CN102657854A

CN102657854A - 多表位疫苗yl66以及在制备肿瘤治疗性疫苗中的应用

Info

Publication number: CN102657854A
Application number: CN2012101599143A
Authority: CN
Inventors: 祁元明; 孙萌; 高艳锋; 邹喆; 陈飞; 翟文杰; 翟明霞
Original assignee: Zhengzhou University
Current assignee: Zhengzhou University
Priority date: 2012-05-22
Filing date: 2012-05-22
Publication date: 2012-09-12

Abstract

本发明公开了一种多表位疫苗YL66，并在此基础上构建出原核表达载体pGEX-4T-2-YL66和真核表达载体pCDNA3.1-YL66，通过载体pGEX-4T-2-YL66的原核表达，得到融合蛋白GST-YL66。通过HLA-A2健康供者外周血和HLA-A2.1/Kb转基因小鼠的体内外ELISPOT实验和LDH实验，对融合蛋白GST-YL66和DNA疫苗pCDNA3.1-YL66进行了免疫活性研究。研究发现：本发明所述抗肿瘤多表位疫苗在转基因小鼠体内和人体外所诱导的特异性CTL对肿瘤细胞EC-9706显示出一定的杀伤率，同时所诱导的CTL具有一定的抗原特异性，可用于肿瘤多表位疫苗构建策略和应用的进一步探究。

Description

多表位疫苗YL66以及在制备肿瘤治疗性疫苗中的应用

技术领域

本发明涉及生物化学领域中的多表位疫苗技术，尤其是涉及一种多表位疫苗YL66，本发明还涉及该多表位疫苗YL66在制备肿瘤治疗性疫苗中的应用。

背景技术

近年来疫苗在预防和治疗感染性疾病和恶性肿瘤上获得巨大成功，研究和开发新型肿瘤疫苗已经成为肿瘤免疫治疗研究的热点和方向。肿瘤疫苗（tumor vaccine）治疗的核心是肿瘤抗原，包括肿瘤特异性抗原（tumor specific antigen，TSA）和肿瘤相关性抗原（tumor-associated antigen，TAA）。肿瘤疫苗的基本原理是利用肿瘤抗原，通过主动免疫的方式来诱导机体产生特异性抗肿瘤免疫反应，以此来激发机体自身的免疫保护机制，达到肿瘤治疗或预防复发的作用。肿瘤抗原的分类标准不尽相同，根据肿瘤抗原的性质和组分的不同，肿瘤疫苗可以分为以细胞为载体的肿瘤疫苗（包括肿瘤细胞疫苗、树突状细胞疫苗和融合疫苗）、多肽/蛋白质疫苗、DNA（核酸）疫苗、抗独特型疫苗、病毒疫苗和异种疫苗等。

多肽疫苗是按照抗原基因中已知或人工软件预测的某段抗原表位的氨基酸序列通过化学合成技术制备的疫苗。使用时，直接将化学合成的多肽疫苗注入体内或者在体外共培养以诱导细胞毒性T淋巴细胞（CTL），它是抗肿瘤免疫中主要的效应细胞，从而对肿瘤细胞起到杀伤作用。多肽疫苗即表位（epitope），是抗原上的抗原决定簇，是与T细胞受体/B细胞受体或抗体特异结合的基本单位，是决定抗原特异性的特殊化学基团。多肽疫苗的优点是特异性高、可以方便地人工设计和大量合成纯度高、复制性好、化学性质稳定安全性好、费用低廉、无致癌性的多肽。但是肽的半衰期很短，只能提供暂时的刺激，同时诱导的免疫反应只能针对该种T细胞表面肽而不能引起广泛的T细胞免疫，而且在应用上还要受到HLA分子配型以及患者肿瘤是否表达该抗原的限制。这些问题使多肽疫苗在临床上的应用受到一定的限制。

由于多肽疫苗的免疫原性弱，只含单个表位肽，且多肽疫苗与人的MHCⅠ类分子HLA-A*0201相关，具有人白细胞抗原HLA-A2限制性，于是，人们提出将肿瘤抗原整个或部分蛋白质作为疫苗。这种蛋白质疫苗包含了更多的MHCⅠ和MHCⅡ类分子限制的表位肽，与多肽疫苗受主要组织相容性复合体（MHC）限制性不同的是，免疫原性较肽疫苗更强且具有所有表位，可以克服HLA限制。

将编码特定蛋白的外源基因直接导入动物体内，来达到免疫接种的目的，这种核酸既是载体同时也是抗原的来源，具有疫苗的功能，被称为核酸疫苗，这是近几年来迅速发展起来的新兴的分子生物学和免疫学相结合的一种技术。它包括DNA疫苗和RNA疫苗，目前研究最多的是DNA疫苗。由于DNA疫苗的众多优点，目前已经被应用于临床前期实验，但是由于整合后的重组真核表达载体可能具有潜在的危险性且不具备内在的扩增能力，其在人体内的安全性和疗效以及远期效果都仍需要继续观察。

然而，免疫原性弱和免疫耐受的存在是多表位疫苗作为肿瘤治疗性疫苗应用的两大障碍。因此，如何提高多表位的免疫原性以及打破机体对多表位的免疫耐受成为肿瘤治疗性多表位疫苗发展的关键。

发明内容

本发明的目的在于提供一种多表位疫苗YL66，本发明还提供了多表位疫苗YL66在制备肿瘤治疗性疫苗中的应用。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的多表位疫苗YL66，以来源于肿瘤细胞高表达抗原COX-2和MAGE-4的HLA-A2限制性CTL优势表位线性九肽p321（ILIGETIKI）、p321-1Y9L（YLIGETIKL）、p286-1Y2L9L（YLLEHVVRL）为基础，引入相关辅助序列TAT-PTD_（47-57）（YGRKKRRQRRR）、Th表位PADRE（AKFVAAWTLKAAA）、肽酶识别基序RVKR以及柔性连接子GSG设计而得的。

YL66的序列示意如下：TAT-PTD_（47-57）— GSG序列—PADRE—RVKR— p321—RVKR—p321-1Y9L— RVKR—p286-1Y2L9L。

YL66的氨基酸序列为：

Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Gly-Ser-Gly-Ala-Lys-Phe-Val-Ala-Ala-Trp-Thr-Leu-Leu-Ala-Ala-Ala-Arg-Val-Lys-Arg-Ile-Leu-Ile-Gly-Glu-Thr-Ile-Lys-Ile-Arg-Val-Lys-Arg-Tyr-Leu-Ile-Gly-Glu-Thr-Ile-Lys-Leu-Arg-Val-Lys-Arg-Tyr-Leu-Leu-Glu-His-Val-Val-Arg-Leu。

由多表位疫苗YL66构建出原核表达载体pGEX-4T-2-YL66和真核表达载体pCDNA3.1-YL66；其中原核表达载体pGEX-4T-2-YL66在大肠杆菌BL21（DE3）中进行原核表达，得到融合蛋白GST-YL66。

本发明还提供了真核表达载体pCDNA3.1-YL66和融合蛋白GST-YL66在制备肿瘤治疗性疫苗中的应用。

本发明的优点在于采用理论和实验相结合的方法构建出多表位疫苗YL66，并用于融合蛋白GST-YL66和DNA疫苗pCDNA3.1-YL66。构建的YL66多表位未见文献报道，为相关肿瘤的免疫治疗提供了实验基础和理论基础，也为重组蛋白表达和纯化方面做出了努力，初步了解该疫苗的免疫效果也为多表位疫苗和DNA疫苗在过继性免疫治疗和临床应用上提供更多的支持。

附图说明

图1、图2 分别为原核表达载体pGEX-4T-2-YL66和真核表达载体pCDNA3.1-YL66的测序图谱。

图3是 GST-YL66融合蛋白表达和GST的全菌体蛋白12%SDS-PAGE分析。

图4 是纯化后蛋白GST和GST-YL66的12%SDS-PAGE分析。

图5～图8 是融合蛋白疫苗GST-YL66特异性CTL分泌IFN-γ的能力检测。

图9～图12是融合蛋白GST-YL66特异性CTL的体外细胞毒实验结果。

图13是融合蛋白疫苗GST-YL66在HLA-A2.1/Kb转基因小鼠体内特异性CTL分泌IFN-γ的能力检测。

图14、图15 是融合蛋白GST-YL66特异性CTL的体内细胞毒实验结果。

图16是DNA疫苗pCDNA3.1-YL66在HLA-A2.1/Kb转基因小鼠体内特异性CTL分泌IFN-γ的能力检测。

图17、图18 是DNA疫苗pCDNA3.1-YL66诱导的特异性CTL在体内细胞毒实验结果。

图19是转基因小鼠的体重变化记录。

具体实施方式

本发明根据理论和实践相结合的方法，以肿瘤高表达抗原COX-2和MAGE-4的HLA-A2限制性CTL表位为基础，选取能够在健康供者外周血或者转基因小鼠体内诱发强效的CD8⁺T细胞免疫反应且对肿瘤细胞产生特异性杀伤的天然表位和改造肽表位，从COX-2得到的HLA-A2限制性CTL表位p321以及它的改造表位肽p321-1Y9L和从MAGE-4得到的HLA-A2限制性CTL表位p286的改造表位肽p286-1Y2L9L进行表位优化组合后，引入Tat-PTD、GSG连接子、PADRE和RVKR接头，构建出多表位融合疫苗YL66，YL66的氨基酸序列如下：

YGRKKRRQRRR—GSG—AKFVAAWTLKAAA—RVKR—ILIGETIKI—RVKR—YLIGETIKL—RVKR—YLLEHVVRL（Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Gly-Ser-Gly-Ala-Lys-Phe-Val-Ala-Ala-Trp-Thr-Leu-Leu-Ala-Ala-Ala-Arg-Val-Lys-Arg-Ile-Leu-Ile-Gly-Glu-Thr-Ile-Lys-Ile-Arg-Val-Lys-Arg-Tyr-Leu-Ile-Gly-Glu-Thr-Ile-Lys-Leu-Arg-Val-Lys-Arg-Tyr-Leu-Leu-Glu-His-Val-Val-Arg-Leu）

由YL66的氨基酸序列得到YL66的核苷酸序列：

TAT GGC CGT AAG AAA CGT CGT CAG CGT CGC CGT GGC AGC GGT GCG AAA TTT GTG GCG GCG TGG ACC CTG AAA GCG GCC GCC CGT GTT AAG CGT ATT CTG ATT GGC GAA ACC ATC AAA ATC CGT GTT AAG CGT TAT CTG ATC GGT GAA ACC ATC AAA CTG CGT GTT AAG CGT TAT CTG CTG GAA CAT GTG GTG CGT CTG

交由生工生物工程（上海）有限公司进行合成pUC57-YL66。

为了将上述YL66的DNA片段克隆进原核表达载体pGEX-4T-2和真核表达载体pCDNA3.1中，以公司合成的pUC57-YL66为模板，设计带有不同酶切位点适合两种质粒载体的两对引物进行YL66的PCR扩增。

载体为pGEX-4T-2时引物设计如下：

Forward primer1（F1）：GGATCCACCATGGGTTATGGC（下划线部分为BamH I）

Reverse primer1（R1）：CCGGAATTCGCAGACGCAC（下划线部分为EcoR I）

载体为pCDNA3.1时引物设计如下：

Forward primer2（F2）：CGGGATCCCGATGTATGGCCGTAAGAA（单下划线部分为BamH I，双下划线为起始密码子）

Reverse primer2（R2）：GGAATTCCTACAGACGCACCACATGTTC（单下划线部分为EcoR I，双下划线为终止密码子）

通过上述引物的PCR方法扩增后，进行双酶切、胶回收、4℃连接过夜的方法将此片段克隆进原核表达载体pGEX-4T-2和真核表达载体pCDNA3.1，以获得原核表达载体pGEX-4T-2-YL66和DNA疫苗pCDNA3.1-YL66，进行测序，测序结果如图1、图2所示，与预期的一致，无阅读框移位等现象。

GST-YL66融合蛋白的原核表达和纯化：将鉴定正确的重组质粒pGEX-4T-2-YL66及pGEX-4T-2空载体转化感受态大肠杆菌BL21（DE3），37℃LB平板（Amp⁺）培养过夜。BL21（DE3）菌种以1:100的比例加入到含有50μg/mL氨苄青霉素的100ml液体LB培养基中，37℃、200r/min培养。次日将1ml菌液加入到100ml的LB培养基（Amp⁺）中，37℃、200r/min振荡培养至对数中期（A600=0.4～0.6），加入IPTG（终浓度为1mmol/L），30℃继续培养3h。3h后的大肠杆菌在4℃、5000rpm离心15min，弃上清取沉淀菌体，加入含终浓度为1mM苯甲基磺酰氟（PMSF）、0.2mg/mL溶菌酶（lysozyme）的pH=7.2的PBS（按照每1L菌液的沉淀菌体加100ml的PBS）进行重悬，冰浴中超声破碎15min（超声10s间歇20s），待浑浊菌液呈澄清状态且与超声振头不粘连时结束超声。在4℃条件下，12000rpm离心20min，弃沉淀取上清4℃保存，用于GST Sefinose^TM Resin的亲和层析纯化实验。亲和层析纯化实验流程：①将恒流泵、支架、空心玻璃柱、核酸蛋白检测仪、台式记录仪、自动部分收集器依次连接完成，在玻璃柱中加入3ml谷胱甘肽-琼脂糖树脂（保存于20%乙醇），用5-10倍柱体积的PBS洗涤，流速1.5ml/min；②用3～5倍谷胱甘肽缓冲液和10倍体积PBS/EDTA/PMSF洗涤柱子，流速1.5ml/min；③将上面步骤得到的上清加入，流速≤0.1ml/min；④用10倍体积的PBS/EDTA洗涤柱，流速为1.5ml/min；⑤用5倍体积的谷胱甘肽缓冲液洗脱结合的GST融合蛋白，流速为0.3mL/min，收集洗脱液，经12% SDS-PAGE电泳后用考马斯亮蓝R-250染色检测亲和层析纯化结果。结果如图3，4所示,得到了融合蛋白GST-YL66。⑥10倍体积PBS继续洗涤后，5倍体积20%乙醇洗涤，并保存于20%乙醇。将鉴定后得到的GST-YL66与凝血酶混合（凝血酶酶切体系：每毫升的柱体积，4℃条件下，准备80μl即160个单位凝血酶和920μl pH7.3PBS的混合物）再按照上述的亲和层析方法③中得到的流出液体即为YL66蛋白。

GST-YL66和pCDNA3.1-YL66的相关免疫活性检测实验：

①GST-YL66融合蛋白疫苗体外免疫活性实验。

HLA-A2健康供者外周血单核细胞（PBMCs）的分离：通过淋巴细胞分离液分离获得 PBMCs。将PBMCs于24孔板中培养，每孔加含IL-2，β₂-M，CpG ODN-1826的IMDM培养基以及PBS组、GST组、GST-YL66组的相应各组分，置于37℃、5% CO2培养箱中培养。

分泌 IFN-γ的T细胞数的检测：采用ELISPOT实验，靶细胞为荷3个单独表位的T2A2细胞，用ELISPOT图像分析仪计数96孔板中每孔形成的斑点数。如图5～图8所示。

结果显示：100μg和200μg融合蛋白疫苗GST-YL66能检测到特异性T细胞免疫，同时相对于100μg GST所产生的斑点数相比差异显著（P＜0.05）。同时，免疫用GST-YL66所诱导的IFN-γ对分别荷肽p321、p321-1Y9L、p286-1Y2L9L的T2A2均能识别。因此，纯化得到的融合蛋白疫苗GST-YL66相对于PBS和GST组具有诱导更强的免疫活性的能力。

细胞毒活性检测：以EC-9706细胞（HLA-A2⁺，COX-2⁺，MAGE-4⁺）为靶细胞，LDH释放法检测特异性CTL 的细胞毒活性；以HT-29细胞（HLA-A2^-，COX-2^-，MAGE-4^-），空载的T2细胞（HLA-A2⁺，COX-2^-，MAGE-4^-）和使用BB7.2处理的EC-9706细胞（HLA-A2^-，COX-2⁺，MAGE-4⁺）为靶细胞，检测表位的限制性与特异性。如图9～图12所示。

结果显示：GST-YL66诱导的CTL对不同的靶细胞杀伤效果不同，具有明显的HLA-A2限制性和COX-2和MAGE-4特异性。

② GST-YL66融合蛋白疫苗和真核表达质粒pCDNA3.1-YL66体内免疫活性实验。

CTL体内诱导：随机选取4～6周龄HLA-A2.1/K^b转基因小鼠，每组5只，雌雄随机。分别于第0 d、第14 d、第28 d进行免疫注射；同时每次免疫注射前，对小鼠进行观察，记录体重。GST-YL66融合蛋白疫苗的注射方式为尾根部皮下注射，DNA疫苗pCDNA3.1-YL66的注射方式为股四头肌肌肉注射。

效应CTL制备：小鼠脱颈致死，取出脾脏，200目钢网研磨后收集脾细胞，体外培养7 d后收集CTL进行细胞毒活性检测。

分泌 IFN-γ的T细胞数的检测：采用ELISPOT实验，靶细胞为荷3个单独表位的T2A2细胞，用ELISPOT图像分析仪计数96孔板中每孔形成的斑点数。如图13，16所示。

结果表明：GST-YL66和DNA疫苗pCDNA3.1-YL66在小鼠体内显著增强的诱导出了分泌IFN-γ的CTL细胞数。同时在一定范围内，此细胞数目随融合蛋白用量的增加而增加（蛋白用量从100 μg增加到200 μg）。同时，对空载T2和荷肽T2细胞的斑点数对比可以看出，GST-YL66和pCDNA3.1-YL66诱导的CTL具有一定的表位特异性。

细胞毒活性检测：以EC-9706细胞（HLA-A2⁺，COX-2⁺，MAGE-4⁺）和HT-29细胞（HLA-A2^-，COX-2^-，MAGE-4^-）作为靶细胞，LDH释放法检测特异性CTL 的细胞毒活性。如图14，15,17,18所示。

结果显示：融合蛋白GST-YL66和DNA疫苗pCDNA3.1-YL66能够在体内被翻译和表达，同时在体内诱导特异性CTL成熟和增殖，且诱导的特异性CTL对EC-9706具有较高的杀伤作用，这种杀伤作用有HLA-A2限制性和COX-2、MAGE-4抗原特异性。

肝肾指数检测：小鼠处死取出脾脏后，取出肝脏、肾脏并称重，计算肝、肾指数，计算方法：肝、肾重量/小鼠体重×100%。如下表1和图19所示。结果说明：各实验组小鼠的肝肾指数与阴性对照组PBS组相比均没有显著性差异（P＞0.05）。说明融合蛋白和DNA免疫制剂对于小鼠的体重和肝肾均没有明显的影响。

表1 免疫制剂对于小鼠肝肾指数的影响（

）

。

体内外免疫活性实验结果显示：融合蛋白GST-YL66和DNA疫苗pCDNA3.1-YL66能够诱导CTL成熟和增殖，能够诱导特异性CTL对EC-9706具有较高的杀伤作用，且这种杀伤作用有HLA-A2限制性和COX-2、MAGE-4抗原特异性。

Application Project

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<120> Title : 多表位疫苗YL66以及在制备肿瘤治疗性疫苗中的应用

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<141> CurrentFilingDate :

Sequence

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<213> OrganismName :人工序列

<400> PreSequenceString :

tyrglyargl yslysargar gglnargarg argglyserg lyalalysph evalalaala 60

trpthrleul eualaalaal aargvallys argileleui leglygluth rilelysile 120

argvallysa rgtyrleuil eglygluthr ilelysleua rgvallysar gtyrleuleu 180

gluhisvalv alargleu 198

<212> Type : 线性氨基酸

<211> Length : 198

SequenceName : YL66

SequenceDescription : 从COX-2得到的HLA-A2限制性CTL表位p321以及它的改造表位肽p321-1Y9L和从MAGE-4得到的HLA-A2限制性CTL表位p286的改造表位肽p286-1Y2L9L进行表位优化组合后，引入Tat-PTD、GSG连接子、PADRE和RVKR接头，构建出多表位融合疫苗YL66

Sequence

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<212> Type : 线性氨基酸

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SequenceName : YL66

Claims

1.一种多表位疫苗YL66，其特征在于：所述疫苗的氨基酸序列为：Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Gly-Ser-Gly-Ala-Lys-Phe-Val-Ala-Ala-Trp-Thr-Leu-Leu-Ala-Ala-Ala-Arg-Val-Lys-Arg-Ile-Leu-Ile-Gly-Glu-Thr-Ile-Lys-Ile-Arg-Val-Lys-Arg-Tyr-Leu-Ile-Gly-Glu-Thr-Ile-Lys-Leu-Arg-Val-Lys-Arg-Tyr-Leu-Leu-Glu-His-Val-Val-Arg-Leu。

2.根据权利要求1所述多表位疫苗YL66，其特征在于：由所述多表位疫苗YL66构建出原核表达载体pGEX-4T-2-YL66和真核表达载体pCDNA3.1-YL66；其中原核表达载体pGEX-4T-2-YL66在大肠杆菌BL21中进行原核表达，得到融合蛋白GST-YL66。

3.根据权利要求2所述真核表达载体pCDNA3.1-YL66和融合蛋白GST-YL66在制备肿瘤治疗性疫苗中的应用。