CN101693885B

CN101693885B - 抗乙型肝炎病毒尼古丁药物组合物

Info

Publication number: CN101693885B
Application number: CN2009101126701A
Authority: CN
Inventors: 李海涛; 高丰光; 倪晓妍
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2009-10-16
Filing date: 2009-10-16
Publication date: 2013-05-08
Anticipated expiration: 2029-10-16
Also published as: CN101693885A

Abstract

抗乙型肝炎病毒尼古丁药物组合物，涉及一种组合物。提供一种抗乙型肝炎树突状细胞及其制备方法，以及抗乙型肝炎树突状细胞在制备用于预防和/或治疗乙型肝炎药物中的应用。将未成熟的树突状细胞在培养液中培养，所述培养液为RPMI Medium 1640培养液，在RPMI Medium 1640培养液中含有尼古丁；使乙型肝炎病毒e抗原，或/和乙型肝炎病毒x抗原，与经尼古丁处理的树突状细胞接触；收集树突状细胞，即得到抗乙型肝炎树突状细胞。所述抗乙型肝炎树突状细胞可应用于制备用于预防和/或治疗乙型肝炎药物。用于预防和/或治疗乙型肝炎药物包括抗乙型肝炎树突状细胞和药学上可接受的载体。

Description

抗乙型肝炎病毒尼古丁药物组合物

技术领域

本发明涉及一种组合物，尤其是涉及一种用尼古丁处理树突状细胞的方法，以及用HBV抗原HBe、HBx负载尼古丁处理后树突状细胞的方法。

背景技术

乙型肝炎病毒(Hepatisis B virus，HBV)引起的病毒性肝炎是严重威胁人类健康的常见病和多发病，目前，全世界有乙型肝炎病毒(HBV)感染者约3.5亿，中国占1/3以上，约为1.2亿，其中有1/4约3000万为慢性乙型肝炎患者。因此，研究慢性乙型肝炎预防和治疗的措施已成为生命科学与医学研究领域的重点和热点。

RongQ等人以分子生物学手段对HBV在肝外组织的存在状态进行研究发现，HBV不仅可在肝细胞中增殖，而且可在包括淋巴细胞、心肌细胞、肾实质细胞等多种细胞中增殖和潜伏。肝外组织中HBV的潜伏可逃避以肝细胞特异性受体为特异靶点的免疫治疗的打击，成为HBV慢性化的根源之一。Agostini C等的研究发现，HBV在淋巴细胞中的存在可影响淋巴细胞的增殖分化与功能，肝脏内HBV特异性CTL(杀伤性T细胞)的失能以及机体对HBV抗原的免疫耐受是HBV感染慢性化的关键。

病毒感染细胞的清除主要依靠适应性免疫应答产生的病毒抗原特异性CTL，以及适应性免疫应答和固有免疫应答过程中分泌的IFN-γ等细胞因子。树突状细胞作为适应性免疫应答的启动者，是目前所知抗原提呈功能最强的抗原提呈细胞(antigen presenting cell，APC)，而且是连接适应性免疫和固有免疫的桥梁。对树突状细胞的研究有助于深入了解机体免疫应答的产生和调控机制。通过人为干预树突状细胞的功能来调控机体的免疫应答，以达到对HBV病毒感染的治疗作用，对乙型肝炎的防治具有重要的实际意义。

随着对HBV慢性化进程中免疫细胞失能和免疫逃逸机制的深入研究，以HBV抗原特异性CTL过继免疫和固有分子TRIM22抗HBV研究也逐步开展。蔡大川等以人HBsAg负载的人脐血来源的树突状细胞与同源靶细胞进行进行混合培养，发现树突状细胞可在体外特异性杀伤HBsAg负载的靶细胞。HBV抗原负载的树突状细胞虽然可在HBV转基因鼠体内成功打破已有的免疫耐受，诱导产生针对抗原的特异性免疫应答，但此类树突状细胞在体内产生免疫应答的效率有待于进一步提高。经细胞因子IL-15、IL-4、IL-18、IFN-γ刺激或其基因转染，联合抗原负载以增强树突状细胞诱导效率的研究方兴未艾，但上述方法有操作复杂、价格昂贵、活性不稳定的缺点而限制其在临床的广泛应用。

乙酰胆碱烟碱样受体(nicotine acetylcholine receptor，nAchR)在神经系统和非神经细胞(如免疫细胞、内皮细胞和上皮细胞)中有广泛的表达。nAchR配体——尼古丁，是由芳族六元环(吡啶)和脂族五元环(吡咯烷)通过单键连接而形成的天然化合物。提纯后的尼古丁是一种味苦、无色透明的油质液体，挥发性强，在空气中极易氧化成暗灰色，能迅速溶于水及酒精中，通过口鼻支气管粘膜很容易被机体吸收，粘在皮肤表面的尼古丁亦可被吸收渗入体内。它具有性质稳定、易于获得和价廉的优点。

尼古丁的英文通用名称为nicotine，中文化学名称为(S)-3-(1-甲基-2-吡咯烷基)吡啶，英文化学名称为(S)-3-(1-Methyl-2-pyrrolidinyl)pyridine，国际编号为61868，CAS编码为54-11-5，其结构式为：

分子式为C₁₀H₁₄N₂，分子量为162.23。物理性质：纯品为无色或淡黄色油状液体，有焦灼味，工业品为棕色；蒸汽压：0.13kPa/61.8℃，闪点：101℃，熔点：＜-80℃，沸点：247℃(分解)；溶解性：60℃以下与水混溶，形成水合物；与乙醚、乙醇混溶，能迅速溶于大多有机溶剂，如乙醇、氯仿、乙醚、油类；密度：相对密度(水＝1)1.01；相对密度(空气＝1)5.61；稳定性：稳定。

尼古丁的制备或来源：烟草中的一种主要生物碱。提取时可将烟草以稀酸浸渍，以碱中和，然后蒸汽蒸馏，并以草酸处理，再进行碱化而制得。

本申请的发明人高丰光在公开号为CN101289653A的发明专利申请中提供了一种制备树突状细胞方法，所述方法包括：(1)在摩尔比浓度为1×10^-9～1×10^-3摩尔/升的尼古丁或其盐存在的条件下，培养未成熟的树突状细胞；(2)收集处理后的树突状细胞。该发明的方法还可包括步骤：在步骤(1)和(2)之间，使步骤(1)中所得的尼古丁处理后的细胞与肿瘤抗原接触。本发明还提供了用该方法制备的树突状细胞、及其组合物、试剂盒和用途。本发明的树突状细胞具有增强的诱导免疫应答能力的树突状细胞，可用于预防和治疗各种肿瘤。

目前，尼古丁作为药物已广泛应用于神经退行性疾病和溃疡性结肠炎的治疗，虽然已有用尼古丁处理树突状细胞的报道，但尚未有将处理后的树突状细胞联合负载HBV的HBe、HBx抗原用于乙型肝炎的预防和治疗的文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗乙型肝炎树突状细胞及其制备方法。

本发明的另一目的在于提供抗乙型肝炎树突状细胞在制备用于预防和/或治疗乙型肝炎药物中的应用。

所述一种抗乙型肝炎树突状细胞为：

抗乙型肝炎树突状细胞表面CD80、CD86、CD40、CCR7等表面分子的表达量显著增加，表明细胞处于活化状态，激活乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)和乙型肝炎病毒x抗原(HBxAg)特异性T细胞的能力显著增强；MHC I类分子表达增加，表明此细胞具有更强的提呈乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)和乙型肝炎病毒x抗原(HBxAg)的能力。

所述一种抗乙型肝炎树突状细胞的制备方法包括以下步骤：

1)将未成熟的树突状细胞在培养液中培养，所述培养液为RPMI Medium 1640培养液，在RPMI Medium 1640培养液中含有摩尔浓度为1×10^-8～1×10^-6mol/L的尼古丁；

2)使乙型肝炎病毒(HBV)e抗原(乙型肝炎病毒e抗原记为HbeAg)，或/和

乙型肝炎病毒(HBV)x抗原(乙型肝炎病毒x抗原记为HbxAg)，与步骤1)中经尼古丁处理的树突状细胞接触；

3)收集树突状细胞，即得到抗乙型肝炎树突状细胞。

在步骤1)中，所述未成熟的树突状细胞可为获自哺乳动物的未成熟树突状细胞；所述尼古丁的摩尔浓度最好为1×10^-7mol/L；所述尼古丁的来源为化学合成或提取自天然植物，所述天然植物选自烟草、番茄或枸杞子等；所述尼古丁可为尼古丁水溶液；所述培养的时间可为12～16h，最好为12～14h，优选为12h。

在步骤2)中，所用HBe、HBx抗原浓度可为1～10μg/ml，最好为1～5μg/ml，优选为1～2μg/ml，最优选为1μg/ml；所述HBV的抗原HBeAg、HbxAg可来自重组工程菌所表达的蛋白；所述接触的时间可为4～6h，最好为6h。

所述抗乙型肝炎树突状细胞可应用于制备用于预防和/或治疗乙型肝炎药物。

所述用于预防和/或治疗乙型肝炎药物包括抗乙型肝炎树突状细胞和药学上可接受的载体。

所述抗乙型肝炎树突状细胞的数量为10⁵～10⁶个，最好为10⁵个。

本发明经过尼古丁刺激，联合乙型肝炎病毒HBe、HBx抗原负载可以增强机体对乙型肝炎病毒杀伤的能力，转输经尼古丁联合HBe、HBx处理后的树突状细胞可有效的预防和治疗慢性乙型肝炎。

本发明具有以下突出的优点：

1)与传统的只用乙型肝炎病毒抗原负载树突状细胞治疗乙型肝炎的方法相比，本发明所得抗乙型肝炎树突状细胞能更有效地启动抗乙型肝炎病毒的免疫应答。

2)与传统的治疗乙型肝炎的药物相比，本发明所述预防和/或治疗乙型肝炎药物价廉且易于制备。

附图说明

图1为尼古丁提高树突状细胞刺激HBeAg特异性T细胞增殖的能力。在图1中，横坐标为实验分组，纵坐标为化学发光数值(RLU/s)；a为对照组，b为乙型肝炎病毒e抗原处理组，c为尼古丁联合乙型肝炎病毒e抗原处理组，d为银环蛇毒素、尼古丁联合乙型肝炎病毒e抗原处理组，e为筒箭毒碱尼古丁联合乙型肝炎病毒e抗原处理组。

图2所示为尼古丁处理提高树突状细胞刺激HBxAg特异性T细胞增殖的能力。在图2中，横坐标为实验分组，纵坐标为化学发光数值(RLU/s)；a为对照组，b为乙型肝炎病毒x抗原处理组，c为尼古丁联合乙型肝炎病毒x抗原处理组，d为银环蛇毒素、尼古丁联合乙型肝炎病毒x抗原处理组，e为筒箭毒碱尼古丁联合乙型肝炎病毒x抗原处理组，f为美加明尼古丁联合乙型肝炎病毒x抗原处理组。

图3所示为尼古丁处理树突状细胞促进混合淋巴细胞反应中诱导HBxAg抗原特异性T细胞向Th1方向极化的细胞因子IL-12的分泌。在图3中，横坐标为实验分组，纵坐标为吸光值(OD450 value)；a为对照组，b为乙型肝炎病毒x抗原处理组，c为尼古丁联合乙型肝炎病毒x抗原处理组，d为银环蛇毒素、尼古丁联合乙型肝炎病毒x抗原处理组，e为筒箭毒碱尼古丁联合乙型肝炎病毒x抗原处理组，f为美加明尼古丁联合乙型肝炎病毒x抗原处理组。

图4所示为尼古丁处理树突状细胞促进混合淋巴细胞反应中诱导HBeAg抗原特异性T细胞向Th1方向极化的细胞因子IL-12的分泌。在图4中，横坐标为实验分组，纵坐标为吸光值(OD450 value)；a为对照组，b为乙型肝炎病毒e抗原处理组，c为尼古丁联合乙型肝炎病毒e抗原处理组，d为银环蛇毒素、尼古丁联合乙型肝炎病毒e抗原处理组，e为筒箭毒碱尼古丁联合乙型肝炎病毒e抗原处理组，f为美加明尼古丁联合乙型肝炎病毒e抗原处理组。

图5所示为尼古丁处理树突状细胞促进HBeAg抗原特异性杀伤性T细胞增殖。在图5中，横坐标为实验分组，纵坐标为免疫斑点数目(IFN-γ Ellspot number)；a为对照组，b为鸡卵白蛋白非特异性对照组，c为乙型肝炎病毒x抗原处理组，d为尼古丁联合乙型肝炎病毒x抗原处理组，e为银环蛇毒素、尼古丁联合乙型肝炎病毒x抗原处理组。

图6所示为尼古丁处理树突状细胞促进HBxAg抗原特异性杀伤性T细胞增殖。在图6中，横坐标为实验分组，纵坐标为免疫斑点数目(IFN-γ Ellspot number)；a为对照组，b为鸡卵白蛋白非特异性对照组，c为乙型肝炎病毒e抗原处理组，d为尼古丁联合乙型肝炎病毒e抗原处理组，e为银环蛇毒素、尼古丁联合乙型肝炎病毒e抗原处理组。

具体实施方式

在本发明中，用尼古丁联合乙型肝炎病毒抗原HBe、HBx处理所得的树突状细胞，已获得本发明的树突状细胞。所述方法包括以下步骤：

3)收集树突状细胞，即得到抗乙型肝炎树突状细胞。

抗乙型肝炎树突状细胞可应用于制备用于预防和/或治疗乙型肝炎药物，所述用于预防和/或治疗乙型肝炎药物包括抗乙型肝炎树突状细胞和药学上可接受的载体，所述抗乙型肝炎树突状细胞的数量为10⁵～10⁶个，最好为10⁵个。

以下给出若干有关所述抗乙型肝炎树突状细胞可应用于抗乙型肝炎的特性。

实施例1.用尼古丁处理树突状细胞

在有GM-CSF和IL-4存在的情况下，培养小鼠骨髓细胞4天，洗掉未贴壁的细胞，贴壁的细胞便是未成熟的DC(immature DC)，在此未成熟DC中加尼古丁使其终摩尔浓度为1×10^-7mol/L。于培养环境中刺激12～16h，后加入HBeAg或HBxAg，使HBV的抗原与上述尼古丁处理的DC接触4～6h。

实施例2.尼古丁处理增加树突状细胞提呈HBe、HBx抗原的能力，并刺激HBe、HBx特异性T细胞的增殖

实验方法

以尼古丁联合HBV抗原HBe、HBx的杀伤性T细胞表位肽刺激未成熟树突状细胞后，将上述树突状细胞和T淋巴细胞按照1∶10～50比例混合，以进行混合淋巴细胞反应(MLR)。MLR在常规培养条件培养5～7天后，以BrdU掺入法检测其刺激T淋巴细胞增殖情况。

实验分组

ImDC/HBe(HBx)为HBe(HBx)刺激的树突状细胞组；imDC/Ni/HBe(HBx)为尼古丁联合HBe(HBx)处理组；imDC/BTX/Ni/HBe(HBx)为银环蛇毒素、尼古丁、HBe(HBx)联合处理组；imDC/Tc/Ni/HBe(HBx)为筒箭毒碱、尼古丁、HBe/HBx联合处理组；imDC/Mc/Ni/HBe(HBx)为美加明、尼古丁、HBe/HBx联合处理组。

实验结果

以BrdU掺入法检测MLR中T细胞增殖情况。尼古丁处理后树突状细胞再以HBe(HBx)的杀伤性T细胞表位刺激后，其刺激T细胞增殖的能力提高了218.9％(302.0％)。当以拮抗剂银环蛇毒素、美加明拮抗尼古丁的作用后，上述能力提高的程度分别下降了112.8％(95.1％)和82.4％(113.4％)(P＜0.05)(参见图1和2)。

结论

用尼古丁处理树突状细胞可极大提高其提呈HBe、HBx抗原的能力，以及其刺激HBe、HBx抗原特异性T细胞增殖的能力。

实施例3.尼古丁处理树突状细胞联合HBe、HBx抗原处理增加混合淋巴细胞反应中促Th1方向极化细胞因子IL-12的产生

实验方法

以尼古丁联合HBV抗原HBe、HBx的杀伤性T细胞表位肽刺激未成熟树突状细胞，并设置尼古丁受体阻断剂银环蛇毒素、筒箭毒碱以及美加明联合尼古丁、HBe/HBx CTL表位刺激未成熟树突状细胞，后将上述经处理的树突状细胞和T淋巴细胞按照1∶10比例混合，以进行混合淋巴细胞反应(MLR)。MLR在常规培养条件培养5～7天后，以酶联免疫吸附(ELISA)实验检测上清中IL-12的产生情况。

实验结果

以酶联免疫吸附试验(ELISA)检测MLR上清中IL-12产生情况发现尼古丁处理后树突状细胞再以HBe(HBx)杀伤性T细胞表位多肽刺激后，其使混合淋巴细胞反应中IL-12分泌的能力提高了14.8％(91.9％)(P＜0.05)。当分别以拮抗剂银环蛇毒素、筒箭毒碱和美加明拮抗尼古丁的作用以后，上述能力提高的程度分别下降了19.1％(12.5％)、17.3％(10.8％)和25.5％(23.0％)(P＜0.05)(参见图3和4)。

结论

尼古丁处理树突状细胞联合HBe、HBx抗原刺激能促进T细胞向Th1方向极化。

实施例4.尼古丁处理联合HBe、HBx抗原刺激增加树突状细胞诱导产生HBe、HBx抗原特异性杀伤性T细胞的能力

实验方法

本实验以尼古丁联合HBe、HBx杀伤性T细胞表位多肽刺激树突状细胞，并设置尼古丁受体阻断剂银环蛇毒素联合尼古丁、HBe/HBx杀伤性T细胞表位刺激未成熟树突状细胞，后收集各组细胞，以腹腔注射法将3×10⁵个上述树突状细胞传输到小鼠体内。传输7天后，将各组小鼠分别处死，取其脾脏制备淋巴细胞，并以相应抗原HBe的CTL表位或HBx的CTL表位再刺激，并设置鸡卵白蛋白OVA非特异性对照组，后进行酶联免疫斑点(ELISPOT)实验检测尼古丁处理树突状细胞诱导机体产生杀伤性T细胞情况。

实验结果

当以3×10⁵个上述尼古丁处理树突状细胞传输小鼠体内并于7天后将各组脾淋巴细胞用相应HBe/HBx杀伤性T细胞表位抗原再刺激后，酶联免疫斑点(ELISPOT)实验显示尼古丁处理后的树突状细胞诱导抗原特异性CTL的产生的你能力提高了2824.9％(2699.7％)，当以拮抗剂银环蛇毒素拮抗尼古丁的作用之后，其诱导抗原特异性CTL产生的能力下降了1897.4％(1751.8％)(参见图5和6)。

结论

尼古丁处理树突状细胞联合HBe、HBx抗原刺激能诱导机体产生更多针对此两种HBV抗原的CTL。

Claims

1.一种抗乙型肝炎树突状细胞的制备方法，其特征在于，所述抗乙型肝炎树突状细胞为抗乙型肝炎树突状细胞表面CD80、CD86、CD40、CCR7表面分子的表达量显著增加，表明细胞处于活化状态，激活乙型肝炎病毒e抗原和乙型肝炎病毒x抗原特异性T细胞的能力显著增强；MHC I类分子表达增加，表明此细胞具有更强的提呈乙型肝炎病毒e抗原和乙型肝炎病毒x抗原的能力；

所述制备方法包括以下步骤：

2)使乙型肝炎病毒e抗原，或/和

乙型肝炎病毒x抗原，与

步骤1)中经尼古丁处理的树突状细胞接触；

3)收集树突状细胞，即得到抗乙型肝炎树突状细胞。

2.如权利要求1所述的一种抗乙型肝炎树突状细胞的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述未成熟的树突状细胞为获自哺乳动物的未成熟树突状细胞。

3.如权利要求1所述的一种抗乙型肝炎树突状细胞的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述尼古丁的摩尔浓度为1×10^-7mol/L。

4.如权利要求1或3所述的一种抗乙型肝炎树突状细胞的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述尼古丁的来源为化学合成或提取自天然植物，所述天然植物选自烟草、番茄或枸杞子。

5.如权利要求1所述的一种抗乙型肝炎树突状细胞的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述尼古丁为尼古丁水溶液。

6.如权利要求1所述的一种抗乙型肝炎树突状细胞的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述培养的时间为12～16h。

7.如权利要求6所述的一种抗乙型肝炎树突状细胞的制备方法，其特征在于所述培养的时间为12～14h。

8.如权利要求7所述的一种抗乙型肝炎树突状细胞的制备方法，其特征在于所述培养的时间为12h。

9.如权利要求1所述的一种抗乙型肝炎树突状细胞的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所用HBe、HBx抗原浓度为1～10μg/ml，所述HBV的抗原HBeAg、HbxAg来自重组工程菌所表达的蛋白；所述接触的时间为4～6h。

10.如权利要求9所述的一种抗乙型肝炎树突状细胞的制备方法，其特征在于所用HBe、HBx抗原浓度为1～5μg/ml，所述接触的时间为6h。

11.如权利要求10所述的一种抗乙型肝炎树突状细胞的制备方法，其特征在于所用HBe、HBx抗原浓度为1～2μg/ml。

12.如权利要求11所述的一种抗乙型肝炎树突状细胞的制备方法，其特征在于所用HBe、HBx抗原浓度为1μg/ml。