CN103041382A - 细粒棘球蚴重组bcg疫苗及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种细粒棘球蚴重组BCG疫苗的制备；本疫苗具有热稳定性好，便于运输和保存，单次免疫就可诱导高效价的针对“靶抗原”的抗体，免疫力持久，免疫次数少，简化了免疫程序，增强了针对细粒棘球蚴病的免疫效果。

Description

细粒棘球蚴重组BCG疫苗及制备方法

技术领域

本发明提供了一种细粒棘球绦虫重组BCG疫苗，用于预防控制动物细粒棘球蚴病，同时还提供了该疫苗的制备方法，属于疫苗制备技术领域。 

背景技术

棘球蚴病（cystic echinococcosis,CE）是一种严重危害人们身体健康的人畜共患寄生虫病，已成为农牧民因病致贫，因病返贫的主要因素之一。目前对包虫病患者进行包虫囊摘除术是首选的治疗方法。但手术对人体带来的损伤比较大且有可能复发, 化疗药物可产生一些严重的不良反应。因此，需要研究更有效的解决方法,而疫苗预防是防治其流行的有效措施。 

预防细粒棘球蚴病的疫苗经历了多肽疫苗，亚单位疫苗，DNA疫苗等多种探索，随着生物技术的发展，重组活疫苗的制备得到了一种新的方法。基因重组卡介苗(rBCG)是借助基因工程技术，将外源基因导入BCG 中构建而成的多价疫苗（rBCG），可诱导长期的体液免疫和细胞免疫，近几年的研究结果已显示出rBCG具有非常好的应用前景，有望发展成为预防疾病的一种实际可用的新型疫苗。 

本发明小组曹春宝等从细粒棘球蚴中克隆了egG1Y162抗原基因。结果显示，egG1Y162基因不论是在基因序列上，还是在氨基酸序列及蛋白结构上均与国外研究者已研发出的用于终末宿主保护的 候选疫苗emY162有高度的相似性，很可能也是终末宿主的保护性抗原。 

虽然使用BCG构建多价疫苗在本领域已经熟知，但影响疫苗效率的因素有很多，如何研发出预防棘球蚴病的高效疫苗仍然是亟待解决的技术问题。 

发明内容

本发明提供了一种细粒棘球绦虫重组BCG疫苗，为穿梭表达载体细粒棘球绦虫重组BCG疫苗，具有热稳定性好，便于运输和保存，免疫力持久，免疫次数少，免疫程序简化，增强了针对细粒棘球蚴病的免疫效果。生产成本少，便于生产等特点。 

本发明还公开了细粒棘球绦虫重组BCG疫苗的制备方法，以利于工业化生产。 

本发明重组细粒棘球绦虫BCG疫苗的解决方案如下：首先获得细粒棘球绦虫保护性抗原基因，进行TA克隆，将测序正确的目的片段酶切回收，再与经同样酶切的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体PMV361相连，构建重组表达载体，将重组表达载体电转化入BCG，经抗性筛选和PCR扩增筛选得到阳性抗细粒棘球绦虫重组BCG克隆。 

本发明所提供的重组细粒棘球绦虫BCG疫苗的制备方法，其包括如下步骤： 

（1）合成上游和下游引物： 

上游引物：5′-CCGAATTCATGGTACTTCGATTCTGT-3′； 

下游引物：5′-CCAAGCTTAGTAAGTAATAGGAGCCCA-3′； 

（2）目的基因egG1Y162的PCR扩增： 

以细粒棘球蚴cDNA为模板，采用上述的上下游引物，进行PCR扩增，扩增体系为：灭菌水16μl，质粒2μl，EcoRI 0.5μl，HindⅢ 0.5μl，mix 20μl，共40μl扩增体系；Touchdown PCR反应条件：95℃ 4 min；95℃ 30s，65℃ 30s 降1℃，72℃ 2min 共11个循环；95℃ 30s，50℃ 30s，75℃ 2min 共25个循环；最后72℃ 延伸，7min，末次4℃，将PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到大小为360bp的目的条带； 

（3）目的片段egG1Y162与载体PMV361的连接： 

egG1Y162扩增产物经DNA纯化试剂盒纯化回收后先与PMD19-T载体连接，利用α互补原则筛选阳性克隆并进行PCR扩增鉴定、酶切鉴定和测序鉴定，将经上述鉴定正确的阳性克隆扩增后提取egG1Y162-PMD19质粒，将该质粒经EcoRI、HindⅢ 限制性内切酶酶切，凝胶回收目的片段后与同样用EcoRI和HindⅢ进行双酶切的pMV361质粒胶回收产物，按3∶1的摩尔比(目的片段∶载体)在T4DNA连接酶的催化下进行连接，连接体系为：buffer缓冲液1 μl，目的片段7 μl，PMV361载体1 μl ，T4 DNA连接酶1 μl，共10μl的连接体系，16℃，连接过夜。转化入E.coli DH5α感受态细胞后，利用PMV361质粒所携带的卡那霉素抗性筛选egG1Y162-PMV361重组子，对阳性克隆进行PCR扩增鉴定和EcoRI和HindⅢ双酶切鉴 定，将鉴定正确的重组质粒命名为egG1Y162-PMV361； 

（4）重组egG1Y162-PMV361载体的电转化 

将-80℃保存的BCG菌株复苏后接种于含10% OADC的7H9液体培养基， 180r／min ，37℃ ，震荡培养至对数生长期，即培养液变混浊, 沙样生长后用于感受态细胞的制备。取在7H9液体培养基上生长良好的BCG培养物， 37℃继续震荡培养10天，4℃，5000 r/min离心10min 收集菌体，以灭菌10%甘油洗涤4次，最后一次用适量的10%甘油重悬菌体，即得到BCG感受态细胞。分别将egG1Y162-PMV361质粒及空质粒pMV361经电穿孔法分别转化入BCG感受态细胞中，具体电转化条件为：电容25Uf，电阻1000Ω，场强18×105V/ m ，转化时间为5 ms，转化次数为3；放电结束后将100μL菌液立即转移入1 mL 7H9液体培养液中，37℃震荡培养过夜（>24h）。取培养过夜的转化后菌液800r/min室温离心10min，取沉淀100μL均匀涂布于含OADC和30μg/ml卡那霉素的7H10固体培养基表面， 37℃培养3-4周，培养基表面见转化后菌落生长。从7H10固体培养基平板表面挑取BCG重组子，接种于罕OADC的7H9液体培养基中， 37℃ ，培养至对数生长期，取菌液进行PCR扩增鉴定证实为阳性克隆后，分别命名为egG1Y162-PMV361-rBCG及PMV361- rBCG； 

（5）重组egG1Y162-PMV361-rBCG的诱导表达 

将经PCR扩增鉴定证实含有egG1Y162-PMV361质粒的rBCG阳性克隆接种在含30μg/ml 卡那霉素的7H9液体培养基中，37℃， 180r/min振摇培养至对数生长期(需3w左右)，进行45℃热诱导45min，离心收集菌体；加入1ml预冷的磷酸盐缓冲液重悬菌泥后超声粉碎，再加入等体积2×SDS-PAGE上样缓冲液，100℃煮沸5min，冰浴5min，4℃，12000rpm离心5min；取10μl上清进行SDS-PAGE分析，最终获得的egG1Y162-PMV361-rBCG表达的融合抗原，其分子量约为71KD。 

使用穿梭表达载体细粒棘球绦虫重组BCG疫苗egG1Y162-PMV361-rBCG免疫小鼠后，不同程度的提高了小鼠的免疫水平。具体表现为：在使用重组BCG疫苗egG1Y162-PMV361-rBCG免疫小鼠后，小鼠体内的特异性抗体水平、细胞因子等免疫指标均随着免疫时间和次数的增加而升高，与BCG组合空白对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）;免疫后进行攻虫实验显示，经重组BCG疫苗egG1Y162-PMV361-rBCG免疫小鼠体内的囊泡大体变化与空白对照组相比，囊数量减少，体积变小，部分囊表面混浊，部分囊壁塌陷，游离于腹腔，或附着于肠系膜或肝表面。囊湿重抑制率为68.34%，表明本发明具有很好的抗细粒棘球绦虫的功效。 

重组BCG疫苗egG1Y162-PMV361-rBCG既能发挥BCG本身较强的免疫佐剂的功能，又能使细粒棘球绦虫保护性抗原蛋白表达并发挥其免疫保护作用，将免疫佐剂和载体的双重优势加以完美组合，从而达到更好的预防细粒棘球蚴病的目的，该疫苗的研制具有非常广阔的应用前景和推广应用价值。 

本发明还在于：重组BCG疫苗egG1Y162-PMV361-rBCG在进 行热诱导时依然稳定表达蛋白质，说明该活疫苗具有热稳定性好，便于运输和保存，同时将该疫苗直接进行预防接种，免去了蛋白质的纯化处理等后续复杂工序，减少了因蛋白质后续处理工序对蛋白结构功能的影响，易于生产，从而大大降低了生产成本，简化了工序，便于在基层的推广应用。 

附图说明

图1：egG1Y162-PMV361质粒模式图。 

具体实施方式：

实施例1 

1 材料 

本发明所使用的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒pMV361和BCG以及E.coli DH5α菌株都可以通过商业途径获得，pMV361和BCG以及E.coli DH5α菌株购自于Biovector Science lab有限公司（中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心）。 

2 方法 

2.1 引物的设计及合成 

参照细粒棘球蚴egG1Y162基因序列（GenBank登录号分别为AB458258和AB458259）和PMV361质粒图谱设计上下游引物，并引入EcoRI、HindⅢ 限制性内切酶酶切位点。 

上游引物：5′-CCGAATTCATGGTACTTCGATTCTGT-3′，带下划线部 分为EcoRI位点； 

下游引物：5′-CCAAGCTTAGTAAGTAATAGGAGCCCA-3′，带下划线部分为HindⅢ位点。 

2.2目的基因egG1Y162的PCR扩增 

以细粒棘球蚴cDNA为模板，采用上述的上下游引物，进行PCR扩增，扩增体系为：灭菌水16μl，质粒2μl，EcoRI 0.5μl，HindⅢ 0.5μl，mix 20μl，共40μl扩增体系；Touchdown PCR反应条件：95℃ 4 min；95℃ 30s，65℃ 30s 降1℃，72℃ 2min 共11个循环；95℃ 30s，50℃ 30s，75℃ 2min 共25个循环；最后72℃ 延伸，7min，末次4℃，将PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到大小为360bp的目的条带。 

2.3 重组egG1Y162-PMV361载体质粒的构建 

2.3.1 目的片段egG1Y162与载体PMV361的连接 

egG1Y162扩增产物经DNA纯化试剂盒纯化回收后先与PMD19-T载体连接，利用α互补原则筛选阳性克隆并进行PCR扩增鉴定、酶切鉴定和测序鉴定，将经上述鉴定正确的阳性克隆扩增后提取egG1Y162-PMD19质粒，将该质粒经EcoRI、HindⅢ 限制性内切酶酶切，凝胶回收目的片段后与同样用EcoRI和HindⅢ进行双酶切的pMV361质粒胶回收产物，按3∶1的摩尔比(目的片段∶载体)在T4DNA连接酶的催化下进行连接，连接体系为：buffer缓冲液1 μl，目的片段7 μl，PMV361载体1 μl ，T4 DNA连接酶1 μl，共10μl的连接体系，16℃，连接过夜。转化入E.coli DH5α感受态细胞后， 利用PMV361质粒所携带的卡那霉素抗性筛选egG1Y162-PMV361重组子，对阳性克隆进行PCR扩增鉴定和EcoRI和HindⅢ双酶切鉴定，将鉴定正确的重组质粒命名为egG1Y162-PMV361。 

2.3.2 重组egG1Y162-PMV361载体的电转化 

将-80℃保存的BCG菌株复苏后接种于含10% OADC的7H9液体培养基， 180r／min ，37℃ ，震荡培养至对数生长期，即培养液变混浊, 沙样生长后用于感受态细胞的制备。取在7H9液体培养基上生长良好的BCG培养物， 37℃继续震荡培养10天，4℃，5000 r/min离心10min 收集菌体，以灭菌10%甘油洗涤4次，最后一次用适量的10%甘油重悬菌体，即得到BCG感受态细胞。分别将egG1Y162-PMV361质粒及空质粒pMV361经电穿孔法分别转化入BCG感受态细胞中，具体电转化条件为：电容25Uf，电阻1000Ω，场强18×105V/ m ，转化时间为5 ms，转化次数为3；放电结束后将100μL菌液立即转移入1 mL 7H9液体培养液中，37℃震荡培养过夜（>24h）。取培养过夜的转化后菌液800r/min室温离心10min，取沉淀100μL均匀涂布于含OADC和30μg/ml卡那霉素的7H10固体培养基表面， 37℃培养3-4周，培养基表面见转化后菌落生长。从7H10固体培养基平板表面挑取BCG重组子，接种于罕OADC的7H9液体培养基中， 37℃ ，培养至对数生长期，取菌液进行PCR扩增鉴定证实为阳性克隆后，分别命名为egG1Y162-PMV361-rBCG及PMV361- rBCG。 

2.3.3重组egG1Y162-PMV361-rBCG的诱导表达 

将经PCR扩增鉴定证实含有egG1Y162-PMV361质粒的rBCG阳性克隆接种在含30μg/ml 卡那霉素的7H9液体培养基中，37℃，180r/min振摇培养至对数生长期(需3w左右)，进行45℃热诱导45min，离心收集菌体；加入1ml预冷的磷酸盐缓冲液重悬菌泥后超声粉碎，再加入等体积2×SDS-PAGE上样缓冲液，100℃煮沸5min，冰浴5min，4℃，12000rpm离心5min；取10μl上清进行SDS-PAGE分析。因egG1Y162-PMV361质粒中含Hsp60标签（分子量约60KD）和egG1Y162(分子量大小约为11KD)，最终获得的egG1Y162-PMV361-rBCG表达的融合抗原分子量约为71KD。 

2.3.4重组egG1Y162-PMV361-rBCG的Western blotting分析 

将热诱导后的rBCG菌体蛋白作SDS-PAGE后,用半干转移系统将凝胶上的蛋白质转印到PVDF膜上；转印膜于封闭液中室温摇床封闭3h；用PBS-T洗涤3次，每次15min；用封闭液稀释的1∶100棘球蚴病人血清室温摇床孵育2h；用PBS洗涤3次，每次10min；用封闭液稀释的1∶1 000人血二抗37℃摇床孵育1h；用PBS洗涤3次，每次10min；用DAB显色剂对PVDF膜避光反应10-15min，蒸馏水终止反应。在PVDF膜上可见分子量约为71KD的特异性条带。 

试验例1 

穿梭表达载体细粒棘球绦虫重组BCG疫苗的用途 

1动物 

实验动物采用健康雌性Balb/c小鼠，随机分为3组：A组：免疫重组egG1Y162-PMV361-rBCG (n=20)组，B组：PMV361-rBCG对照 组（n=20）和C组：生理盐水NS空白对照组(n=20)。 

2方法 

A、B、C组分别背部皮下多点注射重组egG1Y162-PMV361-rBCG、PMV361-rBCG 和NS，剂量为100μg/只/次，共3次，每次间隔2周，每次免疫前小鼠内眦采血收集血清备用，在第3次免疫后一周每只小鼠接种约1000个活细粒棘球绦虫原头蚴继发感染。于感染后70天，采血，处死小鼠，剖检，进行以下各项免疫指标检测，包括囊泡湿重抑制率、囊泡数量以及大体改变ELISA检测小鼠血清中特异性抗体水平变化和细胞因子变化等，结果经统计分析评价免疫保护效果。 

3 结果 

3.1细粒棘球蚴囊大体观察   

NS对照组20只小鼠腹腔均有细粒棘球蚴囊生长，囊壁光滑透明，张力高，数量多。BCG对照组与NS对照组观察结果类似。重组egG1Y162-PMV361-rBCG预防组有8只（8/20）小鼠腹腔及肝表面未见包虫囊肿，表明这8只小鼠获得了完全保护，另外12只小鼠均有棘球蚴囊生长，但与NS对照组相比，囊数量减少，体积变小，部分囊表面混浊，部分囊壁塌陷，游离于腹腔，或附着于肠系膜或肝表面。 

3.2 囊湿重抑制率结果  

各组小鼠均取出细粒棘球蚴囊分别称重，计算囊湿重抑制率。与NS对照组比较，重组egG1Y162-PMV361-rBCG预防组的囊湿重抑制率为67.4% (见表1)。说明本发明所采取的免疫程序安全有效，简便 易行。 

3.3 病理学观察 

光镜下观察生理盐水对照组细粒棘球蚴囊角质层呈多层文理状，生发层细胞结构完整清晰。重组egG1Y162-PMV361-rBCG预防组的棘球蚴囊壁出现不同程度的病理学改变，有的囊壁角质层轻度变性，纹理模糊；有的角质层重度变性，纹理消失，生发层脱落，外膜层有大量淋巴细胞浸润，观察结果见表2。重组egG1Y162-PMV361-rBCG预防组与生理盐水对照组的囊病变之间有显著性差异（P<0.01），提示重组egG1Y162-PMV361-rBCG均可增强宿主的抗棘球蚴能力。 

3.4 对小鼠血清特异性抗体及细胞因子水平的影响 

rBCG-EgG1Y162疫苗有非常理想的免疫调节作用，血清中总IgG，IgG亚类和IgE水平及相应细胞因子水平变化明显，说明有上调Th1型免疫应答，起到了免疫佐剂的作用。(如表3、4、5所示)。 

表1  重组BCG-EgG1Y162免疫预防小鼠的细粒棘球蚴囊湿重抑制率 

*经方差分析，各组间方差不齐，进行秩和检验，BCG组与NS对照组之间无统计学差异（P>0.05）。重组BCG-egG1Y162组与NS组有统计学意义（P<0.01）。 

表2重组BCG-EgG1Y162免疫预防的细粒棘球蚴病理切片观察结果 

经χ²检验，重组BCG-EgG1Y162预防组与NS组相比均有统计学差异。 

表3 rBCG-EgG1Y162疫苗对继发性细粒棘球蚴感染小鼠血清总IgG，IgG亚类和IgE水平的影响 

表4 rBCG-EgG1Y162疫苗对继发性细粒棘球蚴感染小鼠血清IFN-γ的影响 

表5 rBCG-EgG1Y162疫苗对继发性细粒棘球蚴感染小鼠血清IL-10的影响 

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。 

Claims (1)

1.重组细粒棘球绦虫BCG疫苗的制备方法，其包括如下步骤：

（1）合成上游和下游引物：

上游引物：5′-CCGAATTCATGGTACTTCGATTCTGT-3′；

下游引物：5′-CCAAGCTTAGTAAGTAATAGGAGCCCA-3′；

（2）目的基因egG1Y162的PCR扩增：

以细粒棘球蚴cDNA为模板，采用上述的上下游引物，进行PCR扩增，扩增体系为：灭菌水16μl，质粒2μl，EcoRI 0.5μl，HindⅢ 0.5μl，mix 20μl，共40μl扩增体系；Touchdown PCR反应条件：95℃4 min；95℃ 30s，65℃ 30s 降1℃，72℃ 2min 共11个循环；95℃ 30s，50℃ 30s，75℃ 2min 共25个循环；最后72℃ 延伸，7min，末次4℃，将PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到大小为360bp的目的条带；

（3）目的片段egG1Y162与载体PMV361的连接：

egG1Y162扩增产物经DNA纯化试剂盒纯化回收后先与PMD19-T载体连接，利用α互补原则筛选阳性克隆并进行PCR扩增鉴定、酶切鉴定和测序鉴定，将经上述鉴定正确的阳性克隆扩增后提取egG1Y162-PMD19质粒，将该质粒经EcoRI、HindⅢ 限制性内切酶酶切，凝胶回收目的片段后与同样用EcoRI和HindⅢ进行双酶切的pMV361质粒胶回收产物，按3∶1的摩尔比(目的片段∶载体)在T4DNA连接酶的催化下进行连接，连接体系为：buffer缓冲液1 μl，目的片段7 μl，PMV361载体1 μl ，T4 DNA连接酶1 μl，共10μl的连接体系，16℃，连接过夜。转化入E.coli DH5α感受态细胞后，利用PMV361质粒所携带的卡那霉素抗性筛选egG1Y162-PMV361重组子，对阳性克隆进行PCR扩增鉴定和EcoRI和HindⅢ双酶切鉴定，将鉴定正确的重组质粒命名为egG1Y162-PMV361；

（4）重组egG1Y162-PMV361载体的电转化

将-80℃保存的BCG菌株复苏后接种于含10% OADC的7H9液体培养基，180r／min ，37℃ ，震荡培养至对数生长期，即培养液变混浊,沙样生长后用于感受态细胞的制备。取在7H9液体培养基上生长良好的BCG培养物， 37℃继续震荡培养10天，4℃，5000 r/min离心10min 收集菌体，以灭菌10%甘油洗涤4次，最后一次用适量的10%甘油重悬菌体，即得到BCG感受态细胞。分别将egG1Y162-PMV361质粒及空质粒pMV361经电穿孔法分别转化入BCG感受态细胞中，具体电转化条件为：电容25Uf，电阻1000Ω，场强18×105V/ m ，转化时间为5 ms，转化次数为3；放电结束后将100μL菌液立即转移入1 mL 7H9液体培养液中，37℃震荡培养过夜（>24h）。取培养过夜的转化后菌液800r/min室温离心10min，取沉淀100μL均匀涂布于含OADC和30μg/ml卡那霉素的7H10固体培养基表面， 37℃培养3-4周，培养基表面见转化后菌落生长。从7H10固体培养基平板表面挑取BCG重组子，接种于罕OADC的7H9液体培养基中， 37℃ ，培养至对数生长期，取菌液进行PCR扩增鉴定证实为阳性克隆后，分别命名为egG1Y162-PMV361-rBCG及PMV361- rBCG；

（5）重组egG1Y162-PMV361-rBCG的诱导表达

将经PCR扩增鉴定证实含有egG1Y162-PMV361质粒的rBCG阳性克隆接种在含30μg/ml 卡那霉素的7H9液体培养基中，37℃，180r/min振摇培养至对数生长期(需3w左右)，进行45℃热诱导45min，离心收集菌体；加入1ml预冷的磷酸盐缓冲液重悬菌泥后超声粉碎，再加入等体积2×SDS-PAGE上样缓冲液，100℃煮沸5min，冰浴5min，4℃，12000rpm离心5min；取10μl上清进行SDS-PAGE分析，最终获得的egG1Y162-PMV361-rBCG表达的融合抗原，其分子量约为71KD。

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