JP7271433B2 - 免疫賦活薬、免疫療法用医薬組成物、ならびにその調製および使用 - Google Patents

Description

関連技術の相互参照
本出願は、「Ａｎ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｕｓｅｓ」という表題の、中国特許庁に２０１７年３月１３日に出願された中国出願第２０１７１００２１６７９．６号の優先権を主張するものであり、その全内容が参照により本出願に援用される。

技術分野
本発明は、生物医学の分野、特に、免疫賦活薬、免疫療法用医薬組成物、ならびにその調製および使用に関する。

栄養学的状況と共に、健康状態および医療レベルは著しく向上し、平均余命は着実に延びた。しかし、Ｂ型肝炎、ＡＩＤＳ、結核などの主な感染性疾患、ならびに他の病原性微生物によって引き起こされる持続性の感染性疾患および腫瘍は、公衆衛生を脅かす主要な問題になってきている。Ｂ型肝炎、ＡＩＤＳおよびＨＰＶ、結核は、世界中で主要な感染性疾患となっている。２００８年の中国衛生部（Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ｏｆ Ｃｈｉｎａ）による統計報告によれば、中国ではＢ型肝炎ウイルスの感染者が９３００万人となり、世界的に全体の３分の１を占めた。こうした患者の一部には、有効な臨床処置が必要であったが、それが不足していた。中国におけるＡＩＤＳ死亡者数は、急激な増加を示し、４年連続で感染性疾患死第１位の座にあった。ＨＩＶ感染は、高リスク集団から一般集団へと拡大する傾向を示している。結核処置における多剤耐性および広範な薬剤耐性は、より深刻な問題となってきている。結核の耐性率は、中国では２８％にまで上っている。ＨＰＶ感染は、２０００年以来ＨＰＶワクチンが利用可能であるという事実にもかかわらず、その他の深刻な公衆衛生問題となっている。加えて、患者において再発性の発作を引き起こすだけでなく、耐性株の根源ともなる、慢性尿路感染症、肺感染症などの、多くの抗療性慢性細菌感染症が存在する。

Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ Ｃｅｎｔｅｒのデータによれば、米国では、がん死亡件数が５０万件を超えており、これは、２０１４年における２番目に多い死亡に相当し、中国では２００９年において６５７万件であり、これは、この年の全死亡件数の２６％に相当していた。がんの発生率は、より若い世代において有意に増加した。中国における肝臓がんの発生率は、２７／１０００００であり、このうち９０％は、Ｂ型肝炎ウイルスによる持続性感染症に関連する。

したがって、持続性感染症および腫瘍のために、経済的および社会的負荷は劇的に増大しており、公衆衛生上の重大な脅威となっている。

中でも、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症は、公衆衛生をひどく脅かすかなり重篤な感染性疾患である。世界中の約２０億人がＨＢＶに感染しており、その中で、約２億４０００万人が慢性に感染しており、毎年約６５万人が、ＨＢＶ感染による肝不全、肝硬変、および肝臓がんで死亡している。中国では、約９３００万人がＨＢＶに慢性感染しており、その中で、約２０００万人が、慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）患者である。ＨＢＶ複製の持続可能かつ有効な阻害、およびＢ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）に対する血清転換は、ＣＨＢの臨床処置の申し分のない終点になると考えられている。

Ｂ型肝炎の臨床処置の際、Ｂ型肝炎抗原（ＨＢｓＡｇ）消失およびＨＢｓＡｇ血清転換は、臨床的治癒（ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｕｒｅ）であると考えられる。したがって、ＣＨＢ患者において、ＨＢｓＡｇに対する血清転換によって臨床的治癒を実現することは、ＣＨＢを処置する手法の目標である。しかし、ＨＢｓＡｇ血清転換離率は、本来、毎年１～２％である。二重盲検無作為化対照臨床コホート研究において、ＨＢｓＡｇ消失は、テノホビルジピボキシル（ｔｅｎｏｆｏｖｉｒ ｄｉｐｉｖｏｘｉｌ）で１年間処置されたＨＢｅＡｇ陽性ＣＨＢ患者のうち３％のみで実現された。別の無作為化対照臨床研究では、順次ＰＥＧ化インターフェロンアルファと共にエンテカビルで３～４年間処置されたＨＢｅＡｇ陽性ＣＨＢ患者のうち８．５％でＨＢｓＡｇ消失が実現された。処置終了後３年の時点で追跡調査した、ＨＢｅＡｇ陰性ＣＨＢ患者についてのＰＥＧ化インターフェロンアルファの１年間の別の無作為化対照試験では、患者の８．７％のＨＢｓＡｇが一掃されていたことがわかった。これらのデータから、ＣＨＢ患者におけるＨＢｓＡｇのクリアランスは、依然として最も難しい課題であることが示された。したがって、Ｂ型肝炎慢性感染症に対抗する新たな薬物および処置を開発することにより、ＨＢＶを治癒させること（ＷＨＯから命じられている）が差し迫って求められている。

Ｂ型肝炎を現在治癒させることのできない主たる理由は、患者におけるＨＢＶ特異的な細胞性免疫機能の喪失または不全によって引き起こされる、ＣＨＢ患者における免疫寛容である。Ｂ型肝炎治療用ワクチンは、Ｂ型肝炎処置の新たな手法であり、ＨＢＶ感染患者の免疫寛容を崩して、ＨＢＶに対する中和抗体および細胞性応答を生じるように患者を再構築または刺激することを狙うものである。現在、ＤＮＡを主体とするワクチン、ＤＣを主体とするワクチン、遺伝子改変タンパク質を主体とするワクチン、および抗原－抗体複合体が、その効力を評価するための臨床研究中である。上記治療用ワクチンに、いくつかの予見できる問題があることは、注目に値する。たとえば、ＤＮＡワクチンには、不十分な免疫原性が関連付けられる。ＤＣワクチンの調製には、患者の内部に戻される、ｉｎ ｖｉｔｒｏで積載がなされた抗原が必要となるため、品質管理の問題および高いコストに加えて、技術的困難がある。既存の臨床結果を根拠として、組換えタンパク質ワクチンには、宿主の細胞性応答を刺激する能力が低いことが関連付けられた。これらの短所はすべて、臨床利益を得るためにＣＨＢ処置に必要となる免疫寛容を崩すことを損ないかねないものである。

したがって、持続性の微生物感染症に対してだけでなく、腫瘍に対しても、免疫寛容を崩し、疾患を効率よく処置することのできる免疫療法用ワクチンを開発することが差し迫って求められている。

伝統的なワクチンとは、弱毒化、不活化された病原性生物（細菌、ウイルスなど）または遺伝子改変抗原成分によって調製された生物学的製品を指す。現代的なワクチンは、遺伝子改変抗原成分との関係がより深い。ワクチン接種によって、感染性病原体の拡散から個体が防御されるだけでなく、集団における感染性病原体の拡散も制限される。ワクチン接種の機序は、宿主免疫系を活性化することで、最終的に、長期の予防が実現されるように、対応する病原体に応じて特定の免疫記憶が生成されて、同じ病原体に遭遇したなら速やかに病原体が一掃されるというものである。治療用ワクチンは、予防用ワクチンと同じ長期間の効力を有する。健康なヒト対象において使用される予防用ワクチンとは異なり、治療用ワクチンは、宿主免疫系を再活性化または修復することにより、すでに感染し、患者の組織に隠れている病原体をターゲットとして、疾患を処置する。現在、治療用ワクチンに関する研究は、主として、持続性感染性疾患などの、有効な処置のない主要な慢性疾患、ならびに悪性腫瘍に集中している。上で論じたとおり、こうした疾患は、中国において膨大な患者人口を抱える。こうした慢性疾患および悪性腫瘍に対抗する治療用ワクチンの開発を進歩させることで、往々にして低分子薬物と関連付けられる有害作用を解決できるだけでなく、少ない副作用、長い効力、および良好な特異性といった意義を手にすることもできる。

治療用ワクチン開発には、多くの場合、強力なアジュバントが必要であるため、治療用ワクチンは、アジュバントの役割とますます切り離せなくなってきている。特に、組換えタンパク質抗原を主体とする治療用ワクチンには、所望の免疫療法的効力を得るために、アジュバントが必要である。アジュバントは、免疫寛容を崩し、その防御持続期間を延ばし、特定の種類の免疫応答を誘導することにより、治療用ワクチンを補佐して、病原体に対する適応免疫応答を増強しうる薬剤である。しかし、この目的のためのアジュバントの使用または開発には、多くの難題が立ちはだかる。難題の一部として、アジュバントの副作用、アジュバントの有効性、およびアジュバントの用量に関して、抗原に対する免疫応答をどのように有効に増大させるかの問題が挙げられる。すなわち、難題の１つは、所望の有効性を実現する「正しい」アジュバントをどのように選択するかである。

現況技術の短所を考慮して、本発明は、免疫賦活薬および免疫療法用医薬組成物を提供し、免疫療法用医薬組成物の調製方法ならびに免疫賦活薬および関連した免疫療法薬の使用を開示する。本発明の詳細な技術的解決策は、以下のとおりに列記される。

一態様では、本発明は、少なくとも組換え型インターフェロン（ｒＩＦＮ－α）と組換え型顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｒＧＭ－ＣＳＦ）とを含む免疫賦活薬を提供する。

上で言及した免疫賦活薬において、ｒＩＦＮ－αの重量による含有量のｒＧＭ－ＣＳＦの含有量に対する比は、１用量あたり（０．１×１０^４ＩＵ～５×１０^６ＩＵ）：（１μｇ～２００μｇ）の範囲にあることが好ましい。

ｒＩＦＮ－αの含有量のｒＧＭ－ＣＳＦの含有量に対する比は、１用量あたり（０．５×１０^４ＩＵ～１×１０^５ＩＵ）：（５μｇ～１５０μｇ）の範囲にあることがより好ましい。

ｒＩＦＮ－αの含有量のｒＧＭ－ＣＳＦの含有量に対する比は、１用量あたり（０．５×１０^４ＩＵ～５×１０^４ＩＵ）：（５μｇ～５０μｇ）の範囲にあることがより好ましい。

ｒＩＦＮ－αの含有量のｒＧＭ－ＣＳＦの含有量に対する比は、１用量あたり１×１０^４ＩＵ：１０μｇの範囲にあることが最も好ましい。

好ましい一実施形態では、上で言及した免疫賦活薬中のｒＧＭ－ＣＳＦの含有量は、１用量あたり約１μｇ～約１００μｇの範囲内、好ましくは、１用量あたり約５μｇ～約５０μｇの範囲内、より好ましくは、１用量あたり約５μｇ～約２０μｇの範囲内、最も好ましくは、１用量あたり約１０μｇである。

別の好ましい実施形態では、上で言及した免疫賦活薬中のｒＩＦＮ－αの含有量は、１用量あたり１×１０^３ＩＵ～９×１０^６ＩＵの範囲内、好ましくは、１用量あたり５×１０^３ＩＵ～５×１０^５ＩＵの範囲内、より好ましくは、１用量あたり８×１０^３ＩＵ～２×１０^５ＩＵの範囲内、最も好ましくは、１用量あたり約０．５×１０^４ＩＵ～１×１０^５ＩＵの範囲内、たとえば、１×１０^４ＩＵである。

別の好ましい実施形態では、上で言及した免疫賦活薬は、水酸化アルミニウムおよび／またはリン酸アルミニウムなどのアルミニウムアジュバントをさらに含む場合がある。

一例として、アルミニウムアジュバントの量は、１用量あたり約０．５ｍｇ～約１０ｍｇの範囲、好ましくは、１用量あたり約１ｍｇ～約３ｍｇの範囲、より好ましくは、１用量あたり約１．２５ｍｇ～約２．５ｍｇの範囲にある。別の例として、アルミニウムアジュバントの量は、１用量あたり約０．１ｍｇ～約３ｍｇの範囲内、好ましくは、１用量あたり約０．８ｍｇ～約２ｍｇの範囲内、最も好ましくは、１用量あたり約１．２５ｍｇである。さらに別の例として、アルミニウムアジュバントの量は、１用量あたり約０．０１ｍｇ～約３ｍｇの範囲内、好ましくは、１用量あたり約０．０５ｍｇ～約２ｍｇの範囲内、最も好ましくは、１用量あたり約０．１ｍｇ～約０．５ｍｇの範囲内、たとえば、１用量あたり約０．１２５ｍｇである。

一例として、アルミニウムアジュバントのｒＧＭ－ＣＳＦに対する重量比は、１用量あたり（約０．０１ｍｇ～約１ｍｇ）：（約１μｇ～約２００μｇ）の範囲、好ましくは、１用量あたり（約０．０５ｍｇ～約０．５ｍｇ）：（約５μｇ～約１５０μｇ）の範囲にあり、比が、１用量あたり（約０．１ｍｇ～約０．２５ｍｇ）：（約５μｇ～約５０μｇ）の範囲にあることがより好ましく、重量比が、１用量あたり約０．１２５ｍｇ：約１０μｇであることが最も好ましい。別の例として、アルミニウムアジュバントのｒＧＭ－ＣＳＦに対する重量比は、１用量あたり（約０．１ｍｇ～約１０ｍｇ）：（約１μｇ～約３００μｇ）の範囲、好ましくは、１用量あたり（約０．５ｍｇ～約５ｍｇ）：（約２μｇ～約２００μｇ）の範囲にあり、重量比が、１用量あたり（約１．５ｍｇ～約３ｍｇ）：（約５μｇ～約１００μｇ）の範囲にあることがより好ましく、重量比が、１用量あたり（約１ｍｇ～約２ｍｇ）：（約１０μｇ～約７５μｇ）の範囲にあることが最も好ましい。

上で言及したインターフェロンは、インターフェロンアルファ（ＩＦＮ－α）であることが好ましい。

上で言及したインターフェロンは、ｒＩＦＮ－α－２ａであることがより好ましい。

別の態様では、本発明は、少なくとも、抗原と、上で言及した免疫賦活薬とを含む、免疫療法医薬組成物を提供する。

一実施形態では、免疫療法医薬組成物中のｒＩＦＮ－αは、インターフェロンアルファ－２ａである。

別の実施形態では、免疫療法医薬組成物中の抗原は、タンパク質抗原を含む。

タンパク質抗原は、ウイルス性抗原、細菌性抗原、真菌性抗原、寄生生物性抗原、および腫瘍抗原のうちの少なくとも１つであることが好ましい。

上で言及したウイルス性抗原は、ＨＢＶ抗原、ヘルペスウイルス抗原、ＨＰＶ抗原、ＨＩＶ抗原、メルケル細胞ウイルス、インフルエンザウイルス抗原、およびＲＳＶ抗原のうちの少なくとも１つを含むことがより好ましい。

別の実施形態では、上で言及したタンパク質抗原は、不活化ワクチン抗原、弱毒化ワクチン抗原、またはサブユニットワクチン抗原である。

別の実施形態では、タンパク質抗原は、遺伝子改変ワクチン抗原である。

一実施形態では、上で言及した免疫療法用医薬組成物は、薬学的または免疫学的に許容される担体または賦形剤の少なくとも１種をさらに含む。

上で言及した免疫療法用医薬組成物において、ｒＩＦＮ－αの含有量のｒＧＭ－ＣＳＦの含有量に対する比は、１用量あたり（約０．５×１０^４ＩＵ～約１．５×１０^４ＩＵ）：（約５μｇ～約２０μｇ）の範囲にあり、比が、１用量あたり約１×１０^４ＩＵ：約１０μｇであることが好ましい。

上で言及した免疫療法用医薬組成物において、ｒＧＭ－ＣＳＦの含有量は、１用量あたり約１μｇ～約２００μｇ、好ましくは、１用量あたり約５μｇ～約５０μｇ、より好ましくは、１用量あたり約５μｇ～約２０μｇの範囲内、最も好ましくは、１用量あたり約１０μｇである。

上で言及した免疫療法用医薬組成物において、ｒＩＦＮ－αの含有量は、１用量あたり約１×１０^３ＩＵ～約９×１０^５ＩＵ、好ましくは、１用量あたり約５×１０^３ＩＵ～約１×１０^５ＩＵ、より好ましくは、１用量あたり約８×１０^３ＩＵ～約５×１０^４ＩＵ、最も好ましくは、１用量あたり約１×１０^４～約２×１０^４ＩＵの範囲内、たとえば、約１×１０^４ＩＵである。

上で言及した免疫療法用医薬組成物において、抗原のｒＧＭ－ＣＳＦに対する含有量比は、１用量あたり（約０．１μｇ～約１０μｇ）：（約１μｇ～約１００μｇ）、好ましくは、１用量あたり（約０．５μｇ～約５μｇ）：（約５μｇ～約５０μｇ）、より好ましくは、１用量あたり（約１μｇ～約５μｇ）：（約５μｇ～約２５μｇ）の範囲内、最も好ましくは、１用量あたり約１μｇ：約１０μｇである。

別の態様では、本発明は、免疫療法用医薬組成物を調製する方法であって、抗原をｒＩＦＮ－αおよびｒＧＭ－ＣＳＦと混合して混合物とするステップと、次いで、混合物に、薬学的または免疫学的に許容される担体または賦形剤の少なくとも１種を加え、それによって、上で言及した免疫療法用医薬組成物を生成するステップとを含む方法を提供する。

一実施形態では、ｒＧＭ－ＣＳＦ、ｒＩＦＮ－α、および抗原は、４～１０℃、好ましくは４℃で混合される。

別の態様では、本発明は、安全かつ有効な量の上で言及した免疫賦活薬を、免疫化する対象に、抗原の投与または抗原と免疫賦活薬の同時投与前に投与することを含む、上で言及した免疫賦活薬の使用を提供する。

上記投与は、少なくとも粘膜投与または注射投与、より好ましくは、局所注射投与を含むことが好ましい。

上述したような免疫化する対象は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物を含めた哺乳動物であることが好ましい。非ヒト哺乳動物には、げっ歯動物などのげっ歯類、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、およびウシが含まれる。

別の態様では、本発明は、免疫療法薬の調製における免疫療法用医薬組成物の使用であって、
（１）単球産生を促進するステップと、
（２）単球ＣＣＲ２の発現を促進するステップと、
（３）Ｌｙ６Ｃ^ｈｉＣＣＲ２^＋単球の、表現型がＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ１１ｃ^＋ＤＣであるＤＣへの分化を促進するステップと、
（４）対象の細胞性免疫およびＣＴＬ細胞溶解機能を向上させるステップと、
（５）対象の液性免疫および１種または数種の防御抗体の産生を促進するステップと
を含む使用を提供する。

上で言及した使用は、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生生物感染症、および／または腫瘍のうちの１つまたは複数の、予防または処置を含むことが好ましい。

上で言及したウイルス感染症には、ＨＢＶ感染症、ヘルペスウイルス感染症、ＨＰＶ感染症、ＨＩＶ感染症、メルケル細胞ウイルス（たとえば、メルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＶまたはＭＣＰｙＶ））関連感染症、インフルエンザウイルス感染症、およびＲＳＶ感染症のうちの１つまたは複数が含まれることがより好ましい。

好ましい一実施形態では、ウイルス感染症は、慢性Ｂ型肝炎である。

好ましい別の実施形態では、抗原が肝炎表面抗原であるとき、免疫療法用医薬組成物によって、免疫寛容を崩し、感染した肝細胞を除去し、ＨＢｅＡｇとＨＢｓＡｇの両方を一掃し、抗ＨＢｓＡｂを産生させることができる。

好ましい別の実施形態では、抗原が肝炎表面抗原を有するｐｒｅＳ１であるとき、免疫療法用医薬組成物によって、免疫寛容を崩し、感染した肝細胞を除去し、ＨＢｅＡｇとＨＢｓＡｇの両方を一掃し、抗ＨＢｓＡｂを産生させることができる。

好ましい別の実施形態では、抗原が腫瘍抗原であるとき、免疫療法用医薬組成物によって、有効な抗腫瘍免疫応答が誘発される。

好ましい別の実施形態では、上で言及した腫瘍抗原には、前立腺がんエピトープペプチドまたはポリペプチド、乳がんエピトープペプチドまたはポリペプチド、結腸直腸がんエピトープポリペプチド、子宮頚がんエピトープペプチドまたはポリペプチド、肝臓がんエピトープペプチドまたはポリペプチド、多発性骨髄腫エピトープペプチド、および腎細胞癌エピトープペプチドまたはポリペプチドが含まれる。

好ましい別の実施形態では、抗原が連鎖球菌抗原であるとき、免疫療法用医薬組成物によって、抗細菌感染を生じる免疫応答が誘発される。

好ましい別の実施形態では、連鎖球菌抗原は、Ａ型連鎖球菌エピトープペプチドまたはポリペプチドのうちの１つである。

好ましい別の実施形態では、抗原がＨＩＶ抗原であるとき、免疫療法用医薬組成物によって、ＨＩＶ感染に対抗する免疫応答が誘発される。

好ましい別の実施形態では、ＨＩＶ抗原は、ＨＩＶエピトープペプチドまたはポリペプチドのうちの１つである。

上で言及した使用は、上で論じたとおりの免疫療法用医薬組成物の、免疫化する対象への、安全かつ治療に有効な量での投与を含むことが好ましい。

上で言及した免疫化する対象は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物を含めた哺乳動物であることがより好ましい。非ヒト哺乳動物には、げっ歯動物、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、およびウシが含まれる。

既存技術に比べ、本発明における免疫賦活薬の組成物ならびに関連した方法および使用は、以下の利点を有する。
（１）本発明は、免疫機能を著しく向上させ、抗原提示の効率を向上させ、免疫寛容を有効に崩し、有効な免疫活性化および応答を確立し、強力な抗体および細胞性免疫応答を生じうる、ｒＧＭ－ＣＳＦとｒＩＦＮ－αとを免疫賦活薬として最適な比で含む混合物を使用している。
（２）上述のとおりのｒＧＭ－ＣＳＦとｒＩＦＮ－αとを最適な比で含む免疫賦活薬は、液性および細胞性免疫を有効に活性化し、免疫効率を有意に高めうる。
（３）免疫賦活薬とＢ型肝炎表面抗原の混合物または組合せを使用して、Ｂ型肝炎感染動物モデルにおいて免疫寛容をうまく崩すことができ、ＨＢｓＡｇは、その抗ＨＢｓ抗体を伴って一掃されうる。
（４）免疫賦活薬と腫瘍抗原の混合物または組合せを使用して、抗腫瘍免疫応答を誘発することができる。
（５）免疫賦活薬と連鎖球菌抗原の混合物または組合せを使用して、抗細菌感染を生じる免疫応答を誘発することができる。
（６）免疫賦活薬とＨＩＶ抗原の混合物または組合せを使用して、抗ＨＩＶ感染を生じる免疫応答を誘発することができる。
（７）免疫賦活薬は、使用しやすく、低コストであり、有害反応および副作用が少ない。

本発明の視野の範囲内で、上述の本発明の各技術的特色および以下に（実施例として）記載する種々の技術的特色を互いに組み合わせて、新たなまたは好ましい技術的解決策を講じてもよいことは、理解されるべきである。本発明において開示される原則から逸脱しない均等物または変更形態は、本発明の保護範囲にある。

本発明の趣旨、技術的特色、および技術的効果を十分に例証するために、本発明について図面と共にさらに記述する。本発明の前述および他の態様および利点は、以下の記述から明らかとなる。記述の中で、その一部をなし、本発明の好ましい実施形態の例として示されている、添付の図面への言及がなされる。そのような実施形態は、必ずしも本発明の完全な範囲に相当しないが、しかし、したがって、本発明の範囲を解釈するために、特許請求の範囲および本明細書が参照される。

免疫療法用医薬組成物処置の使用による、異なる比および組合せの効果を示す、一式のグラフおよび像である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、１０μｇ、２０μｇ、３０μｇのＧＭ－ＣＳＦを、それぞれ１００ＩＵ、１，０００ＩＵ、１０，０００ＩＵのＩＦＮ－αおよび１ｕｇのＨＢＶワクチンと組み合わせたもので免疫化した。図１Ａ：免疫化後３日目の末梢血ＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ１１ｃ^＋ＤＣ比率。免疫化から２１日後の時点で、１０μｇのＨＢｓＡｇをマウスの左足蹠に注射し、対照として、ＰＢＳを右足蹠に注射した。足蹠の腫脹を、それぞれ、注射後２４時間、４８時間、および７２時間の時点で測定した。図１Ｂ：２４時間ＤＴＨの統計的結果。図１Ｃ：免疫化から２１日後に末梢血を採取し、血清を分離し、ＥＬＩＳＡによって抗ＨＢｓＡｇレベルを測定した。結果は、平均±ＳＥＭとして表示しており、＊がＰ＜０．０５を示し、＊＊がＰ＜０．０１を示し、＊＊＊がＰ＜０．００１を示す。 免疫療法用医薬組成物処置の使用による、異なる比および組合せの効果を示す、一式のグラフおよび像である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、５μｇ、１０μｇ、２０μｇのＧＭ－ＣＳＦを、それぞれ１０００ＩＵ、１００００ＩＵ、１０００００ＩＵのＩＦＮ－αおよび１ｕｇのＨＢＶワクチンと組み合わせたもので免疫化した。図２Ａ：免疫化後３日目の末梢血ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋ＤＣ比率。免疫化から２１日後の時点で、１０μｇのＨＢｓＡｇをマウスの左足蹠に注射し、対照として、ＰＢＳを右足蹠に注射した。足蹠の腫脹を、それぞれ、注射後２４時間、４８時間、および７２時間の時点で測定した。図２Ｂ：２４時間ＤＴＨの統計的結果。図２Ｃ：免疫化から２１日後に末梢血を採取し、血清を分離し、ＥＬＩＳＡによって抗ＨＢｓＡｇレベルを測定した。結果は、平均±ＳＥＭとして表示しており、＊がＰ＜０．０５を示し、＊＊がＰ＜０．０１を示す。 ２種類の予備混合プランにおける末梢血およびリンパ節中のＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ１１ｃ^＋ＤＣの変化ならびに抗ＨＢｓＡｇのレベルの比較を示す、一式のグラフである。図３Ａ：免疫化後３日目の末梢血中のＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ１１ｃ^＋ＤＣの比率。図３Ｂ：免疫化後３日目のマウスリンパ節におけるＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ１１ｃ^＋ＤＣの比率。図３Ｃ：２１日間の血清中抗ＨＢｓＡｇレベル。結果は、平均±ＳＥＭとして、Ｐ＞０．０５についてはｎｓ、Ｐ＜０．０５については＊、Ｐ＜０．０１については＊＊として表示している。 本発明のある特定の実施形態による異なる免疫療法用医薬組成物で免疫化した野生型マウスのＤＴＨ結果を示す、一式のグラフおよび像である。図４Ａ：この実験における異なる実験群のための免疫化戦略。図４Ｂ：２回目の免疫化後７日目の時点で、１０μｇのＨＢｓＡｇ抗原をマウスの左足蹠に注射し、陰性対照として、ＰＢＳを右足蹠に注射した。２４時間後、足蹠の腫脹を観察した。図４Ｃ：マウス足蹠におけるＨＢｓＡｇ抗原の注射後２４時間、４８時間、７２時間の時点における腫脹の程度。ｎｓ（Ｐ＞０．０５）は、統計学的差異なしを示し、＊（Ｐ＜０．０５）は、統計学的差異を示し、＊＊（Ｐ＜０．０１）は、統計学的有意差を示すものとした。 本発明のある特定の実施形態に従って野生型マウスによって産生された、ＨＢｓＡｇ特異的ＨＢｓＡｂであるＩｇＧｌ、ＩｇＧ２ａの濃度を示す、一式のグラフである。図５Ａ：異なる免疫療法用医薬組成物で免疫化後、ＥＬＩＳＡによって測定されたＨＢｓＡｂ濃度の結果。図５Ｂ：２回目の免疫化後７日目に、異なる免疫化群におけるＨＢｓＡｇ特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ濃度をＥＬＩＳＡによって検出した。図５Ｃ：２回目の免疫化後７日目に、ＨＢｓＡｇ特異的ＩｇＧ２ａのＩｇＧ１に対する比を、ＥＬＩＳＡによって検出した。ｎｓ（Ｐ＞０．０５）は、統計学的差異なしを示し、＊＊（Ｐ＜０．０１）は、統計学的有意差を示すものとした。 本発明のある特定の実施形態による異なる免疫療法用医薬組成物で免疫化した野生型マウスからのＴリンパ球のサイトカイン分泌の結果を示す、一式のグラフである。２回目の免疫化から７日後、脾細胞を採取し、ＨＢｓＡｇ（１０μｇ／Ｌ）で１８時間刺激し、最後にＢＦＡによって６時間ブロックした。フローサイトメトリーを使用して、ＩＦＮ－γ（図３Ａ）、ＩＬ４（図３Ｂ）、ＩＬ１７Ａ（図３Ｃ）を分泌するＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＩＦＮ－γ（Ｄ）を分泌するＣＤ４＋Ｔ細胞を検出した。ｎｓ（Ｐ＞０．０５）は、統計学的差異なしを示し、＊（Ｐ＜０．０５）は、統計学的差異を示し、＊＊（Ｐ＜０．０１）は、統計学的有意差を示すものとした。 本発明のある特定の実施形態による異なる免疫療法用医薬組成物で免疫化した野生型マウスからのＴリンパ球のサイトカイン分泌の結果を示す、一式のグラフである。２回目の免疫化から７日後、脾細胞を採取し、ＨＢｓＡｇ（１０μｇ／Ｌ）で１８時間刺激し、最後にＢＦＡによって６時間ブロックした。フローサイトメトリーを使用して、ＩＦＮ－γ（図３Ａ）、ＩＬ４（図３Ｂ）、ＩＬ１７Ａ（図３Ｃ）を分泌するＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＩＦＮ－γ（Ｄ）を分泌するＣＤ４＋Ｔ細胞を検出した。ｎｓ（Ｐ＞０．０５）は、統計学的差異なしを示し、＊（Ｐ＜０．０５）は、統計学的差異を示し、＊＊（Ｐ＜０．０１）は、統計学的有意差を示すものとした。 本発明のある特定の実施形態による異なる免疫療法用医薬組成物で免疫化した野生型マウスからのＴリンパ球の増殖を示す、一式のグラフである。２回目の免疫化から７日後、脾細胞を１μＭのＣＦＳＥで染色し、ＨＢｓＡｇ（１０μｇ／ｍＬ）で７２時間刺激した。フローサイトメトリーを使用して、ＣＤ４＋Ｔ細胞（図４Ａ）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（図４Ｂ）の増殖を検出した。ｎｓ（Ｐ＞０．０５）は、統計学的差異なしを示し、＊（Ｐ＜０．０５）は、統計学的差異を示し、＊＊（Ｐ＜０．０１）は、統計学的有意差を示すものとした。 本発明のある特定の実施形態による異なる免疫療法用医薬組成物で免疫化した野生型マウスのｉｎ ｖｉｔｒｏ ＣＴＬ結果を示す、一式のグラフである。免疫化後、脾細胞を単離し、非関連抗原細胞としてのＨＢＶ ＣＴＬポリペプチドＳ_{２０８－２１５}（１０μｇ／ｍＬ）と共に３日間培養した。ＯＶＡ ＣＴＬペプチドＯＶＡ_{２５７－２６４}（１０μｇ／ｍＬ）を、無関係の抗原細胞として使用した。野生型マウス脾臓細胞を、ＨＢＶ ＣＴＬペプチド（１０μｇ／ｍＬ）と共に３７℃で１時間インキュベートし、収集した後、ＣＦＳＥでターゲット細胞として染色した。エフェクター細胞：ターゲット細胞＝２０：１を混合し、６時間培養し、ＰＩで１５分間染色し、ターゲット細胞のＣＴＬ細胞による死滅をフローサイトメトリーによって検出した。図８Ａ：フローサイトメトリーデータ解析の戦略。図８Ｂ：異なる免疫化群についてのＣＴＬフローサイトメトリー結果。図８Ｃ：異なるＨＢＶ特異的免疫群のＣＴＬ死滅速度統計結果。ｎｓ（Ｐ＞０．０５）は、統計学的差異なしを示し、＊＊（Ｐ＜０．０１）は、統計学的有意差を示すものとした。 本発明のより好適な一例として、野生型マウスにおける、ＩＬ－１２を分泌するＤＣ２．４細胞および血清ＩＬ－１２の濃度に対する、異なる免疫療法用医薬組成物の効果を示す、一式のグラフである。ＤＣ２．４細胞を、ＧＭ－ＣＳＦ（１μｇ／ｍＬ）、ＩＦＮ－α（２０ＩＵ／ｍＬ）、およびＬＰＳでそれぞれ７２時間処理した。図９Ａ：ＤＣ２．４細胞中のＩＬ－１２レベル。図９Ｂ：それぞれの統計結果。免疫化後３、７、１４、および２１日目に、ＥＬＩＳＡによって血清ＩＬ－１２濃度を測定した。図９Ｃ：２１日時点での血清ＩＬ－１２濃度結果。ｎｓ（Ｐ＞０．０５）は、統計学的差異なしを示し、＊（Ｐ＜０．０５）は、統計学的差異を示し、＊＊（Ｐ＜０．０１）は、統計学的有意差を示すものとした。 本発明のより好適な一例として、野生型マウスにおける血中ＤＣ細胞の数および機能に対する、異なる免疫療法用医薬組成物の効果を示す、一式のグラフである。図１０Ａ：異なる薬物の組合せで処置したマウスにおける血中ＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ１１ｃ^＋ＤＣ細胞についてのフローサイトメトリー結果。図１０Ｂおよび図１０Ｃ：それぞれ、マウス血液中のＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ１１ｃ^＋ＤＣの百分率および量。図１０Ｄ：ＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ１１ｃ^＋ＤＣ細胞についてのＣＤ８０発現レベル。図１０Ｅ：ＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ１１ｃ^＋ＤＣ細胞のＭＨＣ－ＩＩ発現レベル。ｎｓ（Ｐ＞０．０５）は、統計学的差異なしを示し、＊（Ｐ＜０．０５）は、統計学的差異を示し、＊＊（Ｐ＜０．０１）は、統計学的有意差を示すものとした。 本発明のより好適な一例として、野生型マウスにおける血中単球の数および機能に対する、異なる免疫療法用医薬組成物の効果を示す、一式のグラフである。図１１Ａおよび図１１Ｂ：：異なる薬物の組合せで処置したマウスにおけるフローサイトメトリー分析戦略およびＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｃ^＋単球の結果。図１１Ｃおよび図１１Ｄ：それぞれ、マウス血液中のＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｃ^＋単球の百分率および量。図１１Ｅ：ＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｃ^＋単球のＭＨＣ－ＩＩ発現レベル。図１１Ｆ：免疫化から２１日後にＥＬＩＳＡによって検出されたマウス血清中のＭＣＰ－１レベル。ｎｓ（Ｐ＞０．０５）は、統計学的差異なしを示し、＊（Ｐ＜０．０５）は、統計学的差異を示し、＊＊（Ｐ＜０．０１）は、統計学的有意差を示すものとした。 本発明のより好適な一例として、野生型マウスにおける血中単球の数および機能に対する、異なる免疫療法用医薬組成物の効果を示す、一式のグラフである。図１１Ａおよび図１１Ｂ：：異なる薬物の組合せで処置したマウスにおけるフローサイトメトリー分析戦略およびＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｃ^＋単球の結果。図１１Ｃおよび図１１Ｄ：それぞれ、マウス血液中のＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｃ^＋単球の百分率および量。図１１Ｅ：ＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｃ^＋単球のＭＨＣ－ＩＩ発現レベル。図１１Ｆ：免疫化から２１日後にＥＬＩＳＡによって検出されたマウス血清中のＭＣＰ－１レベル。ｎｓ（Ｐ＞０．０５）は、統計学的差異なしを示し、＊（Ｐ＜０．０５）は、統計学的差異を示し、＊＊（Ｐ＜０．０１）は、統計学的有意差を示すものとした。 本発明のより好適な一例として、ｒＡＡＶ８－１．３ＨＢＶマウスモデル検証の検証を示す、一式のグラフ、略図、および像である。図１２Ａ：６～８週齢の雄Ｃ５７Ｂ／Ｌ６マウスを選択し、ｒＡＡＶ－１．３ＨＢＶウイルスを、マウス１匹あたり１×１０^１０μｇ／１００μＬの用量で尾静脈から注射した。図１２Ｄ、図１２Ｅ、図１２Ｃ、および図１２Ｇ：注射から１４日後、それぞれ検出された、マウスにおけるＨＢｅＡｇ、ＨＢｓＡｇ、ＨＢＶ－ＤＮＡ、およびＡＬＴの血清レベル。図１２Ｂ：それぞれ、肝臓、心臓、および腎臓におけるＨＢｃＡｇの免疫組織化学結果。矢印で示された細胞がＨＢｃＡｇ陽性細胞である。図１２Ｆ：それぞれ、肝臓、心臓、および腎臓におけるＨＢｃＡｇのヘマトキシリン－エオシン染色結果。ｎｓ（Ｐ＞０．０５）は、統計学的差異なしを示し、Ｐ＜０．０００１は、統計学的有意差を示すものとし、バー＝２００μｍである。 本発明のより好適な一例として、ｒＡＡＶ８－１．３ＨＢＶマウスモデルのモニタリングを示す、一式のグラフである。Ｃ５７Ｂ／Ｌ６マウスをｒＡＡＶ－１．３ＨＢＶウイルスで感染させた。図１３Ａ、図１３Ｂ、および図１３Ｃ：感染後０週間～１２週間の血清中のＨＢｓＡｇ、ＨＢＶ－ＤＮＡ、およびＡＬＴのレベルをモニターした。 本発明のより好適な一例として、Ｂ型肝炎モデルマウスにおいて免疫療法用医薬組成物で免疫化した動物における血清ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇレベルの変化を示す、一式のグラフである。ウイルス感染後２１日目に免疫化を開始し、２週間毎に免役化した。各免疫化の前に血清ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇ濃度を測定した。図１４Ａ：９つの実験群における異なる時点での血清ＨＢｓＡｇ濃度。図１４Ｂ：９つの実験群における異なる時点での血清ＨＢｅＡｇ、点線Ｓ／ＣＯ＝１。ｎｓ（Ｐ＞０．０５）は、統計学的差異なしを示し、＊（Ｐ＜０．０５）は、統計学的差異を示し、＊＊（Ｐ＜０．０１）は、統計学的有意差を示すものとした。 本発明のより好適な一例として、ｒＡＡＶ８－１．３ Ｂ型肝炎マウスの血液中のＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ１１ｃ^＋樹状細胞に対する免疫療法用医薬組成物処置の効果を示す、一式のグラフである。Ｂ型肝炎マウスモデルを免疫化後３日目に、マウスの静脈血を採取し、血中ＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ１１ｃ^＋ＤＣのレベルを測定した。図１５Ａ：血中ＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ１１ｃ^＋ＤＣについてのフローサイトメトリー分析戦略。図１５Ｂ：異なる免疫化群の血中ＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ１１ｃ^＋ＤＣの割合。図１５Ｃ：異なる免疫化群の血中ＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ１１ｃ^＋ＤＣの統計結果。図１５Ｄおよび図１５Ｅは、異なる免疫化群の血液中におけるＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ１１ｃ^＋ＤＣ上でのＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ－Ｉ、およびＭＨＣ－ＩＩの発現および統計結果を示す。ｎｓ（Ｐ＞０．０５）は、統計学的差異なしを示し、＊（Ｐ＜０．０５）は、統計学的差異を示し、＊＊（Ｐ＜０．０１）は、統計学的有意差を示すものとした。 本発明のより好適な一例として、ｒＡＡＶ８－１．３ Ｂ型肝炎マウスの血液中のＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ１１ｃ^＋樹状細胞に対する免疫療法用医薬組成物処置の効果を示す、一式のグラフである。Ｂ型肝炎マウスモデルを免疫化後３日目に、マウスの静脈血を採取し、血中ＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ１１ｃ^＋ＤＣのレベルを測定した。図１５Ａ：血中ＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ１１ｃ^＋ＤＣについてのフローサイトメトリー分析戦略。図１５Ｂ：異なる免疫化群の血中ＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ１１ｃ^＋ＤＣの割合。図１５Ｃ：異なる免疫化群の血中ＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ１１ｃ^＋ＤＣの統計結果。図１５Ｄおよび図１５Ｅは、異なる免疫化群の血液中におけるＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ１１ｃ^＋ＤＣ上でのＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ－Ｉ、およびＭＨＣ－ＩＩの発現および統計結果を示す。ｎｓ（Ｐ＞０．０５）は、統計学的差異なしを示し、＊（Ｐ＜０．０５）は、統計学的差異を示し、＊＊（Ｐ＜０．０１）は、統計学的有意差を示すものとした。 ｒＡＡＶ８－１．３ Ｂ型肝炎マウスの血液中の単球に対する免疫療法用医薬組成物処置の効果を示す、一式のグラフである。Ｂ型肝炎マウスモデルを免疫化後３日目に、マウスの静脈血を採取し、血中の単球レベルを測定した。図１６Ａ：血中の単球についてのフローサイトメトリー分析戦略。図１６Ｂ：異なる免疫化群の血液中におけるＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋Ｌｙ６Ｃ^＋顆粒球、ＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^－Ｌｙ６Ｃ^ｈｉ単球、およびＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^－Ｌｙ６Ｃ^ｌｏ単球の割合。図１６Ｃ：異なる免疫化群の血液中におけるＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋Ｌｙ６Ｃ^＋顆粒球、ＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^－Ｌｙ６Ｃ^ｈｉ単球、およびＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^－Ｌｙ６Ｃ^ｌｏ単球の統計結果。図１６Ｄ：異なる免疫化群の血液中のＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋Ｌｙ６Ｃ^＋顆粒球、ＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^－Ｌｙ６Ｃ^ｈｉ単球、およびＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^－Ｌｙ６Ｃ^ｌｏ単球におけるＣＣＲ２発現の統計結果。ｎｓ（Ｐ＞０．０５）は、統計学的差異なしを示し、＊（Ｐ＜０．０５）は、統計学的差異を示し、＊＊（Ｐ＜０．０１）は、統計学的有意差を示すものとした。 ｒＡＡＶ８－１．３ Ｂ型肝炎マウスの血液中の単球に対する免疫療法用医薬組成物処置の効果を示す、一式のグラフである。Ｂ型肝炎マウスモデルを免疫化後３日目に、マウスの静脈血を採取し、血中の単球レベルを測定した。図１６Ａ：血中の単球についてのフローサイトメトリー分析戦略。図１６Ｂ：異なる免疫化群の血液中におけるＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋Ｌｙ６Ｃ^＋顆粒球、ＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^－Ｌｙ６Ｃ^ｈｉ単球、およびＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^－Ｌｙ６Ｃ^ｌｏ単球の割合。図１６Ｃ：異なる免疫化群の血液中におけるＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋Ｌｙ６Ｃ^＋顆粒球、ＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^－Ｌｙ６Ｃ^ｈｉ単球、およびＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^－Ｌｙ６Ｃ^ｌｏ単球の統計結果。図１６Ｄ：異なる免疫化群の血液中のＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋Ｌｙ６Ｃ^＋顆粒球、ＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^－Ｌｙ６Ｃ^ｈｉ単球、およびＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^－Ｌｙ６Ｃ^ｌｏ単球におけるＣＣＲ２発現の統計結果。ｎｓ（Ｐ＞０．０５）は、統計学的差異なしを示し、＊（Ｐ＜０．０５）は、統計学的差異を示し、＊＊（Ｐ＜０．０１）は、統計学的有意差を示すものとした。 免疫療法用医薬組成物処置によって、ｒＡＡＶ８－１．３ＨＢＶ Ｂ型肝炎マウスの細胞性免疫が向上することを示す、一式のグラフおよび像である。図１７Ａ：４回目の免疫化から７日後、ＨＢｓＡｇ（１０μｇ／１０μＬ）抗原を、マウスの左足蹠に注射し、対照として右足蹠にＰＢＳを注射した。２４時間後、ノギスを用いてキャリパー厚を測定し、蹠腫脹厚＝左蹠厚－右蹠厚とした。図１７Ｂ：異なる免疫化群におけるＣＤ８^＋Ｔ細胞、陽性対照としてのＣＤ３（１μｇ／ｍＬ）およびＣＤ２８（１００ｎｇ／ｍＬ）の増殖についての統計結果。図１７Ｃおよび図１７Ｄ、それぞれ、異なる免疫化群における脾臓ＩＦＮ－γ^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＩＬ－４^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞の統計結果。図１７Ｅ：異なる免疫化群、陽性対照としてのイオノマイシン（１μｇ／ｍＬ）およびＰＭＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）における脾臓ＩＦＮ－γ^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析。図１７Ｆ：異なる免疫化群における脾臓ＩＦＮ－γ^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の統計結果。図１７Ｇ：免疫組織化学的方法によって測定した、異なる免疫化群における肝臓中のＣＤ８^＋Ｔ細胞、バー＝１００μｍ。ｉｎ ｖｉｖｏ ＣＴＬアッセイのフローサイトメトリー結果（左）および統計結果（右）（Ｈ）および（Ｉ）。ｎｓ（Ｐ＞０．０５）は、統計学的差異なしを示し、＊（Ｐ＜０．０５）は、統計学的差異を示し、＊＊（Ｐ＜０．０１）は、統計学的有意差を示すものとした。 免疫療法用医薬組成物処置によって、ｒＡＡＶ８－１．３ＨＢＶ Ｂ型肝炎マウスの液性免疫が向上することを示す、一式のグラフおよび像である。４回目の免疫化から１４日後、末梢血を採取し、血清を分離した。図１８Ａ：血清ＨＢｅＡｇ結果。図１８Ｂ：血清ＨＢｓＡｇ結果。図１８Ｃ：血清ＨＢＶ－ＤＮＡ結果、点線は３０ＩＵ／ｍＬのキット検出限界のため。図１８Ｄ：血清ＡＬＴ結果。図１８Ｅ：肝臓におけるＨＢｃＡｇの免疫組織化学結果、バー＝５０μｍ。図１８Ｆ：血清抗ＨＢｓＡｇ結果。図１８Ｇ：血清ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１結果。ｎｓ（Ｐ＞０．０５）は、統計学的差異なしを示し、＊（Ｐ＜０．０５）は、統計学的差異を示し、＊＊（Ｐ＜０．０１）は、統計学的有意差を示すものとした。 ＣＣＲ２をブロックすることが、免疫療法用医薬組成物処置の効力に与える効果を示す、一式のグラフおよび像である。ＣＣＲ２ブロッカーであるＩＮＣＢ３３４４を、ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮ－α／ＶＡＣＣＩＮＥを注射する１時間前、注射から２４時間後および４８時間後に、それぞれ３０μｇ／ｋｇの用量で３回注射した。それぞれ、３日後の末梢血中のＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｃ^ｈｉＣＣＲ２^ｈｉ単球のフローサイトメトリーおよび統計分析（図１９Ａ）および（図１９Ｂ）。図１９Ｃ：末梢血中のＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ１１ｃ^＋ＤＣの比率の統計結果。図１９Ｄ：脾臓中のＩＦＮ－γ^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の統計結果。図１９Ｅ、図１９Ｆ、および図１９Ｇ：それぞれ、血清ＡＬＴ、ＨＢｓＡｇ、およびＨＢＶ－ＤＮＡの結果。図１９Ｈ：肝臓ＨＢｃＡｇの免疫組織化学結果、バー＝５０μｍ。ｎｓ（Ｐ＞０．０５）は、統計学的差異なしを示し、＊（Ｐ＜０．０５）は、統計学的差異を示し、＊＊（Ｐ＜０．０１）は、統計学的有意差を示すものとした。 本発明のある特定の実施形態による前立腺がんペプチドワクチンの強化に対する免疫療法用医薬組成物処置の免疫効果を示す、一式のグラフである。動物を組成物で免疫化し、抗体産生（図２０Ａ）、およびそのような免疫化後の足蹠腫脹のサイズ変化を誘導し、次いで抗原を負荷すると、細胞性免疫応答が示された（図２０Ｂ）。 本発明のある特定の実施形態による乳がんペプチドワクチンの強化に対する免疫療法用医薬組成物処置の免疫効果を示す、一式のグラフである。動物を組成物で免疫化し、抗体産生（図２１Ａ）、およびそのような免疫化後の足蹠腫脹のサイズ変化を誘導し、次いで抗原を負荷すると、細胞性免疫応答が示された（図２１Ｂ）。 本発明のある特定の実施形態による結腸直腸がんペプチドワクチンの強化に対する免疫療法用医薬組成物処置の免疫効果を示す、一式のグラフである。動物を組成物で免疫化し、抗体産生（図２２Ａ）、およびそのような免疫化後の足蹠腫脹のサイズ変化を誘導し、次いで抗原を負荷すると、細胞性免疫応答が示された（図２２Ｂ）。 本発明のある特定の実施形態による子宮頚がんペプチドワクチンの強化に対する免疫療法用医薬組成物処置の免疫効果を示す、一式のグラフである。動物を組成物で免疫化し、抗体産生（図２３Ａ）、およびそのような免疫化後の足蹠腫脹のサイズ変化を誘導し、次いで抗原を負荷すると、細胞性免疫応答が示された（図２３Ｂ）。 本発明のある特定の実施形態による肝細胞癌ペプチドワクチンの強化に対する免疫療法用医薬組成物処置の免疫効果を示す、一式のグラフである。動物を組成物で免疫化し、抗体産生（図２４Ａ）、およびそのような免疫化後の足蹠腫脹のサイズ変化を誘導し、次いで抗原を負荷すると、細胞性免疫応答が示された（図２４Ｂ）。 本発明のある特定の実施形態による多発性骨髄腫ペプチドワクチン免疫化の強化に対する免疫療法用医薬組成物処置の免疫効果を示す、一式のグラフである。動物を組成物で免疫化し、抗体産生（図２５Ａ）、およびそのような免疫化後の足蹠腫脹のサイズ変化を誘導し、次いで抗原を負荷すると、細胞性免疫応答が示された（図２５Ｂ）。 本発明のある特定の実施形態による腎細胞癌のペプチドワクチンの強化に対する免疫療法用医薬組成物処置の免疫効果を示す、一式のグラフである。動物を組成物で免疫化し、抗体産生（図２６Ａ）、およびそのような免疫化後の足蹠腫脹のサイズ変化を誘導し、次いで抗原を負荷すると、細胞性免疫応答が示された（図２６Ｂ）。 本発明のより好適な一例における、Ａ型連鎖球菌ワクチンの強化に対する免疫療法用医薬組成物処置の免疫効果を示す、一式のグラフである。動物を組成物で免疫化し、抗体産生（図２７Ａ）、およびそのような免疫化後の足蹠腫脹のサイズ変化を誘導し、次いで抗原を負荷すると、細胞性免疫応答が示された（図２７Ｂ）。 本発明のより好適な一例における、ＨＩＶ－１ペプチドワクチンの強化に対する免疫療法用医薬組成物処置の免疫効果を示す、一式のグラフである。動物を組成物で免疫化し、抗体産生（図２８Ａ）、およびそのような免疫化後の足蹠腫脹のサイズ変化を誘導し、次いで抗原を負荷すると、細胞性免疫応答が示された（図２８Ｂ）。 本発明のより好適な一例における、ＨＢＶ ＰｒｅＳおよびＨＢＶ ＰｒｅＳ１の強化に対する免疫療法用医薬組成物処置の免疫効果を示す、一式のグラフである。最適な組成についての用量は、ＧＭ－ＣＳＦを１０μｇ、ＩＦＮ－αを１０，０００ＩＵ、ＰｒｅＳを１μｇまたはＰｒｅＳ１を１μｇである。６週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスに、最適な用量比のＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮ－α／ＰｒｅＳまたはＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮ－α／ＰｒｅＳ１を、それぞれ、隔週で３回皮下注射した。対照群は、ＰｒｅＳまたはＰｒｅＳ１で個々に免疫化した。各免疫化の前後に血液サンプルを採取して、液性免疫を検出した。

一般事項
本発明の実施形態について詳細に説明する前に、本発明は、その出願において、以下の記述の中で明記され、または以下の図面において例証される構成要素の構築および配置の細目に限定されないと理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であり、種々の方法で実践または実施することができる。また、本明細書で使用する術語および用語は、記述する目的のためのものであり、限定するとみなすべきではないと理解されたい。本明細書における「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、または「ｈａｖｉｎｇ」、およびこれらの変形語は、その後に列挙する項目およびその均等物ならびに追加項目を包含するものである。さらに、方法、プロトコール、材料、および試薬は、様々となりうるため、本発明は、記載した特定の方法、プロトコール、材料、および試薬に限定されないと理解されたい。また、本明細書で使用する用語は、特定の実施形態について述べる目的のものにすぎず、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の範囲は、後に出願される仮でない出願によってのみ限定されると理解される。

本明細書および添付の特許請求の範囲において使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈からそうでないことが明らかに規定されない限り、複数の言及を包含する。なお、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ（１つまたは複数）」、および「ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ（少なくとも１つ）」は、本明細書では、区別なく使用される場合がある。用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」、および「ｈａｖｉｎｇ」は、区別なく使用される場合がある。

別段定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、当業者が一般に理解しているのと同じ意味を有する。本発明の実施または試験する際は、本明細書に記載するものと同様または同等ないずれの方法および材料を使用してもよいが、好ましい方法および材料についてここで述べる。本明細書において詳細に言及するすべての刊行物および特許は、本発明と関連して使用することのできる、刊行物において報告されている化学物質、機器、統計分析、および方法を記載および開示することを含むすべての目的で参照により援用される。本明細書で引用するすべての参考文献は、当業界の技量のレベルを示すと解釈される。本明細書には、本発明が、先行発明によってそのような開示に先行する権利を与えられないことを容認すると解釈されるものは何もない。

Ｉ．定義
別段定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する業界の技術者が一般に理解しているのと同じ意味を有する。本明細書で使用するとき、以下の用語は、次の意味を有する。

本明細書で使用する用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」または「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」は、組成物および方法が、列挙される要素を含むが、他のものを除外しないことを意味するものとする。「Ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ（から本質的になる）」は、組成物および方法を規定するのに使用されるとき、明記される目的のために組合せに本質的に重要な他の要素を除外することを意味するものとする。すなわち、本明細書で規定するとおりの要素から本質的になる組成物は、請求項に係る発明の基本的かつ新規な特徴に著しく影響しない他の材料またはステップを除外しないことになる。「Ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ（からなる）」は、微量より多い他の成分の要素および実質的な方法ステップを除外することを意味するものとする。こうした転換用語それぞれによって規定される実施形態は、本発明の範囲内にある。

用語「ａｂｏｕｔ（約）」は、範囲を含めた、数に関する指定、たとえば、温度、時間、量、濃度の前に使用されるとき、（＋）または（－）１０％、５％、または１％変動してもよい近似値を示す。

本明細書で使用する用語「免疫賦活薬」とは、自然な免疫応答を増強、強化、または別な形で増大しうるいずれかの薬剤または物質を指す。一実施形態では、本開示は、少なくとも、組換え型インターフェロンなどのインターフェロンと、組換え型顆粒球マクロファージコロニー刺激因子などの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とを含む免疫賦活薬を明らかにする。好ましい一実施形態では、免疫賦活薬は、ｒＩＦＮ－αとｒＧＭ－ＣＳＦとを含む。

本明細書で使用する用語「医薬組成物」とは、疾患または病態の医学的診断、治癒、処置、または予防における使用を目的とした、いずれかの化学的もしくは生物学的化合物もしくは物質または２種以上のそうした化合物もしくは物質の混合物もしくは組合せを指す。

用語「ｔｒｅａｔ（処置する）」および「ｐｒｅｖｅｎｔ（予防する）」ならびにこれから派生する単語は、本明細書で使用するとき、１００％または完全な処置または予防を必ずしも含意しない。むしろ、当業者が潜在的な利益または治療効果を有すると認める、様々な程度の処置または予防が存在する。一実施形態では、本発明の組成物または方法では、哺乳動物における疾患のいずれかのレベルの処置または予防をいずれかの量で提供することができる。さらに、本発明の方法によって提供される処置または予防は、処置または予防がなされる疾患、たとえば、がんの１つまたは複数の状態または症状の処置または予防を含みうる。また、本明細書における目的では、「予防」は、疾患、またはその症状もしくは状態の発症を遅らせることも包含しうる。本発明の方法に関して、がんは、本明細書に記載の腫瘍抗原のいずれかと関連するがんのいずれかを含めて、いかなるがんでもよい。

本発明は、いかなる哺乳動物にも適用可能である。本明細書で使用するとき、用語「哺乳動物」とは、ヒト、イヌ、ネコなどの温血脊椎動物を指す。一実施形態では、哺乳動物には、げっ歯動物などのげっ歯類、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、およびウシが含まれる。

本明細書で使用する用語「投与する」または「投与」とは、ワクチンや組成物などの物質で患者を処置する分野におけるその通常および普通の意味を指す。本明細書で使用する用語「共投与（ｃｏ－ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」および「同時投与（ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」は、類義語であり、２種の物質または２種の組成物を、両方の物質または両方の組成物が患者の身体において同時に滞留するような要領およびタイミングで患者に投与することを指す。共投与は、時期が同時または順次である場合があり、共投与される物質または組成物は、同時に、または別々であるが近い時期に、または同日に、またはそれぞれの物質もしくは組成物の身体における滞留期間が実質的に一部重なり合う結果となるようにして別な形で、患者に投与される場合がある。投与、たとえば、非経口投与には、皮下投与、筋肉内投与、経皮投与、皮内投与、腹腔内投与、眼内投与、鼻腔内投与、および静脈内投与を含めることができる。

本発明によるワクチンまたは組成物は、当業界で知られている方法に従って個体に投与することができる。そのような方法は、皮膚へのまたは皮膚を介した注射のすべての経路、たとえば、筋肉内、静脈内、腹腔内、皮内、粘膜、粘膜下、または皮下によるなどの、たとえば非経口的な適用を含む。また、ワクチンは、滴剤、スプレー、ゲル、または軟膏としての局所的な適用によって、眼、鼻、口、肛門、もしくは膣の粘膜上皮に、または身体のいずれかの部分における外皮の表皮上に適用される場合もある。考えられる他の適用経路は、呼吸路を介した吸入による、スプレー、エアロゾル、または粉末適用によるものである。この最後の場合では、使用される粒径によって、粒子が呼吸路にどれだけ深く浸透するかが決まる。別法として、適用は、たとえば、粉末、液体、もしくは錠剤として食物、飼料、もしくは飲料水と合わせることによる食事性経路によるもの、または液体、ゲル、錠剤、もしくはカプセル剤として口腔へ、または坐剤として肛門へ直接投与することによるものである場合もある。

ＩＩ．本発明の好ましい実施形態についての記述
本発明について述べる前に、本発明は、記載する特定の方法および実験条件に限定されず、そのため、方法および条件は、変わる場合もあると理解されたい。また、本明細書で使用する用語は、特定の実施形態について述べる目的のものにすぎず、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するものではないと理解されたい。

広範囲にわたる研究の後、出願人らは、免疫賦活薬としてのｒＧＭ－ＣＳＦとｒＩＦＮ－αの最適な比の混合物によって、（たとえば、タンパク質抗原と混合したとき）身体の免疫を有意に向上させ、抗原提示の効率を向上させ、有効な免疫活性化および応答を確立し、強力な抗体および細胞性免疫応答を惹起させて、疾患を予防および処置することができることを初めて発見した。免疫賦活薬をＢ型肝炎ワクチンと混合することで、Ｂ型肝炎動物モデルにおいて、免疫寛容が首尾よく崩れ、ＨＢｓＡｇの除去および抗ＨＢｓＡｂの誘導につながる。

本発明の趣旨は、新規な免疫療法用医薬組成物、特に、持続性ウイルス感染症および腫瘍に対抗する免疫療法用医薬組成物を提供することである。本発明の医薬組成物は、多くの疾患、またはＨＢＶ、ヘルペスウイルス、ＨＰＶ、ＨＩＶ、メルケル細胞ウイルス、インフルエンザウイルス、ＲＳＶなどのウイルスの処置に、新たな免疫療法薬として使用することができる。

一実施形態では、免疫療法用医薬組成物は、少なくとも、組換え型インターフェロンなどのインターフェロンと、組換え型顆粒球マクロファージコロニー刺激因子などの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とを含む。一実施形態では、組換え型インターフェロンは、組換え型インターフェロンアルファ（ｒＩＦＮ－α）である。一実施形態では、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子は、組換え型顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｒＧＭ－ＣＳＦ）である。

一実施形態では、免疫療法用医薬組成物は、少なくとも、組換え型インターフェロンなどのインターフェロンと、組換え型顆粒球マクロファージコロニー刺激因子などの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とを含む免疫賦活薬を含む。

免疫賦活薬の一実施形態では、組換え型インターフェロンの含有量の組換え型顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の含有量に対する比は、１用量あたり（約０．１×１０^４ＩＵ～約５×１０^６ＩＵ）対（約１μｇ～約２００μｇ）である。別の実施形態では、組換え型インターフェロンの含有量の組換え型顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の含有量に対する比は、１用量あたり（約０．５×１０^４ＩＵ～約１×１０^５ＩＵ）対（約５μｇ～約５０μｇ）である。

一実施形態では、免疫賦活薬の組換え型インターフェロンは、インターフェロンアルファ－２ａなどのインターフェロンアルファである。

ｒＩＦＮ－αの重量による含有量のｒＧＭ－ＣＳＦの含有量に対する比は、１用量あたり（０．１×１０^４ＩＵ～５×１０^６ＩＵ）：（１μｇ～２００μｇ）の範囲にあることが好ましい。

ｒＩＦＮ－αの含有量のｒＧＭ－ＣＳＦの含有量に対する比は、１用量あたり（０．５×１０^４ＩＵ～１×１０^５ＩＵ）：（５μｇ～１５０μｇ）の範囲にあることがより好ましい。

ｒＩＦＮ－αの含有量のｒＧＭ－ＣＳＦの含有量に対する比は、１用量あたり（０．５×１０^４ＩＵ～５×１０^４ＩＵ）：（５μｇ～５０μｇ）の範囲にあることがより好ましい。

ｒＩＦＮ－αの含有量のｒＧＭ－ＣＳＦの含有量に対する比は、１用量あたり１×１０^４ＩＵ：１０μｇの範囲にあることが最も好ましい。

好ましい一実施形態では、ｒＧＭ－ＣＳＦの含有量は、１用量あたり約１μｇ～約１００μｇの範囲内、好ましくは、１用量あたり約５μｇ～約５０μｇの範囲内、より好ましくは、１用量あたり約５μｇ～約２０μｇの範囲内、最も好ましくは、１用量あたり約１０μｇである。

別の好ましい実施形態では、ｒＩＦＮ－αの含有量は、１用量あたり１×１０^３ＩＵ～９×１０^６ＩＵの範囲内、好ましくは、１用量あたり５×１０^３ＩＵ～５×１０^５ＩＵの範囲内、より好ましくは、１用量あたり８×１０^３ＩＵ～２×１０^５ＩＵの範囲内、最も好ましくは、１用量あたり約０．５×１０^４ＩＵ～１×１０^５ＩＵの範囲内、たとえば、１×１０^４ＩＵである。

別の好ましい実施形態では、上で言及した免疫賦活薬は、水酸化アルミニウムおよび／またはリン酸アルミニウムなどのアルミニウムアジュバントをさらに含む場合がある。

一例として、アルミニウムアジュバントの量は、１用量あたり約０．５ｍｇ～約１０ｍｇの範囲内、好ましくは、１用量あたり約１ｍｇ～約３ｍｇの範囲内、より好ましくは、１用量あたり約１．２５ｍｇ～約２．５ｍｇの範囲内である。別の例として、アルミニウムアジュバントの量は、１用量あたり約０．１ｍｇ～約３ｍｇの範囲内、好ましくは、１用量あたり約０．８ｍｇ～約２ｍｇの範囲内、最も好ましくは、１用量あたり約１．２５ｍｇである。さらに別の例として、アルミニウムアジュバントの量は、１用量あたり約０．０１ｍｇ～約３ｍｇの範囲内、好ましくは、１用量あたり約０．０５ｍｇ～約２ｍｇの範囲内、最も好ましくは、１用量あたり約０．１ｍｇ～約０．５ｍｇの範囲内、たとえば、１用量あたり約０．１２５ｍｇである。

一例として、アルミニウムアジュバントのｒＧＭ－ＣＳＦに対する重量比は、１用量あたり（約０．０１ｍｇ～約１ｍｇ）：（約１μｇ～約２００μｇ）の範囲、好ましくは、１用量あたり（約０．０５ｍｇ～約０．５ｍｇ）：（約５μｇ～約１５０μｇ）の範囲にあり、比が、１用量あたり（約０．１ｍｇ～約０．２５ｍｇ）：（約５μｇ～約５０μｇ）の範囲にあることがより好ましく、重量比が、１用量あたり約０．１２５ｍｇ：約１０μｇであることが最も好ましい。別の例として、アルミニウムアジュバントのｒＧＭ－ＣＳＦに対する重量比は、１用量あたり（約０．１ｍｇ～約１０ｍｇ）：（約１μｇ～約３００μｇ）の範囲、好ましくは、１用量あたり（約０．５ｍｇ～約５ｍｇ）：（約２μｇ～約２００μｇ）の範囲にあり、重量比が、１用量あたり（約１．５ｍｇ～約３ｍｇ）：（約５μｇ～約１００μｇ）の範囲にあることがより好ましく、重量比が、１用量あたり（約１ｍｇ～約２ｍｇ）：（約１０μｇ～約７５μｇ）の範囲にあることが最も好ましい。

一実施形態では、免疫療法用医薬組成物は、少なくとも、タンパク質抗原（より好ましくは、組換え型タンパク質抗原）などの抗原と、上で論じたとおりの免疫賦活薬とを含む。一実施形態では、組換え型インターフェロンは、インターフェロンアルファ－２ａである。一実施形態では、抗原は、組換え型タンパク質抗原を含む、または組換え型タンパク質抗原である。免疫療法用医薬組成物の一実施形態では、組換え型インターフェロンの含有量の組換え型顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の含有量に対する比は、１用量あたり（約０．５×１０^４ＩＵ～約１×１０^５ＩＵ）対（約５μｇ～約２０μｇ）である。別の実施形態では、組換え型インターフェロンの含有量の組換え型顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の含有量に対する比は、１用量あたり約１×１０^４ＩＵ対約１０μｇである。

一実施形態では、組換え型タンパク質抗原は、ウイルス性抗原、細菌性抗原、真菌性抗原、寄生生物抗原、および腫瘍抗原のうちの少なくとも１つである。一実施形態では、ウイルス性抗原は、ＨＢＶ抗原、ヘルペスウイルス抗原、ＨＰＶ抗原、ＨＩＶ抗原、メルケル細胞ウイルス抗原、インフルエンザ抗原、およびＲＳＶ抗原の少なくとも１種である。一実施形態では、組換え型タンパク質抗原は、不活化ワクチン抗原、弱毒化ワクチン抗原、またはサブユニットワクチン抗原である。

一実施形態では、組換え型タンパク質抗原は、遺伝子改変組換え抗原である。

一実施形態では、免疫療法用医薬組成物は、少なくともアジュバントをさらに含む。一実施形態では、アジュバントは、水酸化アルミニウムなどのアルミニウムアジュバントである。

一実施形態では、免疫療法用医薬組成物は、薬学的または免疫学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む。

一実施形態では、免疫療法用医薬組成物は、Ｂ型肝炎抗原をさらに含む。一実施形態では、対象に抗原を投与する前、または抗原を投与する間（たとえば、共投与）のいずれかに、安全かつ治療に有効な量の免疫賦活薬を対象に投与することができる。一実施形態では、対象に抗原を投与する前に、安全かつ治療に有効な量の免疫賦活薬が対象に投与される。別の実施形態では、対象に抗原を投与する間（たとえば、共投与）に、安全かつ治療に有効な量の免疫賦活薬が対象に投与される。

一実施形態では、Ｂ型肝炎抗原は、組換え型Ｂ型肝炎表面抗原などの組換え型Ｂ型肝炎抗原である。

一実施形態では、組換え型タンパク質抗原は、ウイルス性抗原、細菌性抗原、真菌性抗原、寄生生物抗原、および腫瘍抗原のうちの少なくとも１つである。

一実施形態では、ウイルス性抗原は、ＨＢＶ抗原、ヘルペスウイルス抗原、ＨＰＶ抗原、ＨＩＶ抗原、メルケル細胞ウイルス抗原、インフルエンザ抗原、およびＲＳＶ抗原の少なくとも１種である。

別の実施形態では、組換え型タンパク質抗原は、不活化ワクチン抗原、弱毒化ワクチン抗原、またはサブユニットワクチン抗原である。好ましい一実施形態では、組換え型タンパク質抗原は、遺伝子改変組換え抗原である。

一実施形態では、本発明の免疫療法用医薬組成物は、少なくとも、組換え型インターフェロンなどのインターフェロンと、組換え型顆粒球マクロファージコロニー刺激因子などの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子と、アルミニウムアジュバントなどのアジュバントと、タンパク質抗原（より好ましくは、組換え型タンパク質抗原）などの抗原とを含む。一実施形態では、アジュバントは、水酸化アルミニウムなどのアルミニウムアジュバントである。一実施形態では、組換え型インターフェロンは、インターフェロンアルファ－２ａなどのインターフェロンアルファである。

一実施形態では、組換え型タンパク質抗原は、ウイルス性抗原、細菌性抗原、真菌性抗原、寄生生物抗原、および腫瘍抗原のうちの少なくとも１つである。一実施形態では、ウイルス性抗原は、ＨＢＶ抗原、ヘルペスウイルス抗原、ＨＰＶ抗原、ＨＩＶ抗原、メルケル細胞ウイルス抗原、インフルエンザ抗原、およびＲＳＶ抗原の少なくとも１種である。一実施形態では、組換え型タンパク質抗原は、不活化ワクチン抗原、弱毒化ワクチン抗原、またはサブユニットワクチン抗原である。好ましい一実施形態では、組換え型タンパク質抗原は、組換え型Ｂ型肝炎抗原、好ましくは、組換え型Ｂ型肝炎表面抗原などのＢ型肝炎抗原である。

好ましい一実施形態では、本発明の免疫療法用医薬組成物は、ある特定の割合に従い、ある特定の順序で混合された後、ｒＩＦＮ－αと、ｒＧＭ－ＣＳＦと、アルミニウムアジュバントと、組換え型Ｂ型肝炎表面抗原とを含む。

一実施形態では、本発明の免疫療法用医薬組成物は、Ｂ型肝炎の処置に有用であり、慢性Ｂ型肝炎の処置に特に適しており、免疫賦活薬は、ｒＩＦＮ－αとｒＧＭ－ＣＳＦとを含み、アジュバントは、水酸化アルミニウムである。一実施形態では、タンパク質抗原またはワクチンのｒＩＦＮ－αおよびｒＧＭ－ＣＳＦとの最適な比での組合せが、医薬製剤へと調製される。一実施形態では、ｒＩＦＮ－αの含有量のｒＧＭ－ＣＳＦの含有量に対する比は、１用量あたり（約０．１×１０^４ＩＵ～約５×１０^６ＩＵ）対（約１μｇ～約２００μｇ）、好ましくは、１用量あたり、（約０．５×１０^４ＩＵ～約１×１０^５ＩＵ）対（約５μｇ～約５０μｇ）、より好ましくは、約１×１０^４ＩＵ～約１０μｇである。

一実施形態では、ｒＩＦＮ－αの含有量のｒＧＭ－ＣＳＦの含有量に対する比は、１用量あたり（約０．５×１０^４ＩＵ～約１．５×１０^４ＩＵ）：（約５μｇ～約２０μｇ）の範囲にあり、比が、１用量あたり約１×１０^４ＩＵ：約１０μｇであることが好ましい。

上で言及した免疫療法用医薬組成物において、ｒＧＭ－ＣＳＦの含有量は、１用量あたり約１μｇ～約２００μｇ、好ましくは、１用量あたり約５μｇ～約５０μｇ、より好ましくは、１用量あたり約５μｇ～約２０μｇの範囲内、最も好ましくは、１用量あたり約１０μｇである。

上で言及した免疫療法用医薬組成物において、ｒＩＦＮ－αの含有量は、１用量あたり約１×１０^３ＩＵ～約９×１０^５ＩＵ、好ましくは、１用量あたり約５×１０^３ＩＵ～約１×１０^５ＩＵ、より好ましくは、１用量あたり約８×１０^３ＩＵ～約５×１０^４ＩＵ、最も好ましくは、１用量あたり約１×１０^４～約２×１０^４ＩＵの範囲内、たとえば、約１×１０^４ＩＵである。

上で言及した免疫療法用医薬組成物において、抗原のｒＧＭ－ＣＳＦに対する含有量比は、１用量あたり（約０．１μｇ～約１０μｇ）：（約１μｇ～約１００μｇ）、好ましくは、１用量あたり（約０．５μｇ～約５μｇ）：（約５μｇ～約５０μｇ）、より好ましくは、１用量あたり（約１μｇ～約５μｇ）：（約５μｇ～約２５μｇ）の範囲内、最も好ましくは、１用量あたり約１μｇ：約１０μｇである。

一実施形態では、医薬調製物または製剤中の組成物は、皮下、筋肉、粘膜、他の身体部分などの伝統的な注射方法によって身体に注射され、また、点鼻薬、点眼薬、および皮膚送達によって投与することもできる。投与後、単球は、未熟ＤＣへと効果的に分化し、次いで、成熟ＤＣ細胞へと変換され、これによって、抗原提示の効率が向上して、宿主免疫が効果的に惹起されて、ウイルスによって誘発された免疫寛容は崩され、身体に潜むウイルスは除去され；単球は、ウイルス感染症の再発を予防し、身体からウイルスを除去さえし、ＨＢＶ再感染を予防する、強力な抗体および細胞性免疫応答を伴う。

本発明では、抗原は、ウイルス、細菌、真菌、寄生生物などの微生物由来である場合がある。

一実施形態では、免疫療法医薬組成物中の抗原は、タンパク質抗原を含む。

タンパク質抗原は、ウイルス性抗原、細菌性抗原、真菌性抗原、寄生生物性抗原、および腫瘍抗原のうちの少なくとも１つであることが好ましい。

上で言及したウイルス性抗原は、ＨＢＶ抗原、ヘルペスウイルス抗原、ＨＰＶ抗原、ＨＩＶ抗原、メルケル細胞ウイルス、インフルエンザウイルス抗原、およびＲＳＶ抗原のうちの少なくとも１つを含むことがより好ましい。

別の実施形態では、上で言及したタンパク質抗原は、不活化ワクチン抗原、弱毒化ワクチン抗原、またはサブユニットワクチン抗原である。

別の実施形態では、タンパク質抗原は、遺伝子改変ワクチン抗原である。

好ましい一実施形態では、タンパク質抗原は、Ｂ型肝炎抗原、好ましくは、組換え型Ｂ型肝炎抗原、より好ましくは、組換え型Ｂ型肝炎表面抗原などの組換え型タンパク質抗原である。

一実施形態では、ウイルス性抗原は、血清由来のＢ型肝炎ウイルス表面抗原または遺伝子改変Ｂ型肝炎表面タンパク質であり、酵母およびＣＨＯ細胞において発現させたものである場合がある。一実施形態では、Ｂ型肝炎サブユニット抗原は、酵母系または哺乳動物細胞において発現されるように遺伝子操作によって調製され、抽出され、精製され、アジュバントと組み合わせられる。

ウイルス性抗原は、ヘルペスウイルス、ＨＰＶ、ＨＩＶ、メルケル細胞ウイルス、インフルエンザウイルス、ＲＳＶ、または、限定はしないが、アデノウイルス科、アレナウイルス科、ブラディウイルス科（Ｂｒａｄｙｖｉｒｉｄａｅ）、カリチウイルス科、コロナウイルス科、フィロウイルス科、ヘパドナウイルス科、ヘルペスウイルス科、オルソミクソウイルス科、オルソミクソウイルス科、パポバウイルス科、パラミクソウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科、レオウイルス科、レトロウイルス科、ラブドウイルス科、もしくはトガウイルス科を始めとする各科のウイルス由来である場合がある。また、動物疾患を引き起こす微生物、たとえば、ＰＲＲＳＶ、ＰＣＶ、ＦＭＤＶ、狂犬病ウイルス、パルボウイルス、ジステンパーウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、パラインフルエンザウイルス、ボルデテラ属およびレプトスピラ属の細菌も挙げられる。

腫瘍抗原は、次の腫瘍、すなわち、口腔がん、食道がん、胃がん、十二指腸がん、小腸がん、結腸がん、肛門がん、肝臓がん、膵臓がん、胆嚢がん、胆管癌、がん、肺がん、皮膚がん（黒色腫）、骨がん、骨髄腫、ＴおよびＢ細胞リンパ腫、白血病、ホジキン腫瘍、非ホジキン腫瘍、カポジ肉腫、頭頚部新生物、脳、甲状腺、神経膠腫、甲状腺、胸腺、腎臓、尿管、膀胱、精巣、前立腺、陰茎、子宮、子宮頚、卵巣、卵管、膣由来である場合がある。

一実施形態では、動物ウイルス抗原は、主として、不活化ワクチン、弱毒化ワクチン、サブユニットワクチンなどの動物ワクチン由来である。

一実施形態では、抗原は、腫瘍由来の特異的および関連抗原である場合がある。

別の態様では、本開示によって、本明細書で論述するとおりの免疫療法用医薬組成物を調製する方法であって、抗原と、組換え型インターフェロンと、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子と、薬学的または免疫学的に許容される担体または賦形剤とを、無菌条件下で混合して、免疫療法用医薬組成物を生成するステップを含む方法が明らかになる。

別の態様では、本発明は、本明細書で論述するとおりの免疫療法用医薬組成物の治療用ワクチンアジュバントおよびワクチン組成物としての使用および調製方法を提供する。出願人らは、実証する目的で、一例として組換え型Ｂ型肝炎表面抗原を使用する。具体的な実施過程にいる当分野の技術者によって、これが、本発明における組換え型ｒＨＢｓＡｇ抗原から調製されるＢ型肝炎サブユニットワクチンなどの、既存技術にあるいずれかのワクチンで置き換えられてもよい。

一実施形態では、免疫療法薬の調製における請求項５の免疫療法用医薬組成物の使用であって、１）単球産生を促進するステップと、２）単球ＣＣＲ２の発現を促進するステップと、３）Ｌｙ６Ｃ^ｈｉＣＣＲ２^＋単球の、表現型がＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ１１ｃ^＋であるＤＣへの分化を促進するステップと、４）対象の細胞性免疫およびＣＴＬ細胞溶解機能を向上させるステップと、５）対象の液性免疫および１種または数種の防御抗体の産生を促進するステップとを含む使用。

一実施形態では、使用は、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生生物感染症、および腫瘍のうちの１つまたは複数を予防または処置することを含む。一実施形態では、ウイルス感染症は、ヒト肝炎ウイルス感染症、ヘルペスウイルス感染症、ヒトパピローマウイルス感染症、ヒト免疫不全ウイルス感染症、メルケル細胞ウイルス感染症、インフルエンザウイルス感染症、およびＲＳウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉｕｍ ｖｉｒｕｓ）感染症のうちの１つまたは複数を含む。

一実施形態では、抗原は、Ｂ型肝炎ワクチンであり、免疫療法用医薬組成物は、免疫寛容を崩し、抗ＨＢｓＡｂを生じさせながら、感染した肝細胞、ＨＢｅＡｇ、およびＨＢｓＡｇを除去することができる。一実施形態では、抗原は、腫瘍抗原であり、免疫療法用医薬組成物によって、抗腫瘍免疫応答が誘発される。別の実施形態では、腫瘍抗原は、前立腺がん抗原ポリペプチドまたはエピトープペプチド、乳がん抗原ポリペプチドまたはエピトープペプチド、結腸直腸がん抗原ポリペプチドまたはエピトープペプチド、子宮頚がんポリペプチドまたはエピトープペプチド、肝臓がんポリペプチドまたはエピトープペプチド、多発性骨髄腫ポリペプチドまたはエピトープペプチド、および腎細胞癌ポリペプチドまたはエピトープペプチドのうちの少なくとも１つを含む。

一実施形態では、抗原は、連鎖球菌抗原の１つであり、免疫療法用医薬組成物によって、抗細菌感染を生じる免疫応答が誘発される。一実施形態では、連鎖球菌抗原は、修飾されたＡ型連鎖球菌エピトープペプチドである。

一実施形態では、抗原は、ＨＩＶ抗原の１つであり、免疫療法用医薬組成物によって、抗ＨＩＶ感染を生じる免疫応答が誘発される。一実施形態では、ＨＩＶ抗原は、ＨＩＶエピトープペプチドである。

一実施形態では、抗原は、メルケル細胞ウイルス抗原の１つであり、免疫療法用医薬組成物によって、抗メルケル細胞ウイルス感染を生じる免疫応答が誘発される。一実施形態では、メルケル細胞ウイルス抗原は、メルケル細胞ポリペプチドの１つである。

一実施形態では、使用は、安全かつ治療に有効な量の免疫療法用医薬組成物の、免疫化する対象への投与を含む。一実施形態では、対象は、哺乳動物である。

一実施形態では、出願人らは、１用量あたり約１μｇ～約２００μｇの範囲、好ましくは、１用量あたり約２０μｇ～約１５０μｇの範囲、より好ましくは、１用量あたり約５０μｇ～約１００μｇの範囲にある量のＧＭ－ＣＳＦが有効であることを実験によって確認している。

一実施形態では、出願人らは、約１０００ＩＵ～約５０，０００（ＩＵ）単位の範囲、好ましくは、１用量あたり約２０００ＩＵ～約３０，０００（ＩＵ）の範囲、より好ましくは、約５０００ＩＵ～約２００００（ＩＵ）の範囲にある活性のＩＦＮ－αが有効であることを実験によって確認している。

本発明では、以下の技術的実施形態を採用した。組換え型ヒトインターフェロン－ａは、遺伝子操作技術によって大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）または酵母系において発現させ、抽出し、精製し、賦形剤と合わせて、調製済みｒｈＩＦＮ－α（Ｉ型インターフェロン）とする。組換え型ヒトＧＭ－ＣＳＦは、遺伝子操作技術によって大腸菌または酵母系において発現させ、抽出し、精製し、賦形剤と合わせて、調製済みｒｈＧＭ－ＣＳＦ（組換え型ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）とする。ヒトＢ型肝炎表面抗原は、遺伝子操作技術によって酵母系またはＣＨＯ細胞において発現させ、抽出し、精製し、調製済みｒＨＢｓＡｇ（組換え型Ｂ型肝炎表面抗原）とする。

本発明の組成物中のｒｈＩＦＮ－α、ｒｈＧＭ－ＣＳＦ、および抗原は、当分野における従来の方法によって調製することができ、または市販品として入手可能である。

本発明の組成物の一実施形態では、ｒＨＢｓＡｇのｒｈＧＭ－ＣＳＦに対する質量比は、約１：（１～１００）、好ましくは１：（１～８０）、より好ましくは１：（１～３０）（たとえば、１：７．５）である。ｒｈＧＭ－ＣＳＦのｒｈＩＦＮ－αおよび／またはアルミニウムアジュバントに対する比は、上述のとおりである。

免疫賦活薬
アジュバントおよび非特異的免疫賦活薬としても知られる免疫賦活薬は、抗原性でなく、事前に作用し、または抗原と同時に作用する。抗原と一緒に（たとえば、共投与）または抗原の投与より前に事前に注射された免疫賦活薬は、抗原に対する特定の免疫応答を非特異的に変更または増強して、免疫原性を高め、または免疫応答のタイプを変化させる。伝統的なアルミニウムアジュバントに加えて、サイトカインなどの物質も、重要なアジュバントとなりうる。たとえば、ＧＭ－ＣＳＦは、造血前駆細胞の増殖、分化、および成熟を促進するだけでなく、ＡＰＣ、線維芽細胞、ケラチノサイト、皮膚粘液細胞などの他の細胞も刺激する、多能性の造血細胞成長因子である。

出願人らは、予備実験において、Ｂ型肝炎ワクチンをＧＭ－ＣＳＦと組み合わせることで、哺乳動物における免疫応答を増強することができるが、増強は限定されることを見出した。さらに、出願人らは、ＧＭ－ＣＳＦを１日１回、３回にわたって予備注射し、次いで、同じ部位にワクチン抗原を注射すると、免疫応答、特にＴ細胞応答のレベルが大いに向上しうることを見出した。機序についても徹底的に研究した。ＧＭ－ＣＳＦの予備注射によって、主として、単球の濃縮および変換が向上して、抗原提示細胞（ＤＣ）の数、ＤＣ抗原提示の能力および実現性が増すことがわかった。ＤＣは、抗原に曝されると、Ｔ細胞に効果的に抗原を提示し、したがって、細胞性免疫の応答を増強することができるのであろう。この研究では、ＧＭ－ＣＳＦおよびワクチン抗原の異なる投与戦略によって、異なる免疫効果が生じうることが示唆された。しかし、この方法は、臨床で使用するには非常に不都合である。実際に、ワクチンの注射前にＧＭ－ＣＳＦを３日間予備注射するプロトコールは、患者および注射を取り扱う看護師にとって、実施するのは容易でなかった。３点の主な不利益が存在することがわかった。すなわち、１）この方法では、用いられる注射の回数が多く、臨床試験において各回に同じ場所が注射されなかったために、患者にワクチン接種し、一定の結果を得るのに多大な不都合が生じ、２）上記事由により、患者の不十分な服薬遵守および試験からの脱落が、不都合なプロトコールと関連付けられ、３）患者は、一区切りの注射を完遂できる前に何日間も病院に滞在することが求められる。これらの不利益を考慮すると、３日の予備処置は、早急に改善されるべきである。

高用量投与でのＩＦＮ－αは、近接する細胞に危険を知らせて抗ウイルスタンパク質を産生させることでウイルスの複製を阻害し、それによってウイルス感染を一掃しうるだけでなく、免疫調節の役割を担い、抗ウイルス応答を増強するナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、単球、マクロファージ、およびＴリンパ球活性を増強することもできる。

ＩＦＮ－αは、樹状細胞が分化する原動力となり、樹状細胞交差提示を増強することが示されている（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２年４月１日、１８８：３１１６～３１２６；Ｂｌｏｏｄ ２０１２年２月９日、１１９：１４０７～１４１７）。一緒に投与されたＩＦＮ－αおよびＧＭ－ＣＳＦは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系において、ある特定の濃度で、末梢血単球を強力な抗原提示細胞へと分化させている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９８、６４：３５８～３６７）。しかし、発明された最適な用量比のＩＦＮ－αとＧＭ－ＣＳＦが、タンパク質抗原と共に、ｉｎ ｖｉｖｏで免疫応答の増強をもたらしうるかどうかは、これまで調べられたことがない。特に、分化するＬｙ６Ｃ^ｈｉＣＣＲ２^＋単球の活性化およびＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ１１ｃ^＋樹状細胞への強化によって、免疫応答の増強が媒介されうるかどうかは不明のままである。Ｌｙ６Ｃ^ｈｉＣＣＲ２^＋単球のＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ１１ｃ^＋樹状細胞への分化は、Ｌｙ６Ｃ^－単球などの他のタイプの単球以後の、細胞を媒介とする潜在的な免疫にとって非常に重要である。

これらの主要な２タイプの単球は、マウスおよびヒトにおいて報告されている（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２００３、１９、７１～８２）。最も顕著な相違点は、高いレベルのＬｙ６Ｃを発現する炎症性単球とＬｙ６Ｃを欠いている単球とにある。本発明に記載の最適な製剤の免疫療法用医薬組成物なら、高レベルのＬｙ６Ｃ^ｈｉＣＣＲ２^＋単球を誘導し、その後治療効果につなげることができる。

組合せ
本発明は、免疫療法用医薬組成物を提供する。

本発明の免疫療法用医薬組成物は、薬学的に許容される担体と、有効量の活性成分とを含む。

本明細書で使用するとき、用語「治療に有効な量」または「治療に有効な用量」とは、ヒトおよび／または動物において機能性または活性があり、ヒトおよび／または動物に許容される量を指す。

本明細書で使用するとき、用語「薬学的に許容される担体」とは、毒性、刺激、アレルギーなどの過度の有害作用なしにヒトおよび／または哺乳動物に適用できる妥当な利益／リスク比を有する物質を指す。用語「薬学的に許容される担体」は、治療薬の投与を支援するための担体を指し、種々の賦形剤および希釈剤を包含する。

本発明の免疫療法用医薬組成物は、安全かつ治療に有効な量の活性成分と薬学的に許容される担体とを含む。そのような担体としては、限定はしないが、食塩水、緩衝液、デキストロース、グリセロール、マンニトール、トレハロース、シクロデキストリン、アルミニウムアジュバント、尿素、およびこれらの組合せを挙げることができる。一般に、医薬調製物は、投与の方式に合わせるべきである。本発明の免疫療法用医薬組成物は、注射、経口調製物（錠剤、カプセル剤、経口液）、経皮的薬剤、および徐放性薬剤の形態にすることができる。たとえば、組成物は、従来の方法によって、生理食塩水、またはグルコースを含有する水溶液と、他のアジュバントとを含む場合がある。免疫療法用医薬組成物は、無菌条件下で製造されることが好ましい。

本発明の活性成分の治療に有効な量は、投与の方式および処置する疾患の重症度に応じて様々となりうる。好ましい治療に有効な量は、当分野における一般技術者によって、様々な要素に基づき（たとえば、臨床試験を通して）選択することができる。そのような要素としては、限定はしないが、生物学的利用能、代謝、半減期などの、活性成分の薬動学的パラメーター、疾患の重症度、患者の体重、患者の免疫状態、投与などを挙げることができる。一般に、活性成分を、約０．００００１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．０００１ｍｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの用量で毎日投与すると、申し分のない効果が得られる。たととば、処置条件の緊急性に応じて、いくつかの分割用量を毎週投与してもよいし、または用量を比例的に減らしてもよい。

本発明の薬学的に許容される担体としては、限定はしないが、食塩水、デキストロース、グリセロール、マンニトール、トレハロース、シクロデキストリン、アルミニウムアジュバント、尿素、リポソーム、脂質、油、タンパク質、タンパク質－抗体複合体、ペプチド、セルロース、ナノ粒子、ナノゲル、および他の組合せを挙げることができる。担体は、ことごとく当分野における一般技術者によく知られているとおり、投与の方式に合わせるべきである。

本発明はまた、微生物感染症および持続性感染症（たとえば、ウイルス感染症）または腫瘍を含む疾患を予防および／または処置するための医薬組成物の使用も提供する。

ワクチン組成物
本発明のワクチン組成物は、予防的になる（感染症を予防する）場合もあり、治療的になる場合もある。ワクチン組成物は、免疫原性抗原（タンパク質抗原など）を含み、担体特異的な抗体を誘導しない「薬学的に許容される担体」と組み合わせられる。適切な担体は、通常、大きく、ゆっくりと代謝される巨大分子、たとえば、水酸化アルミニウム、デキストロース、マンニトール、トレハロース、シクロデキストリン、担体タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー、アミノ酸コポリマー、油滴やリポソームなどの脂質凝集体、および／またはこれらのいずれかの組合せである。これらのベクターは、当分野における一般技術者によく知られている。加えて、こうしたベクターは、免疫刺激薬（「アジュバント」）として機能する。抗原は、細菌毒素（ジフテリア、破傷風、コレラ、ジフテリアＣＲＭ_１９７などのトキソイド）または担体タンパク質（ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８からのＬ１、メルケル細胞ウイルスからのＶＰ１、オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン）と接合することもできる。

上で言及した本発明の免疫刺激薬に加えて、ワクチン組成物に同じく加えることのできる、免疫原性組成物の効果を高める他のアジュバントとして、限定はしないが、（１）水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなどのアルミニウム、（２）（ａ）ＭＦ５９（ＷＯ９０／１４８３７を参照されたい）、（ｂ）ＳＡＦ、（ｃ）Ｒｉｂｉ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）などの、水中油エマルション製剤、（３）フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）およびフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）、（４）ＴＬＲアゴニスト、たとえば、ＣｐＧ、ＭＰＬ、ポリＩ：Ｃ、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、フラジェリン、レシキモド、（５）インターロイキン（ＩＬ－１、ＩＬ－２およびＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１２など）や腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのサイトカイン、（５）コレラ毒素ＣＴ、百日咳毒素ＰＴ、大腸菌易熱性毒素ＬＴ、たとえば、ＷＯ９３／１３３０２およびＷＯ９２／１９２６５などの、細菌性ＡＤＰリボシル化毒素解毒変異体、ならびに（６）組成物の有効性を高める他の物質を挙げることができる。

一実施形態では、ワクチン組成物は、抗原などの免疫原性組成物と、薬学的に許容される担体と、アジュバントとを含み、通常は、水、食塩水、グリセロール、緩衝液などの希釈剤を含有する。加えて、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝物質などの補助物質も含まれる場合がある。

より詳細には、免疫原性組成物を含むワクチンは、免疫学的に有効な量の免疫原性ポリペプチド、ならびに所望される他の上述の成分を含有する。「免疫学的に有効な量」とは、対象に一用量としてまたは連続的な投与量の一部として投与される量が、処置または予防に有効であることを意味する。その量は、個体の健康および生理機能、個体の種類（たとえば、ヒト）、個体の免疫系の抗体産生能、所望の防御の程度、ワクチンの製剤、医師による医学的状態の評価、および他の関連要素に応じて様々となりうる。この量は、比較的広い範囲内になり、型通りの実験によって求めることができると予想される。

一般に、ワクチン組成物または免疫原性組成物は、注射として、たとえば、液体の溶液または懸濁液として製剤することができ、注射前に溶液または懸濁液として調製するのに適する固体形態として製造することもできる。製剤は、アジュバント効果を高めるために、乳化してもよいし、またはリポソームに封入してもよい。

加えて、本発明のワクチン組成物は、一価または多価である場合がある。

投与経路および投与量
組成物は、対象に直接投与することができる。対象は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物である場合があり、好ましくはヒトである。ワクチンとして使用するとき、本発明の組成物は、知られているいずれかの方法を使用して、個体に直接投与することができる。こうしたワクチンは、従来のワクチンで使用されるのと同じ経路を使用して、かつ／または病原体の感染を模倣して投与されるのが普通である。

本発明の医薬組成物またはワクチン組成物の投与経路としては、限定はしないが、筋肉内、皮下、皮内、肺内、静脈内、鼻腔内、経膣、経口、または他の非経口投与経路を挙げることができる。所望であれば、投与経路は、疾患の状態に従って、組合せ、または調整してもよい。ワクチン組成物は、１回で、または複数回で投与することができ、免疫を惹起および／または維持するための追加免疫用量の投与を含む場合がある。

ワクチンは、「治療に有効な量」で与えられるべきであり、すなわち、ワクチンの量は、選択された投与経路で免疫応答を惹起するのに十分であり、宿主のウイルス感染からの防御を有効に促進しうる。

各用量について選択される抗原の量は、有意な副作用なく防御応答を誘発することになる量に基づく。一般に、宿主細胞の感染後、各用量は、約０．１μｇ～約１００００μｇ、好ましくは約１μｇ～約１００μｇ、より好ましくは約１０μｇ～約５０μｇのタンパク質抗原を含有する。特定のワクチンについての最適な投与量を求めるには、対象における抗体力価および他の反応を、標準の方法として使用することができる。追加免疫用量が必要であるかの判定には、免疫のレベルを使用することができる。血清中の抗体力価またはＰＢＭＣのＴ細胞機能を評価した後、追加免疫用量が必要となる場合がある。アジュバントおよび／または免疫刺激薬の投与によって、本発明の抗原に対する免疫応答が増大する場合がある。好ましい方法は、免疫原性組成物を、注射によって皮下または筋肉内経路から投与することである。

本発明について、以下で詳細な実施例に関連してさらに記載する。こうした実施例は、本発明を例証するために使用するにすぎず、本発明の範囲を限定するものではないと理解すべきである。以下の実施例では、通常は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（ニューヨーク州Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）に記載されているものなどの従来の条件、または製造者が推奨する条件に従って、実験方法の詳細な条件を示さなかった。別段指摘しない限り、百分率および部には、重量で言及する。

材料および方法
１．実験動物および細胞株
６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６雄マウスを、Ｈｕａｆｕｋａｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｏ．Ｌｔｄ（中国北京）から購入した。すべてのマウスを、環境が制御された条件で収容した。５匹のマウスを１つのケージに入れ、各ケージにおいて個別に換気した。すべての手順を、施設内の動物使用および保護委員会（ａｎｉｍａｌ ｕｓｅ ａｎｄ ｃａｒｅ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の承認を得て実施した。

ＤＣ２．４細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６骨髄由来樹状細胞である。

２．主な試薬
本発明の実施例において使用した主な試薬を表１に示す。

３．抗体
本発明の実施例において使用した主な抗体を表２に示す。

４．動物群および免疫化戦略を表３に示す。

５．マウス血液採取および血清調製
眼窩静脈叢から約２００μＬの血液を採取した。採取した血液を３７℃で４０分間インキュベートし、４℃で３０分間３０００ｒｐｍで遠心分離した。血清を集め、使用に向けて－８０℃で貯蔵した。

６．ＥＬＩＳＡによる特異的抗体力価検出
抗原を２μｇ／ｍＬに希釈して、４℃で終夜プレートをコートした。試験するマウス血清を１０倍勾配希釈によって希釈し、希釈された血清１００μｌを各ウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。３７℃で１時間の２００μｌ／ウェルの二次抗体インキュベーション。３７℃で１５分間のＴＭＢ反応。サンプルのＯＤ値に従って、抗原特異的ＩｇＧの力価を算出した。

７．遅延型過敏症（ＤＴＨ）試験
マウスに、対応する薬物１００μＬを皮下注射した。最後の免疫化後７日目に、マウス足蹠に、微量注射器を使用してＨＢｓＡｇ（１０μｇ／１０μＬ）を注射し、対照としてＰＢＳ １０μＬを右足蹠に注射した。注射後、２４時間、４８時間、および７２時間の時点で、それぞれ、ノギスを使用して足蹠厚を測定した。同じ部位を３回測定し、平均した。ＤＴＨ式：ＤＴＨ腫脹厚（ｍｍ）＝左足蹠厚（ｍｍ）－右足蹠厚（ｍｍ）。

８．フローサイトメトリーによる細胞内サイトカインの検出
マウス脾臓を無菌的に取り出し、単細胞懸濁液へと調製した。細胞を１×１０^７細胞／ｍｌに調整した。ＨＢｓＡｇ（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）を加えて、脾臓細胞を３７℃で１８時間刺激し、最後の６時間にかけて、ブレフェルディンＡ（ＢＦＡ）によってブロックし、ホルボールエステル（ＰＭＡ）１００ｎｇ／ｍｌおよびイオノマイシン１μｇ／ｍｌを陽性対照とした。５０μＬの染色系に適切な蛍光抗体を加え、細胞表面抗体を４℃で３０分間染色し、次いで、細胞内サイトカイン抗体を４℃で１．５時間インキュベートした。ＢＤフローサイトメトリーによる検出結果を、ＦｌｏｗＪｏ７．６ソフトウェアを使用して分析した。

９．カルボキシフルオレセイン二酢酸スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）によるＴ細胞増殖アッセイ
マウス脾臓を無菌的に取り出し、単細胞懸濁液へと調製した。細胞を１×１０^７細胞／ｍｌに調整した。ＨＢｓＡｇ（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）を加えて、脾臓細胞を３７℃で７２時間刺激し、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８（最終濃度１μｇ／ｍＬ、最終濃度１００ｎｇ／ｍＬ）を陽性対照とした。細胞を抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、および抗ＣＤ８で染色した。Ｔ細胞の増殖をフローサイトメトリーによって検出した。結果をＦｌｏｗＪｏ７．６ソフトウェアによって分析した。

１０．ＤＣ２．４細胞試験
１×１０^５細胞／ウェルのＤＣ２．４細胞を６ウェルプレートに播いた。５％ＣＯ２中にて、細胞を、それぞれ、ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）、ＧＭ－ＣＳＦ１μｇ／ｍＬ）、ＩＦＮ－α（１００ＩＵ／ｍＬ）、ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮ－αによって３７℃で７２時間刺激し、最後の６時間にかけてブレフェルディンＡ（ＢＦＡ）を加えた。ＤＣを７２時間培養した後、表面分子ＣＤ１１ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－ＩＩ、および細胞内サイトカインＩＬ１２を染色し、細胞をフローサイトメトリーによって検出した。

１１．ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性溶解アッセイ
マウス脾臓を無菌的に取り出し、単細胞懸濁液へと調製した。エフェクター細胞を、ＨＢｓＡｇのＣＴＬペプチド（１０μｇ／ｍＬ）によって３７℃で７２時間濃縮した。ターゲット細胞を、ＨＢｓＡｇのＣＴＬペプチド（１０μｇ／ｍＬ）によって１時間刺激した。エフェクター細胞のターゲット細胞に対する比は、５０：１とした。反応後、細胞をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色し、フローサイトメトリーによって検出した。

１２．ｉｎ ｖｉｖｏ細胞毒性溶解アッセイ
未処置Ｃ５７ＢＬ／６ドナーマウスからの脾細胞を１５ｍＭのＣＦＳＥで標識し、１ｍｇ／ｍＬのＳ２０８－２１５で瞬間標識した（ＣＦＳＥ高ターゲット細胞として定める）。非ＨＢＶターゲット対照として、等画分の脾細胞を１ｍＭのＣＦＳＥで標識し、１ｍｇ／ｍＬのＯＶＡ２５７－２６４で瞬間標識した（ＣＦＳＥ低ターゲット細胞として定める）。４回目のワクチン接種後１４日目に、ＣＦＳＥ_高とＣＦＳＥ_低細胞の１：１の比の混合物を、免疫化されたレシピエントに、マウス１匹あたり２×１０^７細胞で、静脈内養子移入した。８時間後、脾細胞をレシピエントから単離し、ＣＦＳＥ蛍光強度を分析した。

１３．免疫組織化学（ＩＨＣ）分析
４回目の免疫化後１４日目に、解剖された肝臓サンプルを集め、４％パラホルムアルデヒドで３日間固定した後、パラフィン蝋に包埋し、切断して厚さ５～１０ｍｍの薄片とした。肝臓切片は、組織学分析用に、ヘマトキシリン－エオシンで染色し、ＩＨＣ分析用に、ポリクローナルウサギ抗体と共にインキュベートした。

１４．統計分析
統計分析は、スチューデントｔ検定を使用して行い、０．０５未満のＰ値を有意であると考えた。

ＩＦＮ－α／ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥは、野生型マウスにおいて液性および細胞性免疫を誘発する
１．１ ＧＭ－ＣＳＦとＩＦＮ－αとＶＡＣＣＩＮＥの最適な用量比
３×ＧＭ－ＣＳＦ＋ＶＡＣＣＩＮＥレジメンと同じ免疫療法効果を実現する、ＧＭ－ＣＳＦとＩＦＮ－αとＶＡＣＣＩＮＥの最適な用量比を明らかにするために、ＧＭ－ＣＳＦとＩＦＮ－αとＶＡＣＣＩＮＥの様々な用量比を調べた。本発明者らは、１０μｇのＧＭ－ＣＳＦと１０，０００ＩＵのＩＦＮ－αを１μｇのＶＡＣＣＩＮＥと混合したレジメンの用量比において、ＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ１１ｃ^＋細胞の数が、他の比に比べて有意に高かったことを見出した（図１Ａ）。本発明者らは、動物において、１０μｇのＧＭ－ＣＳＦと１０，０００ＩＵのＩＦＮ－αを１μｇのＶＡＣＣＩＮＥと混合したものによって誘発されたＤＴＨ応答が、３×ＧＭＣＳＦ＋ＶＡＣＣＩＮＥと同じレベルに達し、他の用量比より有意に高かったことを見出した（図１Ｂ）。本発明者らはまた、そのような用量比のＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮ－α／ＶＡＣＣＩＮＥレジメンによって、３×ＧＭ－ＣＳＦ＋ＶＡＣＣＩＮＥに匹敵する最高レベルの高ＨＢｓＡｇが実現されたことも見出した（図１Ｃ）。これらの結果は、１０μｇのＧＭ－ＣＳＦと１０，０００ＩＵのＩＦＮ－αと１μｇのＶＡＣＣＩＮＥを用いたレジメンが、最適な用量比であることを示している。

詳細には、本実施形態では、６～８週齢の雄Ｃ５７Ｂ／Ｌ６マウスを選択する。

最初の実験については、３種の用量のＧＭ－ＣＳＦ（１０μｇ、２０μｇ、および３０μｇ）、３種の用量のＩＦＮ－α（１００ＩＵ、１，０００ＩＵ、１０，０００ＩＵ）、およびＨＢＶワクチン１μｇをそれぞれ選択し、３種の成分を混合し、０日目および１４日目に２回免疫化を行った。免疫化後１、２、および３日目に末梢血サンプルを採取し、ＤＣの変化を検出し、分析した。２１日目に、ＤＴＨおよびＨＢｓＡｂのレベルを検出した。実験結果から、末梢血におけるＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ１１ｃ^＋ＤＣの比率ならびにＤＴＨおよび抗ＨＢｓＡｇ応答のレベルが、１０μｇのＧＭ－ＣＳＦと１０，０００ＩＵのＩＦＮ－αと１μｇのＨＢＶワクチンの組合せによって有意に増大したことが示された（図１）。ＣＴＬ応答および抗ＨＢｓＡｇ抗体レベルは、同じ現象を示した（データは示さない）。

先行する実験では、１０μｇのＧＭ－ＣＳＦ濃度が選択されたうち最低であり、第２用量を発見する実験には、５μｇのＧＭ－ＣＳＦを加えた。同様に、より高い１００，００００ＩＵのＩＦＮ－α用量を、第２用量を発見する実験に加えた。結果を図２に示す。５μｇのＧＭ－ＣＳＦの種々の用量のＩＦＮ－αとの組合せによるＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ１１ｃ^＋ＤＣの比率および抗ＨＢｓＡｇのレベルおよびＤＴＨ応答は、１０μｇのＧＭ－ＣＳＦを他の用量のＩＦＮ－αと組み合わせたものより低かった。驚いたことに、１００，０００ＩＵのＩＦＮ－αを種々の用量のＧＭ－ＣＳＦと組み合わせたものは、１０，０００ＩＵ以下のＩＦＮ－αの組合せより、ＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ１１ｃ^＋ＤＣの比率ならびにＤＴＨおよび抗ＨＢｓＡｇのレベルに、有意な抑制効果をもたらした。この結果は、マウス免疫化に最適な用量比が、ＧＭ－ＣＳＦについては１０ｕｇ、ＩＦＮ－αについては１０，０００ＩＵであることを示している。

１．２ 成分の加工処理が免疫応答に与える効果
実験には、（ＧＭ－ＣＳＦとＩＦＮ－αとＨＢＶワクチンを免疫化の直前に混合する）プランＡ群、および（ＧＭ－ＣＳＦとＩＦＮ－αとＨＢＶワクチンを混合し、免疫化の前に４℃で１２時間保管する）プランＢ群を含めた。各群を０日目と１４日目に２回免疫化し、免疫化後１、２、および３日目に、末梢血およびリンパ節中のＤＣを試験し、２１日目に抗ＨＢｓＡｇレベルを検出した。結果から、プランＡおよびＢ群両方において、末梢血からのＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ１１ｃ^＋ＤＣの比率が、ＰＢＳ対照に比べて有意に高かった（Ｐ＜０．０１）ことが示された。しかし、プランＢ群の方が、プランＡ群より高かった（図３Ａ）。プランＡでは、局所リンパ節中のＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ１１ｃ^＋ＤＣの割合が有意に増加しなかったが、プランＢでは、局所リンパ節中のＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ１１ｃ^＋ＤＣの割合が有意に増加した（図３Ｂ）。加えて、プランＡ群による抗ＨＢｓＡｇ抗体の誘導は、プランＢ群より低かった（２１３６±１６５．２ｍＩＵ／ｍＬ対３０９４±１２６．６ｍＩＵ／ｍＬ、Ｐ＜０．０１、図３Ｃ）。これらの結果は、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－α、およびワクチンの各成分の混合加工処理は、免疫化前に４℃で少なくとも１２時間保管することがより有利であることを示している。

１．３ 免疫化後のマウスＤＴＨ反応
細胞性免疫のレベルは、Ｂ型肝炎ウイルスを一掃する能力とに正の相関が認められるため、細胞性免疫は、慢性Ｂ型肝炎の処置において重要な役割を果たす。ＤＴＨ試験は、細胞性免疫の最も好都合かつ直接的な評価である。図４Ａにあるとおりに示される免疫化戦略に基づき、ＨＢｓＡｇをマウス足蹠に注射して、表３に示した異なるレジメンで免疫化した野生型マウスのＤＴＨ応答を試験した。結果から、ＶＡＣＣＩＮＥのみ、ＩＦＮ－α／ＶＡＣＣＩＮＥ、ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥ、３×ＧＭ－ＣＳＦ＋ＶＡＣＣＩＮＥ、ＩＦＮ－α／ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥのすべてにおいてＤＴＨ応答を誘発することができたことが示された（図４Ｂ）。異なるレジメンを比較する統計分析として（図４Ｃ）。ＤＴＨ応答は、２４時間の時点で、３×ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥまたはＩＦＮ－α／ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥの動物において最も強く実現され、他の群より有意に高かった（Ｐ＜０．０１）。しかし、３×ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥ免疫化とＩＦＮ－α／ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥ免疫化とに有意差はなく（Ｐ＞０．０５）、２つのレジメンによって、同様のレベルの細胞性免疫が誘導されうることが示唆された。ＩＦＮ－α／ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥの単一製剤が使用しやすいことを考慮すると、ＩＦＮ－α／ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥレジメンを使用することは、ワクチン前のＧＭ－ＣＳＦによる３日間の予備処置（３×ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥ）より有利である。

１．４ ＩＦＮ－α／ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥの液性免疫に対する効果
防御抗体の産生は、ワクチン効力を評価する究極の判断基準であるとみなされる。

本発明者らは、各レジメンで免疫化後、抗ＨＢｓＡｇ抗体（ＨＢｓＡｂ）の力価を試験した。結果から、未処置マウス、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－α、およびＩＦＮ－α／ＧＭ－ＣＳＦによる免疫化では、ＨＢｓＡｂが誘導されなかったことが示された。ＶＡＣＣＩＮＥ、ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥ、ＩＦＮ－α／ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥ、および３×ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥでは、種々のレベルのＨＢｓＡｂが誘導された。ＩＦＮ－α／ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥ群におけるＨＢｓＡｂのレベル（２７４９±２３８．９ＩＵ／Ｌ）は、３×ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥ群におけるレベル（３０１６±１９６．２ＩＵ／Ｌ）よりわずかに低かったが、統計的有意差はなかった（Ｐ＞０．０５）。これら２つの群からのＨＢｓＡｂのレベルは、ＶＡＣＣＩＮＥ群（９１８．４±４３．２８ＩＵ／Ｌ）、ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥ群（１６６５±４５．９４ＩＵ／Ｌ）、およびＩＦＮ－α／ＶＡＣＣＩＮＥ群（１９０２±７６．９３ＩＵ／Ｌ、図２Ａ）に比べて、有意に増大していた。加えて、データからは、ＧＭ－ＣＳ／ＶＡＣＣＩＮＥ群およびＩＦＮ－α／ＶＡＣＣＩＮＥ群が、ＶＡＣＣＩＮＥ群より多くのＨＢｓＡｂを産生しうることも示された（Ｐ＜０．０１）。結果は、３×ＧＭ－ＣＳＦ＋ＶＡＣＣＩＮＥとＩＦＮ－α／ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥの両方の群において、より高いレベルの防御ＨＢｓＡｂが誘導されうることを示している。

ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１の比は、Ｔｈ１またはＴｈ２極性化に対する宿主免疫応答の評価に使用することができる。図５Ｂおよび５Ｃに示されるとおり、他の免疫群に比べて有意に高いＩｇＧ２ａ：ＩｇＧ１比は、ＩＦＮ－α／ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥ群および３×ＧＭ－ＣＳＦ＋ＶＡＣＣＩＮＥ群と関連付けられ（Ｐ＜０．０５）、ＩＦＮ－α／ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥおよび３×ＧＭ－ＣＳＦ＋ＶＡＣＣＩＮＥがＴｈ１型の応答をより多く促進するレジメンであることが示唆された。

１．５ ＩＦＮ－α／ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥの細胞性免疫に対する効果
ＨＢｓＡｇ特異的ＤＴＨおよびＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａについての先行する結果において、本発明者らは、ＩＦＮ－α／ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥ群および３×ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥ群がすべて、細胞性免疫を効率よく促進しうることを見出したが、細胞性免疫の重要性は、ウイルス感染を一掃することである。

ＨＢｓＡｇ特異的な細胞性免疫のレベルを、異なるレジメンにおいてさらに調べた。結果から、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、およびＩＬ－１７（図６Ｃ）ならびにＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮ－γ（図６Ｄ）の誘導のレベルが、ＩＦＮ－α／ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥ群および３×ＧＭ－ＣＳＦ＋ＶＡＣＣＩＮＥにおいて、他の群より有意に高かった（Ｐ＞０．０５）ことが示された。ＩＦＮ－α／ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥ群と３×ＧＭ－ＣＳＦ＋ＶＡＣＣＩＮＥ群とに有意差は認められず、両方のレジメンが、Ｔ細胞に同様のレベルのサイトカインを産生させうることが示唆された。

１．６ 免疫化後のＴ細胞増殖
Ｔリンパ球増殖は、細胞性免疫応答の重要な部分である。特有のレベルのＴ細胞増殖は、特定の抗原に対する免疫を反映する。この研究では、ＣＦＳＥ標識法を使用して、ＨＢｓＡｇに対するＴ細胞増殖を試験した。

データは、ＩＦＮ－α／ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥ群におけるＣＤ４＋Ｔ細胞増殖の誘導のレベルが、３×ＧＭ－ＣＳＦ＋ＶＡＣＣＩＮＥと比較して差がない（Ｐ＞０．０５、図７Ａ）ものの、他の群より有意に高かった（Ｐ＜０．０１）ことを示している。ＣＤ８＋Ｔリンパ球増殖レベルについては、ＩＦＮ－α／ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥ群が、ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥ群、ＧＭ－ＣＳＦ群、およびＶＡＣＣＩＮＥ群より有意に高い（Ｐ＜０．０５）ものの、３×ＧＭ－ＣＳＦ＋ＶＡＣＣＩＮＥ、ＩＦＮ－α／ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＦＮ－α／ＶＡＣＣＩＮＥ群とには差がなかった（Ｐ＞０．０５、図７Ｂ）。このことから、ＩＦＮ－α／ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥは、３×ＧＭ－ＣＳＦ＋ＶＡＣＣＩＮＥが誘発したのと同様のレベルで、Ｔリンパ球増殖も有意に促進することができる。

１．７ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＣＴＬアッセイ
ＣＤ８＋細胞溶解性細胞（ＣＴＬ）は、任意の治療用ワクチンの機能を評価するための鍵となる要素である。ＨＢＶ持続性感染症に関しては、ＨＢＶ抗原に特異的なＣＴＬが、感染した細胞からＨＢＶを除去する主要な力であると考えられる。この研究において、本発明者らは、異なる群からのＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞毒性を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＣＴＬアッセイを使用して調べた。結果は、ＩＦＮ－α／ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥおよび３×ＧＭ－ＣＳＦ＋ＶＡＣＣＩＮＥによって誘導されたＣＴＬのレベルが、他の方法より２０％高かったことを示している（Ｐ＜０．０１、図８）。

１．８ 抗原提示細胞（ＡＰＣ）の効果
先行する実験において、本発明者らは、ＩＦＮ－α／ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥレジメンによって、液性および細胞性免疫応答をより良好に刺激できることを見出しており、このレジメンが、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を効率よく活性化する可能性があることが示唆された。ＡＰＣ、特に樹状細胞（ＤＣ）は、生得免疫応答と適応免疫応答とを結び付ける決定的な役割を果たす。したがって、本発明者らは、ＩＦＮ－α／ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥレジメンが、ＤＣの機能に大きな影響を及ぼしうるという仮説を立てた。

まず、本発明者らは、ネズミ骨髄由来のＤＣ２．４細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで試験し、ＩＦＮ－α／ＧＭ－ＣＳＦによる処置によって、ＤＣによるＩＬ－１２の分泌を、ＩＦＮ－αまたはＧＭ－ＣＳＦのみに比べて有意に向上させることができたことを見出した（図９Ｂ）。ｉｎ ｖｉｖｏ実験で、本発明者らは、マウスにおいて、ＩＦＮ－α／ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥまたは３×ＧＭ－ＣＳＦ＋ＶＡＣＣＩＮＥ免疫化後２１日目に、血清ＩＬ－１２ｐ７０の濃度が、他の群により有意に増大したことも見出した（図９Ｃ）。

さらに、本発明者らは、ＩＦＮ－α／ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥレジメンによって誘導された、ＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ１１ｃ^＋ＤＣの頻度および絶対数、ＣＤ８０およびＭＨＣ－ＩＩの発現が、ＩＦＮ－α／ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－α／ＶＡＣＣＩＮＥ、ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥ、またはＶＡＣＣＩＮＥ群より有意に高かったことを観察した（Ｐ＜０．０５）。こうした誘導された変化は、ＩＦＮ－α／ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥおよび３×ＧＭ－ＣＳＦ＋ＶＡＣＣＩＮＥ群において、これら２つのレジメン間に有意差はないとはいえ、最高になった（図１０）。

１．９ ｉｎ ｖｉｖｏ単核細胞アッセイ
先行する結果に示されるとおり、本発明者らは、ＩＦＮ－α／ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥおよび３×ＧＭ－ＣＳＦ＋ＶＡＣＣＩＮＥレジメンによって、ＤＣの数および機能を有意に伸ばすことができたことを証明した。通常、ＤＣは、一定の数で存在する。単球は、異なるサイトカインのもとでマクロファージまたは樹状細胞へと分化し続けることができるため、増加するＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ１１ｃ^＋ＤＣ数の供給源は、単球の変換によるものであると思われる。ＩＦＮ－α／ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥレジメンによってｉｎ ｖｉｖｏで単球がＤＣに変換されたかを探るために、動物を種々のレジメンで免疫化し、その単球を免疫化の前後に分析した。データは、ＩＦＮ－α／ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥまたは３×ＧＭ－ＣＳＦ＋ＶＡＣＣＩＮＥレジメンで処置した末梢血からのＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｃ^＋単球の数が、他のレジメンによる数より有意に高かったことを示している（Ｐ＜０．０５）。同時に、こうした単球上でのＣＤ８０およびＭＨＣ－ＩＩの発現も、有意に増加した（図１１）。加えて、免疫化後２１日目において、ＥＬＩＳＡアッセイによって検出された、ＩＦＮ－α／ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥおよび３×ＧＭ－ＣＳＦ＋ＶＡＣＣＩＮＥレジメンからの血清中のＭＣＰ－１の濃度も、他の免疫化群より有意に高かった（Ｐ＜０．０５）。

１．１０ 要約
上記実験データから、ＩＦＮ－α／ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥによって、３×ＧＭ－ＣＳＦ＋ＶＡＣＣＩＮＥ用量と同じ免疫効果を実現できたことが示唆される。最適な用量および製剤としたこのＩＦＮ－α／ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥでは、３×ＧＭ－ＣＳＦ＋ＶＡＣＣＩＮＥの煩雑なプロトコールより、レジメンの使用がより容易になり、したがって、それに優る大きな利点がもたらされる。最適化されたＩＦＮ－α／ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥは、臨床での適用において、３×ＧＭ－ＣＳＦ＋ＶＡＣＣＩＮＥに完全に取って代わり、臨床利益を得ることができる。

ＩＦＮ－α／ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥは、ｒＡＡＶ－１．３ＨＢＶマウスにおいて免疫寛容を崩す
実施例１において、ＩＦＮ－α／ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥおよび３×ＧＭ－ＣＳＦ＋ＶＡＣＣＩＮＥは両方とも、野生型マウスにおいて液性および細胞性応答を刺激して、ＣＤ８^＋Ｔ細胞のＨＢＶ特異的ＣＴＬ活性を有意に増大させることができる。これらが、慢性Ｂ型肝炎における免疫寛容を崩してＨＢＶを一掃しうるかを試験するために、本発明者らは、新たな動物モデルを採用した。このモデルにおいて、本発明者らは、１．３コピーのＨＢＶゲノムを保有する組換え型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（ＡＡＶ８－１．３ＨＢＶ）を感染させて、ＨＢＶによって誘導された免疫寛容を確立し、このモデルを使用して、最適化されたＩＦＮ－α／ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥレジメンの効力を評価した。

２．１ ｒＡＡＶ－１．３ＨＢＶマウスモデルの樹立および検証
ｒＡＡＶ－１．３ＨＢＶ組換え型ウイルスが雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに感染しうるかどうかを検証するために、１×１０^６ｐｆｕ／ｍｌのウイルスを尾静脈から注射することによりモデルを樹立した。データは、血清サンプルが、感染した後、陽性としてのＨＢｅＡｇ（Ｓ／ＣＯ＞１）、６６７．９±８０．３９ＩＵ／ｍＬのＨＢｓＡｇ、および２０５．６±２８．９２コピー／ｍＬのＨＢＶ－ＤＮＡを含有していたことを示しており、これらは、ＰＢＳ対照群より有意に高かった（Ｐ＜０．０００１、図１２）。感染したマウスからのアラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）のレベルは、２０．８１±１．７２Ｕ／Ｌであり、ＰＢＳ対照群（２２．０１±１．４７Ｕ／Ｌ）とに統計的な差はなかった。免疫組織化学（ＩＨＣ）の結果は、ＨＢｃＡｇ陽性が、ｒＡＡＶ－１．３ＨＢＶウイルスで感染させた肝細胞においてのみ観察され、心臓および腎臓ではＨＢｃＡｇ陽性細胞が見出されなかったことを示した。Ｈ＆Ｅの結果は、ｒＡＡＶ－１．３ＨＢＶで感染させた肝臓細胞のサイズは、より大きくなったが、心筋細胞および腎細胞では明らかな変化が見出されなかったことを示した。

２．２ ｒＡＡＶ－１．３ＨＢＶマウスモデルモニタリング
ウイルス残存性を評価するために、本発明者らは、ウイルス感染後１２週間（ｗｐｉ）かけてマウスを継続的にモニターした。ＨＢｓＡｇおよびウイルスＤＮＡの発現は、１２ｗｐｉにかけて有意に減少することなく安定したままとなった（図１３）。加えて、この期間にかけての血清ＡＬＴレベルは、ＰＢＳ群とに有意差がなく、ｒＡＡＶ－１．３ＨＢＶが雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて持続性感染を引き起こしうることが示唆された。

２．３ Ｂ型肝炎マウスのＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮ－α／ＶＡＣＣＩＮＥ処置
最適化されたレジメンによって、こうしたマウスからＢ型肝炎ウイルス感染を一掃することができるかを試験するために、本発明者らは、ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮ－α／ＶＡＣＣＩＮＥ用に最適化された免疫化戦略を、ｒＡＡＶ８－１．３ＨＢＶで感染させたマウスの処置に適用した。感染したマウスを、種々のレジメンによって隔週で４回免疫化し、血清サンプルを採取して、示した各時点で分析した。本発明者らは、ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮ－α／ＶＡＣＣＩＮＥまたは３×ＧＭ－ＣＳＦ＋ＶＡＣＣＩＮＥ群の血清ＨＢｓＡｇレベルが、他の群に比べて有意に低下し、９ｗｐｉの時点の４回の免疫化後に減少したことを観察した（Ｐ＜０．０１、図１４）。血清ＨＢｅＡｇレベルは、７ｗｐｉの時点で、ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮ－α／ＶＡＣＣＩＮＥおよび３×ＧＭ－ＣＳＦ＋ＶＡＣＣＩＮＥの両方の処置群において、他の群に比べて有意に低下し、一掃された（Ｐ＜０．０１）。ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮ－α／ＶＡＣＣＩＮＥおよび３×ＧＭ－ＣＳＦ＋ＶＡＣＣＩＮＥのどちらの免疫化によっても、こうした免疫寛容動物において同様かつ強固な治療利益が得られ、両方のレジメンによって、動物モデルにおける持続性ＨＢＶ感染の一掃につながる活発な抗ＨＢＶ免疫応答を誘発できることが示唆された。

２．４ ＨＢＶ感染マウスからのＤＣに対するＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮ－α／ＶＡＣＣＩＮＥの効果
ＤＣは、細胞特異的な細胞性免疫の促進において決定的な役割を果たすため、本発明者らは、ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮ－α／ＶＡＣＣＩＮＥが、野生型マウスにおいてＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ１１ｃ^＋ＤＣの産生を有意に促進しうることを見出した。したがって、本発明者らはまた、ｒＡＡＶ８－１．３ＨＢＶ感染マウスにおけるＤＣ産生に対するＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮ－α／ＶＡＣＣＩＮＥの効果も調べようとした。

ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮ－α／ＶＡＣＣＩＮＥおよび３×ＧＭ－ＣＳＦ＋ＶＡＣＣＩＮＥの両方のレジメンによって、ＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ１１ｃ^＋ＤＣの産生を有意に促進することができ、その産生は、他の免疫化群より有意に高かった（Ｐ＜０．０１、図１５Ａ～Ｃ）。加えて、ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮ－α／ＶＡＣＣＩＮＥおよび３×ＧＭ－ＣＳＦ＋ＶＡＣＣＩＮＥレジメンでは、ＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ１１ｃ^＋ＤＣ上でのＣＤ８６、ＭＨＣ－Ｉ、およびＭＨＣ－ＩＩの発現も、他の免疫化群より有意に高く誘導された（Ｐ＜０．０５、図１５Ｄ～Ｅ）。ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮ－α／ＶＡＣＣＩＮＥ処置は、ＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ１１ｃ^＋ＤＣ産生を誘導しうるだけでなく、ＤＣが、こうしたｒＡＡＶ８－１．３ＨＢＶ感染マウスにおいて抗原を加工処理する能力も高めうる。

２．５ ＨＢＶ感染マウスにおける単球に対するＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮ－α／ＶＡＣＣＩＮＥの効果
ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮ－α／ＶＡＣＣＩＮＥは、野生型マウスにおいて、ＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｃ^＋単球を有意に促進したことが見出された。したがって、本発明者らは、ＨＢＶ感染マウスにおける単球に対するＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮ－α／ＶＡＣＣＩＮＥレジメンの効果を検証することを試みた。

ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮ－α／ＶＡＣＣＩＮＥおよび３×ＧＭ－ＣＳＦ＋ＶＡＣＣＩＮＥの両方のレジメンによって、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－α、ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮ－α、ＧＭ－ＣＳＦ／ＶＡＣＣＩＮＥ、およびＩＦＮ－α／ＶＡＣＣＩＮＥ群（Ｐ＜０．０５）、ならびにＰＢＳおよびＶＡＣＣＩＮＥ群（Ｐ＜０．０１、図１６）に比べて、優秀なレベルのＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^－Ｌｙ６Ｃ^ｈｉおよびＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^－Ｌｙ６Ｃ^ｌｏ単球（Ｐ＞０．０５）が誘導された。ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮ－α／ＶＡＣＣＩＮＥ群および３×ＧＭ－ＣＳＦ＋ＶＡＣＣＩＮＥ群における顆粒球の数は、他の群より有意に多かった（Ｐ＜０．０１）。ＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^－Ｌｙ６Ｃ^ｈｉ単球は、こうした単球上に、炎症の指標である、高レベルのＣＣＲ２^ｈｉを誘導することが実証されているのに対し、ＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^－Ｌｙ６Ｃ^ｈｉ単球は、ＣＣＲ２^ｌｏ循環血液中単球（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ）と関連付けられている。

２．６ ヒト単球のＤＣへの分化に対するＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮ－αの効果
本発明者らによって、ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮ－α／ＶＡＣＣＩＮＥがＤＣおよび単球の産生を促進しうることが実証されたため、本発明者らは、ＤＣと単球とに直接的な相関関係があるかを試験することとした。このために、ヒトＰＢＭＣからのＣＤ１４^＋単球を、抗ＣＤ１４を結合させた磁気ビーズによって単離し、それぞれ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－α、ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮ－α、およびＬＰＳで刺激した。結果から、ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＦＮ－αの両方によって、ＣＤ１４^＋単球のＣＤ１１ｃ^＋ＤＣへの変換を促進することができ、組合せの効果は、これらのいずれか一方より正確であったことが示された。ＧＭ－ＣＳＦとＩＦＮ－αの組合せによって、ＤＣ上でのＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＡ－Ａ２、およびＨＬＡ－ＤＲの発現を、これらのいずれか一方より助長することもできた。したがって、ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮ－αの組合せは、単球のＤＣへの変換を促進しうるだけでなく、より重要なことに、ＤＣの成熟および機能性をも助長しうる。

２．７ ＨＢＶ感染マウスにおける細胞性免疫に対するＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮ－α／ＶＡＣＣＩＮＥの効果
ＤＴＨは、抗原特異的な細胞性応答である。ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮ－α／ＶＡＣＣＩＮＥおよび３×ＧＭ－ＣＳＦ＋ＶＡＣＣＩＮＥのどちらのレジメンも、２４時間の時点で、ＨＢＶ感染マウスにおけるＤＴＨ応答およびほとんどの反応を他の群より有意に惹起しうる（Ｐ＜０．０１）（図１７Ａ）。

ＨＢＶ感染マウスにおいて、Ｔ細胞増殖は、ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮ－α／ＶＡＣＣＩＮＥ群および３×ＧＭ－ＣＳＦ＋ＶＡＣＣＩＮＥ群で、他の群に比べて有意に増強された（Ｐ＜０．０１、図１７Ｂ）。

ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮ－α／ＶＡＣＣＩＮＥおよび３×ＧＭ－ＣＳＦ＋ＶＡＣＣＩＮＥの両方の群が、ＨＢＶ感染マウスにおいて、高レベル（Ｐ＜０．０１）のＩＦＮ－γ産生性ＣＤ４^＋Ｔ細胞（Ｔｈ１）およびＣＤ８^＋Ｔ細胞（Ｔｃ１）、ＩＬ－４産生性ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、他の群に優って促進することができた（Ｐ＜０．０１、図１７ＣおよびＦ）。

肝臓組織におけるＣＤ８細胞の免疫組織化学分析によって、本発明者らは、ＨＢＶ感染マウスにおいて、ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮ－α／ＶＡＣＣＩＮＥおよび３×ＧＭ－ＣＳＦ＋ＶＡＣＣＩＮＥの両方の群で、肝臓へのＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤が他の群より多く誘発されたことを観察することができた（図１７Ｇ）。

ｉｎ ｖｉｖｏ ＣＴＬアッセイでは、ＨＢＶ感染マウスにおいて、ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮ－α／ＶＡＣＣＩＮＥおよび３×ＧＭ－ＣＳＦ＋ＶＡＣＣＩＮＥの両方の群で、ＨＢＶに対するＣＴＬを、他の群に比べて有意に高いレベル（４５％）で誘発することができた（図１７ＨＩ）。

２．８ ＨＢＶＨＢＶ感染マウスにおける液性応答に対するＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮ－α／ＶＡＣＣＩＮＥレジメンの効果
ｒＡＡＶ８－１．３ＨＢＶ感染マウスにおける液性免疫応答に対するＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮ－α／ＶＡＣＣＩＮＥレジメンの効果を調べるために、動物を、種々のレジメンによって隔週で４回免疫化し、その抗ＨＢＶ抗体応答について試験し、ＨＢｅＡｇ（図１８Ａ）およびＨＢｓＡｇ（図１８Ｂ）およびＨＢＶ－ＤＮＡ（図１８Ｃ）の濃度について分析した。本発明者らは、ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮ－α／ＶＡＣＣＩＮＥまたは３×ＧＭ－ＣＳＦ＋ＶＡＣＣＩＮＥのいずれかで４回免疫化した後、他の群に比べて、ＨＢｅＡｇおよびＨＢｓＡｇ両方のレベルが一掃され、血清ＨＢＶ－ＤＮＡレベルが検出限界を下回り、血清ＡＬＴが約３倍に増加したことを観察した。ＧＭ－ＣＳＦとＩＦＮ－αの組合せによって、高めのレベルのＡＬＴが誘導されたことも認められ、このような組合せでは、肝臓において高めの炎症が誘発されることが示唆された。肝臓免疫組織化学の分析によって、ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮ－α／ＶＡＣＣＩＮＥおよび３×ＧＭ－ＣＳＦ＋ＶＡＣＣＩＮＥ免疫化の後、肝臓におけるＨＢｃＡｇ陽性細胞が、有意に減少していたことが明らかになった（図１８Ｅ）。加えて、ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮ－α／ＶＡＣＣＩＮＥおよび３×ＧＭ－ＣＳＦ＋ＶＡＣＣＩＮＥ免疫化群だけにおいて、抗ＨＢｓＡｇ抗体を誘導することができた。抗体サブタイプをさらに調べると、ＩｇＧ２ａ：ＩｇＧ１＞１であることが示され、強力な細胞性免疫応答が誘導されたことが示唆された。

２．９ Ｌｙ６Ｃ^ｈｉＣＣＲ２^ｈｉ単球の封鎖がＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮ－α／ＶＡＣＣＩＮＥレジメンに及ぼす影響
ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮ－ａ／ＶＡＣＣＩＮＥは、ｒＡＡＶ８－１．３ＨＢＶ感染動物における末梢血中のＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^－Ｌｙ６Ｃ^ｈｉＣＣＲ２^ｈｉ単球を促進することができたため、細胞性および液性応答、最終的にはＨＢＶクリアランスと強く関連付けられた。Ｌｙ６Ｃ^ｈｉＣＣＲ２^ｈｉ単球が、免疫活性化の状況において特段に重要であり、免疫寛容を崩すのかを試験するために、本発明者らは、同じ動物モデルにおいて、ＣＣＲ２阻害剤を使用してＣＣＲ２機能をブロックした。

本発明者らは、まず第１に、末梢血からのＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｃ^ｈｉＣＣＲ２^ｈｉ単球およびＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ１１ｃ^＋ＤＣの比率が、ｉｎ ｖｉｖｏでＣＣＲ２阻害剤（ＩＮＣＢ３３４４）によってブロックした群において、ブロックしていない群より有意に低かったことを見出した（図１９Ａ～Ｂ）。それに対し、ＩＦＮ－γ産生性ＣＤ８＋Ｔ細胞および血清ＡＬＴは、ＣＣＲ２阻害剤で処置した動物において、非ブロック群より有意に低かった。さらに、本発明者らは、血清ＨＢｓＡｇおよびＨＢＶ－ＤＮＡレベルが、ＣＣＲ２阻害剤で処置した動物またはＰＢＳ対照群において少しばかり変化していたことも見出した。最後に、肝臓免疫組織化学の結果からは、ＣＣＲ２阻害剤で処置した動物において、ＨＢｃＡｇ陽性細胞のクリアランスが、非ブロック群に比べて激しく阻害されたことが示された。

ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮα－２ｂ／ＶＡＣＣＩＮＥの抗腫瘍免疫応答に対する効果を証明するために、本発明者らは、前立腺がんエピトープペプチド配列の１つ（ＰＡＰ、配列は、配列番号１として示されるＣＭＳＡＭＴＮＬＡＡＬＦＰＰＥＧである）をワクチン抗原とするために選択した。選択した前立腺がんエピトープペプチド（ＰＡＰ）を、まず、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と接合した。それを精製した後、５０μｇの接合抗原を、１０μｇのＧＭ－ＣＳＦおよび１０，０００ＩＵのＩＦＮα－２ｂと４℃で混合し、引き続いて、水酸化アルミニウムアジュバントと共に製剤した。製剤されたワクチンを使用して、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、週２回、２回にわたって皮下的に免疫化した。対照群として、５０μｇの接合抗原を、アルミニウムアジュバント中に製剤し、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、週２回、２回にわたって皮下的に免疫化した。前立腺がんエピトープペプチド（ＰＡＰ）をＢＳＡと接合し、ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮα－２ｂおよびアルミニウムアジュバントと共に上述のとおりに製剤した。免疫化の様式は、上で言及したスケジュールおよび経路と同じとした。免疫化から２週間後、抗原特異的な液性応答のレベルを調べるＥＬＩＳＡアッセイ用に、マウスの血清サンプルを採取し、遅延型過敏症（ＤＴＨ）アッセイのために、足蹠に１０μｇの接合抗原を注射した。本発明者らは、前立腺腫瘍抗原に対する抗体（図２０Ａ）およびＤＴＨ（図２０Ｂ）のレベルが、ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮα－２ｂ／接合ＰＡＰワクチンで免疫化した動物において、対照群より有意に高かったことを観察した。

ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮα－２ｂ／ＶＡＣＣＩＮＥの抗腫瘍免疫応答に対する効果を証明するために、本発明者らは、乳がんエピトープペプチドの１つ（ＷＴ１、配列番号２として示される配列：ＣＹＴＷＮＱＭＮＬＳＬＧＥＱＱＹＳＶ）をワクチン抗原とするために選択した。選択した乳がんエピトープペプチド（ＷＴ１）を、まず、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と接合した。それを精製した後、５０μｇの接合抗原を、１０μｇのＧＭ－ＣＳＦおよび１０，０００ＩＵのＩＦＮα－２ｂと４℃で混合し、引き続いて、水酸化アルミニウムアジュバントと共に製剤した。製剤されたワクチンを使用して、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、週２回、２回にわたって皮下的に免疫化した。対照群として、５０μｇの接合抗原を、アルミニウムアジュバント中に製剤し、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、週２回、２回にわたって皮下的に免疫化した。乳がんエピトープペプチド（ＷＴ１）をＢＳＡと接合し、ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮα－２ｂおよびアルミニウムアジュバントと共に上述のとおりに製剤した。免疫化の様式は、上で言及したスケジュールおよび経路と同じとした。免疫化から２週間後、抗原特異的な液性応答のレベルを調べるＥＬＩＳＡアッセイ用に、マウスの血清サンプルを採取し、遅延型過敏症（ＤＴＨ）アッセイのために、足蹠に１０μｇの接合抗原を注射した。本発明者らは、乳がん抗原に対する抗体（図２１Ａ）およびＤＴＨ（図２１Ｂ）のレベルが、ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮα－２ｂ／接合ＷＴ１ワクチンで免疫化した動物において、対照群より有意に高かったことを観察した。

ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮα－２ｂ／ＶＡＣＣＩＮＥの抗腫瘍免疫応答に対する効果を証明するために、本発明者らは、結腸直腸がんエピトープペプチドの１つ（ＣＥＡ、配列は、配列番号３として示されるＹＬＳＧＡＤＬＮＬＣである）をワクチン抗原とするために選択した。選択した乳がんエピトープペプチド（ＣＥＡ）を、まず、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と接合した。それを精製した後、５０μｇの接合抗原を、１０μｇのＧＭ－ＣＳＦおよび１０，０００ＩＵのＩＦＮα－２ｂと４℃で混合し、引き続いて、水酸化アルミニウムアジュバントと共に製剤した。製剤されたワクチンを使用して、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、週２回、２回にわたって皮下的に免疫化した。対照群として、５０μｇの接合抗原を、アルミニウムアジュバント中に製剤し、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、週２回、２回にわたって皮下的に免疫化した。結腸直腸がんエピトープペプチド（ＣＥＡ）をＢＳＡと接合し、ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮα－２ｂおよびアルミニウムアジュバントと共に上述のとおりに製剤した。免疫化の様式は、上で言及したスケジュールおよび経路と同じとした。免疫化から２週間後、抗原特異的な液性応答のレベルを調べるＥＬＩＳＡアッセイ用に、マウスの血清サンプルを採取し、遅延型過敏症（ＤＴＨ）アッセイのために、足蹠に１０μｇの接合抗原を注射した。本発明者らは、結腸直腸がん抗原に対する抗体（図２２Ａ）およびＤＴＨ（図２２Ｂ）のレベルが、ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮα－２ｂ／接合ＣＥＡワクチンで免疫化した動物において、対照群より有意に高かったことを観察した。

ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮα－２ｂ／ＶＡＣＣＩＮＥの抗腫瘍免疫応答に対する効果を証明するために、本発明者らは、結腸直腸がんエピトープペプチドの１つ（Ｅ６、配列は、配列番号４として示されるＤＫＫＱＲＦＨＮＩＲＧＲＷＴＧＲＣＭＳＣＣＲＳＳＲＴＲＲＥＴＱＬＣである）をワクチン抗原とするために選択した。選択した結腸直腸がんエピトープペプチド（Ｅ６）を、まず、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と接合した。それを精製した後、５０μｇの接合抗原を、１０μｇのＧＭ－ＣＳＦおよび１０，０００ＩＵのＩＦＮα－２ｂと４℃で混合し、引き続いて、水酸化アルミニウムアジュバントと共に製剤した。製剤されたワクチンを使用して、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、週２回、２回にわたって皮下的に免疫化した。対照群として、５０μｇの接合抗原を、アルミニウムアジュバント中に製剤し、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、週２回、２回にわたって皮下的に免疫化した。結腸直腸がんエピトープペプチド（Ｅ６）をＢＳＡと接合し、ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮα－２ｂおよびアルミニウムアジュバントと共に上述のとおりに製剤した。免疫化の様式は、上で言及したスケジュールおよび経路と同じとした。免疫化から２週間後、抗原特異的な液性応答のレベルを調べるＥＬＩＳＡアッセイ用に、マウスの血清サンプルを採取し、遅延型過敏症（ＤＴＨ）アッセイのために、足蹠に１０μｇの接合抗原を注射した。本発明者らは、結腸直腸がん抗原に対する抗体（図２３Ａ）およびＤＴＨ（図２３Ｂ）のレベルが、ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮα－２ｂ／接合Ｅ６ワクチンで免疫化した動物において、対照群より有意に高かったことを観察した。

ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮα－２ｂ／ＶＡＣＣＩＮＥの抗腫瘍免疫応答に対する効果を証明するために、本発明者らは、肝細胞癌（ＨＣＣ）エピトープペプチドの１つ（Ｔｒｐ、配列は、配列番号５として示されるＣＲＰＧＷＲＡＡＣＮＱＫＩＬである）をワクチン抗原とするために選択した。選択した肝細胞癌エピトープペプチド（Ｔｒｐ）を、まず、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と接合した。それを精製した後、５０μｇの接合抗原を、１０μｇのＧＭ－ＣＳＦおよび１０，０００ＩＵのＩＦＮα－２ｂと４℃で混合し、引き続いて、水酸化アルミニウムアジュバントと共に製剤した。製剤されたワクチンを使用して、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、週２回、２回にわたって皮下的に免疫化した。対照群として、５０μｇの接合抗原を、アルミニウムアジュバント中に製剤し、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、週２回、２回にわたって皮下的に免疫化した。肝細胞癌エピトープペプチド（Ｔｒｐ）をＢＳＡと接合し、ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮα－２ｂおよびアルミニウムアジュバントと共に上述のとおりに製剤した。免疫化の様式は、上で言及したスケジュールおよび経路と同じとした。免疫化から２週間後、抗原特異的な液性応答のレベルを調べるＥＬＩＳＡアッセイ用に、マウスの血清サンプルを採取し、遅延型過敏症（ＤＴＨ）アッセイのために、足蹠に１０μｇの接合抗原を注射した。本発明者らは、ＨＣＣがん抗原に対する抗体（図２４Ａ）およびＤＴＨ（図２４Ｂ）のレベルが、ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮα－２ｂ／接合ＨＣＣワクチンで免疫化した動物において、対照群より有意に高かったことを観察した。

ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮα－２ｂ／ＶＡＣＣＩＮＥの抗腫瘍免疫応答に対する効果を証明するために、本発明者らは、多発性骨髄腫エピトープペプチドの１つ（ＭＡＧＥ－Ａ３、配列：配列番号６として示されるＫＶＡＥＬＶＨＦＬＦＬＷＧＰＲＡＬＶＣ）をワクチン抗原とするために選択した。選択した多発性骨髄腫エピトープペプチド（ＭＡＧＥ－Ａ３）を、まず、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と接合した。それを精製した後、５０μｇの接合抗原を、１０μｇのＧＭ－ＣＳＦおよび１０，０００ＩＵのＩＦＮα－２ｂと４℃で混合し、引き続いて、水酸化アルミニウムアジュバントと共に製剤した。製剤されたワクチンを使用して、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、週２回、２回にわたって皮下的に免疫化した。対照群として、５０μｇの接合抗原を、アルミニウムアジュバント中に製剤し、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、週２回、２回にわたって皮下的に免疫化した。多発性骨髄腫エピトープペプチド（ＭＡＧＥ－Ａ３）をＢＳＡと接合し、ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮα－２ｂおよびアルミニウムアジュバントと共に上述のとおりに製剤した。免疫化の様式は、上で言及したスケジュールおよび経路と同じとした。免疫化から２週間後、抗原特異的な液性応答のレベルを調べるＥＬＩＳＡアッセイ用に、マウスの血清サンプルを採取し、遅延型過敏症（ＤＴＨ）アッセイのために、足蹠に１０μｇの接合抗原を注射した。本発明者らは、多発性骨髄腫抗原に対する抗体（図２５Ａ）およびＤＴＨ（図２５Ｂ）のレベルが、ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮα－２ｂ／接合ＭＡＧＥ－Ａ３ワクチンで免疫化した動物において、対照群より有意に高かったことを観察した。

ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮα－２ｂ／ＶＡＣＣＩＮＥの抗腫瘍免疫応答に対する効果を証明するために、本発明者らは、腎細胞癌抗原エピトープペプチドの１つ（ｈＴＥＲＴ、配列：配列番号７として示されるＥＡＲＰＡＬＬＴＳＲＬＲＦＩＰＫＣ）をワクチン抗原とするために選択した。

選択した結腸直腸がんエピトープペプチド（ｈＴＥＲＴ）を、まず、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と接合した。それを精製した後、５０μｇの接合抗原を、１０μｇのＧＭ－ＣＳＦおよび１０，０００ＩＵのＩＦＮα－２ｂと４℃で混合し、引き続いて、水酸化アルミニウムアジュバントと共に製剤した。製剤されたワクチンを使用して、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、週２回、２回にわたって皮下的に免疫化した。対照群として、５０μｇの接合抗原を、アルミニウムアジュバント中に製剤し、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、週２回、２回にわたって皮下的に免疫化した。結腸直腸がんエピトープペプチド（ｈＴＥＲＴ）をＢＳＡと接合し、ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮα－２ｂおよびアルミニウムアジュバントと共に上述のとおりに製剤した。免疫化の様式は、上で言及したスケジュールおよび経路と同じとした。免疫化から２週間後、抗原特異的な液性応答のレベルを調べるＥＬＩＳＡアッセイ用に、マウスの血清サンプルを採取し、遅延型過敏症（ＤＴＨ）アッセイのために、足蹠に１０μｇの接合抗原を注射した。本発明者らは、腎細胞癌がん抗原に対する抗体（図２６Ａ）およびＤＴＨ（図２６Ｂ）のレベルが、ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮα－２ｂ／接合ｈＴＥＲＴワクチンで免疫化した動物において、対照群より有意に高かったことを観察した。

ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮα－２ｂ／ＶＡＣＣＩＮＥの抗腫瘍免疫応答に対する効果を証明するために、本発明者らは、Ａ型連鎖球菌抗原エピトープペプチドの１つ（Ｊ８、配列は、配列番号８として示されるＱＡＥＤＫＶＫＱＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＫＱＬＥＤＫＶＱＣである）をワクチン抗原とするために選択した。選択したＡ型連鎖球菌抗原エピトープペプチド（Ｊ８）を、まず、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と接合した。それを精製した後、５０μｇの接合抗原を、１０μｇのＧＭ－ＣＳＦおよび１０，０００ＩＵのＩＦＮα－２ｂと４℃で混合し、引き続いて、水酸化アルミニウムアジュバントと共に製剤した。製剤されたワクチンを使用して、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、週２回、２回にわたって皮下的に免疫化した。対照群として、５０μｇの接合抗原を、アルミニウムアジュバント中に製剤し、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、週２回、２回にわたって皮下的に免疫化した。Ａ型連鎖球菌抗原エピトープペプチド（Ｊ８）をＢＳＡと接合し、ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮα－２ｂおよびアルミニウムアジュバントと共に上述のとおりに製剤した。免疫化の様式は、上で言及したスケジュールおよび経路と同じとした。免疫化から２週間後、抗原特異的な液性応答のレベルを調べるＥＬＩＳＡアッセイ用に、マウスの血清サンプルを採取し、遅延型過敏症（ＤＴＨ）アッセイのために、足蹠に１０μｇの接合抗原を注射した。本発明者らは、Ａ型連鎖球菌抗原に対する抗体（図２７Ａ）およびＤＴＨ（図２７Ｂ）のレベルが、ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮα－２ｂ／接合Ｊ８ワクチンで免疫化した動物において、対照群より有意に高かったことを観察した。

ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮα－２ｂ／ＶＡＣＣＩＮＥの抗腫瘍免疫応答に対する効果を証明するために、本発明者らは、ＨＩＶエピトープペプチドの１つ（Ｃ４－Ｖ３、配列は、配列番号９として示されるＫＱＩＩＮＭＷＱＥＶＧＫＡＭＹＡＲＰＮＣＮＴＲＫＳＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴＴＧＥＩＩＣである）をワクチン抗原とするために選択した。選択したＨＩＶエピトープペプチド（Ｃ４－Ｖ３）を、まず、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と接合した。それを精製した後、５０μｇの接合抗原を、１０μｇのＧＭ－ＣＳＦおよび１０，０００ＩＵのＩＦＮα－２ｂと４℃で混合し、引き続いて、水酸化アルミニウムアジュバントと共に製剤した。製剤されたワクチンを使用して、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、週２回、２回にわたって皮下的に免疫化した。対照群として、５０μｇの接合抗原を、アルミニウムアジュバント中に製剤し、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、週２回、２回にわたって皮下的に免疫化した。ＨＩＶエピトープペプチド（Ｃ４－Ｖ３）をＢＳＡと接合し、ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮα－２ｂおよびアルミニウムアジュバントと共に上述のとおりに製剤した。免疫化の様式は、上で言及したスケジュールおよび経路と同じとした。免疫化から２週間後、抗原特異的な液性応答のレベルを調べるＥＬＩＳＡアッセイ用に、マウスの血清サンプルを採取し、遅延型過敏症（ＤＴＨ）アッセイのために、足蹠に１０μｇの接合抗原を注射した。本発明者らは、ＨＩＶ抗原に対する抗体（図２８Ａ）およびＤＴＨ（図２８Ｂ）のレベルが、ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮα－２ｂ／接合Ｃ４－Ｖ３ワクチンで免疫化した動物において、対照群より有意に高かったことを観察した。

ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮα－２ｂ／ＶＡＣＣＩＮＥの抗腫瘍免疫応答に対する効果を証明するために、本発明者らは、２種の付加的なＨＢＶポリペプチド（配列番号１０として示される、コドンが最適化されたＰｒｅＳ、および配列番号１１として示されるそのｃＤＮＡ配列、ならびに、配列番号１２として示される、コドンが最適化されたＰｒｅＳ１）をワクチン抗原とするために選択した。

５０μｇの接合抗原を、１０μｇのＧＭ－ＣＳＦおよび１０，０００ＩＵのＩＦＮα－２ｂと４℃で混合し、引き続いて、水酸化アルミニウムアジュバントと共に製剤した。製剤されたワクチンを使用して、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、週２回、２回にわたって皮下的に免疫化した。対照群として、５０μｇの接合抗原を、アルミニウムアジュバント中に製剤し、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、週２回、２回にわたって皮下的に免疫化した。

１ｕｇのＰｒｅＳまたは１ｕｇのＰｒｅＳ１を、それぞれ、１０μｇのＧＭ－ＣＳＦおよび１０，０００ＩＵのＩＦＮα－２ｂと４℃で混合し、引き続いて、水酸化アルミニウムアジュバントと共に製剤した。６～８週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを、隔週で３回、それぞれＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮ－α／ＰｒｅＳまたはＧＭ－ＣＳＦ／ＩＦＮ－α／ＰｒｅＳ１で皮下的に免疫化した。対照群は、ＰｒｅＳまたはＰｒｅＳ１のいずれかのみで免疫化した。各免疫化の前後に、液性応答のレベルをＥＬＩＳＡによって検出した。抗ＰｒｅＳ１またはＰｒｅＳ特異的抗体のレベルは、図２９に示されるとおり、対照より有意に高かった。

本発明について、その好ましい実施形態に関して述べてきたが、当業者なら、本発明は、添付の請求項の真意および視野の範囲内で変更を加えて実施してもよいことを認められよう。したがって、本発明は、上述のとおりの実施形態に限定されるべきでなく、本明細書で提供する記述の真意および視野の範囲内にあるそのすべての変形形態および均等物をさらに包含すべきである。

Claims (26)

1. 少なくとも抗原、ならびに少なくとも、組換え型インターフェロンと顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とを含む免疫賦活薬を含む免疫療法用医薬組成物であって、
   組換え型インターフェロンの含有量の組換え型顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の含有量に対する比が、（約０．５×１０ ^４ ＩＵ～約５×１０ ^４ ＩＵ）対（約５μｇ～約５０μｇ）であり、ここで組換え型インターフェロンがインターフェロンアルファ－２ｂである、前記免疫療法用医薬組成物。
2. 抗原が組換え型タンパク質抗原を含む、請求項１に記載の免疫療法用医薬組成物。
3. インターフェロンアルファ－２ｂの含有量の組換え型顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の含有量に対する比が、（約０．５×１０ ^４ ＩＵ～約１．５×１０ ^４ ＩＵ）対（約５μｇ～約２０μｇ）である、請求項１または２に記載の免疫療法用医薬組成物。
4. インターフェロンアルファ－２ｂの含有量の組換え型顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の含有量に対する比が、約１×１０ ^４ ＩＵ対約１０μｇである、請求項１～３のいずれか一項に記載の免疫療法用医薬組成物。
5. 組換え型タンパク質抗原が、ウイルス性抗原、細菌性抗原、真菌性抗原、寄生生物抗原、および腫瘍抗原のうちの少なくとも１つである、請求項２に記載の免疫療法用医薬組成物。
6. ウイルス性抗原が、ＨＢＶ抗原、ヘルペスウイルス抗原、ＨＰＶ抗原、ＨＩＶ抗原、メルケル細胞ウイルス抗原、インフルエンザ抗原、およびＲＳＶ抗原の少なくとも１種である、請求項５に記載の免疫療法用医薬組成物。
7. 組換え型タンパク質抗原が、不活化ワクチン抗原、弱毒化ワクチン抗原、またはサブユニットワクチン抗原である、請求項２に記載の免疫療法用医薬組成物。
8. 組換え型タンパク質抗原が遺伝子改変組換え抗原である、請求項２に記載の免疫療法用医薬組成物。
9. 抗原が、Ｂ型肝炎抗原、または配列番号１０に示されるＨＢＶ ＰｒｅＳタンパク質または配列番号１２に示されるＨＢＶ ＰｒｅＳ１タンパク質であり、免疫療法用医薬組成物によって、免疫寛容を崩し、抗ＨＢｓＡｂを生じさせながら、感染した肝細胞、ＨＢｅＡｇ、およびＨＢｓＡｇを除去することができる、請求項１に記載の免疫療法用医薬組成物。
10. 薬学的または免疫学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の免疫療法用医薬組成物。
11. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の免疫療法用医薬組成物を調製する方法であって、抗原と、組換え型インターフェロンと、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子と、薬学的または免疫学的に許容される担体または賦形剤とを、無菌条件下で混合して、免疫療法用医薬組成物を生成するステップを含み、ここで組換え型インターフェロンがインターフェロンアルファ－２ｂである、方法。
12. １）単球産生を促進するステップと、
    ２）単球ＣＣＲ２の発現を促進するステップと、
    ３）Ｌｙ６ＣｈｉＣＣＲ２＋単球の、表現型がＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋であるＤＣへの分化を促進するステップと、
    ４）対象の細胞性免疫およびＣＴＬ細胞溶解機能を向上させるステップと、
    ５）対象の液性免疫および１種または数種の防御抗体の産生を促進するステップ
    における使用のための請求項１～１０のいずれか一項に記載の免疫療法用医薬組成物。
13. ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生生物感染症、および腫瘍のうちの１つまたは複数を予防または処置における使用のための請求項１２に記載の使用のための免疫療法用医薬組成物。
14. ウイルス感染症が、ヒト肝炎ウイルス感染症、ヘルペスウイルス感染症、ヒトパピローマウイルス感染症、ヒト免疫不全ウイルス感染症、メルケル細胞ウイルス感染症、インフルエンザウイルス感染症、およびＲＳウイルス感染症のうちの１つまたは複数を含む、請求項１３に記載の使用のための免疫療法用医薬組成物。
15. ウイルス感染症が慢性Ｂ型肝炎である、請求項１３に記載の使用のための免疫療法用医薬組成物。
16. 抗原が、Ｂ型肝炎抗原、または配列番号１０に示されるＨＢＶ ＰｒｅＳタンパク質または配列番号１２に示されるＨＢＶ ＰｒｅＳ１タンパク質であり、免疫療法用医薬組成物によって、免疫寛容を崩し、抗ＨＢｓＡｂを生じさせながら、感染した肝細胞、ＨＢｅＡｇ、およびＨＢｓＡｇを除去することができる、請求項１２に記載の使用のための免疫療法用医薬組成物。
17. 抗原が腫瘍抗原であり、免疫療法用医薬組成物によって、抗腫瘍免疫応答が誘発される、請求項１２に記載の使用のための免疫療法用医薬組成物。
18. 腫瘍抗原が、前立腺がん抗原ポリペプチドまたはエピトープペプチド、乳がん抗原ポリペプチドまたはエピトープペプチド、結腸直腸がん抗原ポリペプチドまたはエピトープペプチド、子宮頚がんポリペプチドまたはエピトープペプチド、肝臓がんポリペプチドまたはエピトープペプチド、多発性骨髄腫ポリペプチドまたはエピトープペプチド、および腎細胞癌ポリペプチドまたはエピトープペプチドのうちの少なくとも１つを含む、請求項１７に記載の使用のための免疫療法用医薬組成物。
19. 抗原が、連鎖球菌抗原の１つであり、免疫療法用医薬組成物によって、抗細菌感染を生じる免疫応答が誘発される、請求項１２に記載の使用のための免疫療法用医薬組成物。
20. 連鎖球菌抗原が、修飾されたＡ型連鎖球菌エピトープペプチドである、請求項１９に記載の使用のための免疫療法用医薬組成物。
21. 抗原が、ＨＩＶ抗原の１つであり、免疫療法用医薬組成物によって、抗ＨＩＶ感染を生じる免疫応答が誘発される、請求項１２に記載の使用のための免疫療法用医薬組成物。
22. ＨＩＶ抗原がＨＩＶエピトープペプチドである、請求項２１に記載の使用のための免疫療法用医薬組成物。
23. 抗原が、メルケル細胞ウイルス抗原の１つであり、免疫療法用医薬組成物によって、抗メルケル細胞ウイルス感染を生じる免疫応答が誘発される、請求項１２に記載の使用のための免疫療法用医薬組成物。
24. メルケル細胞ウイルス抗原が、メルケル細胞ポリペプチドの１つである、請求項２３に記載の使用のための免疫療法用医薬組成物。
25. 安全かつ治療に有効な量の免疫療法用医薬組成物の、免疫化する対象への投与における使用のための、請求項１２～２４のいずれか一項に記載の免疫療法用医薬組成物。
26. 対象が哺乳動物である、請求項２５に記載の使用のための医薬組成物。

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