WO2014139359A1

WO2014139359A1 - 乙型肝炎疫苗

Info

Publication number: WO2014139359A1
Application number: PCT/CN2014/072570
Authority: WO
Inventors: 杜笑寒; 葛君; 庄晓倩; 周童; 李建强; 宋翠灵; 孙莹; 王美菊; 顾月; 孙洪林; 徐振兴; 黄红颖; 陈晓晓
Original assignee: 江苏先声药业有限公司
Priority date: 2013-03-13
Filing date: 2014-02-26
Publication date: 2014-09-18
Also published as: US20160136264A1; JP6499592B2; CN104043120B; US9878035B2; EP2974740A1; EP2974740B1; EP2974740A4; HK1218872A1; JP2016512204A; CN104043120A

Abstract

本发明公开了一种组合物，包含：i）HBsAg、该抗原的片段、该抗原的变体，或者至少两种的混合物，ii）HBcAgl-X，该抗原的片段、该抗原或者该抗原的片段的变体，或者其至少两种的混合物，其中X是149-183的整数，iii）CpG-ODN，该寡聚核苷酸为全硫代修饰，其序列中具有两个或两个以上拷贝的5'-NTCGTT-3'基序，其长度为21个碱基。本发明还公开了该组合物用于治疗HBV感染和HBV介导的疾病中的用途，以及治疗HBV感染和HBV介导的疾病的方法。

Description

乙型肝炎疫苗技术领域

[01] 本发明涉及一种乙型肝炎疫苗。特别地，本发明涉及一种乙型肝炎疫苗，其包含乙肝表面抗原、乙肝核心抗原和具有免疫刺激活性的硫代寡聚脱氧核苷酸。背景技术

[02] 乙型肝炎病毒（HBV )感染是世界范围的严重公共卫生问题之一。 HBV感染是导致慢性乙型肝炎、肝硬化和肝细胞癌的重要原因（ Fattovich G. J Hepatol 2008;48:335-352 )。临床治疗慢性 HBV感染的常用药物主要有核苷类似物和干扰素。核苷类似物无法完全清除肝细胞内的 cccDNA, 且长期使用易导致耐药突变株的出现以及停药后反弹（Kwon H， Lok AS. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2011; 8:275-284. )。干扰素不适合用于无症状的 HBV携带者，在慢性 HBV患者中，使用半年后 HBeAg 血清学转换发生率仅 33%，而且干扰素副作用较大也限制其应用（Tang SX, Yu GL丄 ancet 1990;335(8684)： 302)„

[03] 目前广泛应用的乙肝蛋白疫苗通过诱导体液免疫，产生保护性抗体，达到预防的目的。大量的研究发现保护性抗体仅能够消除胞外病毒颗粒，而清除胞内感染的病毒则主要依赖特异性的细胞免疫反应，辅助性 T细胞、 CD⁴⁺T细胞产生的 IFN-γ等 Thl 型细胞因子，尤其是病毒特异性的杀伤性 T淋巴细胞 (cytotoxic T lymphocyte, CTL)来清除（ Chin R， Lacamini S. Rev Med Viorl. 2003:13(4):255-72 )。细胞免疫反应的强弱直接决定着乙肝的预后。因此，理想的治疗性乙肝疫苗需要同时诱导特异性的体液免疫和细胞免疫，突破乙肝的免疫耐受。

[04] 目前国内大多数乙肝治疗性疫苗的研发思路围绕着 HBsAg, 通过克服免疫耐受，产生抗 HBsAg的抗体达到免疫清除的效果，如闻玉梅的 HBsAg-免疫球蛋白复合物（ Xu D Z, Zhao K， et al. PLoS CW£，2008，3:e2565 )，张宜俊的高剂量乙肝表面抗原疫苗（曾滢，张宜俊等，广东医学， 2003年 24卷 07期， 740-706页）等均采用此思路，从其最新的临床数据来看，这两个疫苗的治疗效果还不明朗。

[05] 研究表明，慢性乙肝感染患者的抗 HBsAg 的抗体亚型以 IgG4为主，而乙肝感染治愈的患者的抗 HBsAg的抗体亚型为 IgGl≥IgG4 , 说明在乙肝感染的清除过程中 Thl 型抗体亚型 IgGl发挥着重要的作用，评价 Thl型抗体亚型是否高于或者等于 Th2 型抗体亚型可能提示乙肝治疗的效果（S. Rath, et al. Clin.exp. Immunol.(19SS)12,164-161 )„ 同时，乙肝感染患者的抗 HBcAg抗体亚型为 IgGl > IgG3 > IgG4,而乙肝感染治愈的患者的抗 HBcAg亚型发生转变，为 IgG3>IgGl>IgG4，说明抗 HBcAg 特别是抗 HBcAg的抗体亚型的转变可能与乙肝的治疗息息相关 ( Chien-Fu Huang, et al. Cellular & Molecular Immunology. 2006;3(2):97-106. )₀

[06] 此外，还有研究表明，慢性乙肝病毒携带者和慢性乙肝患者的树突状细胞（ pDC )表面受体 TLR9表达下调，从而导致机体对乙肝表面抗原的免疫耐受，不能产生乙肝表面抗体或对乙肝表面抗原的细胞免疫 ( Q. Xie et al. Microbes and Infection 11 (2009) 515-523 )„

[07] 专利 US4547367利用 HBcAg颗粒治疗 /预防 HBV感染和 HBV介导的疾病， HBcAg颗粒免疫黑猩猩可保护黑猩猩免于感染 HBV。而且 HBcAg颗粒联合 HBsAg颗粒免疫乙肝携带者母亲生产的新生儿，产生高滴度的抗 HBsAg和抗 HBcAg抗体，且在 18个月的监测中均未见 HBV感染。但是该专利并无明确提出抗 HBcAg抗体亚型转变的证据，且无治疗 HBV感染和 HBV 介导的疾病的直接证据。

[08] 专利 WO2007/031334, 保护了乙肝治疗性疫苗组分，其包含 HBsAg、 HBcAg和一种皂苷佐剂，而 CpG-ODN可作为共用佐剂使用，但是，该乙肝治疗性疫苗在临床中需要联合核苷类似物进行联合治疗才能突破乙肝的免疫耐受，且 e 抗原转阴仅发明内容

[09] 本发明涉及一种药物组合物，其包含： i ) 乙肝表面抗原 ( HBsAg ), ii ) 乙肝核心抗原 ( HBcAg ), iii ) CpG寡 it氧核苷酸（CpG-ODN )和 /或任选地 iv )可药用载体。特别地，本发明的药物组合物用作预防性或治疗性疫苗。在某些实施方案中，所述药物组合物由上述组分 i ) -- iii )和任选地 iv )组成。

[10] 在本发明的一些实施方案中，所述 HBsAg 具有 SEQ ID ΝΟ:1所示序列。

[11] 在本发明的另一些实施方案中，所述 HBcAg具有 SEQ ID NO:2所示序列。

[12] 在本发明的又一些实施方案中，所述 CpG-ODN 包含硫代磷酸酯连接。特别地，所述 CpG-ODN为硫代寡聚脱氧核苷酸，优选地为全硫代寡聚脱氧核苷酸。

[13] 在本发明的又一些实施方案中，所述 CpG-ODN 包含两个或更多的 5，-NTCGTT-3，基序。

[14] 在本发明的又一些实施方案中，所述 CpG-ODN长度为 15 ~ 35个核苷酸，优选 20~25个核苷酸。

[15] 在本发明的又一些实施方案中，所述 CpG-ODN具有选自下列的序列： 5，-TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT-3' ( SEQ ID NO:3 )、 5，-TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT CGT T-3' ( SEQ ID NO:4 )、 5，-TCG TCG TCG TCG TCG TCG TCG-3' ( SEQ ID NO:5 )和 5，-TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT-3' ( SEQ ID NO:6 ), 优选地所述 CpG-ODN具有序列： 5，-TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT-3，。

[16] 在本发明的又一些实施方案中，所述药物组合物中的组分 0， ii ) 以及 iii )之间的相对重量比范围是 1: 0.2-5: 1-50, 优选为 1: 1-5: 2~15。

[17] 本发明还涉及一种乙型肝炎疫苗，其包含： 0 乙肝表面抗原（HBsAg ), ii ) 乙肝核心抗原（HBcAg ), iii ) CpG寡聚脱氧核苷酸（CpG-ODN )和任选地 iv )可药用载体。

[18] 本发明还涉及一种药盒，其包含根据本发明的药物组合物或乙型肝炎疫苗以及任选地其使用说明。

[19] 在一个方面，本发明涉及根据本发明的药物组合物在制备用于在对象中治疗 HBV感染和 /或 HBV介导的疾病之药物中的用途,优选地所述 HBV感染和 /或 HBV介导的疾病选自乙型肝炎、肝硬化和肝癌。

[20] 在又一个方面，本发明涉及根据本发明的药物组合物在制备用于在对象中产生针对 HBV的免疫应答（优选地，诱导 Thl和 Th2型免疫应答）之药物中的用途。

[21] 在另一个方面，本发明涉及根据本发明的药物组合物在制备用于在对象中使抗 HBcAg抗体发生亚型转变之药物中的用途。

[22] 在又一个方面，本发明涉及根据本发明的药物组合物在制备用于在对象中突破乙型肝炎病毒免疫耐受之药物中的用途。

[23] 在又一个方面，本发明涉及根据本发明的药物组合物在制备用于在对象中实现乙肝表面抗原 Thl/Th2免疫应答平衡 (例如，大致相当地诱导 Thl和 Th2型免疫应答）之药物中的用途。

[24] 在又一个方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含： 0 乙肝表面抗原 ( HBsAg ), ii ) 乙肝核心抗原 ( HBcAg ), 和 iii ) CpG寡聚脱氧核苷酸（ CpG-ODN )。特别地，本发明的药物组合物可用于在对象中治疗 HBV感染和 /或 HBV介导的疾病、用于在对象中产生针对 HBV的免疫应答（优选地，诱导 Thl和 Th2型免疫应答）、用于在对象中使抗 HBcAg抗体发生亚型转变、用于在对象中引发抗原特异性 CTL杀伤活性和 /或用于在对象中突破乙型肝炎病毒免疫耐受。

[25] 在又一个方面，本发明涉及一种在对象中治疗 HBV感染和 /或 HBV介导的疾病的方法，其包括向对象施用治疗有效量的根据本发明的药物组合物。

[26] 在又一个方面，本发明涉及一种在对象中产生针对 HBV的免疫应答（优选地，诱导 Thl和 Th2型免疫应答）的方法，其包括向对象施用治疗有效量的根据本发明的药物组合物。

[27] 在又一个方面，本发明涉及一种在对象中使抗 HBcAg抗体发生亚型转变的方法，其包括向对象施用治疗有效量的根据本发明的药物组合物。

[28] 在又一个方面，本发明涉及在对象中突破乙型肝炎病毒免疫耐受的方法，其包括向对象施用治疗有效量的根据本发明的药物组合物。

[29] 在又一个方面，本发明涉及在对象中引发抗原特异性 CTL 杀伤活性的方法，其包括向对象施用治疗有效量的根据本发明的药物组合物。

[30] 在又一个方面，本发明涉及在对象中实现乙肝表面抗原 Thl/Th2免疫应答平衡 (例如，大致相当地诱导 Thl和 Th2型免疫应答）的方法，其包括向对象施用治疗有效量的根据本发明的药物组合物。

[31] 在某些实施方案中，本发明的药物组合物不包含皂苷佐剂。附图说明

[32] 图 1 显示本发明组合物与传统疫苗组分相比在增强小鼠对乙肝表面抗原特异性总 I_gG免疫应答的图。

[33] 图 2 显示本发明组合物与传统疫苗组分相比在增强小鼠产生保护性抗体免疫应答的图。

[34] 图 3 显示本发明组合物与传统疫苗组分相比在体液免疫水平增强乙肝表面抗原 Th2免疫应答的图。

[35] 图 4显示本发明组合物与传统疫苗组分相比在体液免疫水平增强乙肝表面抗原 Thl免疫应答的图。

[36] 图 5显示本发明组合物与传统疫苗组分相比在体液免疫水平促进乙肝表面抗原 Thl/Th2免疫应答平衡的图。

[37] 图 6 显示本发明组合物产生的抗 HBcAg 抗体亚型为 IgG2a>IgGl的图。

[38] 图 7显示本发明组合物与传统疫苗组分相比在细胞免疫方面促进 HBsAg CTL表位特异性 Thl细胞分化抑制 Th2细胞增殖的图。

[39] 图 8显示本发明组合物中 HBcAg与 HBsAg+CpG联用在产生抗原特异性 I_gG抗体水平上具有协同作用的图。

[40] 图 9显示本发明组合物中 HBcAg与 HBsAg+CpG联用相比 HBsAg+CpG在细胞免疫水平具有促进 HBsAg特异性的 Thl细胞分化的能力。

[41] 图 10显示本发明组合物在产生抗原特异性 I_gG免疫应答上突破 HBV转基因小鼠和免疫耐受小鼠的免疫耐受的图。

[42] 图 11 显示本发明组合物在产生中和抗体免疫应答上突破 HBV转基因小鼠和免疫耐受小鼠的免疫耐受的图。

[43] 图 12显示本发明组合物突破 HBV转基因小鼠和免疫耐受小鼠的免疫耐受，产生高滴度抗 HBcAg的特异性 I_gG抗体的图。

[44] 图 13显示本发明组合物在 HBV转基因小鼠和免疫耐受小鼠中产生的抗 HBcAg抗体亚型为 IgG2a>IgGl的图。

[45] 图 14 显示本发明组合物与传统疫苗组分相比更具有清除 HBV转基因小鼠中 HBsAg抗原的能力。

[46] 图 15显示本发明组合物具有 HBsAg和 HBcAg抗原特异性 CTL体内杀伤的活性，证明本发明的组合物可用作慢性乙肝治疗性疫苗。具体实施方式

[47] 以下结合附图通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以作出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

[48] 本发明的一个目的是克服现有技术中已知的用于治疗乙型肝炎感染的药物的缺陷。

[49] 特别地，本发明的一个目的是提供一种药物组合物，该组合物可以在慢性 HBV感染患者中产生强烈的免疫应答，促进抗 HBsAg-IgG2a抗体亚型的分化，使 IgG2a和 IgGl趋近平衡；诱导抗 HBcAg抗体亚型发生转变和 /或突破 HBV感染患者的免疫耐受。

[50] 本发明的另一目的是提供了该组合物用于治疗 HBV感染和 /或 HBV介导疾病的用途，以及治疗 HBV感染和 /或 HBV介导的疾病的方法。

[51] 为实现上述目的，本发明提供了药物组合物，其包含：

[52] i ) HBsAg、该抗原的片段、该抗原的变体，或者其至少两种的混合物，

[53] ii ) HBcAg、该抗原的片段、该抗原或者该抗原的片段的变体，或者其至少两种的混合物，

[54] iii ) CpG-ODN, 该寡聚核苷酸为全硫代修饰，其序列中具有两个或两个以上拷贝的 5，-NTCGTT-3，基序，长度为 20~25个碱基。该寡聚核苷酸优选自以下碱基序列： 5，-TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT-3，、 5，-TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT CGT T-3，、 5，-TCG TCG TCG TCG TCG TCG TCG-3，或 5，-TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT-3，。更优选为 5，-TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT-3，。

[55] 本发明的组合物实现了出乎意料的技术效果。与现有的市售乙肝预防疫苗相比，在小鼠体内试验中可以介导更强的免疫应答，包括抗 HBsAg抗体、抗 HBcAg抗体，抗 adr血清型的中和抗体，特别是介导 Thl 细胞免疫应答，产生与病毒清除相关的细胞因子 IFN-γ, 促进抗 HBs-IgG2a抗体亚型的分化和成熟，抗 HBcAg抗体亚型转变，实现体液免疫和细胞免疫的平衡。

[56] 现有技术中（参见专利 CN101492672 ) 已公开了组合物 HBsAg+CpG, 而本发明人出人意料地发现根据本发明的药物组合物（ HBcAg、 HBsAg和 CpG ODN的组合 )可产生显著优于 HBsAg+CpG组合物的抗 HBsAg特异性抗体，表现出出人意料的协同作用。

[57] 更加出人意料地，在转基因小鼠体内实验表明，根据本发明的组合物可以突破转基因小鼠的免疫耐受，产生高滴度的抗 HBsAg抗体、抗 HBcAg抗体、中和抗体，介导 Thl细胞免疫应答，促进 I_gG2a抗体亚型的分化和成熟。同时通过对其血清中乙肝表面抗原表达水平的检测显示，根据本发明的组合物多次免疫可以显著清除转基因小鼠体内的乙肝病毒,使其乙肝病毒表达水平下降。本发明的组合物还显示出诱导强的抗原特异性细胞毒性 T淋巴细胞（ CTL )体内杀伤活性，特别地 HBsAg CTL和 HBcAg CTL体内杀伤活性，此实据更进一步确证了本发明的组合物大大超出了现有技术中已有疫苗的水平，能够更加有效地治疗乙型肝炎（特别是慢性乙型肝炎 )。

[58] 另外，在 BALB/c小鼠和模型小鼠上均能介导强抗 HBcAg 的免疫应答，并且实现了抗 HBcAg抗体亚型转变，即表现出的抗 HBcAg抗体亚型关系为 IgG2a抗体水平高于 I_gGl , 与乙肝感染患者痊愈的抗体亚型关系一致。这一鼓舞人心的结^ ^明根据本发明的组合物可用作乙肝治疗性疫苗，从而解决长期以来困们的这一难题。

定义

[59] 除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考 Current Protocols in Molecular Biology ( Ausubel )₀ 氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代 20个常用 L- ^酸之一的标准 3字母和 /或 1字母代码。

[60] 尽管本发明的广义范围所示的数字范围和参数近似值，但是具体实施例中所示的数值尽可能准确的进行记载。然而，任何数值本来就必然含有一定的误差，其是由它们各自的测量中存在的标准偏差所致。另外，本文公开的所有范围应理解为涵盖其中包含的任何和所有子范围。例如记载的" 1至 10"的范围应认为包含最小值 1和最大值 10之间（包含端点）的任何和所有子范围；也就是说，所有以最小值 1或更始的子范围，例如 1至 6.1, 以及以最大值 10或更小终止的子范围，例如 5.5至 10。另外，任何称为"并入本文，，的参考文献应理解为以其整体并入。

[61] 另外应注意，如本说明书中所使用的，单数形式包括其所指对象的复数形式，除非清楚且明确的限于一个所指对象。术语 "或，，可与术语"和 /或，，互换使用，除非上下文另有清楚指明。

[62] 本文中使用的术语 "多肽"是指氨基酸聚合物，并且无具体的最少氨基酸数目限制。因此其同样包括肽、寡肽、二聚体、三聚体、低聚体、颗粒等。再者，术语"多肽"不仅包括在核糖体中翻译后得到的纯氨基酸聚合物，还包括经过翻译后修饰（例如糖基化、乙酰化、磷酸化、硫代等）获得的多肽。

[63] 本文使用的术语 "抗原性片段，，是指天然或合成多肽的片段，其保留了所述天然或合成多肽的抗原特性，即能够引发针对所述天然或合成多肽的免疫应答。

[64] 本文中使用的术语"乙肝表面抗原（HBsAg、 HBs )，，旨在涵盖天然 HBsA_g、 HBsAg抗原性片段、 HBsAg功能性变体及其任意组合。特别地，所述天然 HBsAg为含有 226个氨基酸的天然 HBsAg多肽。更特别地，所述 HBsAg为来源于现今已知 HBV 标准基因型 A、 B、 C、 D、 E、 F、 G和 /或 H的天然 HBsAg多肽。在某些实施方案中，所述 HBsAg具有 SEQ ID ΝΟ:1所示的序列。

[65] 本文中使用的术语" HBsAg 抗原性片段"旨在表示下述多肽，即该多肽具有天然 HBsAg中少于 226个氨基酸的连续或不连续的片段，并且所述多肽保留天然 HBsAg的抗原性。

[66] 本文中使用的术语" HBsAg 功能性变体"旨在表示下述多肽，即该多目对于天然 HBsAg或 HBsAg片段有至多 30个、至多 25个、至多 20个、至多 15个、至多 10个、至多 5个、至多 4个、至多 3个、至多 2个、至多 1个處基酸缺失、插入、添加或替换，并且所述多肽保留天然 HBsAg的功能（例如抗原性）。 [67] 本文中使用的术语"乙肝核心抗原（HBcAg、 HBc )，，旨在涵盖天然 HBcAg、 HBcAg抗原性片段、 HBcAg功能性变体及其任意组合。特别地，所述天然 HBcAg为含有 183个氨基酸的天然 HBcAg多肽。更特别地，所述天然 HBcAg为来源于现今已知 HBV标准基因型 A、 B、 C、 D、 E、 F、 G和 /或 H的天然 HBcAg。在一些实施方案中，所述 HBcAg选自 HBcAg^多肽，其表示天然 HBcAg的 1-X位 ^酸的片段，特别地， X为 149至 183。在另一些实施方案中，所述 HBcAg选自具有下述序列的多肽： SEQ ID NO:2的 1-149位 ^| ^酸、 SEQ ID NO:2的 1-150位 ^ 酸、 SEQ ID NO:2的 1-151位 ^¾ ^酸、 SEQ ID NO:2的 1-152 位 ^ ^酸、 SEQ ID NO:2的 1-153位 ^ ^酸、 SEQ ID NO:2的 1-154位^^酸、 SEQ ID NO:2的 1-155位^^酸、 SEQ ID NO:2 的 1-156位 ^ ^酸、 SEQ ID NO:2的 1-157位 ^¾ ^酸、 SEQ ID NO:2的 1-158位酸、 SEQ ID NO:2的 1-159位 ^¾ ^酸、 SEQ ID NO:2的 1-160位 ^ ^酸、 SEQ ID NO:2的 1-161位 ^ ^酸、 SEQ ID NO:2的 1-162位^^酸、 SEQ ID NO:2的 1-163位^^ 酸、 SEQ ID NO:2的 1-164位^ ^酸、 SEQ ID NO:2的 1-165 位^ ^酸、 SEQ ID NO:2的 1-166位酸、 SEQ ID NO:2的 1-167位 ^ ^酸、 SEQ ID NO:2的 1-168位 ^ ^酸、 SEQ ID NO:2 的 1-169位氨基酸、 SEQ ID NO:2的 1-170位氨基酸、 SEQ ID NO:2的 1-171位 ^ ^酸、 SEQ ID NO:2的 1-172位^ ^酸、 SEQ ID NO:2的 1-173位^^酸、 SEQ ID NO:2的 1-174位^^酸、 SEQ ID NO:2的 1-175位 ^| ^酸、 SEQ ID NO:2的 1-176位 ^ 酸、 SEQ ID NO:2的 1-177位 ^¾ ^酸、 SEQ ID NO:2的 1-178 位 ^ ^酸、 SEQ ID NO:2的 1-179位 ^ ^酸、 SEQ ID NO:2的 1-180位^^酸、 SEQ ID NO:2的 1-181位^^酸、 SEQ ID NO:2 的 1-182位處基酸和 SEQ ID NO:2的 1-183位氨基酸。在某些实施方案中，所述 HBcAg具有 SEQ ID NO:2所示的序列。

[68] 本文中使用的术语" HBcAg 抗原性片段，，旨在表示下述多肽，即该多肽具有天然 HBcAg中少于 183个氨基酸的连续或不连续的片段，并且所述多肽保留天然 HBcAg的抗原性。 [69] 本文中使用的术语" HBcAg 功能性变体"旨在表示下述多肽，即该多目对于天然 HBcAg或 HBcAg片段有至多 30个、至多 25个、至多 20个、至多 15个、至多 10个、至多 5个、至多 4个、至多 3个、至多 2个、至多 1个基酸缺失、插入、添加或替换，并且所述多肽保留天然 HBcAg的功能 (例如抗原性）。

[70] 优选地，在本发明中， HBcAg以及 HBsAg在根据本发明的组合物中都以颗粒形式存在。

[71] 本文使用的术语"药物组合物"、 "组合药物，，和"药物组合" 可互换地使用，其表示组合在一起以实现某种特定目的的至少一种药物以及任选地可药用赋形剂或辅料的组合。在某些实施方案中，所述药物组合物包括在时间和 /或空间上分开的组合，只要其能够共同作用以实现本发明的目的。例如，所述药物组合物中所含的成分（例如 HBsAg、 HBcAg和 CpG-ODN )可以以整体施用于对象，或者分开施用于对象。当所述药物组合物中所含的成分分开地施用于对象时，所述成分可以同时或依次施用于对象。

[72] 本文使用的术语" CpG寡聚脱氧核苷酸，，或" CpG-ODN"是指短的单链合成 DNA分子，其含有一个或更多个 "CpG"单元，其中 C表示胞嘧啶， G表示鸟嘌呤， p表示磷酸二酯键。特别地，所述 CpG寡聚脱氧核苷酸是非甲基化的。在一些实施方案中，所述 CpG-ODN包含硫代磷酸酯连接或硫代磷酸酯骨架。也就是说，在一些实施方案中，所述 CpG-ODN为硫代磷酸酯寡聚脱氧核苷酸（即硫代寡聚脱氧核苷酸）。优选地，所述 CpG-ODN中所有核苷酸间连接均为硫代磷酸酯连接，即所述 CpG-ODN为全硫代寡聚脱氧核苷酸。在另一些实施方案中，所述 CpG-ODN 包含两个或更多的 5，-NTCGTT-3，基序。在又一些实施方案中，所述 CpG-ODN长度为 15 ~ 35个核苷酸，优选 20~25个核苷酸。特别地，所述 CpG-ODN具有选自下列的序列： 5，-TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT-3' ( SEQ ID NO:3 )、 5，-TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT CGT T-3' ( SEQ ID NO:4 )、 5，-TCG TCG TCG TCG TCG TCG TCG-3' ( SEQ ID NO:5 )和 5，-TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT-3' ( SEQ ID NO:6 ), 更特别地所述 CpG-ODN具有序列： 5，-TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT-3，。

[73] 本文使用的"治疗有效量，，或"有效量，，是指足以显示其对于所施用对象益处的剂量。施用的实际量，以及施用的速率和时间过程会取决于所治疗者的自身情况和严重程度。治疗的处方（例如对剂量的决定等）最终是全科医生及其它医生的责任并依赖其做决定，通常考虑所治疗的疾病、患者个体的情况、递送部位、施用方法以及对于医生来说已知的其它因素。

[74] 本文使用的术语" HBV 介导的疾病，，旨在表示乙肝病毒 ( HBV )所导致、诱发、加重、提高其发生风险和 /或与其有关的疾病，例如乙型肝炎病毒携带者、乙型肝炎、肝硬化、肝腹水、肝癌等。

[75] 本文使用的术语"抗 HBcAg抗体亚型转变"旨在表示施用本发明的药物组合物后，对象中抗 HBcAg抗体亚型关系转变为与乙肝治愈患者中的抗体亚型关系一致，即与乙肝感染患者痊愈的抗体亚型关系一致。特别地，在小鼠中，抗 HBcAg抗体亚型由 IgGl>IgG2a转变为 IgG2a > IgG2b > IgGl或者 IgG2b > IgG2a > IgGl，例如 IgG2a>IgGl，在人中，抗 HBc抗体亚型由 IgGl > IgG3 > IgG4转变为 IgG3>IgGl>IgG4。

[76] 本文所使用的术语"对象，，是指哺乳动物，如人类，但也可以是其它动物，如野生动物（如苍鹭、鹳、鹤等），家畜（如鸭、鹅等）或实验动物（如狸猩、猴子、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠、土拨鼠、地松鼠等）。

[77] 本发明组合物的另一个实施方案，其包含 i ) HBsAg或该抗原的变体， ii ) HBcAg_{1 183}, 和 iii )含有 21个碱基的硫代寡聚核苷酸 CpG-ODN，其序列中具有两个或两个以上拷贝的 5，-NTCGTT-3，基序。

[78] 在一些实施方案中，本发明药物组合物中组分 i )， ii ) 以及 iii )之间的相对重量比范围是 1: 0.2-5: 1-50, 优选为 1: 1-5: 2-15, 更优选 1:1:2。

[79] 在另一些实施方案中，本发明组合物还可包含另外的添加剂，如药物载体或添加剂，尤其是当它以药物制剂形式存在时。

[80] 在某些实施方案中，本发明的药物组合物不包含皂苷佐剂。

[81] 优选的药物载体尤其是水，緩冲水溶液，优选等渗盐溶液如 PBS (磷酸盐緩冲液）、葡萄糖、甘露醇、右旋葡萄糖、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维素、碳酸镁、 0.3%甘油、透明质酸、乙醇或聚亚烷基二醇如聚丙二醇、甘油三酯等。所用药物载体的类型尤其依赖于根据本发明的组合物是否配制为用于口服、鼻、皮内、皮下、肌内或静脉施用。根据本发明的组合物可包含润湿剂、乳化剂或緩冲液物质作为添加剂。

[82] 根据本发明的药物组合物、疫苗或者药物制剂可通过任何适宜的途径施用，例如可口服、鼻、皮内、皮下、肌内或静脉内施用。实施例

[83] 实施例 1· 乙肝表面抗原（HBsAg )与乙肝核心抗原（HBcAg ) 和 CpG-ODN联用增强乙肝表面抗原特异性总 IgG的免疫应答。

[84] 为了检测 HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物的乙肝表面抗原特异性总 IgG免疫应答，本发明人分别将 HBsA_g、 HBcAg与 CpG-ODN, HBsAg与 Al(OH)₃佐剂混匀，用其免疫小鼠，通过测定血清中 HBsAg特异性 I_gG水平，并进行统计学分析，来评价相对于 HBsAg与 Al(OH)₃联用， HBsAg, HBcAg与 CpG-ODN 联用对 HBsAg特异性总 IgG免疫应答的作用。

[85] 本实施例中使用 BALB/c小鼠，雌性， 6-8周，购自上海斯莱克公司。本实施例所使用的 HBsAg抗原购买自 Prospec公司 (批号： 1111PHADW22, 序列如 SEQ ID ΝΟ:1所示），为毕赤酵母表达的 adw2亚型，纯度 95%以上， 4。C冰箱中保存备用。本实施例使用的 HBcAg (序列如 SEQ ID NO:2所示）抗原为发明人制备，为大肠杆菌表达的天然乙肝核心蛋白，纯化制备工艺参见李计来，徐静等在《中国生物制品学杂志》 2011，第 24卷第 1121-1125页中的报道，具体步骤如下：收集菌体后用 10 mM 磷酸钠緩冲液重悬，超声破碎，离心收集上清，加入饱和硫酸铵，使其终浓度为 33%, 充分混匀后 4°C过夜；次日，离心，沉淀用 10 mM磷酸钠緩冲液重悬，放入透析袋，在 10 mM磷酸钠緩冲液中 4Ό透析 24h; 透析后的溶液经羟基磷灰石柱层析，收集蛋白峰，浓缩，经 Sephacryl S-400 HR ^^过滤层析，收集目的蛋白峰； 4。C水箱中保存备用。本实施例所用的 CpG-ODN序列为 5，-TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT-3'，参照 CN200810004736.0专利所述的固相亚磷酰胺三酯法化学合成方法制备，由 3，端开始， 1 )脱保护基：先用三氯乙酸脱去连接在 CpG上的核苷酸的保护基团 DMT (二甲氧基三苯甲基)，获得游离的 5，羟基，以供下一步缩合反应使用； 2 )活化：将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体，此中间体与 CpG上已脱保护基的核苷酸发生缩合反应； 3 )连接：亚磷酰胺四唑活性中间体遇到 CpG上已脱保护基的核苷酸时，将与其 5，羟基发生亲和反应，缩合并脱去四唑，此时寡核苷酸链向前延长一个碱基； 4 )氧化：缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在 CpG上的寡核苷酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸或碱水解，此时使用硫代试剂将亚磷酰胺氧化为硫磷双键的磷酸三酯，从而得到稳定的寡核苷酸； 5 )封闭：缩合反应后为了防止连在 CpG上的未参与反应的 5，羟基在随后的循环反应中被延伸，常通过乙酰化来封闭此端羟基；经过以上五个步骤后，一个脱氧核苷酸就连到 CpG的核苷酸上；重复以上的脱保护基、活化、连接、氧化、封闭过程即可得到一个 DNA片段粗品； ^对其进行切割、脱保护基、纯化、定量等合成后处理即可得到符合的 CpG-ODN; -20* 水箱中保存备用。

[86] HBsAg和 HBcAg用 PBS( Invitrogen公司）释至 10 g/ml; CpG-ODN用 PBS稀释至 20 g/ml。 Α1(ΟΗ)₃佐剂购自天坛生物。对 BALB/c小鼠进行左后肢 ^肠肌免疫，每只注射体积为 100 μΐ, 每组 10 只小鼠。 HBsAg+ Al(OH)₃组每只小鼠注射 l g 经 Al(OH)₃吸附的 HBsAg。 HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组每只小鼠注射 l g HBsAg、 l g HBcAg和 2 g CpG-ODN。每三周免疫一次，在二免后十天血并分离出血清，按照常规方法用 2%脱脂奶对该血清以 1:30稀释倍始，再进行 3倍系列稀释，用于检测抗原特异性 IgG总抗体。

[87] 具体抗原特异性 I_gG总抗体的检测步骤如下：用 HBsAg包被 96孔酶标板（购自 Nunc公司），每孔 25ng， 4°C过夜； ¾ 2次后用 5%脱脂奶 37°C封闭 1小时；洗板 2次后加入上述 3倍系列稀释的待检血清， 37。C作用 1小时；洗板 3次后加入 1:30000 稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 IgG (购自美国 SIGMA公司），每孔 50μ1, 37。C作用 40分钟；洗板 3次后用 TMB (购自美国 Thermo公司）显色，每孔 ΙΟΟμΙ , 显色 15分钟； 2Μ疏酸终止反应，每孔 100μ1，用酶标仪测定 450nm处吸光值 OD450_nm (以 OD630_nm校正），并确定终点滴度。结果显示在图 1中。

[88] 由图 1可见， HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组的免疫应答显著增强， HBsAg 特异性抗体滴度可达 4.0 个对数值，与 HBsAg+Al(OH)₃组比较，具有显著性差异（ PO.001 )，特异性抗体滴度（效价）可增加 3 倍左右。上述结果表明，本发明 HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物疫苗相比于 Α1(ΟΗ)₃佐剂乙肝疫苗能显著增强乙肝表面抗原特异性总 I_gG的免疫应答。

[89] 实施例 2· 乙肝表面抗原（HBsAg )与乙肝核心抗原（HBcAg ) 和 CpG-ODN联用增强乙肝表面抗原保护性抗体水平。

[90] 检测乙型肝炎病毒表面抗体的作用是监测乙肝疫苗的接种是否成功。乙肝疫苗刺^ ^疫系统产生相当于中和抗体的乙型肝炎病毒表面抗体，其效价与疫苗的保护力直接相关，所述抗体的产生对防止 HBV感染具有显著效果。因此，本发明人选用了国际通用的 ARCHITECT乙型肝炎病毒表面抗体国际单位测试系统（化学发光微粒子免疫测定法， CMIA )来检测免疫小鼠血清中的乙型肝炎病毒表面抗体（抗 HBsAg ) 的浓度，并进行统计学分析，从而评价 HBsAg+HBcAg+CpG-ODN 的组合相对于 HBsA_g+Al(OH)₃联用对增强保护性抗体水平的保护力效果。

[91] 本实施例中使用 BALB/c小鼠，雌性， 6-8周，购自上海斯莱克公司。本实施例中所使用的 HBsAg抗原、 HBcAg、 CpG-ODN 和 Α1(ΟΗ)₃佐剂如实施例 1中所述。

[92] HBsAg和 HBcAg用 PBS稀释至 10 g/ml; CpG-ODN用 PBS稀释至 20 g/ml。对 BALB/c小鼠进行左后肢腓肠肌免疫，每只注射体积为 100 μΐ, 每组 10只小鼠。 HBsAg+Al(OH)₃组每只小鼠注射 1μ_δ 经 Α1(ΟΗ)3 吸附的 HBsAg , HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组每只小鼠注射 l g HBsAg, l g HBcAg和 2 g CpG-ODN。每三周免疫一次，在二免后十天采血并分离出血清。将血清进行原倍: ¾J6L或个血用 PBS溶液稀释（对于 250<IU<1000, 500倍稀释个血送样， IU>1000, 5000倍稀释个血送样）送至东南大学第二附属医院进行检测，用 ARCHITECT 乙型肝炎病毒表面抗体国际单位测试系统（化学发光微粒子免疫测定法， CMIA )检测免疫小鼠血清中的乙型肝炎病毒表面抗体（ABBOTT公司 ARCHITECT 系统检测），结果显示在图 2中。

[93] 由图 2可见， HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组可显著增强保护性抗体水平，特异性保护抗体滴度可达 4.3 个对数值，与 HBsAg+Al(OH)₃组比较，具有显著性差异（ PO.05 ), 特异性保护抗体滴度（效价）可增加 5倍左右。上述结果表明，本发明 HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物疫苗比 Α1(ΟΗ)₃佐剂乙肝疫苗能显著增强乙肝表面抗原保护性抗体水平，增强疫苗保护力。

[94] 实施例 3. 乙肝表面抗原（HBsAg )、乙肝核心抗原（HBcAg ) 和 CpG-ODN联用在体液免疫水平增强乙肝表面抗原 Th2免疫应答。

[95] 根据实施例 1 所述的方法，测定本发明 HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物对小鼠 Th2类免疫应答的影响，不同之处在于检测时所使用的酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 IgGl (购自美国 SouthernBiotech公司），稀释倍数为 1:20000。结果显示在图 3中。

[96] 抗原特异性免疫应答分为 Thl和 Th2两种类型，其中 Th2 类应答与高水平的抗原特异性 IgGl 抗体滴度相对应。 Α1(ΟΗ)₃ 是一种极强的 Th2类疫苗佐剂，能够抑制 Thl类免疫应答，表现为免疫后诱生高水平的特异性 IgGl 抗体。在本实施例中， HBsAg+HBcAg+CpG-ODN 组合物产生的 IgGl 抗体水平比 HBsAg+Al(OH)₃组显著更高（ PO.001 ), HBsAg特异性 IgGl 抗体滴度（效价）可增加接近 10倍。上述结果表明，本发明组合物能产生比 Al(OH)₃佐剂组还强的 HBsAg特异性 IgGl抗体，增强乙肝表面抗原 Th2免疫应答。

[97] 实施例 4· 乙肝表面抗原（1188 8 )、乙肝核心抗原（1180 2 ) 和 CpG-ODN联用在体液免疫水平增强乙肝表面抗原 Thl免疫应答。

[98] 根据实施例 1 所述的方法，测定本发明 HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物对小鼠 Thl类免疫应答的影响，不同之处在于检测时所使用的酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 IgG2a (购自美国 SouthernBiotech公司），稀释倍数为 1:6000。结果显示在图 4中。

[99] 实施例 3中提到， Al(OH)₃是一种极强的 Th2类疫苗佐剂，能够抑制 Thl类免疫应答，表现为免疫后诱生极低水平的特异性 IgG2a抗体。在本实施例中， Al(OH)₃作为 HBsAg佐剂诱生的特异性 IgG2a 抗体滴度仅为 2.17 个对数值。用本发明的 HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物免疫时，产生的 HBsAg特异性 I_gG2a抗体滴度增加 2个对数值左右，即 100倍。上述结果表明，本发明的 HBsAg+HBcAg+CpG-ODN联用极强地刺激针对乙肝表面抗原的 Thl免疫应答。

[100] 实施例 5· 乙肝表面抗原（1188 8 )、乙肝核心抗原（1180 2 ) 和 CpG-ODN联用在体液免疫水平促进乙肝表面抗原 Thl/Th2 免疫应答平衡。

[101] 根据实施例 3 和实施例 4 所述，本发明 HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物不仅对小鼠产生较高水平的 Th2类免疫应答，同时也产生极高水平的 Thl类免疫应答。 Thl 促进 CTL反应即所谓的细胞免疫倾向，而 Th2则促进抗体产生即所谓的体液免疫倾向，而治疗性乙肝疫苗的一个目的是清除血清中 HBsAg抗原，这需要产生有效的保护性抗体，主要是体液免疫发挥作用；另一个目的是杀伤感染 HBV的靶细胞，即 CTL 反应，需要细胞免疫发挥作用，所以 Thl和 Th2免疫应答都非常重要。为了更直接地说明 HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物和 HBsAg+Al(OH)₃对照组产生的免疫应答偏向于 T1或 Th2应答方向，将分析抗原特异性 IgG2a/IgGl滴度比值（LoglO ), 结果显示在图 5中，若比值小于 0说明免疫应答偏向于 Th2, 大于 0说明免疫应答偏向于 Thl，接近 0说明免疫应答趋于平衡。分析结果表明， Α1(ΟΗ)₃作为 HBsAg佐剂的对照组产生的免疫应答主要以 IgGl 为主，偏向于 Th2 应答；而 HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物产生的特异性 IgGl和 IgG2a 相当， ^^疫应答趋于 Thl/Th2平衡。

[102] 实施例 6· 乙肝表面抗原（1188 8 )、乙肝核心抗原（1180 2 ) 和 CpG-ODN联用产生的抗 HBcAg抗体亚型 IgG2a>IgGl。

[103] 乙肝感染患者治愈人群的抗 HBcAg 抗体亚型为 IgG3>IgGl>IgG4, 其在小鼠中对应的抗体亚型关系为 IgG2a > IgG2b > IgGl或者 IgG2b > IgG2a > IgGl„根据实施例 3和实施例 4所述的方法，测定本发明 HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物对小鼠抗 HBcAg抗体亚型 IgG2a和 IgGl滴度，考察本组合物是否可促进小鼠抗 HBcAg抗体亚型转变为 IgG2a>IgGl，不同之处在于检测时所使用的包被抗原为 l g/ml HBcAg。结果显示在图 6中。图 6结果表明，本发明 HBsAg+HBcAg+CpG-ODN 组合物产生的抗 HBcAg抗体亚型 IgG2a>IgGl，且具显著性差异（ PO.001 )。说明该组合物可促进小鼠抗 HBcAg抗体亚型转变为乙肝感染治愈患者的抗体亚型。

[104] 实施例 7· 乙肝表面抗原、乙肝核心抗原与 CpG-ODN联用在细胞免疫方面显著促进 HBsAg CTL表位特异性 Thl细胞分化和抑制 Th2细胞增殖。

[105] 为了阐明 HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物联用在细胞免疫方面的作用，本发明人分别将 HBsAg、 HBcAg和 CpG-ODN， HBsAg和 Al(OH)₃佐剂混匀，免疫小鼠，通过 ELISPOT实验检测免疫小鼠脾细胞经 HBsAg CTL表位刺激后特异性分泌 IFN-γ 和 IL-4的水平，并进行统计学分析，即可评价 HBsAg HBcAg、与 CpG-ODN联用相对于 HBsAg与 Α1(ΟΗ)₃联用的促抗原特异性 Thl细胞分化作用。

[106] 本实施例中所使用的为 BALB/c小鼠，雌性， 6-8周，购自上海斯莱克公司；所使用的 HBsAg抗原、 HBcAg, CpG-ODN 和 Α1(ΟΗ)₃佐剂如实施例 1中所述。

[107] HBsAg和 HBcAg用 PBS稀释至 10 g/ml; CpG-ODN用 PBS稀释至 20 g/ml。对 BALB/c小鼠进行左后肢腓肠肌免疫，每只注射体积为 100 μΐ, 每组 5只小鼠。 HBsAg+Al(OH)₃组每只小鼠注射 l g 经 Α1(ΟΗ)3 吸附的 HBsAg ， HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组每只小鼠注射 l g HBsAg, l g HBcAg和 2 g CpG-ODN。每三周免疫一次，在二免后十天取 ^·，按常规方法制备脾淋巴细胞，具体如下：无菌操作取脾脏：用无菌镊子及剪刀剪取脾脏，放于 70 μιη尼龙网筛（购自 BD公司）中，置于含有 5 ml预冷处理的 2%FBS(购自 GIBCO公司）- PBS 的平凰中；用研磨棒研磨脾脏，脾脏细胞通过筛目平皿中，得到细胞悬液，用巴氏吸管将悬液放入经 40 μιη尼龙网筛过滤 (购自 BD公司）的 50 ml无菌离心管； 300 xg， 4。C离心 10分钟；弃去上清，加入 5 ml lx破红剂（购自 BD公司）重悬细胞，室温作用 5分钟，以破碎红细胞；加入 5 ml 2% FBS-PBS终止破红反应； 300 xg， 4。C离心 5分钟；弃去上清，加入 2 ml 2% FBS-PBS重悬细胞备用。用 Mouse IFN-γ /IL-4 ELISPOT试剂盒（ BD公司）检测抗原特异性的 IFN-γ和 IL-4分泌，刺激物为 HBsAg的肽库。试驗完成后，用 ImmimoSPOT Series 3自动读板机上读取斑点数。

[108] HBsAg肽库，由 54个 15氨基酸的多肽片段组成，涵盖整个 HBsAg全长序列 , 每对相邻多肽有 11个氨基酸的相互重叠，代表所有可能的 HBsAg CTL表位。 HBsAg肽库的肽段设计如序列 SEQ ID NO:7~SEQ ID NO:60所示。所有肽段由 Chinese Peptide Company合成，纯化，分装和冻干。

[109] 具体抗原特异性的 IFN-γ和 IL-4分泌的检测步骤如下：用 PBS # Mouse IFN-γ /IL-4(1: 200稀释， BD公司）， 100 μΐ/孔加至 ELISPOT板， 4°C包被过夜；弃去包被抗体，用封闭液（含 10%FBS RPMI-1640培养液）洗孔 1次，加入封闭液 200 μΐ/孔，室温孵育 2 h; 采用 10%FBS-1640培养基稀释肽库至 10 g/ml; 采用 10%FBS-1640培养基稀释 ConA至 20 g/ml作为阳性对照；弃去封闭液，将 lxlO⁷细胞 /ml的脾淋巴细胞悬液与配置好的肽库或 ConA对照按 100 μΐ/孔分别加入 96孔板中，一式两孔重复；于 37°C 5%C0₂培养箱孵育 24 h; 弃去细胞悬液，用去离子水洗板 2次， 3-5 m/次，用 PBST洗涤 3次， 200 μΐ/孔，加入用 10%FBS PBS稀释的 Mouse IFN-γ /IL-4 ELISPOT detection Antibody(l： 250稀释， BD公司）， 100 μΐ/孔，室温孵育 2 h; 弃去检测抗体，用 PBST 洗板 4 次， 200 μΐ/孔，加入用 10%FBS PBS 稀释 Streptavidian-HRP(1: 100 #, BD公司）， 100 μΐ/孑室温孵育 1 h; 弃去酶结合物，用 PBST洗 4次，再用 PBS洗 3次，加入 AEC底物 ΙΟΟ μΙ/孔显色，肉察斑点形成，加去离子水终止反应；在 ImmimoSPOT Series 3自动读板机上读取斑点数。结果显示在图 7中。

[110] Thl细胞主要抗原特异性分泌 IL-2、IL-12、IFN-y和 TNF_p/ 等，介导与细胞毒和局部炎症有关的免疫应答，参与细胞免疫及迟发型超敏性炎症的形成， Th2细胞主要抗原特异性分泌 IL-4、 IL-5、 IL-6和 IL-10,其主要功能为刺激 B细胞增殖并产生抗体，与体液免疫相关。 IFN-γ可诱导 Thl细胞分化，但抑制 Th2细胞增殖； IL-4 i秀导 Th2细胞分化。本实施例中，用 ELISPOT 检测免疫小鼠的脾细胞的抗原特异性 IFN-γ和 IL-4的分泌水平，结果 Al(OH)₃作为 HBsAg佐剂分泌 HBsAg特异性 IL-4水平高于 IFN-γ, 说明 Al(OH)₃佐剂主要刺激 B细胞增殖产生抗体，而用本发明的 HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物分泌 HBsAg特异性 IFN-γ水平远高于 IL-4 水平，说明本发明组合物主要参与 HBsAg特异性细胞免疫，促进 Thl细胞分化，达到 Thl/Th2细胞增殖平衡，因此兼具有杀伤感染 HBV 的肝细胞和清除游离 HBV病毒的潜能。

[111] 实施例 8· HBcAg、 HBsAg和 CpG-ODN联用在产生抗原特异性 I_gG抗体水平上具有协同作用

[112] 为了考察 HBcAg、 HBsAg和 CpG-ODN联用是否有协同作用，本发明人分别将 HBsAg、 HBcAg和 CpG-ODN, HBsAg和 CpG-ODN混匀，免疫小鼠，测定血清中 HBsAg特异性总 IgG，并进行统计学分析，即可评价 HBcAg、 HBsAg和 CpG-ODN联用产生的抗原特异性 I_gG抗体水平上具有协同作用。

[113] 本实施例中所使用的为 BALB/c小鼠，雌性， 6-8周，购自上海斯莱克公司；所使用的 HBsAg抗原、 HBcAg、 CpG-ODN 和 Α1(ΟΗ)₃佐剂如实施例 1中所述。

[114] HBsAg和 HBcAg用 PBS稀释至 10 g/ml; CpG-ODN用 PBS稀释至 20 g/ml。对 BALB/c小鼠进行左后肢腓肠肌免疫，每只注射体积为 100μ1，每组 10只小鼠。

[115] HBsAg+CpG-ODN组每只小鼠注射 l g HBsAg和 2

CpG-ODN , HBsAg+HBcAg+CpG-ODN 组每只小鼠注射 l g HBsAg, l g HBcAg和 2 g CpG-ODN。每三周免疫一次，在二免后十天血并分离出血清，按照常规方法用 2%脱脂奶对该血清以 1:30稀幹倍 t ^始，再进行 3倍系列稀释，用于检测抗原特异性 I_gG总抗体。 [116] 根据实施例 1 所述的方法，测定本发明 HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组和 HBsAg+CpG-ODN组产生的 HBsAg特异性抗体滴度。结果显示在图 8中。

[117] 由图 8可见， HBcAg、 HBsAg和 CpG-ODN联用相对于 HBsAg+CpG-ODN组产生的 HBsAg特异性 IgG水平更高，特异性抗体滴度可达 4.0个对数值，具有显著性差异（ PO.01 ), 特异性抗体滴度（效价 )可增加 3倍左右。上述结果表明，本发明 HBsAg+HBcAg+CpG-ODN 组合物在加入 HBcAg 后比 HBsAg+CpG-ODN联用产生显著更高的 HBsAg特异性 IgG抗体水平，证明 HBcAg、 HBsAg和 CpG-ODN具有协同作用。

[118] 实施例 9. HBcAg、 HBsAg 和 CpG-ODN 联用比 HBsAg+CpG-ODN在细胞免疫方面促进 HBsAg特异性的 Thl 细胞分化。

[119] 实施例 8 中在体液免疫方面考察了 HBcAg、 HBsAg 和 CpG-ODN 具有协同作用，本发明人还在细胞免疫方面分析了 HBcAg, HBsAg和 CpG-ODN联用是否促进 HBsAg的 Thl细胞分化，从而进一步驗证 HBcAg、 HBsAg和 CpG-ODN的协同作用。

[120] 分别将 HBsAg、HBcAg和 CpG-ODN, HBsAg与 CpG-ODN 佐剂混匀，免疫小鼠，通过 ELISPOT实验检测免疫小鼠脾细胞分泌 IFN-γ 和 IL-4 的水平，即可评价 HBsAg 与 HBcAg、 CpG-ODN联用相对于 HBsAg+CpG-ODN联用对促进 HBsAg 的 Thl细胞分化的趋势。

[121] 本实施例中所使用的为 BALB/c小鼠，雌性， 6-8周，购自上海斯莱克公司；所使用的 HBsAg、 HBcAg和 CpG-ODN同实施例 1中所述。

[122] HBsAg和 HBcAg用 PBS稀释至 10 g/ml; CpG-ODN用 PBS稀释至 20 g/ml。对 BALB/c小鼠进行左后肢腓肠肌免疫，每只注射体积为 100 μ1，每组 10只小鼠。 HBsAg+CpG-ODN组每只小鼠注射 l g HBsAg 和 2 g CpG-ODN ， HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组每只小鼠注射 l g HBsAg、 l g HBcAg和 2 g CpG-ODN。每三周免疫一次，在二免后十天取脾，按常规方法制备^淋巴细胞，用 Mo se IFN-γ /IL-4 ELISPOT 试剂盒（ BD公司）检测 IFN-γ和 IL-4, 刺激物为 HBsAg的肽库（具体序列如实施例 7所述）。实验完成后，用 ImmimoSPOT Series 3自动读板机上读取斑点数。

根据实施例 7 所述的方法，测定本发明 HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物和 HBsAg+CpG-ODN组脾细胞 HBsAg表位特异性 IFN-γ和 IL-4的分泌水平。结果显示在图 9中。

[123] 由图 9 可见， HBcAg 与 HBsAg+CpG-ODN联用相对于 HBsAg+CpG-ODN组分泌的 HBsAg特异性 IFN-γ水平高，而 HBsAg 特异性 IL-4 水平低，表明本发明 HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物相比于 HBsAg+CpG-ODN联用在细胞免疫方面更能促进 HBsAg特异性的 Thl细胞分化，说明 HBcAg、 HBsAg和 CpG-ODN具有协同作用。

[124] 实施例 10· HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物突破 HBV转基因小鼠（ adr血清型）和免疫耐受小鼠（ B10.M )的免疫耐受。

[125] 为了 ϋ HBsAg+HBcAg+CpG-ODN联用能否在 HBV转基因模型小鼠和免疫耐受小鼠上突破免疫耐受，本发明人分别将 HBsAg, HBcAg和 CpG-ODN, HBsAg和 Α1(ΟΗ)₃佐剂混匀，免疫小鼠，测定血清 HBsAg特异性总 IgG和保护性抗体 IU 水平，并进行统计学分析，从而评价 HBsAg , HBcAg 和 CpG-ODN联用相对于 HBsAg和 Α1(ΟΗ)₃联用对突破免疫耐受的影响。

[126] 本实施例中所使用免疫耐受小鼠有两种：第一种为 HBV转基因小鼠，血清型为 adr血清型，雄性， 10-12周，购自上海南方模式动物中心；第二种为 B10.M小鼠，为组织相容性小鼠，具有免疫耐受，雄性， 6-8周，购自 The Jackson Laboratory; 所使用的 HBsAg、 HBcAg和、 CpG-ODN和 Α1(ΟΗ)₃佐剂如实施例 1中所述。

[127] HBsAg和 HBcAg用 PBS稀释至 10 g/ml; CpG-ODN用 PBS稀释至 20 g/ml。对小鼠进行左后肢腓肠肌免疫，每只注射体积为 100 μΐ, 每组 4只小鼠。

[128] HBsAg+Al(OH)₃组每只小鼠注射 l g 经 Α1(ΟΗ)₃吸附的 HBsAg , HBsAg+HBcAg+CpG-ODN 组每只小鼠注射 l g HBsAg, l g HBcAg和 lO g CpG-ODN。每三周免疫一次，每次免疫后两周采血，共免疫 6次，按照实施例 1中所述方法检测 HBsAg特异性 I_gG总抗体，结果显示在图 10中，按照实施例 2 中所述方法检测产生的 HBsAg抗体，结果显示在图 11中。

[129] 由图 10可见， HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物组可突破两种模型小鼠的免疫耐受， HBsAg特异性 I_gG抗体滴度可达 4.0 个对数值以上，与 HBsAg+Al(OH)₃组比较，具有显著性差异 ( P<0.05 )， HBsAg特异性 IgG抗体滴度（效价 )可增加 10-200 倍；由图 11可见，保护性抗体水平可达 2.5个对数值以上，与 HBsAg+Al(OH)₃组比较，产生的保护性抗体水平高可增加 5-20 倍。上述结果表明，本发明 HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物疫苗比 Α1(ΟΗ)₃佐剂乙肝疫苗在免疫耐受小鼠上能显著增强乙肝表面抗原特异性的总 I_gG和保护性抗体的免疫应答，更能有效的突破免疫耐受。

[130] 实施例 11· HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物在 HBV转基因小鼠（adr血清型）和免疫耐受小鼠（ B10.M )，产生高滴度抗 HBcAg的特异性 IgG抗体。

[131] 为了^ iHBsAg+HBcAg+CpG-ODN联用能否在 HBV转基因模型小鼠和免疫耐受小鼠上，产生抗 HBcAg的特异性 I_gG抗体，本发明人将 HBsAg, HBcAg和 CpG-ODN混匀，免疫小鼠，测定血清中 HBcAg特异性总 IgG水平。 [132] 本实施例中所使用免疫耐受小鼠有两种，如实施例 10所述；所使用的 HBsAg、 HBcAg和 CpG-ODN同实施例 1中所述。

[133] HBsAg和 HBcAg用 PBS稀释至 10 g/ml; CpG-ODN用 PBS 稀释至 20 g/ml。每只小鼠经左后肢腓肠肌注射 l g HBsAg, l g HBcAg和 lO g CpG-ODN。每只小鼠，注射体积为 ΙΟΟμΙ, 每组 4只小鼠。每三周免疫一次，每次免疫后两周采血，共免疫 6次，按照实施例 1中所述方法检测 HBcAg抗原特异性 IgG总抗体，不同之处在于，包被抗原为 l g HBcAg抗原，结果显示在图 12中。

[134] 由图 12可见， HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物可在两种模型小鼠上，产生高滴度的抗 HBcAg特异性 I_gG抗体，在一免后二周抗体滴度即可达 2.5个对数值以上，此后抗体滴度可达 4.0 个对数值以上。上述结果表明，本发明 HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物产生高滴度抗 HBcAg的特异性 IgG抗体。

[135] 实施例 12· HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物在 HBV转基因小鼠（adr血清型）和免疫耐受小鼠（B10.M ) 中产生的抗 HBcAg抗体亚型 IgG2a>IgGl。

[136] 为了 iiHBsAg+HBcAg+CpG-ODN联用在 HBV转基因模型小鼠和免疫耐受小鼠上产生的抗 HBcAg 抗体亚型 IgG2a>IgGl , 本发明人将 HBsAg、 HBcAg和 CpG-ODN混匀，免疫小鼠，测定血清中抗 HBcAg抗体亚型 IgG2a和 IgGl滴度。

[137] 本实施例中所使用免疫耐受小鼠有两种，如实施例 10所述；所使用的 HBsAg、 HBcAg和 CpG-ODN同实施例 1中所述。

[138] HBsAg和 HBcAg用 PBS稀释至 10 g/ml; CpG-ODN用 PBS 稀释至 20 g/ml。每只小鼠经左后肢腓肠肌注射 1μ_δ HBsAg, l g HBcAg和 lO g CpG-ODN。每只小鼠，注射体积为 100μ1，每组 4只小鼠。每三周免疫一次，每次免疫后两周采血，共免疫 6次，按照实施例 6中所述方法检测抗 HBcAg抗体亚型 I_gG2a和 IgGl滴度，结果显示在图 13中。

[139] 图 13结果表明，本发明 HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物在 HBV转基因小鼠（ adr血清型）和免疫耐受小鼠（ B10.M ) 中产生在的抗 HBcAg抗体亚型 I_gG2a>IgGl , 且具有显著性差异（ Ρ<0·01 )。

[140] 实施例 13· HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物有清除 HBV 转基因小鼠中 HBsAg抗原的趋势。

[141] 对 HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物突破 HBV转基因小鼠免疫耐受，并产生抗原特异性抗体的小鼠进行分析，研究它们体内 HBsAg表达量是否可以出现下降趋势，验证抗体对血清中 HBsAg抗原的清除情况。

[142] 本实施例中所使用的为 HBV转基因小鼠，血清型为 adr血清型（从 C57小鼠改造而来），雄性， 10-12周，购自上海南方模式动物中心；所使用的 HBsAg、 HBcAg、 CpG-ODN和 Α1(ΟΗ)₃ 佐剂如实施例 1中所述。

[143] HBsAg和 HBcAg用 PBS分别稀释至 10 g/ml和 100 g/ml; CpG-ODN用 PBS分别稀幹至 20 g/ml和 200 g/ml。对小鼠进行左后肢腓肠肌免疫，每只注射体积为 100 μ1，每组 8只小鼠。 HBsAg+Al(OH)₃组每只小鼠注射 1 经 Α1(ΟΗ)₃吸附的 HBsAg; HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组分两组，一组每只小鼠注射 1 HBsAg, 1 HBcAg和 10 CpG-ODN, 另外一组每只小鼠注射 10 HBsAg, 10 HBcAg和 20 CpG-ODN。每三周免疫一次，每次免疫后两周采血，共免疫 6次，按照常规方法用 2%脱脂奶对免疫前和六免二周后的血清以 1:200稀释，用实施例 1中所述 HBsAg抗原作为标准品，用 C57小鼠（购自上海斯莱克公司）血清按 lOOOng/mK 500ng/mK 250ng/mK 125ng/ml、 62.5ng/ml、 31.25 ng/ml, 15.625 ng/ml, 7.8 ng/ml进行稀释作为起始浓度，再用 2%脱脂奶进行 1:200稀释，然后将稀释的样品和标准品用 HBsAg抗原检测试剂盒（上海科华公司）检测 HBsAg抗原浓度。用测定的标准曲线计算免疫前和六免二周后个鼠血清中含有的 HBsAg 抗原浓度，并计算六免二周后 HBsAg抗原浓度下降％。结果显示在图 14中。

[144] 具体 HBsAg 抗原浓度的检测步骤如下：取出预包被抗 HBsAg的反应板，加入 75μ1稀释的血清和阴、阳性对照于反应孔中；用封片纸覆盖反应^，将反应板置 37°C孵育 1 h; 取出反应板，撕去封片，在已加入待测样本和阴性、阳性对照孔中加入 50 μΐ酶结合物；微孔振荡器上震荡 10 s; 用封片纸覆盖反应将反应板置 37^eC孵育 30 m; 取出反应板，撕去封片，洗涤反应板 5次；洗涤结束后立即在所有孔内加入显色剂 A、显色剂 B各 50μ1，混匀；微孔振荡器上震荡 10 s; 用封片纸覆盖反应^ , 将反应板置 37°C孵育 30 m; 在所有孔内加入 50μ1终止液，震荡反应 5 s, 使之充分混匀。酶联仪测定 OD₄₅。_nm值（以 OD₆₃₀請校正）。

[145] 由图 14所示， HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物组在 HBV 转基因小鼠上的 HBsAg抗原浓度下降％高于 HBsAg+Al(OH)₃ 组，具有显著性差异（ P<0.05 )；提高 HBsAg、HBcAg和 CpG-ODN 佐剂剂量后， HBsAg抗原浓度下降％更明显，平均可达 90%以上。表明该组合物具有清除 HBsAg抗原并使 HBsAg抗原转阴的趋势，为慢性乙肝治疗性疫苗打下坚实的基础。

[146] 实施例 14· HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组合物具有 HBsAg 和 HBcAg抗原特异性 CTL体内杀伤的活性。

[147] 抗原特异性 CTL体内杀伤是对治疗性疫苗效果的最直接证据，对免疫 HBsAg+HBcAg+CpG-ODN 组合物的小鼠进行 HBsAg和 HBcAg抗原特异性 CTL体内杀伤活性的检测， ¾ϋ 其 CTL体内杀伤活性，计算 CTL杀伤率。

[148] 本实施例中所使用的为 C57BL/6J小鼠，雌性， 6-8周，购自上海斯莱克公司；所使用的 HBsAg抗原、 HBcAg和 CpG-ODN 佐剂如实施例 1中所述。 [149] HBsAg和 HBcAg用 PBS稀释至 100 g/ml; CpG-ODN用 PBS稀释至 200 g/ml。对小鼠进行左后肢腓肠肌免疫，每只注射体积为 100 μ1，每组 8只小鼠。 HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组每只小鼠注射 10 HBsAg、 lO g HBcAg和 20 CpG-ODN。每两周免疫一次，共免疫三次，在三免后十天检测 HBsAg 和 HBcAg抗原特异性 CTL体内杀伤活性，结果显示在图 15中。

[150] 具体抗原特异性 CTL体内杀伤活性检测步骤如下：无菌取未免疫小鼠的脾脏，玻片研磨， 300xg, 4。C离心 5 min, 弃上清；加入 5ml红细胞裂解液（购自 BD公司）重悬细胞，室温静置 5 min裂解红细胞，用 10 ml PBS (购自 GIBCO公司）洗涤两次；用 PBS将 CFSE (购自 Molecular Probes公司）稀释到 4 μΜ和 0.4 μΜ,分别与等体积的细胞悬液混匀，室温静置 7 min; 300xg, 4。C离心 5 min弃上清，用 PBS洗两次；分别用 RPMI-1640 (购自 GIBCO公司）完全培养基将细胞重悬，使细胞浓度为 2xl0⁷ cells/ml, CFSE^high细胞中分别加入等体积的 HBsAg肽库（见实施例 7 )和 HBcAg肽库； CFSE^low细胞中补加等体积 RPMI-1640 完全培养基，各转移至细胞培养瓶， 37。C， 5% C02培养箱中静置 4 h; 用 PBS洗两次； PBS重悬细胞并进行计数，根据计数结果用 PBS将细胞调至 2xl0⁷cells/ml，然后将两群细胞等体积混合；将制备好的标记细胞混合液经眼眶注射给免疫 HBsAg+HBcAg+CpG-ODN的小鼠，每只小鼠 100 μΐ; 15-17 h 后制备小鼠脾细胞悬液，用 2%FBS-PBS重悬细胞，用流式细胞仪进行检测；计算抗原特异性 CTL杀伤百分率。

[151] 上述 HBcAg肽库由 43个 15 J ^酸的多肽片且成，涵盖整个 HBcAg全长序列，每对相邻多肽有 11个氨基酸的相互重叠，代表所有可能的 HBcAg CTL表位，例如 SEQ ID NO:2的 1-15 位、 5-19位、 9-23位…… 169-183位酸的片段。上述 HBcAg 肽库的肽段设计如序列 SEQ ID NO:61~SEQ ID NO:103所示。所有肽段由 Chinese Peptide Company合成，纯化，分装和冻干。

[152] 由图 15 所示， HBsAg+HBcAg+CpG-ODN 组合物组在 C57BL/6J小鼠上，具有 HBsAg和 HBcAg抗原特异性 CTL体内杀伤活性，其 CTL 杀伤率在 30%左右。表明该组合物具有 HBsAg和 HBcAg抗原特异性 CTL体内杀伤活性，为慢性乙肝治疗性疫苗提供最直接的证据。

[153] 在本申请中，多个出版物在括号中被引用。由此，这些出版物的公开以整体通过引用并入本申请，以更完整的描述与本发明相关的技术的状态。

[154] 尽管通过公开的实施方案描述了本发明，本领域技术人员应当容易理解，具体的实施例和上文详述的研究只是对本发明的举例说明。应当理解在不脱离本发明精神的情况下，可作出各种修改。因此，本发明只受所附权利要求的限制。

Claims

权利要求

1.一种药物组合物，其包含：

i ) 乙肝表面抗原 ( HBsAg ),

ii ) 乙肝核心抗原 ( HBcAg ),

iii ) CpG寡聚脱氧核苷酸（ CpG-ODN )，和 /或

iv )任选地可药用载体。

2.根据权利要求 1所述的药物组合物，其用作预防性或治疗性疫苗。

3. 根据以上任一权利要求所述的药物组合物，其中所述

HBsAg具有 SEQ ID ΝΟ:1所示序列。

4. 根据以上任一权利要求所述的药物组合物，其中所述 HBcAg具有 SEQ ID NO:2所示序列。

5. 根据以上任一权利要求所述的药物组合物，其中所述 CpG-ODN包含硫代磷酸酯连接，优选地所述 CpG-ODN是全硫代寡聚脱氧核苷酸。

6. 根据以上任一权利要求所述的药物组合物，其中所述 CpG-ODN包含两个或更多个 5， -NTCGTT-3' 基序。

7. 根据以上任一权利要求所述的药物组合物，其中所述 CpG-ODN长度为 15 ~ 35个核苷酸，优选 20~25个核苷酸。

8. 根据以上任一权利要求所述的药物组合物，其中所述 CpG-ODN具有选自下列的序列： 5， -TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT-3' ( SEQ ID NO:3 ), 5' -TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT CGT T-3' ( SEQ ID NO:4 )、 5， -TCG TCG TCG TCG TCG TCG TCG-3' ( SEQ ID NO:5 )和 5， -TCC ATGACG TTC CTGACG TT-3' ( SEQ ID NO:6 ), 优选地所述 CpG-ODN具有序列： 5， -TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT-3' ( SEQ ID NO:3 )„

9.根据以上任一权利要求所述的药物组合物，其中组分 i )， ii ) 以及 iii )之间的相对重量比范围是 1: 0.2-5: 1-50, 优选为 1: 1-5: 2~15。

10.—种药盒，其包含权利要求 1-9任一项的药物组合物以及其使用说明。

11.根据权利要求 1至 9中任一项所述的药物组合物在制备用于在对象中治疗 HBV感染和 /或 HBV介导的疾病之药物中的用途，优选地所述 HBV感染和 /或 HBV介导的疾病选自乙型肝炎、肝硬化和肝癌。

12.根据权利要求 1至 9中任一项所述的药物组合物在制备用于在对象中产生针对 HBV的免疫应答之药物中的用途。

13.根据权利要求 1至 9中任一项所述的药物组合物在制备用于在对象中使抗 HBc抗体发生亚型转变之药物中的用途。

14.根据权利要求 1至 9中任一项所述的药物组合物在制备用于在对象中突破乙型肝炎病毒免疫耐受之药物中的用途。