胞，如巨噬细胞、DC的作用，gp96及HSP70可诱导DC成熟，从而上调共刺激因子和MHC分子的表达。(3)HSP还参与非MHC分子限制的免疫活化，可激活受体为γ、δ的T细胞以及NK细胞。(4)HSP70促进Th0细胞向Thl转化，肿瘤患者的免疫功能低下表现之一为Thl降低，而HSP70调整了机体的免疫状态，有利于控制肿瘤。(5)HSP激活补体系统并诱导分泌多种细胞因子协同抗肿瘤免疫。总之，HSP不仅调动了机体的特异性免疫(后天免疫)，也调动了非特异免疫(先天免疫)，是一个非常全面的、强有力的增强机体免疫的蛋白质佐剂，在肿瘤免疫中可发挥重要作用。
HSP65属于HSP60亚型，其活化巨噬细胞和释放诸多细胞因子的增强免疫功能已被证实，它将成为一个良好的免疫佐剂。
STEAP1(six transmembrane epithelial antigen of the prostate)是一种新近被克隆出来的6次跨膜的前列腺上皮抗原，属于IIIa型膜蛋白，位于染色体9q21.2。STEAP1仅在正常组织中的前列腺中表达，并且在包括前列腺，膀胱，肺，卵巢癌和尤文肉瘤的各种癌症类型中过表达。其独特和受限的表达模式和其在前列腺癌启动和进展中的作用的越来越多的证据使得STEAP1成为PCa疫苗的极好的靶标，并且有研究显示STEAP1疫苗在抑制黑色素瘤生长方面也有一定的疗效。
然而，当作为DNA疫苗，委内瑞拉马脑炎病毒复制子颗粒(VEEVRP)加强时，STEAP1被证明是弱免疫的。另外，Federica Cappuccini等人使用猿腺病毒ChAdOx1和修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)的高免疫原疫苗接种平台，用于递送STEAP1抗原和诱导STEAP1特异性细胞免疫反应。这种异源引发-加强方案在临床前感染性疾病模型中诱导了特别强的T细胞应答。并且检测出STEAP1蛋白其中一个抗原表位是第186位至196位的八个氨基酸序列。STEAP1186-193基因得氨基酸序列为：Arg-Ser-Tyr-Arg-Tyr-Lys-Leu-Leu-NH2
由于STEAP1被证明是弱免疫的，单独使用免疫原性相对较低，HSP65具有活化巨噬细胞和释放诸多细胞因子的增强免疫功能，是一个良好的免疫佐剂。故考虑将HSP65基因与STEAP1186-193基因连接起来，并在HSP65基因前添加6个组氨酸串联起来的组氨酸标签，从而组建一种pET28a-His-Hsp65-STEAP1186-193的重组质粒，诱导表达融合蛋白，将其作为疫苗刺激机体产生主动免疫，打破免疫耐受，从而抑制肿瘤的生长。
发明内容
本发明公开一种表达重组Hsp65和STEAP1186-193融合蛋白的基因工程菌。
本发明的一个目的是提供该重组菌的制备方法，方法简便，易于操作。
本发明的另一个目的是公开该重组蛋白的纯化方法。
在本发明的第一个方面，该大肠杆菌菌株命名为Escherichia coli BL21/pET28a-HST1：pET28a-His-Hsp65-STEAP1186-193，菌株已提交中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国、武汉、武汉大学。保藏日期：2018年1月16日，保藏编号为CCTCC NO：M2018040，分类命名为Escherichia coli BL21/pET28a-HST1：pET28a-His-Hsp65-STEAP1186-193，其细胞中含有重组质粒pET28a-His-Hsp65-STEAP1186-193，质粒中含有SEQ IDNO.1所示的重组His-Hsp65-STEAP1186-193基因序列。
在本发明的第二个方面，提供了该重组质粒的制备方法，其技术路线详述如下：
1.重组质粒pET28a-His-Hsp65-STEAP1186-193及相应基因工程菌的构建
根据本实验室已有的关于重组质粒pET-28a-His-Hsp65的序列信息，利用引物设计软件Primer 5来设计引物P1、P2。上游引物P1中引入Nco I酶切位点，下游引物P2中引入EcoR I酶切位点。采用PCR技术从pET-28a-His-Hsp65质粒中克隆得到基因His-Hsp65。通过Genbank检索获得STEAP1基因序列(检索序列号：AK144312.1)，并获得其186-193位氨基酸所对应的碱基序列，根据次序列利用引物设计软件Primer 5来设计引物P3、P4，上游引物中引入EcoR I酶切位点，下游引物中引入Hind III酶切位点，利用T4 PolynucleotideKinase(T4 PNK)处理引物P3、P4，并进行变性退火获得可直接用于酶连的STEAP1186-193目的基因。通过酶切、酶连反应将目的基因His-Hsp65和STEAP1186-193插入pET28a空质粒载体的相应酶切位点中，得到重组质粒pET28a-His-Hsp65-STEAP1186-193，将重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21获得需要的重组基因的工程菌。
2.融合蛋白的诱导表达
将重组工程菌进行活化，接种至含硫酸卡那霉素的LB培养基中震荡培养过夜，按1∶100转接于新鲜LB培养液中，37℃培养至OD600值为0.5-0.8时，加入乳糖(终浓度5mM)进行诱导表达，6h后离心收取菌体沉淀，进行12％SDS-PAGE分析，观察目的蛋白条带位置和表达量。
3.融合蛋白的分离纯化
收集菌体，每克湿菌体加入10mL菌体裂解缓冲液(20mM Tris-HCl pH7.9，0.5MNaCl，10％Glycerol)溶解，菌体超声裂解，离心收集上清。获得的上清用Ni-NTA琼脂糖凝胶纯化，用浓度梯度为0.02、0.06、0.1、0.2、0.5、1M Imidazole的层析缓冲液洗脱，收集洗脱峰，检测含目的蛋白的洗脱峰，进行蒸馏水充分透析除盐后冻干保存。
附图说明
图1 重组质粒构建原理示意图。
图2 0.8％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物His-Hsp65基因图。
Lane1：DNA Marker，Lane2：His-Hsp65的PCR产物
图3 4％琼脂糖凝胶电泳检测STEAP1186-193目的基因图。
Lane1：DNA Marker，Lane2：STEAP1186-193的PCR产物
图4 0.8％琼脂糖凝胶电泳检测His-Hsp65-STEAP1186-193目的基因图。
Lane1：Protein Marker，Lane2：重组质粒His-Hsp65-STEAP1186-193的菌落PCR产物
图5 0.8％琼脂糖凝胶电泳重组质粒限制性酶切酶验证图。
Lane1：Protein Marker，Lane2：Nco I、Hind III双酶切得到His-Hsp65-STEAP1186-193基因，Lane3：Hind III单酶切验证
图6 重组质粒pET28a-His-Hsp65-STEAP1186-193基因的双向测序。
图7 12％ SDS-PAGE电泳检测重组菌经不同乳糖浓度诱导表达融合蛋白的诱导曲线。
Lane1：Protein Marker，
Lane2：诱导前的全菌蛋白样品，
Lane3-7：分别用1、3、5、7、9mM乳糖诱导8h的全菌蛋白样品
图8 12％ SDS-PAGE电泳检测重组菌经5mM乳糖诱导表达融合蛋白的诱导曲线。
Lane1：Protein Marker，
Lane2：诱导前的全菌蛋白样品，
Lane3-7：诱导后1-8h每个小时的全菌蛋白样品
图9 12％ SDS-PAGE电泳检测融合蛋白破碎后图。
Lane1：Protein Marker，
Lane2：超声破碎后离心沉淀，
Lane3：超声破碎后离心上清
图10 12％ SDS-PAGE电泳检测His-Hsp65-STEAP1186-193蛋白纯化图。
Lane1：Protein marker，Lane2：纯化后的His-Hsp65-STEAP1186-193蛋白
具体实施方式
材料
(1)菌株
载体pET28a-mGM-CSF-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG，Escherichia coli BL21，菌株pET28a-His-Hsp65均为本实验室保存。
(2)工具酶和试剂
分子克隆工具酶为Thermo Fisher Scientific公司产品；质粒抽提试剂盒为上海捷瑞生物科技有限公司；产物纯化试剂盒以及PCR胶回收试剂盒为上海生工生物科技有限公司的产品。
(3)培养基
LB培养基，配方见参考文献Sambrook J，FristshE F，Maniatis T.MolecularCloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989。
本说明书所提及的方法中质粒提取、PCR反应、内切酶酶切、PCR产物的回收、连接酶连接和转化大肠杆菌，这些都是基因工程研究领域的常规操作方法，具体参见SambrookJ，FristshE F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NY：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989，pp.16-340。
实施例1 His-Hsp65基因的克隆与STEAP1186-193基因的获得
根据本实验室已构建的关于pET-28a-His-Hsp65的序列信息，利用引物设计软件Primer分别设计两对引物P1、P2：
P1：5’CATGCCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCGCCAAGACAATTGC3’59bp
P2：5′CCGGAATTCGAAATCCATGCCACCCATGTCGCCGC3′35bp
上游引物P1中引入酶切位点Nco I，下游P2中引入酶切位点EcoR I以。用质粒提取试剂盒提取质粒pET-28a-His-Hsp65。利用引物P1、P2克隆His-Hsp65基因，PCR反应体系见表1，反应参数见表2。
表1 His-Hsp65 PCR反应体系
表2 His-Hsp65 PCR反应参数
0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，条带位置与预期的1671bp一致。(参见说明书附图2)
通过Genbank检索获得STEAP1基因序列(检索号：AK144312.1)，并获得其186-193位氨基酸所对应碱基序列，利用引物设计软件Primer分别设计两对引物P3、P4：
P3：5’AATTCAGATCCTACAGATACAAGCTACTCTA 3’31bp
P4：5’AGCTTAGAGTAGCTTGTATCTGTAGGATCTG 3′31bp
上游引物P3中引入EcoR I酶切位点，下游引物P4中引入Hind III酶切位点。上游引物P3和下游引物P4互补配对，经T4 PNK处理后，再经高温变性低温退火，即可用于酶连。T4 PNK处理反应体系见表3，T4 PNK处理反应条件及变性退火条件见表4。
表3 STEAP1186-193T4 PNK处理反应体系
表4 STEAP1186-193 T4 PNK处理反应及变性退火条件条件
4％琼脂糖凝胶电泳鉴定T4 PNK处理产物，条带位置与预期的37bp一致。(参见说明书附图3)
通过切胶回收获得目的片段His-Hsp65，将目的片段His-Hsp65用Nco I和EcoR I双酶切，载体质粒pET28a-mGM-CSF-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG用Nco I、HindIII双酶切，双酶切反应体系见表5、表6。
表5 His-Hsp65基因双酶切反应体系
表6 pET28a-mGM-CSF-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG双酶切反应体系
酶切产物通过PCR产物纯化试剂盒纯化，琼脂糖凝胶电泳分别回收目的基因片段与载体基因片段，随后将His-Hsp65、STEAP1186-193和pET28a质粒用T4 DNA连接酶于4℃连接过夜，用冷CaCl2法制备大肠杆菌BL21的感受态细胞，将酶连产物转化感受态细胞后涂布到含卡那霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养后挑取单菌落，将单菌落接种至LB液体培养基中，培养过夜，提取质粒，分别通过PCR、单酶切和双酶切等方法初筛阳性克隆，并送至生工测序公司进行测序，测序结果经软件比对后完全正确。(参见说明书附图4，附图5，附图6)
实施例2 His-Hsp65-STEAP1186-193基因在大肠杆菌中的表达及培养
重组菌以1％接种量在液体LB培养基试管中37℃振荡培养过夜，再以1％的接种量转接摇瓶大批培养，培养2.5h后加入终浓度为5mM乳糖诱导表达，诱导6h后收集菌体，留样进行SDS-PAGE分析。融合蛋白在诱导后6h达到稳定的最大表达量，通过Bandscan软件分析融合蛋白的表达量可达菌体总蛋白量的70.2％。
(参见说明书附图8)
实施例3 融合蛋白的初步分离纯化
挑选高表达量菌株，接种于LB培养基中，37℃过夜培养；过夜培养液转接入LB培养基，37℃扩大培养，选取最优发酵条件获得发酵菌体。5000r/min离心15min，上清及沉淀均留样。将沉淀用配制好的菌体裂解液(10mL/g菌体)溶解，超声裂解菌体。12000r/min离心20min，收集上清及沉淀均留样标记。SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白主要存在于菌体破碎液上清中，故可判断融合蛋白为可溶性表达。(参见说明书附图9)
实施例4 Ni-NTA琼脂糖凝胶(His标签纯化树脂)
本实验采用的Ni-NTA琼脂糖凝胶是His标签纯化树脂，我们设计的融合蛋白带有His标签，所以可以通过Ni-NTA琼脂糖凝胶来进行纯化，先将Ni-NTA琼脂糖凝胶装入层析柱中，层析柱上端进液口连接恒流泵，下出口连接核酸蛋白检测仪，再用平衡缓冲液(20mMTris-HCl pH 7.9，0.5M NaCl，10％ Glycerol)进行层析柱的平衡，平衡完毕后以1mL/min的速度进行蛋白溶液的上样操作，上样后重复平衡操作，再用分别含0.02、0.06、0.1、0.2、0.5、1M Imidaole的平衡缓冲液进行梯度洗脱，收集洗脱峰留样，进行SDS-PAGE电泳分析。
实施例5 脱盐冻干
收集蛋白纯度较高的洗脱液，4℃对RO水其用透析过夜，将透析后的洗脱液在冻干机中冻干，刮取蛋白干粉冷冻保存并进行SDS-PAGE电泳分析。(参见说明书附图10)
除上述事实外，本发明还可以有其他实施方式，凡采用等同替换或等效变换性的技术方案，均落于本发明要求的保护范围。

Claims (7)

1.一种生产重组蛋白His-Hsp65-STEAP1186-193的大肠杆菌菌株，其特征在于大肠杆菌菌株Escherichia coli.BL21/pET28a-HST1：pET28a-His-Hsp65-STEAP1186-193，保藏编号：CCTCC NO：M 2018040。
2.根据权利要求书1所述的该大肠杆菌菌株BL21/pET28a-HST1，其特征在于：大肠杆菌细胞中含有重组质粒pET28a-His-Hsp65-STEAP1186-193。
3.根据权利要求书2所述的该大肠杆菌菌株BL21/pET28a-HST1中重组质粒pET28a-His-Hsp65-STEAP1186-193，其特征在于：含有重组的His-Hsp65-STEAP1186-193，可表达融合蛋白，其具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
4.一种制备权利要求书1所述的该大肠杆菌菌株的方法，它包括以下步骤：
(I)用质粒提取试剂盒提取质粒pET-28a-His-Hsp65和pET28a-mGM-CSF-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG，通过PCR方法扩增出目的片段His-Hsp65，通过酶切pET28a-mGM-CSF-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG获得pET28a空载体。
(II)通过合成引物的方法，合成STEAP1186-193片段DNA的两条链，先用T4 Polynucleotide Kinase(T4 PNK)处理目的基因STEAP1186-193的两条引物，再通过引物互补配对经高温变性、低温退火后即可得到直接用于酶连的STEAP1186-193目的基因。
(III)用T4 Polynucleotide Kinase(T4 PNK)处理目的基因STEAP1186-193，用限制性内切酶NcoI、EcoRI切割目的基因His-Hsp65，用限制性内切酶NcoI、HindIII和pET28a-mGM-CSF-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG质粒，用E.coli DNA连接酶4℃连接过夜，将其转化大肠杆菌菌株，获得含质粒pET28a-His-Hsp65-STEAP1186-193的菌株。
(III)鉴定重组质粒：使用PCR法、和单酶切、双酶切方法进行验证，将重组菌株进行测序验证。
5.根据权利要求3所述的一种新型融合蛋白His-Hsp65-STEAP1186-193，其特征在于：该基因表达的融合蛋白实际分子量约为59kDa，其N端为His-Hsp65，C端为STEAP1基因的第186-193的八肽序列。
6.根据权利要求5所述的His-Hsp65-STEAP1186-193蛋白的重组方法，其特征在于：包含抗肿瘤疫苗的抗原表位STEAP1186-193，并且Hsp65是一个良好的免疫佐剂，该融合蛋白具有很好的抗肿瘤功能。
7.一种His-Hsp65-STEAP1186-193肽的制备方法，其特征在于，该方法包含步骤：
(I)根据权利要求4所述步骤构建宿主菌
(II)通过乳糖诱导，超声破碎来初步获得重组蛋白。
(III)通过Ni-NTA琼脂糖凝胶(His标签纯化树脂)纯化分离出His-Hsp65-STEAP1186-193蛋白，该融合蛋白纯度可达SDS-PAGE电泳纯。
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