CN105132371A

CN105132371A - 一种体外提呈、激活dc细胞的方法及其应用

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Publication number: CN105132371A
Application number: CN201510440972.7A
Authority: CN
Inventors: 张嵘; 林童俊; 张天赋
Original assignee: Beijing Dingcheng Taiyuan Biotechnology Co Ltd
Current assignee: BEIJING DINGCHENG TAIYUAN BIOTECHNOLOGY CO., LTD.
Priority date: 2015-07-24
Filing date: 2015-07-24
Publication date: 2015-12-09
Anticipated expiration: 2035-07-24
Also published as: CN105132371B

Abstract

一种体外提呈、激活DC细胞的方法，包括：体外培养诱导生成DC细胞、制备肿瘤抗原、所述肿瘤抗原冲击DC细胞，所述肿瘤抗原表达MAGE-3基因，所述肿瘤抗原为MAGE-3抗原融合蛋白、MAGE-3病毒疫苗或特异性抗原肽。本发明将DC细胞的抗原提呈在体外进行，在实验室理想的环境下，采用融合蛋白、特异性抗原肽或者表达特异性抗原蛋白的病毒疫苗冲击DC细胞，使DC细胞在体外成熟并携带肿瘤抗原后，回输患者体内，最大可能的避免了体内抗原提呈和激活的失败。确保了DC细胞激活的可控性、有效性和成功率。经本发明中通过基因重组构建的能够表达MAGE-3的抗原冲击的DC细胞刺激诱导的淋巴细胞能够有效杀伤MAGE-3表达阳性的癌细胞。

Description

一种体外提呈、激活DC细胞的方法及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及基于重组技术及多肽合成技术，具体为一种体外提呈、激活DC细胞的方法及其应用。

背景技术

非小细胞肺癌目前是全世界死亡率最高的癌症。除了采用传统的手术、放化疗之外，生物免疫疗法是探索开展的新的治疗手段。

目前生物免疫方法治疗晚期非小细胞癌一般步骤：APC细胞的抗原提呈、T细胞激活、T细胞转运、T细胞进入肿瘤、起效。这五个过程都是在体内进行。临床实践证明，上述五个环节都非常脆弱，尤其是体内的激活过程更是容易受到干扰，是生物治疗的瓶颈。

DC细胞是已知体内功能最强、唯一能活化静息T细胞的专职抗原提呈细胞，是启动、调控和维持免疫应答的中心环节。通过大量体外活化培养负载肿瘤抗原的DC细胞，当细胞数量达到一定数量后回输给病人，可诱导机体产生强烈的抗肿瘤免疫反应。通过DC细胞免疫治疗来达到靶向治疗的疗效，既往及目前有关特异性细胞免疫治疗的研究及临床应用主要是应用肿瘤抗原来刺激DC细胞，以期获得能直接特异性杀伤肿瘤细胞的DC-CIK细胞。但问题是针对肿瘤的最佳抗原仍未明确，且肿瘤细胞本身及其微环境的免疫抑制仍未解决，因此目前大多数DC-CIK细胞治疗并不能真正实现特异性杀伤肿瘤。

通过DC细胞诱导机体产生抗肿瘤免疫的治疗流程目前有以下两种方法：

1）抽取病人外周血50-60ml——分离单个核细胞，体外诱导DC细胞——DC细胞负载肿瘤抗原，通过静脉回输给病人或经皮下注射——经肿瘤抗原负载DC能刺激自体T细胞——产生强烈的抗肿瘤免疫应答。

2）抽取病人外周血50-60ml——分离单个核细胞，体外诱导DC细胞——DC细胞负载肿瘤抗原并与自体的淋巴细胞混合，刺激自体T细胞产生细胞毒性T淋巴细胞——将这些细胞毒性T淋巴细胞，通过静脉回输给病人——直接杀伤肿瘤细胞。

然而以上治疗方法并不成熟，尤其是体外诱导DC细胞及DC细胞负载肿瘤抗原技术理论上研究较多，但在具体实施过程中还有许多问题，缺乏明确的、肿瘤细胞发生发展关键的信号传导通路相关分子作为诱导抗原，因为肿瘤抗原不明及肿瘤微环境免疫抑制的障碍，使实现特异性细胞靶向免疫治疗难以顺利实施。

发明内容

本发明旨在提供一种体外提呈、激活DC细胞的方法，以一种明确的、肿瘤细胞发生发展关键的信号传导通路相关分子作为诱导抗原，从而能够绕过肿瘤抗原不明及肿瘤微环境免疫抑制的障碍，为实现特异性细胞靶向免疫治疗提供前期体外抗原制备和细胞激活技术。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种体外提呈、激活DC细胞的方法，包括：体外培养诱导生成DC细胞、制备肿瘤抗原、所述肿瘤抗原冲击DC细胞，所述肿瘤抗原表达MAGE-3。

进一步的，所述肿瘤抗原为MAGE-3抗原融合蛋白、MAGE-3病毒疫苗或特异性MAGE-3抗原肽。

关于制备肿瘤抗原方面，进一步的技术方案，所述MAGE-3抗原融合蛋白为HBVc-MAGE-3融合蛋白，HBVc-MAGE-3融合蛋白分子量22.4kD；所述HBVc-MAGE-3融合蛋白的制备步骤包括：构建质粒通过大肠杆菌表达HBVc-MAGE-3融合蛋白、融合蛋白分离纯化和超滤脱盐；所述构建质粒通过大肠杆菌表达HBVc-MAGE-3融合蛋白步骤为：

a、将含HBVc蛋白表达序列的pET-28a质粒，以HindIII限制性内切酶进行酶切，插入序列SEQIDNO：1；

b、NcoI和XhoI双酶切pET-28a质粒，目的基因大小为630bp，酶切后空质粒大小为5.4kb;

c、使用构建好的pET-28a质粒转化大肠杆菌感受态细胞，表达出的融合蛋白HBVc-MAGE-3自动组装成类病毒颗粒。

进一步的技术方案，所述MAGE-3病毒疫苗为rMVA-MAGE-3疫苗，所述rMVA-MAGE-3疫苗的制备方法包括：

a、构建穿梭质粒:A549细胞RNA逆转录获取MAGEA3基因cDNA；将MAGEA3基因cDNA克隆到pIIIdHR-P7.5质粒中；

b、重组MVA病毒构建：CEF细胞（鸡胚成纤维细胞）或者BHK-21细胞（仓鼠肾成纤维细胞）单层生长到70%~90%覆盖率依次感染MVA、转染穿梭质粒，培养获得单层细胞；所述单层细胞通过冻融、破碎获得rMVA溶液；所述rMVA溶液接种到RK-13细胞（兔肾细胞）培养获取rMVA感染RK-13聚集点，挑取所述聚集点筛选纯化得到所需rMVA；清除掉所述rMVA中wtMVA，将rMVA培养于CEF或者BHK-21细胞单层中，筛选不含选择基因K1L的rMVA，纯化得到rMVA-MAGE-3，扩增分离得到rMVA-MAGE-3。

进一步的技术方案，所述特异性MAGE-3抗原肽的大小为10~15aa，所述特异性MAGE-3抗原肽的合成方法包括：

a、锚定：把第一个氨基酸锚定在固相树脂上；

b、去保护：使用碱性溶剂去除氨基的保护基团；

c、活化：使用活化剂活化待连接的氨基酸羧基；

d、键联：活化的羧基与前一个氨基酸裸露的氨基反应，形成肽键；

e、重复步骤b-d，使整条肽链完全合成。

进一步的，所述特异性MAGE-3抗原肽的氨基酸序列为FFPVIFSKASSSLQL或EVDPIGHLY。

关于肿瘤抗原冲击DC细胞方面，进一步的技术方案为：所述肿瘤抗原为HBVc-MAGE-3融合蛋白，所述肿瘤抗原冲击DC细胞的方法包括：将HBVc-MAGE-3融合蛋白使用RPMI-1640+10%FBS培养基配制成0.7~0.9μM的溶液；把配制好的溶液与未成熟的DC细胞(iDC)共培养4h；PBS清洗、加入含有10%FBS、TNF-a、IL-6、IL-1β的RPMI-1640培养液，培养48~72h，收获携带MAGE-3抗原的成熟DC细胞（mDC）。

进一步的技术方案，所述肿瘤抗原为rMVA-MAGE-3疫苗，所述肿瘤抗原冲击DC细胞的方法包括：重组rMVA-MAGE-3病毒以MOI=0.3感染未成熟DC细胞(iDC)，感染4h后，加入含TNF-α、IL-6、IL-1β、10%FBS的RPMI-1640培养基，继续培养48~72h，收获携带MAGE-3抗原的成熟DC细胞(mDC)。

进一步的技术方案，所述肿瘤抗原为特异性MAGE-3抗原肽，所述肿瘤抗原冲击DC细胞的方法包括：用RPMI-1640+10%FBS培养基把合成的特异性MAGE-3抗原肽配制成15~25uM的溶液；把配制好的溶液分别与未成熟的DC细胞(iDC)共培养4h；PBS清洗、加入含有10%FBS、TNF-a、IL-6、IL-1β的RPMI-1640培养液，培养48~72h，收获携带MAGE-3抗原的成熟DC细胞(mDC)。

一种所述体外提呈、激活DC细胞的方法的应用，用于体外刺激T细胞产生细胞毒性淋巴细胞，操作方法为：收集携带MAGE-3抗原的成熟DC细胞(mDC)，以1:20的比例与PBMC共培养7天，培养基含有RPMI-1640、10%FBS、20U/mLIL-2、10ng/mLIL-7；使用所述携带MAGE-3抗原的DC细胞再次刺激PBMC，培养7天后的PBMC使用细胞分选系统分选出细胞毒性CD8+T细胞。

本发明将DC细胞的抗原提呈在体外进行，在实验室理想的环境下，采用融合蛋白、特异性抗原肽或者表达特异性抗原蛋白的病毒疫苗冲击DC细胞，使DC细胞在体外成熟并携带肿瘤抗原后，回输患者体内，最大可能的避免了体内抗原提呈和激活的失败。确保了DC细胞激活的可控性、有效性和成功率。

本发明的有益效果为：

1、而本发明所获得的DC细胞，是以已经较为明确的、肿瘤细胞发生发展关键的信号传导通路相关分子作为诱导抗原，理论上可绕过肿瘤抗原不明及肿瘤微环境免疫抑制的障碍，实现特异性细胞靶向免疫治疗的目的。

2、经本发明中通过基因重组构建的能够表达MAGE-3的抗原冲击的DC细胞刺激诱导的淋巴细胞能够有效杀伤MAGEA3表达阳性的癌细胞。

3、而本发明所获得的DC细胞，应用于临床时排斥反应轻微，安全性高，无明显毒副作用。

下面结合附图及具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

附图说明

图1为本发明体外提呈、激活DC细胞的方法流程图；

图2为HBVc-MAGE-3融合蛋白制备示意图；

图3为特异性MAGE-3抗原肽合成流程图；

图4为磁珠分选上述3中mDC刺激的外周血淋巴细胞作用结果图（1）；

图5为磁珠分选上述3中mDC刺激的外周血淋巴细胞作用结果图（2）；

图6为磁珠分选上述3中mDC刺激的外周血淋巴细胞作用结果图（3）；

图7为磁珠分选上述3中mDC刺激的外周血淋巴细胞作用结果图（4）；

图8为磁珠分选上述3中mDC刺激的外周血淋巴细胞作用结果图（5）；

图9为回输rMVA-MAGE-3激活后淋巴细胞对靶细胞的杀伤作用图；

图10为回输HBVc-MAGE-3激活后淋巴细胞对靶细胞的杀伤作用图。

具体实施方式

一种体外提呈、激活DC细胞的方法，包括：体外培养诱导生成DC细胞、制备肿瘤抗原、所述肿瘤抗原冲击DC细胞，所述肿瘤抗原表达MAGE-3基因。所述肿瘤抗原为MAGE-3抗原融合蛋白、MAGE-3病毒疫苗或特异性MAGE-3抗原肽。体外提呈、激活DC细胞的方法的整体流程图见图1。

实施例1

本实施例中通过基因重组构建HBVc-MAGE-3融合蛋白，HBVc-MAGE-3融合蛋白分子量22.4kD；所述HBVc-MAGE-3融合蛋白的制备步骤包括：构建质粒通过大肠杆菌表达HBVc-MAGE-3融合蛋白、融合蛋白分离纯化和超滤脱盐。

HBVc-MAGE-3融合蛋白特性：HBVc类病毒颗粒(HBVcVLPs)可以作为疫苗的佐剂。HBVc类病毒颗粒具有其特征性的免疫原性，因而可以作为其他蛋白或肽段的有效载体。HBVc蛋白的B细胞抗原表位或主要免疫原性区域（mostimmunogenicregion,MIR）位于包被于HBVc抗原外壳的尖刺状蛋白的顶端，并规则排列，有利于其与B细胞受体（BCR）的偶联。通过生物工程技术将MAGE-3肽段重组表达于HBVc颗粒的MIR区域，获得的HBVc-MAGE-3嵌合蛋白能够将MAGE-3表位呈递于球状重组蛋白的表面，有利于免疫细胞的快速识别。如图2所示，A.主要免疫原性区域（MIR）位于HBVc蛋白的顶端；HBVc蛋白自发聚合形成类病毒颗粒（VLP）。B.构建融合蛋白表达载体并将MAGE-3肽段嵌合于HBVc蛋白的主要免疫原性区域（MIR）。

C.重组HBVc-MAGE-3嵌合蛋白HBVc-MAGE形成类病毒颗粒（VLP），并将MAGE-3肽段呈递于MIR区域。

一、构建质粒通过大肠杆菌表达HBVc-MAGE-3融合蛋白的步骤为：

1、使用包含HBVc蛋白表达序列的pET-28a质粒，使用HindIII限制性内切酶进行酶切，同时使用HindIII限制性内切酶酶切插入序列插入序列SEQIDNO：1；

2、使用NcoI和XhoI双酶切pET-28a质粒反应，琼脂糖凝胶电泳鉴定，目的基因大小为630bp，酶切后空质粒大小为5.4kb；

3、使用构建好的pET-28a质粒转化大肠杆菌感受态细胞，表达出的融合蛋白（HBVc-MAGE-3）会自动组装成类病毒颗粒（如图2所示）。

二、HBVc-MAGE-3融合蛋白分离纯化操作流程：

1、将BL21(DE3)融合蛋白MAGEA3表达菌株接种于100g/mLKan的LB液体培养基，37℃200r/min振荡培养17hr；

2、将过夜培养物按1:100，转接至400ml含10mM葡萄糖和100g/mLKan的LB液体培养基，37℃140r/min振荡培养至对数生长期(OD₆₀₀=1.0)，大约需要5个小时；

3、加入终浓度为1.0mM的IPTG，23℃140r/min诱导表达16-18hr；

4、4℃10,000rpm离心5min，收集诱导表达的菌体，

离心结束后，弃上清，倒入PBS轻摇洗一下，倒掉PBS；

5、加入160mLBindingBuffer（20mMNaH₂PO₄.2H₂O,500mMNaCl,20mMImidazole）重悬菌体；

每瓶加25mlBindingBuffer涡旋振荡，重悬菌体，放到两个50ml小烧杯中；

6、添加lysozyme至终浓度为0.2mg/mL，室温孵育10min；

7、超声处理裂解菌体(冰浴)；

8、4℃10,000rpm离心20minutes，收集沉淀；

超声后菌液取200μl放到4℃备用；2mlEP管中，超声后的液体2ml/管，离心13000rpm，20min，4℃；离心后上清加到1支50ml离心管中，液体要吸干净，放到4℃；

9、30mLSolubilizationBuffer(6Murea,25mMphosphatepH8,0.1MNaCl,50mMimidazole)重悬沉淀，超声处理促进沉淀溶解(冰浴)；

10、4℃13,000rpm离心20minutes，收集上清；

11、上清0.8μm滤膜过滤，4℃保存；

12、预处理PD-10脱盐柱：

1）20%乙醇漂洗滤片20min,双蒸水漂洗滤片两次至酒精被完全洗掉；

2）用剪刀将柱子的头部剪去；

3）将滤片装入空PD-10脱盐柱；

13、预处理填料及加样柱上纯化:

1）轻微混合填料，分别取6ml填料加入两只15ml离心管，500rpm5min4摄氏度离心，弃去离心结束后的上清液；

2）加入10ml双蒸水上下颠倒3min混匀侵泡，500rpm5min4摄氏度离心，弃去离心结束后的上清液；

3）重复步骤2）；

4）加solubilizationbuffer10ml，轻微颠倒3min，500rpm离心*5min；去上清；

5）加入与沉淀等体积的solutionbuffer上下颠倒5~10min混匀侵泡后，得蛋白溶液，放入4度过夜，以备第二天使用；

6）向柱子中加入步骤5中的蛋白溶液，封闭柱子，上下颠倒混匀后放入4度冰箱，并每隔15min上下颠倒混匀一次，共2h后，将柱子放入50ml离心管500rpm5min4度离心。离心结束后垂直放置柱子，使液体从柱子中流出，并收集流出液放入4度。重复该步骤至蛋白溶液被全部处理；

7）重复步骤6两次，共上柱30ml步骤5中的蛋白溶液；最后将所有流出液再次过柱。

8）16-32mlwashingbuffer1-9依次洗柱；

9）加入6ml含0.5M咪唑elutionbuffer上下颠倒混匀，4度放置1小时或者过夜，放液前500rpm离心5min，EP管收集纯化后的流出液，4℃保存；

10）重复上述步骤9；

11）Solubilizationbuffer(6Murea,25mMphosphatepH8,0.1MNaCl,50mMimidazole)洗10个柱体积；

12）4M咪唑洗3个柱体积；

13）PBS洗10个柱体积；

14）加入20%乙醇4℃保存镍柱。

三、超滤脱盐:

使用超滤方法进行脱盐，使用产品为AmiconUltra-15CentrifugalFilterUnitwithUltracel-10membrane（UFC901096，Millipore）

1）超滤管中加入超纯水，水量过膜，浸泡3-5min；

2）将水倒出，加入15ml镍柱洗脱纯化后的蛋白产物；

3）4℃3,000rpm离心，浓缩至2ml；

4）再加入超纯水，重复离心；

5）重复步骤4），直至将蛋白脱盐至合适浓度；

6）加入10XPBS调至1X，4℃保存。

通过上述大肠杆菌蛋白质表达、融合蛋白分离纯化和超滤管超滤脱盐处理后，可以得到较纯的HBVc-MAGE-3融合蛋白，分子量为22.4kD。

四、HBVc-MAGE-3融合蛋白抗原冲击DC方法：

首先，把HBVc-MAGE-3融合蛋白抗原使用RPMI-1640+10%FBS配制成0.8uM溶液，0.22um滤器过滤。把配制好的溶液分别于未成熟的DC(iDC)共培养4h。然后，PBS清洗细胞3遍。加入RPMI-1640+10%FBS+10ng/mLTNF-a+IL-6+IL-1β，培养48-72h，收获携带MAGE-3抗原的成熟DC细胞(mDC)。

由于HBVc-MAGE-3融合蛋白会形成类病毒颗粒，并且该蛋白会使MAGE-3的抗原区域都暴露在类病毒颗粒的外侧，所以可以使DC细胞更容易摄取MAGE-3抗原。

实施例2

本实施例中通过基因重组技术构建rMVA-MAGE-3疫苗，所述rMVA-MAGE-3疫苗的制备方法包括：

构建穿梭质粒:A549细胞RNA逆转录获取MAGEA3基因cDNA；将MAGEA3基因cDNA克隆到pIIIdHR-P7.5质粒中；

重组MVA病毒构建：CEF细胞或者BHK-21细胞单层生长到70~90%覆盖率依次感染MVA、转染穿梭质粒，培养获得单层细胞；所述单层细胞通过冻融、破碎获得rMVA溶液；所述rMVA溶液接种到RK-13细胞培养获取rMVA感染RK-13聚集点，挑取所述聚集点筛选纯化得到所需rMVA；清除掉所述rMVA中wtMVA，将rMVA培养于CEF或者BHK-21细胞单层中，筛选不含选择基因K1L的rMVA，纯化得到rMVA-FS，扩增分离得到rMVA-MAGE-3。

病毒疫苗的特性：改良型痘苗病毒安卡拉株（MVA,modifiedvacciniavirusankara）是通过使用亲代病毒在鸡胚成纤维细胞（CEF）中经过多于500次传代减毒后得到的，并且德国使用它作为都病毒疫苗验证的其安全性。MVA在人和大多数哺乳动物细胞中只能有限次的增殖。复制缺陷发生在病毒子形态形成过程中，这就导致在一次感染循环过程中病毒或者重组基因高水平表达。MVA拥有多处大片段丢失和许多小突变，这些都是在CEF传代过程中发生的，并且导致它丢失了许多免疫防御性基因。人类宿主范围限制就是基于这些基因的丢失，以此降低其恢复毒力的可能性。并且，MVA在免疫缺陷的小鼠和猴子体内被验证是安全的。

具体操作为：

一、细胞和病毒株选取了培养

A549(ATCCCRM-CCL-185)细胞、Babyhamsterkidney(BHK)-21细胞（仓鼠成纤维细胞）(ATCCCCL-10)和rabbitkidneyRK-13（兔肾细胞）(ATCCCCL-37)细胞使用含10%热灭活FBS的RPMI-1640培养基培养于37℃，5%CO₂条件下。病毒感染时，FBS浓度要降低到2%。

新鲜的鸡胚成纤维细胞(CEF)取自11天龄SPF级鸡胚。培养于含10%热灭活FBS和25ug/mlamphothericinB(1%AB/AM)。

病毒株为ModifiedvacciniavirusAnkara,MVA(IInew)

二、穿梭质粒的构建

MAGEA3基因(NCBIAcc.No.NM_005362)cDNA来源于A549细胞RNA逆转录。把MAGEA3基因cDNA克隆到pIIIdHR-P7.5质粒中。

三、重组MVA病毒构建

1、CEF细胞或者BHK-21细胞在6孔板中单层生长到80%覆盖率；

2、以MOI=0.01-0.05感染MVA，培养基为RPMI-1640/2%FBS/1%AB/AM，培养90-120min；

3、感染开始15-30min后，开始准备转染穿梭质粒，按照转染试剂供应商转染说明准备，每孔转染1.5-10ug质粒；

4、把上一步的质粒混合液直接加入到感染MVA的孔中，37℃培养48h；

5、收获单层细胞并把细胞转移到1.5ml离心管中，-80℃或-20℃保存；

6、反复冻融收获的单层细胞3次，并使用超声破碎细胞4次，每次15s，避免样品过热；

7、把上一步得到的rMVA溶液直接接种到RK-13细胞孔中，37℃培养48-72h；

8、挑取典型的rMVA感染RK-13聚集点到新的含有500ul病毒生长培养基的1.5ml离心管中，挑取5-15个这种聚集点；

9、反复冻融并超声破碎细胞如步骤4；

10、重复步骤6-92-4次，直到得到较纯的rMVA，使用PCR方法检测样品中是否含有wtMVA；

11、清除掉wtMVA后，再把rMVA培养于CEF或者BHK-21细胞单层中，筛选不含选择基因K1L的rMVA，重复步骤6~10，往往需要3轮筛选得到rMVA-FS(rMVA-foreignsequences)；

12、扩增分离得到rMVA-MAGE-3。

四、rMVA-MAGE-3DC疫苗冲击DC方法

重组rMVA-MAGE-3病毒以MOI=0.3感染未成熟DC（iDC），感染4h后，每孔加入每孔加入2mL含10ng/mLhTNF-α、1000IU/mLIL-6和10ng/mLIL-1β的10%FBSRPMI-1640培养基，继续培养48h~72h，得到特异性递呈MAGE-3抗原的成熟DC细胞（mDC）。

由于rMVA-MAGE-3DC疫苗感染DC后，会在DC细胞内表达MAGE-3抗原，胞内抗原通过HLA-1类分子递呈到细胞表面，主要激活CD8+T细胞分化为细胞毒T细胞，CD8+细胞毒T细胞是主要的肿瘤杀伤细胞。DC细胞内表达的MAGE-3抗原可以分泌到细胞外，并被DC细胞摄取，可以通过HLA-2类分子递呈到细胞外，主要激活CD4+T细胞分化为Th1细胞，对细胞毒T细胞对肿瘤细胞的杀伤起到巨大的辅助作用。

实施例3

本实施例中直接合成特异性MAGE-3抗原肽。

特异性MAGE-3抗原肽特性：通过生物信息学计算预测MAGE-3蛋白质多肽链中可能具有抗原特异性的片段位置，通过化学合成手段合成相应片段多肽链（约10-15aa），并通过细胞和动物实验验证多肽链的抗原特异性。选择抗原特异性好的多肽链组成混合物冲击DC细胞，使DC细胞提呈更多的MAGE-3抗原。特异性MAGE-3抗原肽氨基酸序列为：FFPVIFSKASSSLQL、EVDPIGHLY。

一、特异性MAGE-3抗原肽的合成方法为：

1、锚定：把第一个氨基酸锚定在固相树脂上；

2、去保护：保护的氨基酸使用碱性溶剂去除氨基的保护基团；

3、活化：使用活化剂活化待连接的氨基酸羧基；

4、键联：活化的羧基与前一个氨基酸裸露的氨基反应，形成肽；

5、重复步骤b-d，使整条肽链完全合成。

多肽固相流程操作方法，具体见图3。

二、MAGE-3抗原肽冲击DC方法：

使用RPMI-1640+10%FBS的培养基把合成的MAGE-3抗原肽配制成20μM的溶液，0.22um滤器过滤。其次，把配制好的溶液分别于未成熟的DC（iDC）共培养4h。然后，PBS清洗细胞3遍。加入RPMI-1640+10%FBS+10ng/mLTNF-a+IL-6+IL-1β，培养48~72h，收获成熟携带MAGE-3抗原的DC细胞（mDC）。

实施例4

收集上述3个实施例所获的方式获得的成熟的DC细胞（mDC）可以直接通过静脉回输给病人经肿瘤抗原负载DC能刺激自体T细胞，也可以细胞负载肿瘤抗原在体外与淋巴细胞混合，刺激T细胞产生细胞毒性T淋巴细胞，再将这些细胞毒性T淋巴细胞，通过静脉回输给病人。

本实施例中将上述3中mDC用于体外刺激T细胞产生细胞毒性T淋巴细胞。具体操作为。首先，收集上述3种方式获得的mDC，以1:20的比例与外周血单个核细胞（PBMC）养，培养基为RPMI-1640+10%FBS+20U/mLIL-2+10ng/mLIL-7，培养7天，使用相同的mDC再次刺激PBMC。

培养7天后的PBMC使用细胞分选系统分选出细胞毒性CD8+T细胞，步骤如下：

a.300g，离心1min

b.每10⁷细胞用80ulbuffer重悬

c.每10⁷细胞加入20ulCD8磁珠抗体

d.混匀，4℃放置15min

e.每10⁷细胞用1-2mlbuffer洗1次，300g，离心10min

f.每10⁸细胞用500ulbuffer重悬

g.用500ulbuffer上柱润洗分选注buffer将要流完时，加入细胞悬液，并在下方准备收集管，收取阴性细胞500ulbuffer清洗细胞悬液管，并再次加入分选柱。

重复步骤i下分选柱，放在新的收集管中，并在分选柱中加入1mlbuffer分选柱活塞快速快速推下buffer，回收CD8+细胞毒T细胞通过细胞分选，可以得到3种DC细胞刺激产生的不同CD8+细胞毒细胞。通过磁珠分选上述3中mDC刺激的外周血淋巴细胞，可以回收到98%以上的CD8+T淋巴细胞（见图4~8）。

实施例5

直接将成熟的DC细胞（mDC）至动物体内验证mDC作用效果。

回输特异性递呈MAGE-3抗原DC细胞给小鼠。8周龄C57/BL6小鼠分别经经NT（阴性对照），MAGE-3抗原肽，HBVc-MAGE-3及rMVA-NT（阴性对照组），rMVA-MAGE-3感染iDCs，刺激成熟后回输免疫4周后，处死并收集脾淋巴细胞。分离的脾淋巴细胞培养于含有10%FBS，50IU/mLrmIL-2的RPMI-1640培养液中，体外培养3天。第四天，分别将肺癌细胞株NCI-H226，NCI-H358以1x10⁵细胞/孔的密度铺于96孔板中，作为靶细胞（T:Targetcell）；将体外培养3天的脾淋巴细胞，作为效应细胞(E:Effectorcell)，按照E:T=10:1的比例加入至各孔中。以知加入淋巴细胞组作为Eself-release组；向不含脾淋巴细胞的靶细胞中加入细胞裂解液（celllysisbuffer）设为Targetmaximumrelease组，于37℃CO₂培养箱中孵育6小时。经1,000rpm离心后收集各组分培养上清，利用LDH检测试剂盒(PromegaCat#G1780)测量LDH的释放，使用酶标仪检测490nm光吸收值，检测脾淋巴细胞对靶细胞的杀伤，杀伤活性的计算方法为Cytotoxicity%=(Experimentalrelease-Eself-release)/Targetmaximumreleasex100{细胞毒性%=（实验组释放-效应细胞自身释放）/靶细胞最大释放X100}。

LDH释放实验结果显示，经rMVA-NT，rMVA-MAGE-3感染DCs回输免疫的小鼠脾淋巴细胞能够有效杀伤MAGE-3表达阳性的肺癌细胞系NCI-H226、NCI-H358，并且rMVA-MAGE-3组杀伤效率显著高于NT组。结果见图9（图9，MOCK组为未加入重组病毒组，NT组为加入rMVA-NT病毒组，MAGE-3组为加入rMVA-MAGE-3病毒组）。

LDH释放实验结果显示，经MAGE-3，HBVc-MAGE-3负载DCs免疫的小鼠脾淋巴细胞能够有效杀伤MAGE-3表达阳性的肺癌细胞系NCI-H226、NCI-H358，并且HBVc-MAGE-3组杀伤效率显著高于MAGE-3组，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001，n=2。结果见图10（图10，NT组为HBVc蛋白刺激组，MAGE-3组为特异性MAGE-3抗原肽刺激组，HBV-MAGE-3为HBVc-MAGE-3融合蛋白刺激组）。

本发明用于细胞免疫治疗时，采用的是自身免疫细胞，在体外通过细胞因子和相关单克隆抗体在无血清培养基或用自身血浆加入培养基内培养，因此可以避免交叉感染。效应细胞在回输前经3～4次无菌PBS或生理盐水洗涤，可以避免因异种抗原产生的过敏反应。另外，效应细胞在回输前还需经过细菌、真菌、热原和内毒素检测，并通过显微镜及革兰氏染色，可避免细菌污染的漏检。除少数患者可能产生轻度发热和感冒症状外（通常是由于加入细胞液中的IL-2所致），病人能够充分耐受，无明显严重不良反应发生。总之，因回输的免疫细胞来自患者自身，所用的培养基为质量合格的无血清培养基，故排斥反应轻微，安全性高，无明显毒副作用。

本项目产品是采用患者自身细胞在体外经过高科技程序化处理而产生的功能强大的特异性细胞，不存在违背医学伦理的问题。

Claims

1.一种体外提呈、激活DC细胞的方法，包括：体外培养诱导生成DC细胞、制备肿瘤抗原、所述肿瘤抗原冲击DC细胞，其特征在于：所述肿瘤抗原表达MAGE-3。

2.根据权利要求1所述的体外提呈、激活DC细胞的方法，其特征在于：所述肿瘤抗原为MAGE-3抗原融合蛋白、MAGE-3病毒疫苗或特异性抗原肽。

3.根据权利要求2所述的体外提呈、激活DC细胞的方法，其特征在于：所述MAGE-3抗原融合蛋白为HBVc-MAGE-3融合蛋白，HBVc-MAGE-3融合蛋白分子量22.4kD；所述HBVc-MAGE-3融合蛋白的制备步骤包括：构建质粒并通过大肠杆菌表达HBVc-MAGE-3融合蛋白、融合蛋白分离纯化和超滤脱盐；所述构建质粒并通过大肠杆菌表达HBVc-MAGE-3融合蛋白步骤为：

将含HBVc蛋白表达序列的pET-28a质粒，以HindIII限制性内切酶进行酶切，插入序列SEQIDNO：1；

NcoI和XhoI双酶切pET-28a质粒，目的基因大小为630bp，酶切后空质粒大小为5.4kb;

使用构建好的pET-28a质粒转化大肠杆菌感受态细胞，表达出的融合蛋白HBVc-MAGE-3自动组装成类病毒颗粒。

4.根据权利要求2所述的体外提呈、激活DC细胞的方法，其特征在于：所述MAGE-3病毒疫苗为rMVA-MAGE-3疫苗，所述rMVA-MAGE-3疫苗的制备方法包括：

构建穿梭质粒：A549细胞RNA逆转录获取MAGE-3基因cDNA；将MAGE-3基因cDNA克隆到pIIIdHR-P7.5质粒中；

5.根据权利要求2所述的体外提呈、激活DC细胞的方法，其特征在于：所述特异性MAGE-3抗原肽的大小为10~15aa，所述特异性MAGE-3抗原肽的合成方法包括：

锚定：把第一个氨基酸锚定在固相树脂上；

去保护：使用碱性溶剂去除氨基的保护基团；

活化：使用活化剂活化待连接的氨基酸羧基；

键联：活化的羧基与前一个氨基酸裸露的氨基反应，形成肽键；

重复步骤b-d，使整条肽链完全合成。

6.根据权利要求5所述的体外提呈、激活DC细胞的方法，其特征在于：所述特异性MAGE-3抗原肽的氨基酸序列为FFPVIFSKASSSLQL或EVDPIGHLY。

7.根据权利要求1所述的体外提呈、激活DC细胞的方法，其特征在于：所述肿瘤抗原为HBVc-MAGE-3融合蛋白，所述肿瘤抗原冲击DC细胞的方法包括：将HBVc-MAGE-3融合蛋白使用RPMI-1640+10%FBS培养基配制成0.7~0.9μM的溶液；把配制好的溶液与未成熟的DC细胞共培养4h；PBS清洗、加入含有10%FBS、TNF-a、IL-6、IL-1β的RPMI-1640培养液，培养48-72h，收获携带MAGE-3抗原的成熟DC细胞。

8.根据权利要求1所述的体外提呈、激活DC细胞的方法，其特征在于：所述肿瘤抗原为rMVA-MAGE-3疫苗，所述肿瘤抗原冲击DC细胞的方法包括：重组rMVA-MAGE-3病毒以MOI=0.3感染未成熟DC，感染4h后，加入含TNF-α、IL-6、IL-1β、10%FBS的RPMI-1640培养基，继续培养48~72h，收获携带MAGE-3抗原的成熟DC细胞。

9.根据权利要求1所述的体外提呈、激活DC细胞的方法，其特征在于：所述肿瘤抗原为特异性MAGE-3抗原肽，所述肿瘤抗原冲击DC细胞的方法包括：用RPMI-1640+10%FBS培养基把合成的特异性MAGE-3抗原肽配制成15~25uM的溶液；把配制好的溶液分别与未成熟的DC共培养4h；PBS清洗、加入含有10%FBS、TNF-a、IL-6、IL-1β的RPMI-1640培养液，培养48-72h，收获携带MAGE-3抗原的成熟DC细胞。

10.一种权利要求1~10中任意一项所述体外提呈、激活DC细胞的方法的应用，其特征在于：用于体外刺激T细胞产生细胞毒性淋巴细胞，操作方法为：收集所述携带MAGE-3抗原的成熟DC细胞，以1:20的比例与PBMC共培养7天，培养基含有RPMI-1640、10%FBS、20U/mLIL-2、10ng/mLIL-7；使用所述携带MAGE-3抗原的DC细胞再次刺激PBMC，培养7天后的PBMC使用细胞分选系统分选出细胞毒性CD8+T细胞。