CN101920009A - 一种用于预防和治疗肿瘤的疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明属于疫苗及其制备，特别是指一种用于预防和治疗肿瘤的疫苗及其制备。提供一种用于预防和治疗肿瘤的疫苗，采用包括端粒酶逆转录酶表位序列的选择、多表位端粒酶逆转录酶的核苷酸的串联连接、多表位端粒酶逆转录酶DNA疫苗的制备、多表位端粒酶逆转录酶多表位肽疫苗的制备等工艺步骤制成。本发明解决了单一肽疫苗仅能在个别肿瘤患者中产生临床效果的不足。具有免疫机体后可激活表位特异性的CD4+T细胞和CD8+T细胞，在CD4+T细胞分泌的Th1型细胞因子的辅助下，CD8+CTL可以特异性杀死表达TERT的肿瘤细胞，对肿瘤起到预防和治疗作用等优点。
Description
技术领域
本发明属于疫苗及其制备，特别是指一种用于预防和治疗肿瘤的疫苗及其制备。
背景技术
肿瘤是严重威胁人类健康的头号杀手，根据WHO报告，目前全球每年新发癌症病人约1000万，死亡660万，预计未来25年内将有3亿新病例，1亿死于该病。我国每年新发病例160万至200万，现有癌症病人300多万人，并以3％的速度递增且呈年轻化趋势。手术、放疗和化疗是治疗恶性肿瘤的三大传统方法，由于恶性肿瘤的生物学特性，使上述治疗方法都存在一定的局限性，随着免疫学、分子生物学与基因工程技术的发展，以免疫治疗为代表的生物治疗己成为继手术、化疗和放疗后的第四种肿瘤治疗模式。肿瘤抗原被宿主免疫系统的效应细胞和效应分子识别，是进行免疫治疗的基础，伴随人类肿瘤抗原的不断揭示，治疗性肿瘤疫苗成为生物治疗的热点课题之一。
体液免疫的作用是中和胞外抗原，而肿瘤抗原多是胞内蛋白，因此肿瘤疫苗的设计应以诱导细胞免疫为主。肿瘤细胞一般不表达MHC-II类分子，所以肿瘤免疫中T细胞作用的研究主要集中在CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)上，许多研究表明：CTL在识别和清除肿瘤细胞中发挥着重要的作用，过继转移肿瘤特异性CTL或用MHC-I限制的肽疫苗免疫小鼠，均可有效抑制肿瘤；抗原刺激的DC(树突状细胞)疫苗在肿瘤治疗中也具有巨大潜力；然而当这些治疗措施进行临床试验时，尽管也产生了CTL，但疗效极不明显。造成肿瘤疫苗临床试验失败的原因是多方面的。
在缺乏CD4+T细胞的情况下，CTL抗肿瘤效应微弱而且短暂，这一现象使人们逐渐认识到CD4+T细胞对于CD8+CTL细胞反应的重要性。越来越多的证据表明，CD4+T细胞不仅可直接抑制肿瘤，而且在激活CTL以及产生和维持长期记忆性CD8+T细胞方面发挥着中心作用。CD4+T细胞对于CD8+T细胞的激活以及记忆细胞的产生和维持是必需的。给黑色素瘤患者过继转移包括CD8+和CD4+T细胞的同源肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，可以观察到显著的临床应答，并且转移的T细胞保持长期活性(2年)。相反，仅过继转移肿瘤反应性CD8+T细胞克隆，则观察不到临床应答，而且两周后在外周血中就已经检测不到这些细胞了。这种辅助作用的机制为：
(1)抗原提呈细胞(APC)表面的主要组织相容性抗原MHC-II提呈适当抗原给CD4+T细胞，并激活CD4+T细胞，导致CD40L的表达，与APC表面的CD40结合，从而被激活的APC表达共刺激分子(如：B7)，这些被激活的APC进一步通过B7-CD28共刺激而激活CD8+T细胞。
(2)CD4+T细胞通过TRAIL依赖的机制控制记忆性CD8+T细胞的产生。在缺乏CD4+T细胞辅助下激活的CD8+T细胞会上调TRAIL，并且在再次遇到抗原时激活诱导细胞死亡(AICD)，而那些在CD4+T细胞辅助下激活的CD8+T细胞不会上调TRAIL，当再次遇到抗原时就会产生大量的克隆扩增。
既然已经证明CD4+T细胞在临床上的确是有用的，那么非特异性辅助(如乙肝核心抗原是最有效的CTL应答促进剂)还是蛋白特异性T细胞辅助(来自于同一个蛋白的CD4+T细胞表位)更有效呢？研究表明后者是最有效的。几个研究证实：最有效的CTL产生需要CD4+T细胞和CD8+T细胞识别同一个APC上的抗原。
综上所述：一个抗原中同时含有可以激活CD4+T和CD8+T细胞的表位是肿瘤疫苗的理想策略(即CD4+T细胞表位和CD8+T细胞表位串联连接在一起)。
肿瘤是由不同病理表现及生物学行为的细胞亚群构成的，不同个体的同一类肿瘤及同一肿瘤在不同器官或不同分化阶段往往表达不同的相关抗原；含单一抗原的肿瘤疫苗所诱导的免疫应答是高度特异性的，而它针对的靶标是高度异质性和变化性的，这是单一肽疫苗仅能在个别肿瘤患者中产生临床效果的主要原因之一，解决这一问题方法主要有两个，一是使用含多个抗原肽的疫苗，二是使用通用肿瘤抗原(或广谱肿瘤抗原)，即无论哪类肿瘤、无论在什么器官、也无论是什么分化阶段的肿瘤均表达这种肿瘤抗原，而正常细胞几乎不表达。无疑后者是最理想的，目前绝对符合该条件的肿瘤抗原还未找到，但已经发现几个可以在绝大部分肿瘤中表达的抗原，如(人端粒酶逆转录酶)hTERT、Survivin等等。
hTERT是端粒酶的催化亚单位，在90％以上的肿瘤中过表达，且与肿瘤的恶性程度密切相关，而正常的人类细胞，除造血干细胞、激活的B细胞等分裂旺盛的细胞表达端粒酶外，绝大多数无端粒酶活性，也不表达hTERT，这使得hTERT成为一种广谱的肿瘤相关抗原，是一个肿瘤免疫治疗的重要靶点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含多个抗原肽的用于预防和治疗肿瘤的疫苗及其制备方法。
当用肽meTERT和/或真核表达重组质粒免疫机体后，肽meTERT会被抗原提呈细胞摄取，并被切割成上述的7个表位肽片段，然后分别提呈给7种T细胞克隆，特异性地激活表位特异性的CD4+T细胞和CD8+T细胞；而真核表达重组质粒被细胞摄取后，首先在细胞中表达成肽meTERT，然后再被切割成上述的7个表位肽片段，分别提呈给7种T细胞克隆，特异性地激活表位特异性的CD4+T细胞和CD8+T细胞；在CD4+T细胞分泌的细胞因子的辅助下，CD8+CTL可以特异性杀死表达hTERT的肿瘤细胞，从而起到预防和治疗作用。即在体内最终真正发挥免疫激活作用的实质上是每一个独立的表位肽，将它们串联起来的目的是为了使hTERT特异性(因为这些表位肽来源于抗原蛋白hTERT)的CD4+T细胞和CD8+T细胞能够同时被有效激活，通过这两种细胞的相互作用，从而发挥更好的杀伤作用。因此，理论上这7个肽无论以何种顺序串联连接不会影响其在体内对T细胞的激活作用。
表位的选择：查阅大量英文文献，选择目前已经鉴定的并且有研究表明具有确切的免疫原性的表位，另外，由于表位肽只有通过与抗原提呈细胞的MHC I或MHC II类分子结合成复合物才能激活T细胞，所以表位的选择同时考虑了兼顾大多数人群的MHC I或II类分子的限制性。
表位核苷酸序列的确定：在Genbank中查到hTERT的全长氨基酸和核苷酸序列，通过表位的氨基酸残基序列和位置，在全长核苷酸序列中找到对应的核苷酸序列以及表位序列两侧各两个氨基酸残基对应的核苷酸。
表位序列的连接是共价连接，可以通过基因重组的方法实现。根据表位的核苷酸序列设计引物，使用重叠延伸PCR方法将各表位基因串联连接成片段，经一定的内切酶切割，与原核表达质粒连接，转化原核宿主细胞，表达复合表位肽；也可以与真核载体相连，直接引入被免疫的机体，在体内的细胞中表达复合表位肽。
本发明的整体技术构思是：
用于预防和治疗肿瘤的疫苗，连接后的多表位端粒酶逆转录酶核苷酸序列如下：
gaggagatcctggccaagttcctgcactggctgatgagtaccttgacagacctccagccgtacatgcgacagttcgtggctcacctgctgcgtttggtggatgatttcttgttggtgacacctccggtgtacgccgagaccaagcacttcctctactcctggcaggtgtacggcttcgtgcgggcctgcctgcgccggaaactctttggggtcttgcggctgaagtgtcaccgccccggcctcctgggcgcctctgtgctgggcctggacgatatc。
用于预防和治疗肿瘤的疫苗的制备，制备方法包括如下工艺步骤：
A、表位序列的选择；
B、多表位端粒酶逆转录酶的核苷酸的串联连接；
C、多表位端粒酶逆转录酶DNA疫苗的制备；
D、多表位端粒酶逆转录酶多表位肽疫苗的制备。
本发明的具体的技术解决方案还有：
所述的步骤A表位的选择中包括如下特异性表位：
I540 ILAKFLHWL；
R865 RLVDDFLLV；
K973 KLFGVLRLK；
V324 VYAETKHFL；
V461 VYGFVRACL；
R672 RPGLLGASVLGLDDI；
L766 LTDLQPYMRQFVAHL。
步骤B是设计8条首尾互补的引物，经过4轮PCR反应，得到编码多表位肽的DNA片段，即多表位端粒酶逆转录酶基因。
步骤B包括如下工艺步骤：
B1、第一步扩增体系为：10×PCR缓冲液2微升，2.5毫摩尔的dNTP2微升，10微摩尔合成引物RT1、FT1各1微升，5单位/微升Taq DNA聚合酶1微升，加去离子水至20微升；PCR反应条件为：94℃预变性1分钟；94℃变性30秒，58℃退火30秒、72℃延伸30秒，扩增5个循环；72℃继续延伸1分钟；
B2、随后三步扩增均以上一步PCR产物稀释50倍作为模板进行；扩增体系同步骤A，只是引物第二步PCR选用RT2和FT2，第三步选用RT3和FT3；PCR反应条件为：94℃预变性1分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒、72℃延伸30秒，扩增30个循环；72℃继续延伸5分钟；第四次PCR扩增后所得目的基因即为多表位端粒酶逆转录酶meTERT；1.2％琼脂糖凝胶电泳分析聚合酶链式反应产物；
合成的首尾重叠的引物如下：5’---3’
FT4 GCGGGATCCGCCACCATGAGCGAGGAGATCCTGGCCAAGTTCCTGCACTGG；
FT3 CAAGTTCCTGCACTGGCTGATGAGTACCTTGACAGACCTCCAGCCGTACATGC；
FT2 CTCCAGCCGTACATGCGACAGTTCGTGGCTCACCTGCTGCGTTTGGTGGATGA；
FT1 TGCGTTTGGTGGATGATTTCTTGTTGGTGACACCTCCGGTGTACGCCGAGACC；
RT1 CGAAGCCGTACACCTGCCAGGAGTAGAGGAAGTGCTTGGTCTCGGCGTACACC；
RT2 AAGACCCCAAAGAGTTTCCGGCGCAGGCAGGCCCGCACGAAGCCGTACACCTG；
RT3 GGCGCCCAGGAGGCCGGGGCGGTGACACTTCAGCCGCAAGACCCCAAAGAGTT；
RT4 ATAGCGGCCGCGATATCGTCCAGGCCCAGCACAGAGGCGCCCAGGAGGCCG。
步骤C是将PCR产物分别用BamH I、Not I 双酶切，连接到双酶切的pcDNA3.1(+)V5His表达载体中，得重组质粒pcDNA3.1(+)V5His-meTERT；对构建的载体分别进行PCR、酶切和DNA测序鉴定；以构建的pcDNA3.1(+)V5His-meTERT质粒为模板进行PCR，经琼脂糖凝胶电泳，在200-500bp之间出现目的条带，结果与预期一致；pcDNA3.1(+)V5His-meTERT经内切酶BamH I和Not I双酶切，经琼脂糖凝胶电泳，出现大小两个片段，分别为质粒和插入的目的片段；经测序鉴定，结果均表明该质粒的插入序列正确。
步骤C包括如下工艺步骤：
C1、PCR回收产物及pcDNA3.1(+)V5His质粒的酶切
取pcDNA3.1(+)V5His质粒10μl，用BamHI和EcoRI进行双酶切，酶切体系由如下体积的组份组成：
pcDNA3.1(+)V5His质粒 10μl
BamHI 1μl
Not I 1μl
10×K Buffer 2μl
无菌水 6μl
将PCR回收产物15μl，用BamHI和Not I进行双酶切，酶切体系由如下体积的组份组成：
PCR产物 15μl
BamHI 1μl
Not I 1μl
10×K Buffer 2μl
无菌水 1μl
C2、DNA片段的纯化回收
将酶切后的PCR片断及pcDNA3.1(+)V5His载体电泳后切胶加入600微升的溶胶液，50℃-60℃放置2分钟；将融化后的溶液放入离心纯化柱中，以13000转/分钟转速离心30秒，倒掉收集管中的废液，加入500微升80％乙醇，以13000转/分钟转速离心30秒，倒掉收集管中的废液；将纯化柱套入干净的1.5毫升离心管中，加入30微升缓冲液，放置2分钟，离心30秒，-20℃保存；
C3、DNA的连接
PCR产物及pcDNA3.1(+)V5His酶切后经琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段后连接，连接体系由如下体积的组份组成：
PCR回收产物 7μl
pcDNA3.1(+)V5His 1μl
T4DNA连接酶 1μl
10×Buffer 1μl
反应条件为16℃水浴16h。
C4、细菌的转化
加入10μl连接产物至感受态细胞，冰浴30分钟，42℃热休克90秒，再冰浴2分钟，加850μl不含氨苄青霉素的LB培养基振摇45-50分钟后，以4000转/分钟转速离心10分钟，加100μl新鲜的LB培养基将菌液悬起，涂于LB琼脂平板上，琼脂平板中含100μg/ml氨苄青霉素，置于37℃培养过夜；
C5、质粒的小量提取
挑取3个菌落用LB培养基进行增菌，然后提取质粒；质粒DNA的提取采用碱裂解方法进行；按试剂盒说明取过夜培养的菌液3ml，以12000转/分钟转速离心1分钟，收集菌体，重悬于250μl溶液P1，振荡至彻底悬浮；
加入250μl溶液P2，温和颠倒数次，使菌体充分裂解；
加入350μl溶液P3，温和颠倒数次，以1200转/分钟转速离心10分钟，小心将上清加入吸附柱CB3，室温放置1-2分钟，以1200转/分钟转速离心1分钟，取出吸附柱，倒掉流出的液体，将吸附柱重新放回收集管中；
加入700ul洗液，以1200转/分钟转速离心1分钟，再重复洗一次，弃废液后，以1200转/分钟转速空转2分钟，取出吸附柱，放入1.5ml的Eppendorf管中，加入30μl pH＝8.0的TE缓冲液洗脱，室温放置2分钟，以12000转/分钟转速离心1分钟，收集洗脱液即为提取的质粒，于-20℃贮存；
C6、酶切鉴定质粒
取5μl提取的质粒，BamH I和Not I进行双酶切，酶切体系由如下体积的组份组成：
pcDNA3.1(+)V5His-meTERT 10μl
BamH I 1μl
Not I 1μl
10×M Buffer 2μl
无菌水 6μl
反应条件为：37℃、3小时，酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳；
C7、PCR扩增鉴定重组体
PCR反应体系由如下体积的组份组成：
pcDNA3.1(+)V5His-meTERT 5μl
2.5mmol/L 4×dNTP 1μl
FT 2μl
RT 2μl
10×M Buffer 4μl
TaqDNA聚合酶 1μl
无菌水 25μl
PCR反应条件为：94℃预变性1分钟，94℃变性30秒，58℃复性30秒，72℃延伸30秒，最后72℃延伸5分钟；扩增30个循环，抽取扩增产物5μl，用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，用DNA Marker来判断扩增片段的大小；
C8、pcDNA3.1(+)V5His-meTERT质粒瞬时转染COS-7细胞
C8(1)、COS-7细胞培养
于含10％灭活胎牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100U/ml的RPMI-1640培养液中，置于含5％CO2、饱和湿度、37℃恒温培养箱中进行培养，每2-3天传代一次。
C8(2)、pcDNA3.1(+)V5His-meTERT质粒转染COS-7细胞：
脂质体法转染：
(1)处理细胞：
转染前一天将每孔105个细胞放入1ml无抗生素的RPMI1640培养液中，待细胞长至70％时开始转染；
(2)准备DNA-脂质体混合液：
b液：将2μl脂质体用无血清无双抗培养基稀释成100μl，轻轻混匀，室温放置5分钟；
a液：将5μg质粒加入到100μl无血清无双抗培养基中，轻轻混匀；室温放置5分钟后，与A液轻轻混匀，室温放置20分钟；
(3)弃去孔内培养基，每孔加入1ml无双抗无血清1640培养基，将200μlDNA-脂质体溶液加入到含有细胞和培养基的培养孔中，轻轻混匀；
(4)将细胞培养于37℃含5％CO2培养箱中培养48小时。
C8(3)、转染后鉴定：Western-blot法鉴定meTERT多肽的表达
C8(3-1)、SDS-PAGE：
培养48小时后分别收取转染pcDNA3.1(+)V5His-meTERT质粒的COS-7细胞，转染pcDNA3.1(+)V5His空质粒的COS-7细胞以及未转染的COS-7细胞，用细胞裂解液将细胞裂解，离心后取上清，分别加入等量2倍十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液，煮沸5分钟。各取20微升进行转移电泳；
聚丙烯酰胺凝胶的配制方法如下：
分离胶12％ 积层胶5％
水 2.6ml 2.1ml
30％丙稀酰胺 3.2ml 0.5ml
Tris pH＝8.82.0ml pH＝6.80.38ml
10％SDS 80μl 30μl
10％过硫酸铵 80μl 30μl
TEMED 4μl 3μl
C8(3-2)、电转膜：
电泳结束后，取一块与凝胶等大的醋酸纤维素膜贴在凝胶上，夹于六片等大的滤纸中间，各层之间避免产生气泡；凝胶一侧置于阴极，电流160毫安转膜3小时；取出胶在染液中染色，观察效果；
C8(3-3)、转膜结束后将膜取出用水洗净，加封闭液于4℃封闭12小时，将封闭后的膜用洗液以10分钟/次的速度洗4次后，与1∶500稀释的抗鼠的HisB单克隆抗体共同孵育1小时；用洗液洗2次，用磷酸盐缓冲液洗两次，每次10分钟；然后与1∶1000稀释的碱性磷酸酶标记兔抗鼠IgG反应1小时；再用磷酸盐缓冲液-吐温20洗液洗4次，加底物显色后，放入水中终止显色；与染色的凝胶对比观察实验结果，看有无特异性条带出现。
步骤D是设计了引物T-R(EcoR I)：5’ACAGAATTCGATATCGTCCAGGCCCAGCACAGA3’，以FT4引物为上游引物，以T-R(EcoR I)为下游引物，以PCR产物序列为模板，进行PCR反应，将上述PCR产物分别用BamH I、EcoR I 双酶切，连入原核表达质粒pGEX-4T中，得重组表达质粒pGEX-meTERT，分别经PCR、酶切及测序鉴定，表明meTERT的DNA片段正确插入了质粒中。将鉴定正确的质粒转化大肠杆菌E.coli BL21，37℃培养至OD600为0.4-0.6，IPTG诱导表达，收集菌体，SDS-PAGE分析；Western-blot检测蛋白GST-meTERT的表达；亲和层析纯化GST-meTERT。
步骤D包括如下工艺步骤：
D1、PCR回收产物及pGEX-4T质粒的酶切
取pGEX-4T质粒10μl，用BamHI和EcoRI进行双酶切，酶切体系由如下体积的组分组成：
pGEX-4T质粒 10μl
BamHI 1μl
EcoR I 1μl
10×K Buffer 2μl
无菌水 6μl
将PCR回收产物15μl，用BamHI和EcoR I进行双酶切，酶切体系由如下体积的组分组成：
PCR产物 15μl
BamHI 1μl
EcoR I 1μl
10×K Buffer 2μl
无菌水 1μl
D2、采用步骤D1的方法将DNA片段纯化回收；
D3、DNA的连接
将步骤D2中的PCR产物及pGEX-4T酶切后经琼脂糖凝胶电泳、切胶回收目的片段后连接，连接体系由如下体积的组分组成：
PCR回收产物 5μl
pGEX-4T Vector 2μl
T4DNA连接酶 1μl
10×Buffer 1μl
反应的条件为16℃水浴16小时；
D4、酶切鉴定阳性克隆
将步骤D3中的产物转化感受态细胞，提取质粒，取提取的质粒10μl，行双酶切鉴定，酶切体系由如下体积的组分组成：
重组质粒 7μl
BamHI 1μl
EcoR I 1μl
10×K Buffer 2μl
无菌水 9μl
反应的条件为37℃、3小时，酶切产物行1％琼脂糖电泳分析；
D5、采用步骤D4的方法进行PCR鉴定；
D6、采用步骤D4的方法将鉴定阳性的质粒和pGEX-4T空质粒分别转化至表达宿主菌E.coli BL21；
D7、小量诱导蛋白GST-meTERT和GST表达
挑取单个菌落接种于含有氨苄青霉素100μg/ml的LB培养基中，37℃培养过夜；次日按1∶50扩大培养，37℃培养至菌密度为A600＝0.6-0.9时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，继续培养4小时，取1.5ml离心菌，100μl水悬浮沉淀，加100μl 2xSDS凝胶加样缓冲液，煮沸10分钟，离心后取10μl进行SDS-PAGE分析；
聚丙烯酰胺凝胶的配制过程如下：
分离胶12％ 积层胶5％
水 2.6ml 2.1ml
30％丙稀酰胺 3.2ml 0.5ml
Tris(1mol/L) pH＝8.82.0ml pH6.80.38ml
10％SDS 80μl 30μl
10％过硫酸铵 80μl 30μl
TEMED 4μl 3μl
D8、Western-blot检测蛋白GST-meTERT和GST的表达
取诱导后的BL21表达菌株和BL21空菌株做SDS-PAGE电泳，电泳完毕，切胶浸泡于去离子水中，并剪取与胶大小相似的PVDF膜及滤纸六张，PVDF膜在甲醇中浸泡3-5分钟后，将胶、PVDF膜及滤纸置电转移液中平衡5分钟。排列顺序从负极到正极依次为：三层滤纸、胶、PVDF膜、三层滤纸，各层之间排空气泡，两端夹好，4℃、160毫安电转移3小时，用1×丽春红染色观察蛋白转移效果。然后将其用水洗净，加封闭液于4℃封闭12小时，TBST洗液按照10分钟/次洗4次后，与1∶800稀释的GST单抗37℃共同孵育1小时；采用上述方法用TBST洗涤，然后与1∶1000稀释的AP标记马抗鼠IgG 37℃反应1小时；TBST洗涤2次，去离子水漂洗1次，BCIP/NBT显色观察结果；
D9、大量诱导表达蛋白GST-meTERT和GST
接种单菌落于100ml含羧苄青霉素100μg/ml的LB培养基，37℃培养过夜，按1∶4将过夜菌接种于新鲜的含羧苄青霉素100μg/ml的LB培养基，37℃、250转/分钟培养3小时，至菌液OD600＝0.6，加入IPTG至终浓度1mmol/L，继续培养5小时，离心菌，将菌体反复3次，用超声裂解液悬浮菌体，反应条件为10ml/g湿菌体；超声波破碎后，反应条件为350瓦×30分钟，4℃、8000g离心15分钟，沉淀主要为包涵体，将上清、包涵体与Marker进行SDS-PAGE电泳鉴定；
D10、纯化目的蛋白GST-meTERT和GST
将步骤D9中的沉淀重悬于9倍体积包涵体洗液中，室温放置5分钟，4℃、8000g离心5分钟；沉淀重悬于15mlTriton/1L菌液，充分混匀，4℃、12000g离心10分钟，重复4次；再将沉淀重悬于去15mlTriton/1L菌液，4℃、12000g离心10分钟；用尿素洗液15mlTriton/1L菌液洗涤菌体，4℃、12000g离心10分钟，重复4次；
溶解纯化的包涵体在15ml变性缓冲液/升菌液中，充分混匀，4℃过夜，使其充分溶解；4℃、12000g离心20分钟，吸上清置于一干净的新管中，加入15μl β-巯基乙醇，4℃、1小时，将其装入处理好的透析袋中，放在加入8M尿素的复性缓冲液中，4℃透析，浓度梯度为1摩尔浓度/2小时。
透析完成后，将GST-meTERT和GST分别分装入Ep管，瞬时离心取上清，冷冻干燥，-80℃保存。
本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：
该疫苗免疫机体后可激活表位特异性的CD4+T细胞和CD8+T细胞，在CD4+T细胞分泌的Th1型细胞因子的辅助下，CD8+CTL可以特异性杀死表达hTERT的肿瘤细胞，从而对肿瘤起到预防和治疗作用。
附图说明
图1是meTERT的CD4+和CD8+T细胞表位的串联连接片段电泳图。
图2是真核重组表达质粒pcDNA3.1(+)V5His-meTERT的构建示意图。
图3是重组质粒pcDNA3.1(+)V5His-meTERT的PCR(A)和酶切(B)鉴定电泳图。
图4是真核表达质粒pcDNA3.1(+)V5His-meTERT转化真核细胞COS-7的Western blot鉴定图谱。
图5是原核重组表达质粒pGEX-meTERT的构建示意图。
图6是重组质粒pGEX-meTERT的PCR(A)和酶切(B)鉴定电泳图。
图7是重组蛋白GST-meTERT的表达(A)、Western-blot鉴定(B)和纯化(C)的电泳图。
图8是用流式细胞仪检测的脾细胞中CD4+T和CD8+T细胞的比例。
图9是用LDH法检测的特异性的CTL杀伤活性的示意图。
附图中各个视图中的标记说明如下：
图1中泳道：1.DNA标准分子量Marker；2.第一次重叠延伸PCR后的结果片段(T1)；3.第二次重叠延伸PCR后的结果片段(T2)；4.第三次重叠延伸PCR后的结果片段(T3)；5.第四次重叠延伸PCR后的结果片段(meTERT)。
图3中A，泳道：1.DNA标准分子量Marker；2.meTERT核苷酸片段对照；3.PCR扩增的片段；
B，泳道：1.DNA标准分子量Marker；2.BamH I/Not I双酶切重组质粒pcDNA3.1(+)V5His-meTERT；3.meTERT核苷酸片段对照。
图4中1.pcDNA3.1(+)V5His-meTRET转染的COS-7细胞；2.空质粒pcDNA3.1(+)V5His转染的COS-7细胞；3.未转染的COS-7细胞。
图6中A，泳道：1.DNA标准分子量Marker；2.PCR扩增的片段；3.meTERT核苷酸片段对照；
B，泳道：1.DNA标准分子量Marker；2.meTERT核苷酸片段对照；3.BamHI/Not I双酶切重组质粒pcDNA3.1(+)V5His-meTERT。
图7中A，1.蛋白标准分子量Marker；2.未诱导的coli-pGEX-meTERT；3、4.诱导的coli-pGEX-meTERT；5.诱导的coli-pGEX-meTERT的上清；6.诱导的E.coli-pGEX-meTERT的沉淀；7.诱导的E.coli-pGEX-4T的沉淀；
B，1.融合蛋白GST-meTERT的Western-blot结果；2.载体蛋白GST的Western-blot结果；
C，1.蛋白标准分子量Marker；2.未诱导的coli-pGEX-meTERT；3.诱导的E.coli-pGEX-meTERT；4.纯化的融合蛋白GST-meTERT；5.纯化的载体蛋白GST。
图9中A，靶细胞为GST-meTERT蛋白刺激的SP/20时的特异性CTL杀伤活性；
B，靶细胞为GST蛋白刺激的SP/20时的特异性CTL杀伤活性。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例做进一步描述，但不应理解为对本发明的限定。本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准。
用于预防和治疗肿瘤的疫苗，连接后的多表位端粒酶逆转录酶核苷酸序列如下：
gaggagatcctggccaagt tcctgcactggctgatgagtacct tgacagacctccagccgtacatgcgacagttcgtggctcacctgctgcgtttggtggatgatttcttgttggtgacacctccggtgtacgccgagaccaagcacttcctctactcctggcaggtgtacggcttcgtgcgggcctgcctgcgccggaaactctttggggtcttgcggctgaagtgtcaccgccccggcctcctgggcgcctctgtgctgggcctggacgatatc。
用于预防和治疗肿瘤的疫苗的制备，制备方法包括如下工艺步骤：
A、表位序列的选择；
B、多表位端粒酶逆转录酶的核苷酸的串联连接；
C、多表位端粒酶逆转录酶DNA疫苗的制备；
D、多表位端粒酶逆转录酶多表位肽疫苗的制备。
本发明的具体的技术解决方案还有：
所述的步骤A表位的选择中包括如下特异性表位：
I540 ILAKFLHWL；
R865 RLVDDFLLV；
K973 KLFGVLRLK；
V324 VYAETKHFL；
V461 VYGFVRACL；
R672 RPGLLGASVLGLDDI；
L766 LTDLQPYMRQFVAHL。
所述的步骤B是设计8条首尾互补的引物，经过4轮PCR反应，得到编码多表位肽的DNA片段meTERT。
步骤B包括如下工艺步骤：
B1、第一步扩增体系为：10×PCR缓冲液2微升，2.5毫摩尔的dNTP2微升，10微摩尔合成引物RT1、FT1各1微升，5单位/微升Taq DNA聚合酶1微升，加去离子水至20微升；PCR反应条件为：94℃预变性1分钟；94℃变性30秒，58℃退火30秒、72℃延伸30秒，扩增5个循环；72℃继续延伸1分钟；
B2、随后三步扩增均以上一步PCR产物稀释50倍作为模板进行；扩增体系同步骤A，只是引物第二步PCR选用RT2和FT2，第三步选用RT 3和FT3；PCR反应条件为：94℃预变性1分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒、72℃延伸30秒，扩增30个循环；72℃继续延伸5分钟；第四次PCR扩增后所得目的基因即为多表位端粒酶逆转录酶meTERT；1.2％琼脂糖凝胶电泳分析聚合酶链式反应产物；
合成的首尾重叠的引物如下：5’---3’
FT4 GCGGGATCCGCCACCATGAGCGAGGAGATCCTGGCCAAGTTCCTGCACTGG；
FT3 CAAGTTCCTGCACTGGCTGATGAGTACCTTGACAGACCTCCAGCCGTACATGC；
FT2 CTCCAGCCGTACATGCGACAGTTCGTGGCTCACCTGCTGCGTTTGGTGGATGA；
FT1 TGCGTTTGGTGGATGATTTCTTGTTGGTGACACCTCCGGTGTACGCCGAGACC；
RT1 CGAAGCCGTACACCTGCCAGGAGTAGAGGAAGTGCTTGGTCTCGGCGTACACC；
RT2 AAGACCCCAAAGAGTTTCCGGCGCAGGCAGGCCCGCACGAAGCCGTACACCTG；
RT3 GGCGCCCAGGAGGCCGGGGCGGTGACACTTCAGCCGCAAGACCCCAAAGAGTT；
RT4 ATAGCGGCCGCGATATCGTCCAGGCCCAGCACAGAGGCGCCCAGGAGGCCG。
PCR合成后的序列如下：
GCGGGATCC 
GC
GAGGAGATCCTGGCCAAGTTCCTGCACTGGCTGATGAGTACCTTGACAGACCTCCAGCCGTACATG
CGACAGTTCGTGGCTCACCTGCTGCGTTTGGTGGATGATTTCTTGTTGGTGACACCTCCGGTGTAC
GCCGAGACCAAGCACTTCCTCTACTCCTGGCAGGTGTACGGCTTCGTGCGGGCCTGCCTGCGCCGG
AAACTCTTTGGGGTCTTGCGGCTGAAGTGTCACCGCCCCGGCCTCCTGGGCGCCTCTGTGCTGGGC
CTGGACGATATCGCGGCCGCTAT。
该序列5’端含BamH I酶切位点，3’端含Not I酶切位点，这两个酶切位点用于将串联序列插入到真核表达质粒pcDNA3.1(+)V5His中。
电泳结果可见清晰的4条DNA片段，分别为4轮PCR的结果，第5泳道为目的片段meTERT，片段大小与理论值相符，初步表明CD4+和CD8+T细胞表位正确连接(图1)。
所述的步骤C是将PCR产物分别用BamH I、Not I双酶切，连接到双酶切的pcDNA3.1(+)V5His表达载体中，得重组质粒pcDNA3.1(+)V5His-meTERT；对构建的载体分别进行PCR、酶切和DNA测序鉴定；以构建的pcDNA3.1(+)V5His-meTERT质粒为模板进行PCR，经琼脂糖凝胶电泳，在200-500bp之间出现目的条带，结果与预期一致(图3A)；pcDNA3.1(+)V5His-meTERT经内切酶BamH I和Not I双酶切，经琼脂糖凝胶电泳，出现大小两个片段，分别为质粒和插入的目的片段(图3B)；经测序鉴定，结果均表明该质粒的插入序列正确。
所述的步骤C包括如下工艺步骤：
C1、PCR回收产物及pcDNA3.1(+)V5His质粒的酶切
pcDNA3.1(+)V5His质粒10μl，用BamHI和EcoRI进行双酶切，酶切体系由如下体积的组份组成：
pcDNA3.1(+)V5His质粒 10μl
BamHI 1μl
Not I 1μl
10×K Buffer 2μl
无菌水 6μl
将PCR回收产物15μl，用BamHI和Not I进行双酶切，酶切体系由如下体积的组份组成：
PCR产物 15μl
BamHI 1μl
Not I 1μl
10×K Buffer 2μl
无菌水 1μl
C2、DNA片段的纯化回收
将酶切后的PCR片断及pcDNA3.1(+)V5His载体电泳后切胶加入600微升的溶胶液，50℃-60℃放置2分钟；将融化后的溶液放入离心纯化柱中，以13000转/分钟转速离心30秒，倒掉收集管中的废液，加入500微升80％乙醇，以13000转/分钟转速离心30秒，倒掉收集管中的废液；将纯化柱套入干净的1.5毫升离心管中，加入30微升缓冲液，放置2分钟，离心30秒，-20℃保存；
C3、DNA的连接
PCR产物及pcDNA3.1(+)V5His酶切后经琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段后连接，连接体系由如下体积的组份组成：
PCR回收产物 7μl
pcDNA3.1(+)V5His 1μl
T4DNA连接酶 1μl
10×Buffer 1μl
反应条件为16℃水浴16h。
C4、细菌的转化
加入10μl连接产物至感受态细胞，冰浴30分钟，42℃热休克90秒，再冰浴2分钟，加850μl不含氨苄青霉素的LB培养基振摇45-50分钟后，以4000转/分钟转速离心10分钟，加100μl新鲜的LB培养基将菌液悬起，涂于LB琼脂平板上，琼脂平板中含100μg/ml氨苄青霉素，置于37℃培养过夜；
C5、质粒的小量提取
挑取3个菌落用LB培养基进行增菌，然后提取质粒；质粒DNA的提取采用碱裂解方法进行；按试剂盒说明取过夜培养的菌液3ml，以12000转/分钟转速离心1分钟，收集菌体，重悬于250μl溶液P1，振荡至彻底悬浮；
加入250μl溶液P2，温和颠倒数次，使菌体充分裂解；
加入350μl溶液P3，温和颠倒数次，以1200转/分钟转速离心10分钟，小心将上清加入吸附柱CB3，室温放置1-2分钟，以1200转/分钟转速离心1分钟，取出吸附柱，倒掉流出的液体，将吸附柱重新放回收集管中；
加入700ul洗液，以1200转/分钟转速离心1分钟，再重复洗一次，弃废液后，以1200转/分钟转速空转2分钟，取出吸附柱，放入1.5毫升的Eppendorf管中，加入30μl pH＝8.0的TE缓冲液洗脱，室温放置2分钟，以12000转/分钟转速离心1分钟，收集洗脱液即为提取的质粒，于-20℃贮存；
C6、酶切鉴定质粒
取5μl提取的质粒，BamH I和Not I进行双酶切，酶切体系由如下体积的组份组成：
pcDNA3.1(+)V5His-meTERT 10μl
BamH I 1μl
Not I 1μl
10×M Buffer 2μl
无菌水 6μl
反应条件为：37℃3h，酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳；
C7、PCR扩增鉴定重组体
PCR反应体系由如下体积的组份组成：
pcDNA3.1(+)V5His-meTERT 5μl
2.5mmol/L 4×dNTP 1μl
FT 2μl
RT 2μl
10×M Buffer 4μl
TaqDNA聚合酶 1μl
无菌水 25μl
PCR反应条件为：94℃预变性1分钟，94℃变性30秒，58℃复性30秒，72℃延伸30秒，最后72℃延伸5分钟；扩增30个循环，抽取扩增产物5μl，用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，用DNA Marker来判断扩增片段的大小；
C8、pcDNA3.1(+)V5His-meTERT质粒瞬时转染COS-7细胞
C8(1)、COS-7细胞培养
于含10％灭活胎牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100U/ml的RPMI-1640培养液中，置于含5％CO2、饱和湿度、37℃恒温培养箱中进行培养，每2-3天传代一次。
C8(2)、pcDNA3.1(+)V5His-meTERT质粒转染COS-7细胞：
脂质体法转染：
(1)处理细胞：
转染前一天将每孔105个细胞放入1ml无抗生素的RPMI1640培养液中，待细胞长至70％时开始转染；
(2)准备DNA-脂质体混合液：
b液：将2μl脂质体用无血清无双抗培养基稀释成100μl，轻轻混匀，室温放置5分钟；
a液：将5μg质粒加入到100μl无血清无双抗培养基中，轻轻混匀；室温放置5分钟后，与A液轻轻混匀，室温放置20分钟；
(3)弃去孔内培养基，每孔加入1ml无双抗无血清1640培养基，将200μlDNA-脂质体溶液加入到含有细胞和培养基的培养孔中，轻轻混匀；
(4)将细胞培养于37℃含5％CO2培养箱中培养48小时。
C8(3)、转染后鉴定：Western-blot法鉴定meTERT多肽的表达
C8(3-1)、SDS-PAGE：
培养48小时后分别收取转染pcDNA3.1(+)V5His-meTERT质粒的COS-7细胞，转染pcDNA3.1(+)V5His空质粒的COS-7细胞以及未转染的COS-7细胞，用细胞裂解液将细胞裂解，离心后取上清，分别加入等量2倍十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液，煮沸5分钟。各取20微升进行转移电泳；
聚丙烯酰胺凝胶的配制方法如下：
分离胶12％ 积层胶5％
水 2.6ml 2.1ml
30％丙稀酰胺 3.2ml 0.5ml
Tris pH＝8.82.0ml pH＝6.80.38ml
10％SDS 80μl 30μl
10％过硫酸铵 80μl 30μl
TEMED 4μl 3μl
C8(3-2)、电转膜：
电泳结束后，取一块与凝胶等大的醋酸纤维素膜贴在凝胶上，夹于六片等大的滤纸中间，各层之间避免产生气泡；凝胶一侧置于阴极，电流160毫安转膜3小时；取出胶在染液中染色，观察效果；
C8(3-3)、转膜结束后将膜取出用水洗净，加封闭液于4℃封闭12小时，将封闭后的膜用洗液以10分钟/次的速度洗4次后，与1∶500稀释的抗鼠的HisB单克隆抗体共同孵育1小时；用洗液洗2次，用磷酸盐缓冲液洗两次，每次10分钟；然后与1∶1000稀释的碱性磷酸酶标记兔抗鼠IgG反应1小时；再用磷酸盐缓冲液-吐温20洗液洗4次，加底物显色后，放入水中终止显色；与染色的凝胶对比观察实验结果，看有无特异性条带出现(图4)。
所述的步骤D是设计了引物T-R(EcoR I)))：5’ACAGAATTCGATATCGTCCAGGCCCAGCACAGA3’，以FT4引物为上游引物，以T-R(EcoR I)为下游引物，以PCR产物序列为模板，进行PCR反应，将上述PCR产物分别用BamH I、EcoR I双酶切，连入原核表达质粒pGEX-4T中，得重组表达质粒pGEX-meTERT，分别经PCR(图5A)、酶切(图5B)及测序鉴定，表明meTERT的DNA片段正确插入了质粒中。将鉴定正确的质粒转化大肠杆菌E.coli BL21，37℃培养至OD600为0.4-0.6，IPTG诱导表达，收集菌体，SDS-PAGE分析；Western-blot检测蛋白GST-meTERT的表达；亲和层析纯化蛋白GST-meTERT。
将鉴定为阳性的重组质粒转化至E.coli BL21，诱导表达后，经SDS-PAGE电泳，结果显示：诱导产物在35KD分子量附近出现高表达的蛋白条带，与目的蛋白的分子量(37KD)一致，而未诱导的菌没有表达目的产物(图6A)；Western-blot结果表明：经IPTG诱导的菌体蛋白与GST单抗可产生特异性结合反应，在相应的目的条带处有明显杂交信号，而未转染的coli BL21菌体蛋白不与GST单抗反应，表明融合蛋白在coli BL21中成功表达(图6B)；经亲和层析纯化，SDS-PAGE电泳结果表明获得了纯化蛋白GST-meTERT(图6C)。具体操作步骤如下：
D1、PCR回收产物及pGEX-4T质粒的酶切
取pGEX-4T质粒10μl，用BamHI和EcoRI进行双酶切，酶切体系由如下体积的组分组成：
pGEX-4T质粒 10μl
BamHI 1μl
EcoR I 1μl
10×K Buffer 2μl
无菌水 6μl
将PCR回收产物15μl，用BamHI和EcoR I进行双酶切，酶切体系由如下体积的组分组成：
PCR产物 15μl
BamHI 1μl
EcoR I 1μl
10×K Buffer 2μl
无菌水 1μl
D2、采用步骤D1的方法将DNA片段纯化回收；
D3、DNA的连接
将步骤D2中的PCR产物及pGEX-4T酶切后经琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段后连接，连接体系由如下体积的组分组成：
PCR回收产物 5μl
pGEX-4T Vector 2μl
T4DNA连接酶 1μl
10×Buffer 1μl
反应的条件为16℃水浴16小时；
D4、酶切鉴定阳性克隆
将步骤D3中的产物转化感受态细胞，提取质粒，取提取的质粒10μl，行双酶切鉴定，酶切体系由如下体积的组分组成：
重组质粒 7μl
BamHI 1μl
EcoR I 1μl
10×K Buffer 2μl
无菌水 9μl
反应的条件为37℃、3小时，酶切产物行1％琼脂糖电泳分析；
D5、采用步骤D4的方法进行PCR鉴定；。
D6、采用步骤D4的方法将鉴定阳性的质粒和pGEX-4T空质粒分别转化至表达宿主菌E.coli BL21；。
D7、小量诱导蛋白GST-meTERT和GST表达
挑取单个菌落接种于含有氨苄青霉素100μg/ml的LB培养基中，37℃培养过夜；次日按1∶50扩大培养，37℃培养至菌密度为A600＝0.6-0.9时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，继续培养4小时，取1.5ml离心菌，100μl水悬浮沉淀，加100μl 2xSDS凝胶加样缓冲液，煮沸10分钟，离心后取10μl进行SDS-PAGE分析；
聚丙烯酰胺凝胶的配制过程如下：
分离胶12％ 积层胶5％
水 2.6ml 2.1ml
30％丙稀酰胺 3.2ml 0.5ml
Tris(1mol/L) pH＝8.82.0ml pH6.80.38ml
10％SDS 80μl 30μl
10％过硫酸铵 80μl 30μl
TEMED 4μl 3μl
D8、Western-blot检测蛋白GST-meTERT和GST的表达
取诱导后的BL21表达菌株和BL21空菌株做SDS-PAGE电泳，电泳完毕，切胶浸泡于去离子水中，并剪取与胶大小相似的PVDF膜及滤纸六张，PVDF膜在甲醇中浸泡3-5分钟后，将胶、PVDF膜及滤纸置电转移液中平衡5分钟。排列顺序从负极到正极依次为：三层滤纸、胶、PVDF膜、三层滤纸，各层之间排空气泡，两端夹好，4℃，160毫安电转移3小时，用1×丽春红染色观察蛋白转移效果。然后将其用水洗净，加封闭液于4℃封闭12小时，TBST洗液按照10分钟/次洗4次后，与1∶800稀释的GST单抗37℃共同孵育1小时；采用上述方法用TBST洗涤，然后与1∶1000稀释的AP标记马抗鼠IgG 37℃反应1小时；TBST洗涤2次，去离子水漂洗1次，BCIP/NBT显色观察结果；
D9、大量诱导表达蛋白GST-meTERT和GST
接种单菌落于100ml含羧苄青霉素100μg/ml的LB培养基，37℃培养过夜，按1∶4将过夜菌接种于新鲜的含羧苄青霉素100μg/ml的LB培养基，37℃、250转/分钟培养3小时，至菌液OD600＝0.6，加入IPTG至终浓度1mmol/L，继续培养5小时，离心菌，将菌体反复3次，用超声裂解液悬浮菌体，反应条件为10ml/g湿菌体；超声波破碎后，反应条件为350瓦×30分钟，4℃、8000g离心15分钟，沉淀主要为包涵体，将上清、包涵体与Marker进行SDS-PAGE电泳鉴定；
D10、纯化目的蛋白GST-meTERT和GST
将步骤D9中的沉淀重悬于9倍体积包涵体洗液中，室温放置5分钟，4℃、8000g离心5分钟；沉淀重悬于15mlTriton/1L菌液，充分混匀，4℃、12000g离心10分钟，重复4次；再将沉淀重悬于去15mlTriton/1L菌液，4℃、12000g离心10分钟；用尿素洗液15ml Triton/1L菌液洗涤菌体，4℃、12000g离心10分钟，重复4次；
溶解纯化的包涵体在15ml变性缓冲液/升菌液中，充分混匀，4℃过夜，使其充分溶解；4℃、12000g离心20分钟，吸上清置于一干净的新管中，加入15μl β-巯基乙醇，4℃、1小时，将其装入处理好的透析袋中，放在加入8M尿素的复性缓冲液中，4℃透析，浓度梯度为1摩尔浓度/2小时。。
透析完成后，将GST-meTERT和GST分别分装入Ep管，瞬时离心取上清，冷冻干燥，-80℃保存。
小鼠的免疫
6-9周龄的雌性BALB/c小鼠30只，随机分为5组，分别为①PBS对照组；②空质粒(pcDNA3.1(+)V5His)组，简称PC；③DNA疫苗(pcDNA3.1(+)V5His-meTERT)组，简称PCT；④GST-meTERT肽疫苗组，简称PCG；⑤PCT+PCG联合免疫组，即第一次用PCT免疫，第二及第三次用PCG免疫。均以20％的氢氧化铝为佐剂，PCT(100微克)免疫途径为大腿肌肉注射，PCG(50微克)为皮内多点注射免疫。共免疫3次，每次间隔10天，末次免疫后14天经小鼠内眦静脉取血，处死小鼠，取脾制备脾单细胞悬液，准备进行细胞免疫指标的检测。
流式细胞仪检测CD4+T和CD8+T细胞：
(1)用生理盐水洗涤离心脾细胞2次，调整细胞浓度为1×106个/ml；
(2)将细胞悬液分为2管，分别加入CD4-FITC和CD8-PE各10μl，混匀后，室温下避光孵育30分钟；
(3)加生理盐水2ml，振荡，离心，洗涤2次，以除去未结合的荧光抗体；
(4)用FACSsort型流式细胞仪进行检测。
结果见图7，与PBS组比较，PCT、PG、PCT+PG组CD4+T和CD8+T细胞的百分率明显升高(P＜0.01)，PCT+PG组与PCT或PG组比较CD4+T和CD8+T细胞的百分率亦明显升高(P＜0.01)，表明肽疫苗和DNA疫苗单独免疫和联合免疫均能有效激活CD4+T和CD8+T细胞，另外，联合免疫能够激活更多的CD4+T和CD8+T细胞。
ELISPOT检测细胞免疫应答的类型：
ELISPOT检测具体操作按Cayman公司ELISPOT试剂盒产品说明书进行：在96孔滤膜板中加100微升/孔的70％乙醇，室温放置10分钟，倒掉乙醇，用PBS或包被缓冲液洗涤；加100微升/孔适当稀释的捕获抗体，4℃包被过夜；倾空板子，用包被缓冲液洗涤2次，加200微升/孔RPMI1640完全培养基，室温封闭1小时；弃液，加入100微升/孔用RPMI1640稀释的抗原(GST-meTERT或GST)；每孔加入脾细胞106个/100微升，在37℃、5％二氧化碳CO2培养箱中培养36小时；将培养物倒掉、拍干，用洗液洗涤3次，加100微升/孔生物素标记的检测抗体，室温放2小时。弃液，用洗液洗涤4次，加100微升/孔亲和素标记的辣根过氧化物酶，室温放置45分钟，洗涤，加100微升/孔新配置的底物液，室温显色10-60分钟，观察斑点形成。加200微升/孔蒸馏水洗板3次终止反应。自然干燥，用读板机读板。
ELISPOT结果显示：GST蛋白刺激孔的各组细胞数无显著性差异。而GST-meTERT抗原刺激孔，PCT+PCG联合免疫诱导的分泌干扰素IFN-γ的淋巴细胞数量显著高于其它各组(P＜0.01)；另外，PCT+PCG诱导的分泌干扰素IFN-γ的淋巴细胞数显著高于其诱导的分泌白细胞介素IL-4的淋巴细胞数量。这些结果表明：PCT+PCG联合免疫比PCT或PCG单独免疫诱导的meTERT特异性CD4+Th淋巴细胞免疫应答更强，而且PCT+PCG诱导了淋巴细胞CD4+Th1型优势应答，即肽疫苗和DNA疫苗联合免疫诱导了有利于清除肿瘤细胞的细胞免疫类型(图8)。
用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性
最后一次免疫后14天处死小鼠，取脾细胞，用0.5微摩尔GST-meTERT体外刺激脾细胞5天得效应细胞；取肿瘤细胞SP2/0细胞用10微摩尔GST-meTERT或GST蛋白刺激2小时得两种靶细胞，然后在96孔板中按不同的效/靶比100∶1、50∶1、25∶1、12.5∶1加载效应细胞和靶细胞，未刺激的肿瘤细胞SP2/0细胞作为对照细胞，同时设置肿瘤细胞SP2/0自然释放乳酸脱氢酶孔和最大释放乳酸脱氢酶孔，分别设3个复孔，在CO2培养箱37℃共培养6小时，根据乳酸脱氢酶释放试剂盒说明书检测细胞毒性T淋巴细胞活性。特异性细胞杀伤率(％)＝(试验组吸光度值-自然释放组吸光度值)/(最大释放吸光度值-自然释放组吸光度值)。结果：当靶细胞为GST刺激的SP/20时，各组均未产生有效的CTL；而当靶细胞为GST-meTERT刺激的SP/20时，与PBS组比较，PCT和PCG单独免疫组在效靶比为50∶1和100∶1时meTERT特异性杀伤活性均有一定的升高，但无统计学意义，而PCT+PCG联合免疫组所诱导的meTERT特异性CTL水平明显高于其它各组(P＜0.01)，表明PCT+PCG联合免疫诱导了显著的特异性细胞毒性T淋巴细胞杀伤活性，即肽疫苗和DNA疫苗联合免疫诱导了具有强烈活性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，能够有效杀死表达人端粒酶逆转录酶(hTERT)的肿瘤细胞(图9)。
上述描述仅作为本发明一种用于预防和治疗肿瘤的疫苗及其制备方法可实施的技术方案提出，不作为对其本身的单一限制条件。
Claims (9)
1.用于预防和治疗肿瘤的疫苗，其特征在于连接后的多表位端粒酶逆转录酶核苷酸序列如下：
gaggagatcctggccaagttcctgcactggctgatgagtaccttgacagacctccagccgtacatgcgacagttcgtggctcacctgctgcgtttggtggatgatttcttgttggtgacacctccggtgtacgccgagaccaagcacttcctctactcctggcaggtgtacggcttcgtgcgggcctgcctgcgccggaaactctttggggtcttgcggctgaagtgtcaccgccccggcctcctgggcgcctctgtgctgggcctggacgatatc。
2.根据权利要求1所述的用于预防和治疗肿瘤的疫苗的制备，其特征在于制备方法包括如下工艺步骤：
A、端粒酶逆转录酶表位序列的选择；
B、多表位端粒酶逆转录酶的核苷酸的串联连接；
C、多表位端粒酶逆转录酶DNA疫苗的制备；
D、多表位端粒酶逆转录酶多表位肽疫苗的制备。
3.根据权利要求2所述的用于预防和治疗肿瘤的疫苗的制备，其特征在于所述的步骤A表位的选择中包括如下特异性表位：
I540 ILAKFLHWL；
R865 RLVDDFLLV；
K973 KLFGVLRLK；
V324 VYAETKHFL；
V461 VYGFVRACL；
R672 RPGLLGASVLGLDDI；
L766 LTDLQPYMRQFVAHL。
4.根据权利要求2所述的用于预防和治疗肿瘤的疫苗的制备，其特征在于所述的步骤B是设计8条首尾互补的引物，经过4轮PCR反应，得到编码多表位肽的DNA片段，即多表位端粒酶逆转录酶基因。
5.根据权利要求4所述的用于预防和治疗肿瘤的疫苗的制备，其特征在于所述的步骤B包括如下工艺步骤：
B1、第一步扩增体系为：10×PCR缓冲液2微升，2.5毫摩尔的dNTP2微 升，10微摩尔合成引物RT1、FT1各1微升，5单位/微升Taq DNA聚合酶1微升，加去离子水至20微升；PCR反应条件为：94℃预变性1分钟；94℃变性30秒，58℃退火30秒、72℃延伸30秒，扩增5个循环；72℃继续延伸1分钟；
B2、随后三步扩增均以上一步PCR产物稀释50倍作为模板进行；扩增体系同步骤A，只是引物第二步PCR选用RT2和FT2，第三步选用RT3和FT3；PCR反应条件为：94℃预变性1分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒、72℃延伸30秒，扩增30个循环；72℃继续延伸5分钟；第四次PCR扩增后所得目的基因即为多表位端粒酶逆转录酶meTERT；1.2％琼脂糖凝胶电泳分析聚合酶链式反应产物；
合成的首尾重叠的引物如下：5’---3’
FT4 GCGGGATCCGCCACCATGAGCGAGGAGATCCTGGCCAAGTTCCTGCACTGG；
FT3 CAAGTTCCTGCACTGGCTGATGAGTACCTTGACAGACCTCCAGCCGTACATGC；
FT2 CTCCAGCCGTACATGCGACAGTTCGTGGCTCACCTGCTGCGTTTGGTGGATGA；
FT1 TGCGTTTGGTGGATGATTTCTTGTTGGTGACACCTCCGGTGTACGCCGAGACC；
RT1 CGAAGCCGTACACCTGCCAGGAGTAGAGGAAGTGCTTGGTCTCGGCGTACACC；
RT2 AAGACCCCAAAGAGTTTCCGGCGCAGGCAGGCCCGCACGAAGCCGTACACCTG；
RT3 GGCGCCCAGGAGGCCGGGGCGGTGACACTTCAGCCGCAAGACCCCAAAGAGTT；
RT4 ATAGCGGCCGCGATATCGTCCAGGCCCAGCACAGAGGCGCCCAGGAGGCCG。
6.根据权利要求2所述的用于预防和治疗肿瘤的疫苗的制备，其特征在于所述的步骤C是将PCR产物分别用BamH I、Not I双酶切，连接到双酶切的pcDNA3.1(+)V5His表达载体中，得重组质粒pcDNA3.1(+)V5His-meTERT；对构建的载体分别进行PCR、酶切和DNA测序鉴定；以构建的pcDNA3.1(+)V5His-meTERT质粒为模板进行PCR，经琼脂糖凝胶电泳，在200-500bp之间出现目的条带，结果与预期一致；pcDNA3.1(+)V5His-meTERT经内切酶BamH I和Not I双酶切，经琼脂糖凝胶电泳，出现大小两个片段，分别为质粒和插入的目的片段；经测序鉴定，结果均表明该质粒的插入序列正确。
7.根据权利要求6所述的用于预防和治疗肿瘤的疫苗的制备，其特征在于所述的步骤C包括如下工艺步骤：
C1、PCR回收产物及pcDNA3.1(+)V5His质粒的酶切
取pcDNA3.1(+)V5His质粒10μl，用BamHI和EcoRI进行双酶切，酶切体系由如下体积的组份组成：
pcDNA3.1(+)V5His质粒 10μl
BamHI 1μl
Not I 1μl
10×K Buffer 2μl
无菌水 6μl
将PCR回收产物15μl，用BamHI和Not I进行双酶切，酶切体系由如下体积的组份组成：
PCR产物 15μl
BamHI 1μl
Not I 1μl
10×K Buffer 2μl
无菌水 1μl
C2、DNA片段的纯化回收
将酶切后的PCR片断及pcDNA3.1(+)V5His载体电泳后切胶加入600微升的溶胶液，50℃-60℃放置2分钟；将融化后的溶液放入离心纯化柱中，以13000转/分钟转速离心30秒，倒掉收集管中的废液，加500微升80％乙醇，以13000转/分钟转速离心30秒，倒掉收集管中的废液；将纯化柱套入干净的1.5毫升离心管中，加入30微升缓冲液，放置2分钟，离心30秒，-20℃保存；
C3、DNA的连接
PCR产物及pcDNA3.1(+)V5His酶切后经琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段后连接，连接体系由如下体积的组份组成：
PCR回收产物 7μl
pcDNA3.1(+)V5His 1μl
T4DNA连接酶 1μl
10×Buffer 1μl
反应条件为16℃水浴16h。
C4、细菌的转化
加入10μl连接产物至感受态细胞，冰浴30分钟，42℃热休克90秒，再冰浴2分钟，加850μl不含氨苄青霉素的LB培养基振摇45-50分钟后，以4000转/分钟转速离心10分钟，加100μl新鲜的LB培养基将菌液悬起，涂于LB琼脂平板上，琼脂平板中含100μg/ml氨苄青霉素，置于37℃培养过夜；
C5、质粒的小量提取
挑取3个菌落用LB培养基进行增菌，然后提取质粒；质粒DNA的提取采用碱裂解方法进行；按试剂盒说明取过夜培养的菌液3ml，以12000转/分钟转速离心1分钟，收集菌体，重悬于250μl溶液P1，振荡至彻底悬浮；
加入250μl溶液P2，温和颠倒数次，使菌体充分裂解；
加入350μl溶液P3，温和颠倒数次，以1200转/分钟转速离心10分钟，小心将上清加入吸附柱CB3，室温放置1-2分钟，以1200转/分钟转速离心1分钟，取出吸附柱，倒掉流出的液体，将吸附柱重新放回收集管中；
加入700ul洗液，以1200转/分钟转速离心1分钟，再重复洗一次，弃废液后，以1200转/分钟转速空转2分钟，取出吸附柱，放入1.5ml的Eppendorf管中，加入30μl pH＝8.0的TE缓冲液洗脱，室温放置2分钟，以12000转/分钟转速离心1分钟，收集洗脱液即为提取的质粒，于-20℃贮存；
C6、酶切鉴定质粒
取5μl提取的质粒，BamH I和Not I进行双酶切，酶切体系由如下体积的组份组成：
pcDNA3.1(+)V5His-meTERT 10μl
BamH I 1μl
Not I 1μl
10×M Buffer 2μl
无菌水 6μl
反应条件为：37℃、3小时，酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳；
C7、PCR扩增鉴定重组体
PCR反应体系由如下体积的组份组成：
pcDNA3.1(+)V5His-meTERT 5μl
2.5mmol/L4×dNTP 1μl
FT 2μl
RT 2μl
10×M Buffer 4μl
TaqDNA聚合酶 1μl
无菌水 25μl
PCR反应条件为：94℃预变性1分钟，94℃变性30秒，58℃复性30秒，72℃延伸30秒，最后72℃延伸5分钟；扩增30个循环，抽取扩增产物5μl，用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，用DNA Marker来判断扩增片段的大小；
C8、pcDNA3.1(+)V5His-meTERT质粒瞬时转染COS-7细胞
C8(1)、COS-7细胞培养
于含10％灭活胎牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100U/ml的RPMI-1640培养液中，置于含5％CO2、饱和湿度、37℃恒温培养箱中进行培养，每2-3天传代一次。
C8(2)、pcDNA3.1(+)V5His-meTERT质粒转染COS-7细胞：
脂质体法转染：
(1)处理细胞：
转染前一天将每孔105个细胞放入1ml无抗生素的RPMI1640培养液中，待细胞长至70％时开始转染；
(2)准备DNA-脂质体混合液：
b液：将2μl脂质体用无血清无双抗培养基稀释成100μl，轻轻混匀，室温放置5分钟；
a液：将5μg质粒加入到100μl无血清无双抗培养基中，轻轻混匀；室温放置5分钟后，与A液轻轻混匀，室温放置20分钟；
(3)弃去孔内培养基，每孔加入1ml无双抗无血清1640培养基，将200μlDNA-脂质体溶液加入到含有细胞和培养基的培养孔中，轻轻混匀；
(4)将细胞培养于37℃含5％CO2培养箱中培养48小时。
C8(3)、转染后鉴定：Western-blot法鉴定meTERT多肽的表达
C8(3-1)、SDS-PAGE：
培养48小时后分别收取转染pcDNA3.1(+)V5His-meTERT质粒的COS-7细胞，转染pcDNA3.1(+)V5His空质粒的COS-7细胞以及未转染的COS-7细胞， 用细胞裂解液将细胞裂解，离心后取上清，分别加入等量2倍十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液，煮沸5分钟。各取20微升进行转移电泳；
聚丙烯酰胺凝胶的配制方法如下：
分离胶12％ 积层胶5％
水 2.6ml 2.1ml
30％丙稀酰胺 3.2ml 0.5ml
Tris pH＝8.82.0ml pH＝6.80.38ml
10％SDS 80μl 30μl
10％过硫酸铵 80μl 30μl
TEMED 4μl 3μl
C8(3-2)、电转膜：
电泳结束后，取一块与凝胶等大的醋酸纤维素膜贴在凝胶上，夹于六片等大的滤纸中间，各层之间避免产生气泡；凝胶一侧置于阴极，电流160毫安转膜3小时；取出胶在染液中染色，观察效果；
C8(3-3)、转膜结束后将膜取出用水洗净，加封闭液于4℃封闭12小时，将封闭后的膜用洗液以10分钟/次的速度洗4次后，与1∶500稀释的抗鼠的HisB单克隆抗体共同孵育1小时；用洗液洗2次，用磷酸盐缓冲液洗两次，每次10分钟；然后与1∶1000稀释的碱性磷酸酶标记兔抗鼠IgG反应1小时；再用磷酸盐缓冲液-吐温20洗液洗4次，加底物显色后，放入水中终止显色；与染色的凝胶对比观察实验结果，看有无特异性条带出现。
8.根据权利要求2所述的用于预防和治疗肿瘤的疫苗的制备，其特征在于所述的步骤D是设计了引物T-R(EcoR I)：5’ACAGAATTCGATATCGTCCAGGCCCAGCACAGA3’，以FT4引物为上游引物，以T-R(EcoR I)为下游引物，以PCR产物序列为模板，进行PCR反应，将上述PCR产物分别用BamH I、EcoR I双酶切，连入原核表达质粒pGEX-4T中，得重组表达质粒pGEX-meTERT，分别经PCR、酶切及测序鉴定，表明meTERT的DNA片段正确插入了质粒中；将鉴定正确的质粒转化大肠杆菌E.coli BL21，37℃培养至OD600为0.4-0.6，IPTG诱导表达，收集菌体，SDS-PAGE分析；Western-blot检测蛋白GST-meTERT的表达；亲和层析纯化GST-meTERT。
9.根据权利要求2所述的用于预防和治疗肿瘤的疫苗的制备，其特征在于所述的步骤D包括如下工艺步骤：
D1、PCR回收产物及pGEX-4T质粒的酶切
取pGEX-4T质粒10μl，用BamHI和EcoRI进行双酶切，酶切体系由如下体积的组分组成：
pGEX-4T质粒 10μl
BamHI 1μl
EcoR I 1μl
10×K Buffer 2μl
无菌水 6μl
将PCR 收产物15μl，用BamHI和EcoR I进行双酶切，酶切体系由如下体积的组分组成：
PCR产物 15μl
BamHI 1μl
EcoR I 1μl
10×K Buffer 2μl
无菌水 1μl
D2、采用步骤D1的方法将DNA片段纯化回收；
D3、DNA的连接
将步骤D2中的PCR产物及pGEX-4T酶切后经琼脂糖凝胶电泳、切胶回收目的片段后连接，连接体系由如下体积的组分组成：
PCR回收产物 5μl
pGEX-4T Vector 2μl
T4DNA连接酶 1μl
10×Buffer 1μl
反应的条件为16℃水浴16小时；
D4、酶切鉴定阳性克隆
将步骤D3中的产物转化感受态细胞，提取质粒，取提取的质粒10μl，行双酶切鉴定，酶切体系由如下体积的组分组成：
重组质粒 7μl
BamHI 1μl
EcoR I 1μl
10×K Buffer 2μl
无菌水 9μl
反应的条件为37℃、3小时，酶切产物行1％琼脂糖电泳分析；
D5、采用步骤D4的方法进行PCR鉴定；
D6、采用步骤D4的方法将鉴定阳性的质粒和pGEX-4T空质粒分别转化至表达宿主菌E.coli BL21；
D7、小量诱导蛋白GST-meTERT和GST表达
挑取单个菌落接种于含有氨苄青霉素100μg/ml的LB培养基中，37℃培养过夜；次日按1∶50扩大培养，37℃培养至菌密度为A600＝0.6-0.9时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，继续培养4小时，取1.5ml离心菌，100μl水悬浮沉淀，加100μl 2xSDS凝胶加样缓冲液，煮沸10分钟，离心后取10μl进行SDS-PAGE分析；
聚丙烯酰胺凝胶的配制过程如下：
分离胶12％ 积层胶5％
水 2.6ml 2.1ml
30％丙稀酰胺 3.2ml 0.5ml
Tris(1mol/L) pH＝8.82.0ml pH6.80.38ml
10％SDS 80μl 30μl
10％过硫酸铵 80μl 30μl
TEMED 4μl 3μl
D8、Western-blot检测蛋白GST-meTERT和GST的表达
取诱导后的BL21表达菌株和BL21空菌株做SDS-PAGE电泳，电泳完毕，切胶浸泡于去离子水中，并剪取与胶大小相似的PVDF膜及滤纸六张，PVDF膜在甲醇中浸泡3-5分钟后，将胶、PVDF膜及滤纸置电转移液中平衡5分钟。排列顺序从负极到正极依次为：三层滤纸、胶、PVDF膜、三层滤纸，各层之间排空气泡，两端夹好，4℃、160毫安电转移3小时，用1×丽春红染色观察蛋白转移效果。然后将其用水洗净，加封闭液于4℃封闭12小时，TBST洗液按照10分钟/次洗4次后，与1∶800稀释的GST单抗37℃共同孵育1小时； 采用上述方法用TBST洗涤，然后与1∶1000稀释的AP标记马抗鼠IgG 37℃反应1小时；TBST洗涤2次，去离子水漂洗1次，BCIP/NBT显色观察结果；
D9、大量诱导表达蛋白GST-meTERT和GST
接种单菌落于100ml含羧苄青霉素100μg/ml的LB培养基，37℃培养过夜，按1∶4将过夜菌接种于新鲜的含羧苄青霉素100μg/ml的LB培养基，37℃、250转/分钟培养3小时，至菌液OD600＝0.6，加入IPTG至终浓度1mmol/L，继续培养5小时，离心菌，将菌体反复3次，用超声裂解液悬浮菌体，反应条件为10ml/g湿菌体；超声波破碎后，反应条件为350瓦×30分钟，4℃、8000g离心15分钟，沉淀主要为包涵体，将上清、包涵体与Marker进行SDS-PAGE电泳鉴定；
D10、纯化目的蛋白GST-meTERT和GST
将步骤D9中的沉淀重悬于9倍体积包涵体洗液中，室温放置5分钟，4℃、8000g离心5分钟；沉淀重悬于15mlTriton/1L菌液，充分混匀，4℃、12000g离心10分钟，重复4次；再将沉淀重悬于去15ml Triton/1L菌液，4℃、12000g离心10分钟；用尿素洗液15ml Triton/1L菌液洗涤菌体，4℃、12000g离心10分钟，重复4次；
溶解纯化的包涵体在15ml变性缓冲液/升菌液中，充分混匀，4℃过夜，使其充分溶解；4℃、12000g离心20分钟，吸上清置于一干净的新管中，加入15μlβ-巯基乙醇，4℃、1小时，将其装入处理好的透析袋中，放在加入8M尿素的复性缓冲液中，4℃透析，浓度梯度为1摩尔浓度/2小时。
透析完成后，将GST-meTERT和GST分别分装入Ep管，瞬时离心取上清，冷冻干燥，-80℃保存。
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20120808 Termination date: 20130306 |