CN111388659A - 一种非复制型弓形虫在作为和/或制备禽用免疫增强剂方面中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种非复制型弓形虫在作为和/或制备禽用免疫增强剂方面中的应用。本发明提供了一种弓形虫基因缺失株在作为或制备禽用免疫增强剂方面中的新用途，该弓形虫基因缺失株具有促进禽用疫苗免疫反应的作用，能够激发家禽对疫苗的免疫反应，增强疫苗的免疫效力，从而提高机体对病原的抵抗力，可应用于基础免疫研究、临床应用研究等领域。

Description

一种非复制型弓形虫在作为和/或制备禽用免疫增强剂方面 中的应用

技术领域

本发明属于兽医生物制品技术领域，尤其是一种非复制型弓形虫在作为和/或制备禽用免疫增强剂方面中的应用。

背景技术

目前，应用于养禽业的禽用免疫增强剂种类繁多，化学药物廉价易得，但容易造成畜产品的药物残留；各类中草药方剂或中草药提取物，因其成分复杂，其有效成分的提取工艺复杂或免疫增强作用机制的研究还不清楚，产品的成本较高，不适宜长期应用于养殖业。

非复制型弓形虫是一种将弓形虫的乳清酸核苷-5’-单磷酸脱羧酶

(orotidine-5’-monophosphate decarboxylase，OMDPC)和尿嘧啶核苷磷酸化酶(uridine phosphorylase，UP)基因进行双敲除，进而阻断嘧啶合成途径，构建的非复制型尿嘧啶营养缺陷型弓形虫(Nonreplicating Toxoplasma uracil auxotrophs，NRTUAs)。NRTUAs在体外培养中，能够入侵动物细胞，但不能增殖，当培养液中添加尿嘧啶时，NRTUAs既可以入侵动物细胞，又能够在细胞内增殖。由于必需酶的缺失，NRTUAs只能入侵宿主细胞，不能在宿主体内增殖，进一步降低弓形虫感染对宿主的毒力和致病性，具有良好的生物安全性。

研究表明，小鼠对弓形虫易感，并容易导致小鼠死亡，而NRTUAs感染小鼠后，5天左右就能被机体的免疫系统快速清除。即使是NRTUAs感染免疫缺陷的动物，如γ干扰素(IFN-γ)敲除的小鼠或缺乏T细胞、B细胞和NK细胞的小鼠(NOD/scid/gamma小鼠)，NRTUAs对宿主无致病性，而且宿主能安全地耐受。经NRTUAs感染的NOD/scid/gamma小鼠，其谷丙转氨酶和谷草转氨酶的水平均正常，说明NRTUAs在小鼠体内不产生毒素，不会造成肝功能损伤，进一步证实NRTUAs的生物安全性良好。

NRTUAs易于入侵宿主的髓样细胞，如树突状细胞、单核/巨噬细胞，诱导髓样细胞成熟并激活髓样细胞的免疫活性，显著提高髓样细胞的共刺激分子CD80和CD86、以及MHCI分子的表达，并增加白介素-12(IL-12)的产生，进而增强细胞的抗原递呈和T细胞激活功能，进而够调节宿主的免疫系统，提高机体的免疫反应，逆转肿瘤导致的免疫抑制微环境。同时，NRTUAs能够诱导强烈的获得性免疫应答，通过激活CD8α⁺树突状细胞，进而增强抗原递呈来刺激CD4⁺和CD8⁺T细胞的成熟，增加IL-12和IFN-γ的产生，并维持肿瘤特异性抗体在较高的水平。综上所述，NRTUAs不仅对机体具有免疫调节作用，而且显示出良好的生物安全性，可以作为家禽潜在的免疫增强剂，具有更为广阔的研究意义和应用价值。

NRTUAs能够激发宿主的免疫反应，具有免疫调节作用，但是NRTUAs对于家禽免疫调节作用的影响还没有详细的研究，比如NRTUAs对家禽疫苗免疫后对细胞免疫和体液免疫的影响，NRTUAs免疫对家禽生长发育的影响，NRTUAs免疫对家禽各个器官的致病性等等都有待于本领域的技术人员进行不断地探索。

通过对比，本发明专利申请与上述公开文献存在本质的不同。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种非复制型弓形虫在作为和/或制备禽用免疫增强剂方面中的应用，弓形虫基因缺失株具有促进禽用疫苗免疫反应的作用，能够激发家禽对疫苗的免疫反应，增强疫苗的免疫效力，从而提高机体对病原的抵抗力，可应用于基础免疫研究、临床应用研究等领域。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种非复制型弓形虫在作为禽用免疫增强剂方面中的应用。

而且，所述非复制型弓形虫为将弓形虫的乳清酸核苷-5’-单磷酸脱羧酶基因和尿嘧啶核苷磷酸化酶基因进行双敲除而获得的非复制型尿嘧啶营养缺陷型弓形虫。

而且，利用CRISPR/CAS9技术将弓形虫的乳清酸核苷-5’-单磷酸脱羧酶基因和尿嘧啶核苷磷酸化酶基因进行双敲除。

而且，当非复制型弓形虫的用量为0.1mL非复制型弓形虫虫株10⁶个/只禽时，非复制型弓形虫不影响雏鸡的生长发育，病理剖检没有可见病变，病理组织学观察未见异常；

或者，当非复制型弓形虫的用量为0.1mL非复制型弓形虫虫株10⁵个/只禽时，能够提高禽的外周血淋巴细胞的增殖能力，能够提高禽的血清中IL-4的含量，能够促进活化禽的B细胞增殖并提高血清中的抗体水平，能提高雏鸡血清中INF-γ的含量，能够刺激T细胞、B细胞增殖和B细胞抗体的分泌，提高血清中的抗体水平。

而且，所述非复制型弓形虫的用量为：0.1mLNRTUAs虫株10⁵个/只禽。

一种非复制型弓形虫在制备禽用免疫增强剂方面中的应用。

而且，所述非复制型弓形虫为将弓形虫的乳清酸核苷-5’-单磷酸脱羧酶基因和尿嘧啶核苷磷酸化酶基因进行双敲除而获得的非复制型尿嘧啶营养缺陷型弓形虫。

而且，利用CRISPR/CAS9技术将弓形虫的乳清酸核苷-5’-单磷酸脱羧酶基因和尿嘧啶核苷磷酸化酶基因进行双敲除。

而且，当非复制型弓形虫的用量为0.1mL非复制型弓形虫虫株10⁶个/只禽时，非复制型弓形虫不影响雏鸡的生长发育，病理剖检没有可见病变，病理组织学观察未见异常；

或者，当非复制型弓形虫的用量为0.1mL非复制型弓形虫虫株10⁵个/只禽时，能够提高禽的外周血淋巴细胞的增殖能力，能够提高禽的血清中IL-4的含量，能够促进活化禽的B细胞增殖并提高血清中的抗体水平，能提高雏鸡血清中INF-γ的含量，能够刺激T细胞、B细胞增殖和B细胞抗体的分泌，提高血清中的抗体水平。

而且，0.1mLNRTUAs虫株10⁵个/只禽。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明提供了一种弓形虫基因缺失株在作为或制备禽用免疫增强剂方面中的新用途，该弓形虫基因缺失株具有促进禽用疫苗免疫反应的作用，能够激发家禽对疫苗的免疫反应，增强疫苗的免疫效力，从而提高机体对病原的抵抗力，可应用于基础免疫研究、临床应用研究等领域。弓形虫基因缺失虫株可以是利用CRISPR/CAS9技术将弓形虫的OMDPC基因和UP基因进行双敲除而获得。

2、本发明提供了一种新型、安全、高效的禽用疫苗免疫增强剂NRTUAs，NRTUAs配合新城疫疫苗免疫雏鸡，能显著增强细胞免疫和体液免疫，提高疫苗的免疫应答，同时可以预防弓形虫的感染，可在兽医临床上推广应用。

3、低剂量免疫NRTUAs能够快速激发宿主持久地产生依赖CD8⁺T细胞的免疫保护力来对抗野生型弓形虫的再感染。值得关注的是，与现有的非复制型细菌或病毒疫苗载体相比，NRTUAs首次免疫1万个虫体就可以激发宿主产生保护性CD8⁺T细胞免疫应答，可以作为抗弓形虫的弱毒疫苗。此外，弓形虫能够入侵大多数温血动物的有核细胞，作为良好的抗原表达载体，通过改造可以将外源抗原打靶在虫体的胞浆内、细胞核内、虫体膜表面、纳虫空泡以及宿主细胞内，增强宿主细胞的抗原递呈能力，刺激宿主产生高水平的系统性免疫应答。

4、本发明通过对雏鸡皮下注射0.1mLNRTUAs虫株10⁶个/只，发现免疫NRTUAs的雏鸡没有死亡，也没有临床症状，NRTUAs不影响雏鸡的生长发育，病理剖检没有可见病变，病理组织学观察未见异常，说明NRTUAs免疫对雏鸡没有致病性，显示出良好的使用安全性。

5、本发明通过对雏鸡皮下注射0.1mLNRTUAs虫株10⁵个/只，再免疫新城疫Ⅳ系疫苗，通过HA和HI试验检测不同时期的血清中新城疫抗体水平，发现在NRTUAs的作用下，雏鸡的新城疫抗体水平得到一定程度的提高，并且能够维持高水平抗体在体内存续的时间。通过MTT法检测不同时期的外周血淋巴细胞的增殖能力，发现NRTUAs皮下免疫能够提高雏鸡外周血淋巴细胞的增殖能力。通过ELISA试剂盒检测不同时期血清中白介素-4(IL-4)和INF-γ的含量，发现NRTUAs皮下免疫能够使雏鸡血清中IL-4的含量得到一定程度的提高，促进活化B细胞增殖并提高血清中的抗体水平，同时也能提高雏鸡血清中INF-γ的含量，进而促进细胞免疫反应，刺激T细胞、B细胞增殖和B细胞抗体的分泌，提高血清中的抗体水平。

附图说明

图1为本发明中NRTUAs的敲除载体构建图；其中，A代表同源重组过程，分别扩增获得OMDPC和UP基因的5’UTR、3’UTR同源模板，并将DHFR-YFP与左右5’UTR、3’UTR同源模板连接，构建同源修复模板用于替代阻断OMDPC的编码区，同理，将CAT-mCherry与左右5’UTR、3’UTR同源模板连接，构建同源修复模板用于替代阻断UP的编码区；B代表敲除载体构建图，以PCR扩增的方式替换模板质粒中的sgUPRT为sgUP或sgOMDPC，获得识别UP和OMDPC靶点的敲除质粒；

图2为本发明中UP基因的5’UTR、3’UTR同源模板扩增图；其中，U5为UP基因的5’UTR，U3为UP基因的3’UTR，M为AL5000 DNA Marker；

图3为本发明中UP基因的5’UTR-CAT-mCherry-3’UTR同源修复序列扩增图；其中，1，2均为UP基因同源修复PCR产物，M为AL5000 DNA Marker；

图4为本发明中UP基因的sgRNA扩增图；其中，UsgRNA为敲除UP基因的sgRNA，M为AL5000 DNA Marker；

图5为本发明中OMDPC基因的5’UTR、3’UTR同源模板扩增图；其中，O5为OMDPC基因的5’UTR，O3为OMDPC基因的3’UTR，M为AL5000 DNA Marker；

图6为本发明中OMDPC基因的5’UTR-DHFR-YFP-3’UTR同源修复序列扩增图；其中，1，2均为OMDPC基因同源修复PCR产物，M为AL5000 DNA Marker；

图7为本发明中OMDPC基因的sgRNA扩增图；其中，M为AL5000 DNA Marker，OsgRNA为敲除OMPDC基因的sgRNA；

图8为本发明中敲除虫体荧光鉴定图；其中，A为UP基因缺失虫株，自左至右的三幅图分别为荧光下敲除虫体自发红色荧光、白光下敲除虫体、荧光与白光重叠图像，B为OMPDC基因和UP基因同时缺失虫株，自左至右的三幅图分别为荧光下敲除虫体自发黄色荧光、荧光下敲除虫体自发红色荧光、双荧光与白光重叠图像；

图9为本发明中UP基因敲除虫体鉴定图；其中，1为ΔUP虫株UP 5’UTR上游鉴定，2为ΔUP虫株UP 3’UTR下游鉴定，3为ΔUP虫株UP内部基因鉴定，4为ΔUP虫株UP内部基因鉴定，5为AL5000 DNA Marker，6为ΔKu80虫株UP 5’UTR上游鉴定，7为ΔKu80虫株UP 3’UTR下游鉴定，8为ΔKu80虫株UP内部基因鉴定，9为ΔKu80虫株UP内部基因鉴定；

图10为本发明中OMDPC基因敲除虫体鉴定图；其中，1为ΔOMDPCΔUP(NRTUAs)虫株OMDPC 5’UTR上游鉴定，2为NRTUAs虫株OMDPC 3’UTR下游鉴定，3为NRTUAs虫株OMDPC内部基因鉴定，4为NRTUAs虫株OMDPC内部基因鉴定，5为AL5000 DNA Marker，6为ΔUP虫株OMDPC5’UTR上游鉴定，7为ΔUP虫株OMDPC 3’UTR下游鉴定，8为ΔUP虫株OMDPC内部基因鉴定，9为ΔUP虫株OMDPC内部基因鉴定；

图11为本发明中雏鸡的体重变化图；

图12为本发明中雏鸡的剖检病变观察图；其中，左代表实验组，中代表感染对照组，右代表空白对照组；第1-5行依次分别代表心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏的病理剖检眼观病变；

图13为本发明中雏鸡的器官指数图；

图14为本发明中雏鸡的病理组织学观察图；其中，左代表实验组，中代表感染对照组，右代表空白对照组；第1-5行依次分别代表心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏的病理组织学观察结果，标尺表示90μm；

图15为本发明中新城疫疫苗抗体效价图；其中，ns表示组间差异不显著(P>0.05)，不同的小写字母表示组间差异显著(P<0.05)，不同的大写字母表示组间差异极显著(P<0.01)；

图16为本发明中外周血淋巴细胞的增殖能力图；其中，不同的小写字母表示组间差异显著(P<0.05)，不同的大写字母表示组间差异极显著(P<0.01)；

图17为本发明中血清中IL-4的含量图；其中，不同的小写字母表示组间差异显著(P<0.05)，不同的大写字母表示组间差异极显著(P<0.01)；

图18为本发明中血清中INF-γ的含量图；其中，不同的小写字母表示组间差异显著(P<0.05)，不同的大写字母表示组间差异极显著(P<0.01)。

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

一种非复制型弓形虫在作为禽用免疫增强剂方面中的应用。

较优地，所述非复制型弓形虫为将弓形虫的乳清酸核苷-5’-单磷酸脱羧酶基因和尿嘧啶核苷磷酸化酶基因进行双敲除而获得的非复制型尿嘧啶营养缺陷型弓形虫。

较优地，利用CRISPR/CAS9技术将弓形虫的乳清酸核苷-5’-单磷酸脱羧酶基因和尿嘧啶核苷磷酸化酶基因进行双敲除。

较优地，当非复制型弓形虫的用量为0.1mL非复制型弓形虫虫株10⁶个/只禽时，非复制型弓形虫不影响雏鸡的生长发育，病理剖检没有可见病变，病理组织学观察未见异常；

或者，当非复制型弓形虫的用量为0.1mL非复制型弓形虫虫株10⁵个/只禽时，能够提高禽的外周血淋巴细胞的增殖能力，能够提高禽的血清中IL-4的含量，能够促进活化禽的B细胞增殖并提高血清中的抗体水平，能提高雏鸡血清中INF-γ的含量，能够刺激T细胞、B细胞增殖和B细胞抗体的分泌，提高血清中的抗体水平。

较优地，所述非复制型弓形虫的用量为：0.1mLNRTUAs虫株10⁵个/只禽。

一种非复制型弓形虫在制备禽用免疫增强剂方面中的应用。

较优地，所述非复制型弓形虫为将弓形虫的乳清酸核苷-5’-单磷酸脱羧酶基因和尿嘧啶核苷磷酸化酶基因进行双敲除而获得的非复制型尿嘧啶营养缺陷型弓形虫。

较优地，利用CRISPR/CAS9技术将弓形虫的乳清酸核苷-5’-单磷酸脱羧酶基因和尿嘧啶核苷磷酸化酶基因进行双敲除。

较优地，当非复制型弓形虫的用量为0.1mL非复制型弓形虫虫株10⁶个/只禽时，非复制型弓形虫不影响雏鸡的生长发育，病理剖检没有可见病变，病理组织学观察未见异常；

或者，当非复制型弓形虫的用量为0.1mL非复制型弓形虫虫株10⁵个/只禽时，能够提高禽的外周血淋巴细胞的增殖能力，能够提高禽的血清中IL-4的含量，能够促进活化禽的B细胞增殖并提高血清中的抗体水平，能提高雏鸡血清中INF-γ的含量，能够刺激T细胞、B细胞增殖和B细胞抗体的分泌，提高血清中的抗体水平。

较优地，0.1mLNRTUAs虫株10⁵个/只禽。

更具体地，相关的制备及检测如下：

1.1NRTUAs的构建

1.1.1敲除载体的构建

参考Toxo DB数据库(http://www.toxodb.org)中RH虫株的基因组信息，应用http://grna.ctegd.uga.edu/网站设计UP基因和OMDPC基因的特异single guide RNA(sgRNA)序列。然后以pSAG1::Cas9 GFP-U6::sg UPRT为模板，分别通过引物gUP-F/R和gOMDPC-F/R以PCR扩增的方式替换模板质粒中的sgUPRT，获得识别UP和OMDPC靶点的敲除质粒(见图1B、图4、图7)；分别利用引物KO UP-F1/R1/F2/R2和KO OMDPC-F1/R1/F2/R2来扩增获得UP和OMDPC基因的5’UTR和3’UTR同源模板(见图1A、图2、图5)，并通过多片段连接酶试剂盒(ClonExpress^TMMultiS)将UP基因5’UTR、CAT-mCherry、UP基因3’UTR三个片段连接用于替代阻断UP编码区的同源重组模板(见图1A、图3)，此外，通过多片段连接酶试剂盒(ClonExpress^TMMultiS)将OMDPC基因5’UTR、DHFR-YFP、OMDPC基因3’UTR三个片段连接用于替代阻断OMDPC编码区的同源重组模板(见图1A、图6)。

引物序列：

KO UP-F1：ATGACCATGATTACGCCTACGTATGTTTAAGTCGAGCAGTTTTACTT

KO UP-R1：AACGCGGACATGCATATCGAAACGTTTCTTCACTTTTGTTTG

KO UP-F2：ACTGTAGCCTGCCAGAACACATGAATTCAAATGATGCGTTTCAT

KO UP-R2：TATAGGGCGAATTGGATATCCAAAAACAAATGGGCGAAGAAATA

gUP-F：CCACATGGGTCAATACACAAGACAGCTA

gUP-R：TTCTAGCTCTAAAACCCGTCGTGATGTATGCGTAATGCAACTTGACATCCC

KO OMDPC-F1：

ATGACCATGATTACGCCTACGTAAGAAAAAGTCTACGAAAAAGTCAAATTT

KO OMDPC-R1：AATTCGCCCTATAGTGAGTCTCAATTGTCACGGAAAAATGTCTGTA

KO OMDPC-F2：ACTGTAGCCTGCCAGAACACTGACTCTGGTCTACATTAAA

KO OMDPC-R2：TATAGGGCGAATTGGATATCAAAACGTGCCCGGTTTTCTC

gOMDPC-F：CCACATGGGTCAATACACAAGACAGCTA

gOMDPC-R：

TTCTAGCTCTAAAACGTCGTGATATGCCACGAGAGAAACTTGACATCCC

1.1.2敲除虫株ΔUP的获得与筛选鉴定

将弓形虫ΔKu80虫株进行富集和纯化，溶于适量电转液，使虫体的终浓度为2×10⁷个/mL。调节电转仪，参数为2050V电压，电阻无穷大，电容25μF，使用4mm电转杯。取700μL虫体加入电转杯中，将10μg敲除质粒和50μg同源重组模板加入电转杯中混匀，将电转杯放入安全操作池，启动程序，电转完毕后，电转杯静止20min。将电转完毕的弓形虫加入新鲜培养的HFF细胞中，培养12h时，可以在敲除虫体的细胞核内观察到Cas9-eGFP瞬时表达而产生的绿色荧光，更换细胞培养液，加入终浓度为50pg/mL的氯霉素进行初步筛选，接种后每天观察各孔虫株生长状态，传至第三代时，可以观察到红色荧光(见图8A)和噬斑出现；当红色荧光和噬斑出现比例占细胞80％面积时，用细胞刷刮起细胞，注射器反复推注破碎细胞释放弓形虫，收集弓形虫继续进行氯霉素筛选传代，当敲除虫体的发光率稳定时，说明替换模板已成功插入弓形虫的基因组中，然后通过有限稀释法进行单克隆虫株的筛选，接种到96孔板内培养，直至虫株长成噬斑，挑出UP基因缺失的单克隆抗性虫株进行扩大培养，提取敲除虫株的基因组，利用引物UP 5-F/R和UP 3-F/R进行重组同源臂上下游PCR鉴定，利用引物UP I1-F/R和UP I2-F/R进行内源性UP位点缺失PCR鉴定，ΔUP虫株UP 5’UTR上游鉴定为阳性。ΔUP虫株UP 3’UTR下游鉴定为阴性，ΔUP虫株UP内部基因鉴定为阴性，ΔUP虫株UP内部基因鉴定为阴性，对照ΔKu80虫株UP 5’UTR上游鉴定为阴性，对照ΔKu80虫株UP 3’UTR下游鉴定为阴性，对照ΔKu80虫株UP内部基因鉴定为阳性，对照ΔKu80虫株UP内部基因鉴定为阳性(见图9)。鉴定正确的敲除虫株ΔUP用于OMDPC基因敲除。

引物序列：

UP 5-F：TCGAACAAAGATCCCGTGGCGTGG

UP 5-R：CCAGCTCACCGTCTTTCATTGCCA

UP 3-F：GCAAGGGCGAGGAGGATAACATGG

UP 3-R：TTCGAGGCAACGACGCCTGCTTCAT

UP I1-F：TGTCCTGTGGTTGTGTGTTTGTCG

UP I1-R：GCTTTCTGCCTCTTTACAACCGTG

UP I2-F：GGCGTCTGCGCTGTTATGTTAATC

UP I2-R：CTAAACGCGACACACACACACACAC

1.1.3敲除虫株ΔOMDPCΔUP(NRTUAs)的获得与筛选鉴定

将弓形虫ΔUP虫株进行富集和纯化，溶于适量电转液，使虫体的终浓度为2×10⁷个/mL。调节电转仪，参数为2050V电压，电阻无穷大，电容25μF，使用4mm电转杯。取700μL虫体加入电转杯中，将10μg敲除质粒和50μg同源重组模板加入电转杯中混匀，将电转杯放入安全操作池，启动程序，电转完毕后，电转杯静止20min。将电转完毕的弓形虫加入新鲜培养的HFF细胞中，细胞培养液中含250μM尿嘧啶(之后如未做说明，后续与基因缺失株相关的培养基中均含有250μM尿嘧啶)。培养12h时，可以在敲除虫体的细胞核内观察到Cas9-eGFP瞬时表达而产生的绿色荧光，更换细胞培养液，加入浓度为1μm的乙胺嘧啶进行初步筛选，接种后每天观察各孔虫株生长状态，传至第三代时，可以观察到黄色荧光、红色荧光(见图8B)和噬斑出现；当黄色荧光、红色荧光和噬斑出现比例占细胞80％面积时，用细胞刷刮起细胞，注射器反复推注破碎细胞释放弓形虫，收集弓形虫继续进行乙胺嘧啶筛选传代，当敲除虫体的发光率稳定时，说明替换模板已成功插入弓形虫的基因组中，然后通过有限稀释法进行单克隆虫株的筛选，接种到96孔板内培养，直至虫株长成噬斑，挑出ΔOMDPCΔUP基因缺失的单克隆抗性虫株进行扩大培养，提取敲除虫株的基因组，利用引物OMDPC 5-F/R和OMDPC 3-F/R进行重组同源臂上下游PCR鉴定，利用引物OMDPC I1-F/R和OMDPC I2-F/R进行内源性OMDPC位点缺失PCR鉴定。ΔOMDPCΔUP(NRTUAs)虫株OMDPC 5’UTR上游鉴定为阳性，NRTUAs虫株OMDPC 3’UTR下游鉴定为阳性，NRTUAs虫株OMDPC内部基因鉴定为阴性，NRTUAs虫株OMDPC内部基因鉴定为阴性，对照ΔUP虫株OMDPC 5’UTR上游鉴定为阴性，对照ΔUP虫株OMDPC 3’UTR下游鉴定为阴性，对照ΔUP虫株OMDPC内部基因鉴定为阳性，对照ΔUP虫株OMDPC内部基因鉴定为阳性(见图10)。鉴定正确的敲除虫株NRTUAs用于后续实验。

引物序列：

OMDPC I1-F：CGGTAGATTCCTTGCTCACAGTCG

OMDPC I1-R：GAAGAATAGGAACATCGTCGGGAA

OMDPC I2-F：CCCGAAACGCAGGAACCATAGAAG

OMDPC I2-R：GATCTGTTCTCTGTATGCGTTAGC

OMDPC 5-F：TTACGAGTGAGAACACCTTTCTAGATTGAA

OMDPC 5-R：TTTTTGTCACACGACGAAAGTGTTTGAAAT

OMDPC 3-F：TGAACTTCAAGATCCGCCACAACAT

OMDPC 3-R：TTTCGTGTTTCCAGGTCGCTCACTGTTT

1.2NRTUAs免疫对家禽的临床症状、生长发育与致病性的影响

7日龄雏鸡适应性喂养3天，随机分为3组，每组10只，实验组皮下注射0.1mLNRTUAs虫株10⁶个/只，感染对照组皮下注射等量ΔKu80虫株，空白对照组皮下注射等量生理盐水，每日称重，观察雏鸡的临床症状，期间各组有死亡的雏鸡立即进行剖检，在实验第33天，采集各组雏鸡的心、肝、脾、肺、肾并称重，计算器官指数并进行组织固定，最后开展病理组织切片制备和观察。实验数据利用Graphad Prism软件进行统计与分析，图表用GraphadPrism软件绘制，以

表示。

各组雏鸡在整个实验周期内无死亡，也无临床症状，体重变化趋势相近，仅在实验第20、23、27、33天，空白对照组显著高于感染对照组(P<0.05)，实验第33天，实验组极显著高于感染对照组(P<0.01)，其他各时期体重差异不显著(P>0.05)(见图11)，说明NRTUAs通过皮下注射途径免疫雏鸡不会影响雏鸡的生长。由于雏鸡对弓形虫的感染不是十分敏感，因此，各组雏鸡在整个实验中未出现死亡，但是在实验的后期，感染对照组的体重会有明显的下降，说明弓形虫感染会影响雏鸡的生长，而NRTUAs由于不能在雏鸡体内增殖，对雏鸡的致病性大大降低，不会影响雏鸡的生长。

对雏鸡进行剖检观察，各组雏鸡的心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏无明显的眼观病理变化，说明NRTUAs通过皮下注射途径免疫雏鸡不会对雏鸡的器官造成可见的病理损伤(见图12)。对器官指数进行分析，心脏指数，各组相比差异不显著(P>0.05)；肝脏指数、脾脏指数、肺脏指数和肾脏指数同肝脏指数，说明NRTUAs通过皮下注射途径免疫雏鸡不会影响雏鸡的器官发育(见图13)。对雏鸡的器官进行病理组织学观察，发现感染对照组的雏鸡，其肝脏出血、局灶性坏死，有一定的炎症反应，肺脏出血并出现一定程度的炎症反应，脾脏轻度出血，除此之外，各组雏鸡的其他器官组织未发现病变(见图14)，说明NRTUAs通过皮下注射途径免疫雏鸡不会对雏鸡的器官造成病理损伤。

NRTUAs对雏鸡从生长、器官发育还是器官的致病性方面都无影响，显示出良好的使用安全性。

1.3NRTUAs对新城疫弱毒疫苗的免疫增效作用

1.3.1NRTUAs对新城疫弱毒疫苗的体液免疫应答的影响

7日龄雏鸡适应性喂养3天，然后随机分为3组，每组10只，实验组皮下注射0.1mLNRTUAs虫株10⁵个/只，免疫对照组和空白对照组分别皮下注射等量的生理盐水。然后实验组和免疫对照组分别免疫新城疫Ⅳ系疫苗，免疫剂量10^6.0EID₅₀/只，免疫途径为滴鼻、点眼，空白对照组免疫等量的生理盐水。在免疫后0、7、14、21和28天，各组鸡只翅静脉采血，将血液分离血清，利用血凝(HA)试验和血凝抑制(HI)试验检测血清中新城疫的抗体效价。实验数据利用Graphad Prism软件进行统计与分析，图表用Graphad Prism软件绘制，以

表示。

由于空白对照组未免疫新城疫疫苗，其针对新城疫的抗体水平逐渐下降，与此同时，实验组和免疫对照组的新城疫抗体水平在免疫后逐渐上升，在免疫后第21天达到最高。此外，在免疫后第14天，实验组的新城疫抗体水平极显著高于免疫对照组(P<0.01)，在免疫后第21天，实验组的新城疫抗体水平显著高于免疫对照组(P<0.05)，在免疫后第28天，实验组的新城疫抗体水平极显著高于免疫对照组(P<0.01)(见图15)。可见，在NRTUAs的作用下，雏鸡的新城疫抗体水平得到一定程度的提高，并且能够维持高水平抗体在体内存续的时间。

1.3.2NRTUAs对新城疫弱毒疫苗免疫后外周血淋巴细胞增殖能力的影响

参照1.3.1的免疫程序，在免疫后第14、21、28天对各组鸡只进行翅静脉采血，采用鸡外周血淋巴细胞分离液试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，货号：P8740)提取鸡外周血淋巴细胞，用1640完全培养液将淋巴细胞浓度调整为1×10⁶个/mL，并将细胞悬液加入96孔板，200μL/孔，实验孔加入工作浓度为2μg/mL的伴刀豆凝集素A(ConA)，阴性对照孔不加ConA，空白对照孔不加细胞，只有200μL 1640完全培养液。混匀后置于37℃，5％CO₂培养箱，48h后每孔加入10μL噻唑蓝(MTT)，继续放入培养箱培养4h，然后吸取上清100μL/孔，并加入二甲基亚砜(DMSO)100μL/孔，静置20min，酶标仪设定OD值为490，读取每孔吸光度，并计算刺激指数。实验数据利用Graphad Prism软件进行统计与分析，图表用Graphad Prism软件绘制，以

表示。

刺激指数(stimulation index，SI)＝(实验孔OD-空白对照孔OD)/(阴性对照孔OD-空白对照孔OD)

由于空白对照组未免疫新城疫疫苗，其外周血淋巴细胞的增殖能力变化不大，与此同时，由于新城疫疫苗的免疫作用，实验组和免疫对照组的外周血淋巴细胞的增殖能力极显著高于空白对照组(P<0.01)。在免疫后第14天，实验组的外周血淋巴细胞的增殖能力极显著高于免疫对照组(P<0.01)，在免疫后第28天，实验组的外周血淋巴细胞的增殖能力极显著高于免疫对照组(P<0.01)(见图16)。淋巴细胞增殖能力是评价细胞免疫的一个重要指标，而NRTUAs通过激活CD8α⁺树突状细胞，增强抗原递呈来刺激CD4⁺和CD8⁺T细胞的成熟，进而诱导强烈的细胞性免疫应答。可见，NRTUAs皮下免疫能够使雏鸡的外周血淋巴细胞的增殖能力得到一定程度的提高。

1.3.3NRTUAs对新城疫弱毒疫苗免疫后血清中细胞因子含量的影响

参照1.3.1的免疫程序，在免疫后第14、21、28天对各组鸡只进行翅静脉采血，分离血清，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒检测血清中细胞因子IL-4和INF-γ的含量，按照说明书方法和步骤进行测定。试剂盒由上海润裕生物科技有限公司提供。实验数据利用GraphadPrism软件进行统计与分析，图表用GraphadPrism软件绘制，以

表示。

由于空白对照组未免疫新城疫疫苗，其血清中IL-4和INF-γ的含量逐渐减少，与此同时，由于新城疫疫苗的免疫作用，实验组和免疫对照组的血清中IL-4和INF-γ的含量显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)高于空白对照组。

在免疫后第21天，实验组的血清中IL-4的含量极显著高于免疫对照组(P<0.01)，在免疫后第28天，实验组的血清中IL-4的含量极显著高于免疫对照组(P<0.01)(见图17)。IL-4是静止的B细胞增殖的辅助因子，是辅助性T细胞分化成Th2型细胞的主要细胞因子，主要参与体液免疫反应。NRTUAs皮下免疫能够使雏鸡血清中IL-4的含量得到一定程度的提高，促进活化B细胞增殖并提高血清中的抗体水平。

在免疫后第14天，实验组的血清中INF-γ的含量显著高于免疫对照组(P<0.05)，在免疫后第21天，实验组的血清中INF-γ的含量极显著高于免疫对照组(P<0.01)，免疫后第28天，实验组的血清中INF-γ的含量显著高于免疫对照组(P<0.05)(见图18)。IFN-γ是由Th1型细胞产生，主要参与细胞介导的免疫反应。NRTUAs皮下免疫能够使雏鸡血清中INF-γ的含量得到一定程度的提高，进而促进细胞免疫反应，刺激T细胞、B细胞增殖和B细胞抗体的分泌，提高血清中的抗体水平。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

序列表

<110> 天津农学院

<120> 一种非复制型弓形虫在作为和/或制备禽用免疫增强剂方面中的应用

<160> 28

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 47

<212> DNA

<213> KO UP-F1(Unknown)

<400> 1

atgaccatga ttacgcctac gtatgtttaa gtcgagcagt tttactt 47

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> KO UP-R1(Unknown)

<400> 2

aacgcggaca tgcatatcga aacgtttctt cacttttgtt tg 42

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> KO UP-F2(Unknown)

<400> 3

actgtagcct gccagaacac atgaattcaa atgatgcgtt tcat 44

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> KO UP-R2(Unknown)

<400> 4

tatagggcga attggatatc caaaaacaaa tgggcgaaga aata 44

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> gUP-F(Unknown)

<400> 5

ccacatgggt caatacacaa gacagcta 28

<210> 6

<211> 51

<212> DNA

<213> gUP-R(Unknown)

<400> 6

ttctagctct aaaacccgtc gtgatgtatg cgtaatgcaa cttgacatcc c 51

<210> 7

<211> 51

<212> DNA

<213> KO OMDPC-F1(Unknown)

<400> 7

atgaccatga ttacgcctac gtaagaaaaa gtctacgaaa aagtcaaatt t 51

<210> 8

<211> 46

<212> DNA

<213> KO OMDPC-R1(Unknown)

<400> 8

aattcgccct atagtgagtc tcaattgtca cggaaaaatg tctgta 46

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> KO OMDPC-F2(Unknown)

<400> 9

actgtagcct gccagaacac tgactctggt ctacattaaa 40

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> KO OMDPC-R2(Unknown)

<400> 10

tatagggcga attggatatc aaaacgtgcc cggttttctc 40

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> gOMDPC-F(Unknown)

<400> 11

ccacatgggt caatacacaa gacagcta 28

<210> 12

<211> 49

<212> DNA

<213> gOMDPC-R(Unknown)

<400> 12

ttctagctct aaaacgtcgt gatatgccac gagagaaact tgacatccc 49

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> UP 5-F(Unknown)

<400> 13

tcgaacaaag atcccgtggc gtgg 24

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> UP 5-R(Unknown)

<400> 14

ccagctcacc gtctttcatt gcca 24

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> UP 3-F(Unknown)

<400> 15

gcaagggcga ggaggataac atgg 24

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> UP 3-R(Unknown)

<400> 16

ttcgaggcaa cgacgcctgc ttcat 25

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> UP I1-F(Unknown)

<400> 17

tgtcctgtgg ttgtgtgttt gtcg 24

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> UP I1-R(Unknown)

<400> 18

gctttctgcc tctttacaac cgtg 24

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> UP I2-F(Unknown)

<400> 19

ggcgtctgcg ctgttatgtt aatc 24

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<211> 25

<212> DNA

<213> UP I2-R(Unknown)

<400> 20

ctaaacgcga cacacacaca cacac 25

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> OMDPC I1-F(Unknown)

<400> 21

cggtagattc cttgctcaca gtcg 24

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> OMDPC I1-R(Unknown)

<400> 22

gaagaatagg aacatcgtcg ggaa 24

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> OMDPC I2-F(Unknown)

<400> 23

cccgaaacgc aggaaccata gaag 24

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> OMDPC I2-R(Unknown)

<400> 24

gatctgttct ctgtatgcgt tagc 24

<210> 25

<211> 30

<212> DNA

<213> OMDPC 5-F(Unknown)

<400> 25

ttacgagtga gaacaccttt ctagattgaa 30

<210> 26

<211> 30

<212> DNA

<213> OMDPC 5-R(Unknown)

<400> 26

tttttgtcac acgacgaaag tgtttgaaat 30

<210> 27

<211> 25

<212> DNA

<213> OMDPC 3-F(Unknown)

<400> 27

tgaacttcaa gatccgccac aacat 25

<210> 28

<211> 28

<212> DNA

<213> OMDPC 3-R(Unknown)

<400> 28

tttcgtgttt ccaggtcgct cactgttt 28

Claims (10)

1.一种非复制型弓形虫在作为禽用免疫增强剂方面中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述非复制型弓形虫为将弓形虫的乳清酸核苷-5’-单磷酸脱羧酶基因和尿嘧啶核苷磷酸化酶基因进行双敲除而获得的非复制型尿嘧啶营养缺陷型弓形虫。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：利用CRISPR/CAS9技术将弓形虫的乳清酸核苷-5’-单磷酸脱羧酶基因和尿嘧啶核苷磷酸化酶基因进行双敲除。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：当非复制型弓形虫的用量为0.1mL非复制型弓形虫虫株10⁶个/只禽时，非复制型弓形虫不影响雏鸡的生长发育，病理剖检没有可见病变，病理组织学观察未见异常；

或者，当非复制型弓形虫的用量为0.1mL非复制型弓形虫虫株10⁵个/只禽时，能够提高禽的外周血淋巴细胞的增殖能力，能够提高禽的血清中IL-4的含量，能够促进活化禽的B细胞增殖并提高血清中的抗体水平，能提高雏鸡血清中INF-γ的含量，能够刺激T细胞、B细胞增殖和B细胞抗体的分泌，提高血清中的抗体水平。

5.根据权利要求1至4任一项所述的应用，其特征在于：所述非复制型弓形虫的用量为：0.1mLNRTUAs虫株10⁵个/只禽。

6.一种非复制型弓形虫在制备禽用免疫增强剂方面中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述非复制型弓形虫为将弓形虫的乳清酸核苷-5’-单磷酸脱羧酶基因和尿嘧啶核苷磷酸化酶基因进行双敲除而获得的非复制型尿嘧啶营养缺陷型弓形虫。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：利用CRISPR/CAS9技术将弓形虫的乳清酸核苷-5’-单磷酸脱羧酶基因和尿嘧啶核苷磷酸化酶基因进行双敲除。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：当非复制型弓形虫的用量为0.1mL非复制型弓形虫虫株10⁶个/只禽时，非复制型弓形虫不影响雏鸡的生长发育，病理剖检没有可见病变，病理组织学观察未见异常；

或者，当非复制型弓形虫的用量为0.1mL非复制型弓形虫虫株10⁵个/只禽时，能够提高禽的外周血淋巴细胞的增殖能力，能够提高禽的血清中IL-4的含量，能够促进活化禽的B细胞增殖并提高血清中的抗体水平，能提高雏鸡血清中INF-γ的含量，能够刺激T细胞、B细胞增殖和B细胞抗体的分泌，提高血清中的抗体水平。

10.根据权利要求6至9任一项所述的应用，其特征在于：所述非复制型弓形虫的用量为：0.1mLNRTUAs虫株10⁵个/只禽。

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