CN110876759A

CN110876759A - M基因突变的水疱型口炎病毒在抗肿瘤药物中的应用

Info

Publication number: CN110876759A
Application number: CN201811038927.9A
Authority: CN
Inventors: 楼建华
Original assignee: Nanjing Perfect Medical Technology Co Ltd
Current assignee: Nanjing Perfect Medical Technology Co Ltd
Priority date: 2018-09-06
Filing date: 2018-09-06
Publication date: 2020-03-13

Abstract

本发明提供一种M基因突变的水疱型口炎病毒在抗肿瘤药物中的应用，其中，M基因突变位点为氨基酸位点M51R、V221F和S226R；所述应用具体为M基因突变的水疱型口炎病毒在抗肿瘤药物中改善水疱型口炎病毒溶瘤效果。本发明在黑色素瘤模型和皮下注射Lewis肺癌细胞建立的小鼠肺癌模型中，通过比较给予M基因突变水疱型口炎病毒治疗的荷瘤小鼠和野生型病毒治疗的荷瘤小鼠，发现本发明能够有效缓解小鼠肿瘤大小和提高小鼠生存率；本发明在治疗抗肿瘤溶瘤病毒的药物研发及生产中，具有重要的应用推广价值。

Description

M基因突变的水疱型口炎病毒在抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物基因技术领域，涉及M基因突变的水疱型口炎病毒在抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

肿瘤是指机体在内界或者外界致癌因素作用下，局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性无限增生而形成的病变。学界一般将肿瘤分为良性和恶性两大类，恶性肿瘤就是癌症。

传统肿瘤治疗以手术、放疗、化疗、靶向为主，以上方法各有优缺点。外科切除是最早应用的治疗癌症的方法，也是目前许多早期癌症治疗的首选疗法。化学治疗利用化学药物阻止癌细胞的增殖、浸润、转移，直至最终杀灭癌细胞的一种治疗的方式；放射治疗随着放疗作用越来越大，癌症治愈患者中的近一半归功于放疗，但是上述两种治疗对正常细胞和肿瘤细胞均会产生杀伤作用，对患者毒副作用较大。靶向治疗会有针对性的杀死癌细胞，精准而且温和，不会波及正常细胞，副作用较小，但是靶向治疗对于特定癌症，需要有靶向位点药物，且癌细胞在一段时间后可能对靶向药物产生耐药性。

免疫疗法继手术、化疗、放疗、靶向治疗后肿瘤治疗领域的一场革新。目前免疫疗法包括细胞治疗、免疫检查点抗体治疗和溶瘤病毒治疗。细胞治疗目前比较流行的是嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，但这种疗法需要比较好的肿瘤抗原作为识别位点，以CD19分子为靶点的CAR-T在血液淋巴瘤中治疗效果较好，在实体肿瘤中还未见显著疗效。以PD-1抗体为代表的免疫检查点抗体治疗是近2年肿瘤治疗领域热点。PD-1抗体能够解除肿瘤局部免疫抑制的微环境，从而使得机体免疫细胞发挥正常的抗肿瘤免疫，在黑色素瘤临床治疗中PD-1抗体的缓解率只有30％左右，疗效与患者本身肿瘤组织是否表达PD-1相关。有研究表明溶瘤病毒T-Vec和PD-1抗体类药物的联合治疗可以大大提高肿瘤治疗的应答率至60-70％。目前有研究报道，可以做为溶瘤病毒的载体包括疱疹病毒、腺病毒、柯萨奇病毒、呼肠孤病毒、弹状病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、痘病毒等。

水疱型口炎病毒(VSV)属于弹状病毒的一种，是单股负链RNA病毒。VSV天然宿主为偶蹄目的动物，如猪、牛、羊等。人感染主要见于实验工作人员和流行地区与家畜接触的人。受感染的动物表现为发热，嗜睡，食欲下降，口腔、乳头、趾间及蹄冠上出现水疱性病灶和腿部的罐状环带。水泡易破裂，露出肉芽组织，呈红色糜烂，周围又刮破的上皮，常在7～10天内完全痊愈。人感染后20～30h开始发作，可能开始于结膜，而后出现流感样症状：冷颤、恶心、呕吐、肌痛、咽炎、结膜炎、淋巴结炎，一般7天后自愈，无并发症及致死。

VSV病毒反向遗传系统的建立为VSV病毒的研究和应用提供了强大的工具。反向遗传操作技术是指通过构建病毒的感染性cDNA分子克隆，从而在DNA分子水平上对其基因组进行改造，进而达到研究病毒的结构与功能的目的。对于负链的RNA病毒，其基因组不具有感染性，仅有感染性的cDNA分子，还不足以获得重组病毒，在进行负链的RNA病毒反向重组时，除了要构建包含病毒的全长cDNA分子克隆外，还需要额外提供病毒反向遗传重组所需要的RNA聚合酶核心。水疱性口炎病毒的反向遗传重组系统正是建立在以下四个质粒基础上:pXN₂、pN、pP、pL。pXN₂包含病毒的全长cDNA序列、T7启动子以及δ肝炎核酶，主要负责提供不包含冗余序列的病毒全长RNA基因组。pP、pN和pL质粒能够提供P、N和L蛋白，以组成RNA聚合酶核心。在pXN₂质粒上有单一限制性内切酶位点xolI和NheI，用于外源基因在VSV基因组的插入，构建重组病毒。VSV病毒M基因是基质蛋白基因，已经有报道M基因可能与宿主I型干扰素抗病毒反应相关，M基因M51R位突变的VSV可以诱导机体更强的I型干扰素反应，另外也有报道M基因V221F和S226R的突变也可以使得病毒的毒力减弱；VSV是一种安全的疫苗载体，用VSV作为溶瘤病毒，在肿瘤治疗方面也已有应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种M基因三点突变的水疱型口炎病毒(VSV_3M)的用途，可作为关键成分应用于抗肿瘤药物中。

为实现上述目的，本发明实施例公开了一种M基因突变的水疱型口炎病毒在抗肿瘤药物中的应用；其中，M基因突变的位点为氨基酸位点M51R、V221F和S226R。

具体地，M基因突变的水疱型口炎病毒在抗肿瘤药物中具有改善水疱型口炎病毒溶瘤效果。

所述的肿瘤为黑色素瘤。

进一步地，上述M基因突变的水疱型口炎病毒在抗黑色素瘤的药物中具有改善水疱型口炎病毒溶瘤效果的应用。

具体地，M基因突变的水疱型口炎病毒应用于黑色素瘤的抗黑色素瘤药物中的过程包括以下步骤：

S1、建立小鼠黑色素瘤模型；

在6-8周龄的Balb/c雌性小鼠中，每只小鼠皮下接种5×10⁵数量的B16小鼠黑色素瘤细胞；

在接种细胞的第8天左右，测量皮下肿瘤的大小，约为40mm³左右。

S2、治疗效果的观察与统计分析；

给予每只小鼠瘤内注射100uL 10⁷PFU剂量的VSV_3M作为实验组；

给予每只小鼠瘤内注射100uL10⁷PFU剂量的野生型VSV作为治疗对照组；

给予每只小鼠瘤内注射100uL PBS作为空白对照组。

给予上述小鼠溶瘤病毒治疗后，在不同时间点分别检测用M基因三点突变的VSV_3M病毒和野生型VSV病毒进行瘤内注射处理的小鼠的肿瘤大小和小鼠存活率,通过T检测统计分析、判断M基因三点突变的VSV_3M病毒对于抗肿瘤效果是否有显著的改善作用。

可选地，所述的肿瘤为肺癌。

进一步地，上述M基因突变的水疱型口炎病毒在抗肺癌的药物中具有改善水疱型口炎病毒溶瘤效果的应用。

进一步地，M基因突变的水疱型口炎病毒应用于肺癌的抗肺癌药物中的过程包括以下具体步骤：

S1、皮下注射LLC肺癌细胞建立小鼠肺癌模型；

在6-8周龄的Balb/c雌性小鼠中，每只小鼠皮下接种10⁶数量的LLC肺癌细胞；

在接种细胞的第10天左右，测量皮下肿瘤的大小，约为40mm³左右；

S2、治疗效果的观察与统计分析；

同样地，给予每只小鼠瘤内注射100uL 10⁷PFU剂量的VSV_3M作为实验组；

给予每只小鼠瘤内注射100uL PBS作为空白对照组。

给予小鼠溶瘤病毒治疗后，在不同时间点分别检测用M基因三点突变的VSV_3M病毒和野生型VSV病毒进行瘤内注射处理的小鼠的肿瘤大小和小鼠存活率,通过T检测统计分析、判断M基因三点突变的VSV_3M病毒对于抗肿瘤效果是否有显著的改善作用。

实验结果表明，本发明具有以下有益效果：本发明提供的以M基因三点突变的VSV_3M是抗肿瘤药物的有效成分；当分别瘤内注射给予肺癌小鼠VSV_3M病毒和野生型病毒并对治疗的结果进行比较，发现本发明能明显的抑制肿瘤生长，提高小鼠生存率；本发明对于抗肿瘤溶瘤病毒的药物研发具有重要的应用推广价值。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施方式及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定；其中：

图1是基因合成XN₂质粒xbaI-mluI片段序列图：

图2是VSV_3M病毒构建示意图；

图3是VSV_3M病毒滴鼻感染小鼠安全性评估体重变化曲线图；

图4是VSV_3M病毒滴鼻感染小鼠安全性评估生存率曲线图；

图5是实施例1中VSV_3M病毒治疗黑色素瘤小鼠肿瘤体积变化图；

图6是实施例1中VSV_3M病毒治疗黑色素瘤小鼠30天生存率图；

图7是实施例2中VSV_3M病毒治疗肺癌小鼠肿瘤体积变化图；

图8是实施例2中VSV_3M病毒治疗肺癌小鼠34天生存率图。

具体实施例

为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请具体实施方式及相应的附图对本申请技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施方式仅是本申请一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本申请中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本申请保护的范围。

下面详细描述本发明的实施方式，所述实施方式的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施方式是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

在具体实施例中，首先构建携带M基因三点突变的VSV_3M病毒，其具体方式为：

如图1所示，利用基因合成技术，合成VSV包装质粒XN₂载体中xbaI和mluI之间酶切片段序列，其中包括M基因，在M基因氨基酸序列分别做如下突变，在M51R，V221F和S226R三个位点上突变。

把基因合成的片段通过酶切连接的方式重新连接到xbaI和MluI酶切过的XN₂载体，得到M基因三点突变的XN₂的包装质粒pXN₂-3M。

如图2所示的VSV_3M基因组结构，N，P，M，G和L为病毒编码基因，在P基因和G基因内部分别有单一酶切位点xbaI和MluI,两者之间为1kb大小，包含了M基因，通过基因合成的方式，合成M基因三点突变的xbaI-MluI片段，序列如图1所示，然后通过克隆连接的方式替换到野生型病毒基因组上，然后包装获得VSV_3M突变病毒。M基因的三点突变如图2所示。

在BHK细胞共转染pXN₂-3M、pN、pP、pL四个质粒，转染第二天可以看到细胞病变，收取细胞培养上清，得到M基因三点突变的VSV_3M病毒，重新感染Vero细胞，感染后收取细胞上清并测定病毒滴度。

进一步地，对于VSV_3M、VSV感染的小鼠体内安全性进行评价，具体评价步骤包括：

取6-8周龄的雌性Balb/c小鼠24只，分3组，每组8只，以滴鼻感染的方式给每只小鼠100uL 10⁶PFU剂量的VSV_3M病毒，和野生型100uL10⁶PFU VSV病毒，以PBS作为空白对照，病毒感染后每天检测各组小鼠的体重和统计各组小鼠生存率。

检测结果如图3和图4所示，实验结果表明，与PBS对照组相比，注射了VSV_3M病毒的小鼠的体重减小明显小于注射了VSV的小鼠，生存率和PBS非感染组一样为100％，即注射了VSV_3M病毒的小鼠全部生存下来，而VSV感染组小鼠有五只小鼠死亡，说明VSV_3M病毒通过M基因的定点突变改造，相对于野生型VSV感染，VSV_3M病毒的安全性在小鼠体内得到了提高，和PBS组相当。

实施例1

本发明实施例公开了一种M基因突变的水疱型口炎病毒在治疗黑色素瘤的抗肿瘤药物中的应用，M基因突变的水疱型口炎病毒在上述抗肿瘤药物中具有改善水疱型口炎病毒溶瘤效果；M基因突变的位点为氨基酸位点M51R、V221F和S226R。所述肿瘤为黑色素瘤。

M基因突变的水疱型口炎病毒应用于黑色素瘤疾病中抗肿瘤药物中的过程包括以下具体步骤：

S1、建立小鼠黑色素瘤模型；

在6-8周龄的Balb/c雌性小鼠中，每只小鼠皮下接种5×10⁵数量的B16小鼠黑色素瘤细胞；在接种细胞的第8天左右，测量皮下肿瘤的大小，约为40mm³左右。

S2、治疗效果的观察与统计分析；

进一步地，评价VSV_3M对于黑色素瘤模型小鼠的治疗作用的具体方式为：

取6-8周龄的雌性Balb/c小鼠36只，皮下接种小鼠B16细胞5×10⁵/只，接种后8天游标卡尺测量皮下肿瘤大小，挑选能够成瘤并且肿瘤大小一致的小鼠作为后续实验小鼠。把成瘤的小鼠分3组，每组10只，给予每只小鼠瘤内注射100uL 10⁷PFU剂量的VSV_3M作为实验组；给予每只小鼠瘤内注射100uL 10⁷PFU剂量的野生型VSV作为治疗对照组；给予每只小鼠瘤内注射100uL PBS作为空白对照组。

肿瘤大小的比较实验结果如图5所示，与PBS对照组相比，注射了VSV_3M病毒的小鼠的黑色素肿瘤生长大小比注射了VSV病毒小鼠要显著减小；在接种后28天后再进一步检测各组小鼠肿瘤大小，VSV_3M组平均大小为1000mm³，明显小于VSV治疗组的平均大小2000mm³，而没有治疗组PBS肿瘤大小超过5000mm³。

如图6所示，VSV_3M治疗组生存率也有了明显的提高，在皮下接种黑色素肿瘤细胞30天的观察期内，采用VSV_3M治疗的实验组生存率为70％，而VSV病毒治疗的治疗对照组的小鼠存活率为30％，而PBS作为空白对照组的小鼠最后全部死亡，说明以注射的方式给予小鼠VSV_3M病毒的治疗，相对于野生型VSV病毒治疗，能够显著的抑制小鼠肿瘤大小和提高小鼠的生存率。

实施例2

本发明实施例公开了一种M基因突变的水疱型口炎病毒在肺癌疾病的抗肿瘤药物中的应用，M基因突变的水疱型口炎病毒在抗肿瘤药物中具有改善水疱型口炎病毒溶瘤效果；M基因突变的位点为氨基酸位点M51R、V221F和S226R。所述肿瘤为肺癌。

M基因突变的水疱型口炎病毒应用于肺癌疾病中抗肿瘤药物中的过程包括以下具体步骤：

S1、皮下注射LLC肺癌细胞建立小鼠肺癌模型；

在6-8周龄的Balb/c雌性小鼠中，每只小鼠皮下接种10⁶数量的LLC肺癌细胞；在接种细胞的第10天左右，测量皮下肿瘤的大小，约为40mm³左右。

S2、治疗效果的观察与统计分析；

进一步地，评价VSV_3M对于LLC肺癌模型小鼠的治疗作用的具体方式为：

取6-8周龄的雌性Balb/c小鼠36只，皮下接种小鼠肺癌细胞数LLC 10⁶/只，接种后10天游标卡尺测量皮下肿瘤大小，挑选能够成瘤并且大小一致的小鼠作为后续实验小鼠。把成瘤的小鼠分3组，每组10只；给予每只小鼠瘤内注射100uL 10⁷PFU剂量的VSV_3M作为实验组；给予每只小鼠瘤内注射100uL10⁷PFU剂量的野生型VSV作为治疗对照组；给予每只小鼠瘤内注射100uL PBS作为空白对照组。

肿瘤大小的比较实验结果如图7所示，与PBS对照组相比，注射了VSV_3M病毒的小鼠的肿瘤生长大小比注射了VSV病毒小鼠要显著减小；在接种后32天后再进一步检测各组小鼠肿瘤大小，VSV_3M组平均大小为160mm³，明显小于VSV治疗组的平均大小960mm³，而没有治疗组PBS肿瘤大小超过3600mm³。

如图8所示，VSV_3M治疗组生存率也有了明显的提高，在皮下接种肿瘤细胞34天的观察期内，采用VSV_3M治疗的实验组生存率为70％，而VSV病毒治疗的治疗对照组的小鼠存活率为50％，而PBS作为空白对照组的小鼠最后全部死亡，说明以注射的方式给予小鼠VSV_3M病毒的治疗，相对于野生型VSV病毒治疗，能够显著的抑制小鼠肿瘤大小和提高小鼠的生存率。

实验结果表明，本发明具有以下有益效果：

本发明提供的以M基因三点突变的VSV_3M是抗肿瘤药物的有效成分；当分别瘤内注射给予患癌小鼠VSV_3M病毒和野生型病毒并对治疗的结果进行比较，发现本发明能明显的抑制肿瘤生长，提高小鼠生存率。需要注意的是，本发明实施例分别通过皮下接种B16小鼠黑色素瘤细胞建立小鼠黑色素瘤模型和通过皮下注射LLC肺癌细胞建立小鼠肺癌模型对小鼠进行瘤内注射和病毒治疗，验证了M基因三点突变的VSV_3M是抗肿瘤药物的有效成分，具有改善水疱型口炎病毒溶瘤效果。

但是在具体实施中，本发明并不限于在上述两种抗肿瘤药物中的应用；M基因突变的水疱型口炎病毒通过在氨基酸位点M51R、V221F和S226R位点三个位点的突变，通过对细胞内普遍存在的IFN-α固有信号分子通路进行调控的机制，实现了改善水疱型口炎病毒溶瘤效果，所以M基因三点突变的VSV_3M在抗肿瘤药物中具有广谱的应用；本发明对于抗肿瘤溶瘤病毒的药物研发具有重要的应用推广价值。

应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.M基因突变的水疱型口炎病毒在抗肿瘤药物中的应用，所述的M基因突变的位点为氨基酸位点M51R、V221F和S226R。

2.根据权利要求1所述的M基因突变的水疱型口炎病毒在抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的应用为M基因突变的水疱型口炎病毒在抗肿瘤药物中改善水疱型口炎病毒溶瘤效果。

3.根据权利要求2所述的M基因突变的水疱型口炎病毒在抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的肿瘤为黑色素瘤。

4.根据权利要求2所述的M基因突变的水疱型口炎病毒在抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的肿瘤为肺癌。