CN102154418B - 一种动物干扰素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种制备动物干扰素的方法。本发明方法的实施步骤如下：(1)无菌采取实验鸡脾脏，用脾脏制备淋巴细胞悬液，加入10μg/ml卡那霉素，用配置好的培养液稀释淋巴细胞悬液；(2)鸡脾淋巴细胞中加入为每ml含105少量干扰素，于37℃水浴培养0.5-2小时；(3)再加入黄芪多糖，使其最终浓度为25-100μg/ml，于37℃水浴培养1-2小时；(4)然后在上述鸡脾淋巴细胞悬液中再加入适量干扰素诱生剂仙台病毒；(5)待干扰素达到高峰值时，离心收集上清，即得粗制动物干扰素。该方法生产的干扰素含量高，生产成本明显降低。
Description
技术领域
本发明属于动物医药领域，特别涉及一种制备动物干扰素的方法。
背景技术
鸡病毒性疾病仍是当前严重制约养鸡业健康发展的主要传染病。而传统的传染病治疗方案临床上有时难以凑效，尤其针对病毒病办法不多。鸡病毒性疾病至今尚无有效的治疗药物和治疗方法。近年来曾经有人进行过用中草药制剂预防和治疗鸡病毒性疾病的试验，但治愈率较低。抗生素及磺胺类药物基本无效。目前，鸡干扰素是治疗鸡病毒性疾病的有效药物。
存在的问题是：在鸡干扰素的生产中使用常规用鸡新城疫病毒(NDV)诱导鸡脾白细胞产生干扰素含量较低，但没有人用仙台病毒作为干扰素诱导剂。另外采集无菌鸡脾比较困难。
黄芪多糖是一种具有新型免疫调节作用物质，能刺激人体免疫系统的功能，诱生和促生干扰素产生，也是一种的鸡脾淋巴细胞调节素。黄芪多糖具有增强免疫力、抗肿瘤、抗病毒、抗放射、保肝、催眠等广泛的药理活性，能诱生与促诱生人血细胞产生干扰素-a(IFN-a)，干扰素-r(IFN-r)，鸡脾淋巴细胞介素-2(IL-2)，鸡脾淋巴细胞介素-6(IL-6)，肿瘤坏死因子-a(TNF-a)，与粒一巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等多种细胞活性因子。黄芪多糖是一种新型的生物反应调节剂，具有间接抗病毒、抗肿瘤作用。
但有关利用仙台病毒和黄芪多糖作复合干扰素诱导剂高效制备干扰素的方法目前还未见报道。
因此，提供一种简单工艺方法生产含量高、制备成本低的高效生产动物干扰素的方法，是该技术领域科研人员急需开发的新课题之一。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术中的不足之处，提供一种动物干扰素的制备方法。
为实现上述目的本发明所采用的技术方案如下：
一种动物干扰素的制备方法，具体实施步骤如下：
(1)无菌采取实验鸡脾脏，用脾脏制备淋巴细胞悬液，加入10μg/ml卡那霉素，用配置好的培养液稀释淋巴细胞悬液，使鸡脾淋巴细胞浓度稀释为每ml含1×105-1×107；；
(2)对淋巴细胞单层进行传代培养；
(3)鸡脾淋巴细胞中加入少量干扰素，使其最终浓度为100-1000IU/ml，于37℃水浴培养0.5-2小时；
(4)再加入黄芪多糖，使其最终浓度为25-100μg/ml，于37℃水浴培养1-2小时；
(5)然后在上述鸡脾淋巴细胞悬液中再加入适量干扰素诱生剂仙台病毒，使其最终浓度为128-1280血凝单位/ml，37℃摇床培养18-24小时；
(6)待干扰素达到高峰值时，离心收集上清，加入盐酸调至pH2.0，4.0℃，放置1-4天，灭活病毒，再加NaOH调至pH 7.0，即得粗制动物干扰素。
本发明的有益效果是：鸡基因工程干扰素具有制备成本高，在临床推广中受到很到限制。本发明利用鸡脾制备动物干扰素的方法：其具有很多优点：生产工艺简单、制备成本低，疗效好。常规用NDV-F诱导鸡脾淋巴细胞产生干扰素含量低。
本发明在仙台病毒诱导干扰素过程中加入黄芪多糖，显著提高利用鸡脾制备动物干扰素的含量，显著降低了药物的成本。本产品注入鸡机体后，具有疗效好、安全可靠、用量低、无毒副作用和成本低等优点。
具体实施方式
以下结合实施例，对依据本发明提供的具体实施方式详述如下：
实施例1
一种动物干扰素的制备方法的具体步骤如下：
(1)鸡脾淋巴细胞制备
无菌采取实验鸡脾脏，用脾脏制备淋巴细胞悬液，加入10μg/ml卡那霉素，用配置好的培养液稀释淋巴细胞悬液，使鸡脾淋巴细胞浓度稀释为每ml含1×106。鸡脾淋巴细胞的分离应在采集后48小时内进行。活细胞数应达到90％以上。并对淋巴细胞单层进行传代培养；使鸡脾淋巴细胞浓度稀释为每ml含1×106。鸡脾淋巴细胞的分离应在制备后48小时内进行。活细胞数应达到90％以上。
(2)诱生病毒
采用仙台病毒，血凝效价达到适宜滴度方可投产。
(3)培养液
采用细胞培养基RPMI-1640，内含5-10％牛血清和10μg/ml卡那霉素或庆大霉素，也可用其它适宜培养液。
(4)生产用原水应符合饮用水标准，直接用于制品的水应符合注射用水标准。
(5)粗制干扰素的制备工艺
(5.1)诱生病毒的制备
采用9-10日龄健康鸡胚，于每胚的尿囊腔内接种适量仙台病毒，37℃培养48-72小时，鸡胚发育良好，病毒达到适宜滴度后，收集尿囊液，并做无菌试验，检验合格后合并，抽样做效价测定，放-20℃待用；
(5.2)鸡脾淋巴细胞悬液
用离心法分离血浆，吸取鸡脾淋巴细胞层，然后用步骤(3)中配置的培养液稀释，以每ml含5×106为宜；
(5.3)起动与诱生
鸡脾淋巴细胞悬液中加入少许干扰素，使其最终浓度为600IU/ml，于37℃水浴培养0.5小时，再加入黄芪多糖，使其最终浓度为100μg/ml，于37℃水浴培养1.5小时；
(5.4)再加入1024血凝单位/ml仙台病毒进行诱生，待干扰素达到高峰值时，收集上清，将上清经酸化和中性化后灭活病毒，即为粗制动物干扰素；
(5.5)待干扰素达到高峰值时，离心收集上清，加入盐酸调至pH2.0，4.0℃，放置2天，灭活病毒，再加NaOH调至pH7.0，即得粗制动物干扰素；
(5.6)离心收集上清即得粗制干扰素，放-20℃保存；
(5.7)留样分别作无菌试验、余毒试验及安全检验，并以微量法滴定干扰素效价。通过此法制备的鸡粗制干扰素共1次，2个批号，获得了高产量干扰素，平均效价为21600IU/ml。不加入黄芪多糖的常规诱生组干扰素平均效价低于8450IU/ml。
干扰素效价测定：采用CPE(细胞致病效应)抑制为基础的抑制微量测定法，以每ml干扰素检品的最高稀释度仍能保护半数细胞人羊膜细胞Wish细胞(50)免受水泡性口腔炎病毒攻击的稀释度的倒数定为干扰素单位。以国际单位(IU)表示，并用国家标准品校正结果。
半成品和成品的检验：
半成品检定：半成品进行细菌内毒素、无菌检查、pH值等项检测。
成品检定：成品分别作干扰素的鉴别试验、外观检测、pH值、特异活性试验、蛋白质反应、无菌检查、细菌内毒素、异常毒性等项检验。
实施例2
一种动物干扰素的制备方法的具体步骤如下：
(1)无菌采取实验鸡脾脏，用脾脏制备淋巴细胞悬液，10μg/ml青霉素、链霉素，用配置好的1640培养基稀释细胞沉淀物，使鸡脾淋巴细胞浓度稀释为每ml含1×107。
(2)在鸡脾淋巴细胞悬液中加入8％鸡血浆，混匀。
(3)在上述鸡脾淋巴细胞悬液中加入少许干扰素，使其最终浓度为200-300IU/ml，于37℃水浴培养1小时。
(4)再加入黄芪多糖，使其最终浓度为25μg/ml；于37℃水浴培养2小时。
(5)在启动的鸡脾淋巴细胞悬液中再加入512血凝单位/ml仙台病毒进行诱生，37℃摇床培养12-24小时。
(6)待干扰素达到高峰值时，以3000rpm离心，离心收集上清，加入盐酸调至pH2.0，4.0℃，放置4天，灭活病毒，再加NaOH调至pH7.0，即得粗制鸡细胞干扰素。留样测定干扰素效价，通过此法制备的鸡粗制干扰素共2次，4个批号，获得了高产量干扰素，平均效价为19700IU/ml。不加入黄芪多糖的常规诱生组干扰素平均效价为11750IU/ml。
半成品和成品的检验：
半成品检定：半成品进行细菌内毒素、无菌检查、pH值等项检测。
成品检定：成品分别作干扰素的鉴别试验、外观检测、pH值、特异活性试验、蛋白质反应、无菌检查、细菌内毒素、异常毒性等项检验。
实施例3
一种动物干扰素的制备方法，具体步骤如下：
(1)无菌采取实验鸡脾脏，用脾脏制备淋巴细胞悬液，加入10μg/ml卡那霉素，4.0℃冰箱放置。用配置好的培养液稀释细胞沉淀物，使鸡脾淋巴细胞浓度稀释为每ml含1×105。
(2)鸡脾淋巴细胞悬液中加入少许干扰素，使其最终浓度为800IU/ml，于37℃水浴培养2小时。
(3)再加入黄芪多糖，使其最终浓度为50μg/ml，于37℃水浴培养2小时。
(4)在启动的鸡脾淋巴细胞悬液中再加入256-1280血凝单位/ml仙台病毒进行诱生，同时在鸡脾淋巴细胞悬液中加入含5％牛血清的DMEM培养基，37℃摇床培养12-24小时。
(5)待干扰素达到高峰值时，以3000rpm离心，收集上清即得粗制动物干扰素。留样测定干扰素效加，通过此法制备的鸡粗制干扰素共2次，3个批号，平均效价为18900IU/ml。不加入黄芪多糖的常规诱生组干扰素平均效价为13400IU/ml。
半成品和成品的检验：
半成品检定：半成品进行细菌内毒素、无菌检查、pH值等项检测。
成品检定：成品分别作干扰素的鉴别试验、外观检测、pH值、特异活性试验、蛋白质反应、无菌检查、细菌内毒素、异常毒性等项检验。
使用该制备方法生产的干扰素含量高，显著降低了生产成本。具体方法如下：首先取鸡脾脏，用脾脏制备淋巴细胞悬液，使用仙台病毒和黄芪多糖作为复合干扰素诱生剂诱导健康动物干扰素，其包括有鸡脾淋巴细胞悬液、启动干扰素、病毒液和培养液，经原料制备→混和→水浴搅拌、诱导培养→离心收获→灭活病毒→解冻除菌→分装→成品包装工序制成，制成的动物干扰素。留样分别作无菌试验、余毒试验及安全检验。通过此法制备的鸡粗制干扰素共3次，4个批号，获得了高产量干扰素，平均效价大于30720IU/ml，无菌试验、余毒试验均阴性，动物体内注射后均健康存活，无不良反应。
本发明制备的动物干扰素具有治疗鸡病毒性疾病等病毒病作用，同时对细菌性疾病也有治疗作用。用于防治鸡疾病。如鸡法氏囊病、鸡新城疫病、鸡传染性支气管炎等疾病。注射用法与用量：小鸡0.002万-0.02万IU/只/天，育成鸡0.004万-0.04万IU/头/天。每日注射1次，一个疗程3次，病重用量略加。
通过本发明获得了高产量干扰素，通过此法制备的鸡粗制干扰素共7次，6个批号，其中4个批号效价在31200IU/ml以上(最高达40960IU/ml)；其余效价在10120IU/ml以上。平均效价约为24230IU/ml，使用该制备方法生产的干扰素含量高，显著降低了生产成本。
留样干扰素无菌试验、余毒试验均阴性，动物体内注射后均健康存活，无不良反应。副作用，对鸡病毒性传染性疾病有良好治疗效果。本发明是一种广谱抗病毒制剂，主要治疗鸡病毒性疾病，例如鸡法氏囊病、鸡瘟、鸡传染性支气管炎和鸡新城疫病等。通过注射或口服该制剂，使其与机体细胞发生反应，诱导细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制病毒的繁殖，起到抗病毒作用。
临床实验证明：
利用本发明研制的动物干扰素治疗鸡法氏囊病、鸡传染性支气管炎和鸡新城疫病等鸡疾病共2819头，治愈2545头，治愈率达90.1％；其中特别是治疗鸡法氏囊病有效率达96.2％，治愈率高达91.6％，效果非常显著。
上述参照实施例对该高效生产动物干扰素的方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种动物干扰素的制备方法，其特征在于具体实施步骤如下：
(1)无菌采取实验鸡脾脏，用脾脏制备淋巴细胞悬液，加入10μg/ml卡那霉素，用配置好的培养液稀释淋巴细胞悬液，使鸡脾淋巴细胞浓度稀释为每ml含1×105-1×107；
(2)对淋巴细胞单层进行传代培养；
(3)鸡脾淋巴细胞中加入少量干扰素，使其最终浓度为100-1000IU/ml，于37℃水浴培养0.5-2小时；
(4)再加入黄芪多糖，使其最终浓度为25-100μg/ml，于37℃水浴培养1-2小时；
(5)然后在上述鸡脾淋巴细胞悬液中再加入适量干扰素诱生剂仙台病毒，使其最终浓度为128-1280血凝单位/ml，37℃条件下旋转培养18-24小时；
(6)待干扰素达到高峰值时，离心收集上清，加入盐酸调至pH2.0，4.0℃，放置1-4天，灭活病毒，再加NaOH调至pH 7.0，即得粗制动物干扰素。
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