JP2023506439A

JP2023506439A - 医薬組成物及びその用途

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Publication number: JP2023506439A
Application number: JP2022535199A
Authority: JP
Inventors: 李建強; 葛君; 孫嬌嬌; 周童; 任蘇林; 譚昌耀; 顧月; 黄紅穎; 王世偉; 陳曉曉; 黄精俸; 王曉東; 陳悦
Original assignee: Grand Theravac Life Science Nanjing Co Ltd
Current assignee: Grand Theravac Life Science Nanjing Co Ltd
Priority date: 2019-12-13
Filing date: 2020-12-11
Publication date: 2023-02-16
Also published as: WO2021115410A1; EP4074335A1; US20230073321A1; CA3161628A1; AU2020403296A1; TW202128219A; AU2020400234A1; BR112022011445A2; KR20220114031A; WO2021115408A1; EP4074334A1; WO2021115409A1; CN112972670A; CN112972672A; CN112972670B; US20230076371A1; EP4074336A1; JP2023506441A; ZA202207790B; JP2023506440A

Abstract

バイオ医薬品分野に属し、具体的には、医薬組成物に関する。前記医薬組成物はＢ型肝炎表面抗原と、Ｂ型肝炎コア抗原と、免疫刺激性組成物とを含み、前記免疫刺激性組成物はサポニンとＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドとを含み、又は前記免疫刺激性組成物はサポニンを含むアジュバントとＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドとからなる。

Description

本発明は、バイオ医薬品分野に属する。具体的には、本発明は、Ｂ型肝炎表面抗原と、Ｂ型肝炎コア抗原と、免疫刺激性組成物とを含む医薬組成物に関する。前記免疫刺激性組成物はサポニンとＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドとを含み、又は前記免疫刺激性組成物は、サポニンを含むアジュバントとＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドとからなり、前記ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド配列は２つ又は２つ以上のコピーの５’－ＴＴＣＧＴＴ－３’モチーフ又は５’－ＴＣＧＴＣＧＴＣＧ－３’モチーフを有する。本発明は、さらに、Ｂ型肝炎ウイルス感染及び／又はＢ型肝炎ウイルス媒介性疾患を治療するための前記医薬組成物の用途に関する。

Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染は世界で深刻な公衆衛生問題の１つである。ＨＢＶ感染は慢性Ｂ型肝炎、肝硬変と肝細胞がんの重要な原因である（ＦａｔｔｏｖｉｃｈＧ．Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．２００８；４８：３３５－３５２）。慢性ＨＢＶ感染の臨床治療によく使用する薬物には主にヌクレオシド類似体、インターフェロンがある。ヌクレオシド類似体は肝細細胞内のｃｃｃＤＮＡを完全に除去できず、長期服用の場合に薬剤耐性変異体の発生や投与中止後のリバウンドが起こりやすい（ＫｗｏｎＨ，ＬｏｋＡＳ．ＮａｔＲｅｖＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌＨｅｐａｔｏｌ．２０１１；８：２７５－２８４）。インターフェロンは無症候性ＨＢＶ保因者に適さず、慢性ＨＢＶ患者において、半年使用後のＨＢｅＡｇ血清変換率が３３％にとどまり、しかもその大きな副作用により使用も制限されている（ＴａｎｇＳＸ，ＹｕＧＬ．Ｌａｎｃｅｔ１９９０；３３５（８６８４）：３０２）。

現在幅広く使用されるＢ型肝炎タンパク質ワクチンは、体液性免疫を誘導して、防御中和抗体を生じさせることで、予防目的を達成するものである。数多くの研究から分かるように、中和抗体が排除できるのは細胞外のウイルス粒子だけで、細胞内の感染ウイルスの除去は主に特異的な細胞性免疫応答や、ヘルパーＴ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞が生じたＩＦＮ－γなどのＴｈ１サイトカイン、特にウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、略称ＣＴＬ）に頼る（ＣｈｉｎＲ，ＬａｃａｍｉｎｉＳ．ＲｅｖＭｅｄＶｉｏｒｌ．２００３：１３（４）：２５５－７２）。細胞性免疫応答の強さが直接的にＢ型肝炎の予後を決定している。したがって、治療用Ｂ型肝炎ワクチンとしては理想的なのは特異的な体液性免疫と細胞性免疫を同時に誘導して、Ｂ型肝炎の免疫寛容を突破する必要があるものである。例えば、中国特許ＣＮ１０４０４３１２０Ｂは、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）と、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）と、オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ）とを含む治療用Ｂ型肝炎ワクチンを提供し、それはＢ型肝炎の免疫寛容を突破でき、ウイルス性Ｂ型肝炎、特に慢性Ｂ型肝炎の治療に用いられる。

本発明者は従来の技術について踏み入った研究を行ったところ、アジュバントが治療用Ｂ型肝炎ワクチンの治療効果に重要な役割を果たすことを見出した。アジュバントとしてよく使用されるオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ）は免疫刺激性組成物として、その化学的本質がシトシングアニンジヌクレオチドを含むオリゴデオキシヌクレオチドで、天然のＣｐＧパターン認識受容体と似ている免疫応答を有し、細胞膜におけるＴｏｌｌ様受容体と結合して、ＴＬＲ９シグナル伝達経路を介して哺乳類において効果的に免疫応答を誘発することができる。サポニンアジュバントはトリテルペン又はスピロステラン系化合物をアグリコンとするグリコシドで、植物由来のアジュバントに属する。その中で、キラヤサポニン（ＱＳ）はキラヤから抽出されるサポニンであり、ＱＳシリーズにおいてＱＳ－２１はこれまで関連の報告が最も多いアジュバントであるが、細胞の溶血を誘発する可能性があり、全身的・局所的な毒性副作用がある。Ａｌｖｉｎｇら（ＡＬＶＩＮＧＣＲ，ＭＡＴＹＡＳＧ，ＢＥＣＫＺ，ｅｔａｌ．ＲｅｖｕｅＲｏｕｍａｉｎｅｄｅＣｈｉｍｉｅ，２０１６，６１（８）：６３１－６３５．）の研究により、ＡＬＦリポソームがアジュバントとしてＭＰＬＡとＱＳ－２１と結合してＨＩＶｇｐ１４０タンパク質に対抗する場合に血清中の抗体価を効果的に高められることが分かった。Ｎｇら（ＮＧＨ，ＦＥＲＮＡＮＤＯＧＪＰ，ＤＥＰＥＬＳＥＮＡＩＲＥＡＣＩ，ｅｔａｌ．ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｐｏｒｔｓ，２０１６，６（１）：２２８－２３０．）は皮下送達技術としてナノパッチを用いて、ＱＳ－２１とアジュバント複合体を構成する。結果からは、従来の筋肉内注射と比べ、ナノパッチが抗原とＱＳ－２１の用量を明らかに減らし、より高いＩｇＧ力価を誘導できることが判明した（韓子怡，曾忠良，現代農業科技，２０１９（１４）：２２０－２２１．）。

従来の技術（ＷＯ２００１０５１０８３Ａ３）にはサポニンとＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドとを含む免疫刺激性組成物が報告され、そのなか、ＣｐＧアジュバントがＣｐＧ１８２６、ＣｐＧ７９０９に関する。しかし、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの構造の多様性により、異なる配列のＣｐＧアジュバントは効果が大きく異なる。

したがって、今は免疫効果のより強いアジュバントとＢ型肝炎治療薬が要望される。

本発明者は従来技術の欠点について、多くの研究を行ったところ、思いがけずも、免疫効果のより強い免疫刺激性組成物、前記免疫刺激性組成物を含む医薬組成物を発見した。本発明に係る医薬組成物は二重アジュバントを含み、且つその中のサポニンとＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドが効率的な相乗効果を表すため、より強い免疫応答を媒介することができる。本発明は、さらに、Ｂ型肝炎ウイルス感染及び／又はＢ型肝炎ウイルス媒介性疾患を治療するための前記医薬組成物の用途を提供する。

本発明の目的は下記の技術的解決手段により達成される。
本発明は、一態様において、
ｉ）Ｂ型肝炎表面抗原、前記抗原の活性フラグメント、前記抗原の変異体、又はそれらの少なくとも２つの混合物と、
ｉｉ）Ｂ型肝炎コア抗原、前記抗原の活性フラグメント、前記抗原の変異体、又はそれらの少なくとも２つの混合物と、
ｉｉｉ）サポニンとＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドとを含み、又はサポニンを含むアジュバントとＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドとからなり、前記ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド配列は２つ又は２つ以上のコピーの５’－ＴＴＣＧＴＴ－３’モチーフ又は５’－ＴＣＧＴＣＧＴＣＧ－３’モチーフを有する免疫刺激性組成物とを含む、医薬組成物を提供する。

本発明に係る医薬組成物において、前記ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの配列は、
ＣｐＧＴ１：ＴＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＴＴ（配列番号６）、ＣｐＧＴ２：ＴＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＴＴ（配列番号７）、ＣｐＧＴ３：ＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧ（配列番号８）から選ばれるいずれか１つであり、
好ましくは、前記ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの配列はＣｐＧＴ１：ＴＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＴＴ（配列番号６）である。

本発明に係る医薬組成物において、前記サポニンはキラヤサポニン、ギンセノシド、プラチコジン、アストラガロシド、ノトギンセノシド、グリチルリチン、ジュリブロシド、オフィオポゴニン、サイコシド又はチクセツサポニンから選ばれる１つ又は複数であってもよい。好ましくは、前記サポニンはキラヤサポニン、ギンセノシド、プラチコジン又はアストラガロシドＡであり、より好ましくは、前記キラヤサポニンはＱＳ－７、ＱＳ－１７、ＱＳ－１８又はＱＳ－２１であり、さらに好ましくは、前記キラヤサポニンはＱＳ－２１であり、前記ギンセノシドはギンセノシドＲｇ１、ギンセノシドＲｇ３、ギンセノシドＲｂ１又はギンセノシドＲｅであってもよく、前記プラチコジンはプラチコジンＤ、プラチコジンＤ２又はその両方の混合物であってもよく、前記アストラガロシドはアストラガロシドＡ（アストラガロシドＩＶ）、アストラガロシドＩ、アストラガロシドＩＩなどのモノマー又はそれらの２つ若しくは２つ以上のサポニンモノマーの混合物であってもよく、前記ノトギンセノシドはノトギンセノシドＲ１であってもよく、前記オフィオポゴニンはオフィオポゴニンＤなどであってもよく、前記サイコシドはサイコシドａ、サイコシドｄ又はその両方の混合物であってもよく、前記ジュリブロシドはゴウカンヒの総サポニンなどであってもよく、前記グリチルリチンはカンゾウの総サポニンであってもよく、前記チクセツサポニンはチクセツニンジンの総サポニンであってもよい。

本発明に係る医薬組成物において、サポニンを含む前記アジュバントは免疫刺激性複合体アジュバント（Ｉｓｃｏｍアジュバント）である。

本発明に係る医薬組成物において、前記ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドはホスホロチオエート結合を含んでもよく、好ましくは、前記ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドはチオオリゴデオキシヌクレオチドであり、より好ましくは、ペルチオオリゴデオキシヌクレオチドである。

本発明に係る医薬組成物において、前記ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドとサポニンの重量比は１～４０：０．１～２であり、好ましくは、２～４０：０．１～２である。

好ましくは、前記ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドとサポニンの重量比は１：０．１、１：１、１：２、２：０．１、２：１、４０：０．１、４０：１又は２０：１であり、好ましくは、１：１、２：１、４０：０．１、４０：１又は２０：１であり、より好ましくは、２：１である。

本発明に係る医薬組成物において、前記Ｂ型肝炎表面抗原は、配列番号１に示す配列を含み又はそれからなる。

本発明に係る医薬組成物において、前記Ｂ型肝炎コア抗原は配列番号２に示す配列を含み、又はそれからなり、好ましくは、前記Ｂ型肝炎コア抗原の活性フラグメントは配列番号２における１位～Ｘ位の連続のアミノ酸を含み、又はそれからなり、Ｘは１４９～１８３との間の整数であってもよく、より好ましくは、Ｘは１５２～１８３との間の整数である。

本発明に係る医薬組成物において、前記医薬組成物の成分ｉ）、ｉｉ）とｉｉｉ）の重量比は４：２：１．１～４２であり、好ましくは、４：２：２．１～４２である。

さらに好ましくは、前記医薬組成物の成分ｉ）、ｉｉ）とｉｉｉ）の重量比は４：２：１．１、４：２：２、４：２：３、４：２：２．１、４：２：４０．１、４：２：４１又は４：２：４２であり、好ましくは、４：２：２、４：２：３、４：２：４０．１、４：２：４１又は４：２：４２であり、より好ましくは、４：２：３である。

本発明に係る医薬組成物において、前記医薬組成物は、ｉｖ）薬学的に許容される担体をさらに含む。

本発明は、別の態様において、前記医薬組成物を含むＢ型肝炎予防用ワクチン又はＢ型肝炎治療用ワクチンを提供し、好ましくは、前記ワクチンはＢ型肝炎治療用ワクチンである。

本発明は、更なる態様において、Ｂ型肝炎ウイルス感染及び／又はＢ型肝炎ウイルス媒介性疾患を予防及び／又は治療するための薬物の製造における前記医薬組成物の用途を提供し、好ましくは、前記Ｂ型肝炎ウイルス感染及び／又はＢ型肝炎ウイルス媒介性疾患はＢ型肝炎、肝硬変、肝がんから選ばれる。

本発明は、更なる態様において、対象においてＢ型肝炎ウイルスに対する体液性免疫及び／又は細胞性免疫応答を産生させるための薬物の製造における前記医薬組成物の用途を提供する。

本発明は、更なる態様において、対象におけるＢ型肝炎コア抗体にサブタイプを変換させるための薬物の製造における前記医薬組成物の用途を提供する。

本発明は、更なる態様において、対象においてＢ型肝炎ウイルスの免疫寛容を突破するための薬物の製造における前記医薬組成物の用途を提供する。

本発明は、更なる態様において、それを必要とする被験者に予防及び／又は治療有効量の医薬組成物を投与することを含む、Ｂ型肝炎ウイルス感染及び／又はＢ型肝炎ウイルス媒介性疾患を予防及び／又は治療する方法を提供し、好ましくは、前記Ｂ型肝炎ウイルス感染及び／又はＢ型肝炎ウイルス媒介性疾患はＢ型肝炎、肝硬変、肝がんから選ばれる。

本発明は、別の態様において、それを必要とする被験者に有効量の医薬組成物を投与することを含む、対象においてＢ型肝炎ウイルスに対する体液性免疫及び／又は細胞性免疫応答を産生させる方法を提供する。

本発明は、別の態様において、それを必要とする被験者に有効量の医薬組成物を投与することを含む、対象におけるＢ型肝炎コア抗体にサブタイプを変換させる方法を提供する。

本発明は、別の態様において、それを必要とする被験者に有効量の医薬組成物を投与することを含む、対象においてＢ型肝炎ウイルスの免疫寛容を突破する方法を提供する。

本発明に係る医薬組成物は二重アジュバントを含み、予期しえぬ技術的効果を有し、より強い免疫応答を媒介することができる。ＣｐＧＴ１、ＣｐＧＴ２、ＣｐＧＴ３単独使用の免疫刺激効果はＣｐＧ１０１８、ＣｐＧ７９０９、ＣｐＧ１８２６などより弱いが、ＱＳ２１と併用すると、前記アジュバントが予期しえぬ相乗効果を表し、免疫効果が明らかに増強する。当該免疫刺激性組成物を含むＢ型肝炎治療用ワクチンは遺伝子改変マウスの免疫寛容を突破して、力価の高い抗ＨＢｓＡｇ抗体、抗ＨＢｃＡｇ抗体、中和抗体を産生させることができる。いずれの検出結果からも示すように、当該ワクチンは複数回の免疫化により遺伝子改変マウスの体内のＢ型肝炎ウイルスを明らかに除去でき、免疫化プロセスの終了後、ＨＢｓＡｂレベルがほぼ飽和となり、安定した長期の免疫効果を保つことができ、ＨＢｓＡｇの平均低下率が約９２％に維持される。同時に、前記免疫刺激剤を含むＢ型肝炎ワクチンは比較的強いＨＢｓＡｇとＨＢｃＡｇ特異的ＩＦＮ－γレベルを誘導産生させることができ、免疫効果が単独のアジュバントより明らかに優れ、他のＣＰＧアジュバントとＱＳ２１の組み合わせより明らかに優れている。

以下、各図を参照して本発明の実施形態を詳細に説明する。
異なるＣＰＧオリゴデオキシヌクレオチドのＨＢｓＡｇ抗原特異的ＩＦＮ－γの分泌レベルに対する影響を示す。異なるＣＰＧオリゴデオキシヌクレオチドのＨＢｃＡｇ抗原特異的ＩＦＮ－γの分泌レベルに対する影響を示す。本発明に係る異なる免疫刺激性組成物のＨＢｓＡｇ抗原特異的ＩＦＮ－γの分泌レベルに対する影響を示す。本発明に係る異なる免疫刺激性組成物のＨＢｃＡｇ抗原特異的ＩＦＮ－γの分泌レベルに対する影響を示す。本発明に係る異なる用量の免疫刺激性組成物のＨＢｓＡｇ抗原特異的ＩＦＮ－γの分泌レベルに対する影響を示す。本発明に係る異なる用量の免疫刺激性組成物のＨＢｃＡｇ抗原特異的ＩＦＮ－γの分泌レベルに対する影響を示す。本発明に係る免疫刺激性組成物を含むＢ型肝炎ワクチンの血清中のＨＢｓＡｇレベルに対する影響を示す。本発明に係る免疫刺激性組成物を含むＢ型肝炎ワクチンの血清中のＨＢｓＡｂレベルに対する影響を示す。本発明に係る免疫刺激性組成物を含むＢ型肝炎ワクチンのＨＢｓＡｇ抗原特異的ＩＦＮ－γの分泌レベルに対する影響を示す。本発明に係る免疫刺激性組成物を含むＢ型肝炎ワクチンのＨＢｃＡｇ抗原特異的ＩＦＮ－γの分泌レベルに対する影響を示す。本発明に係る免疫刺激性組成物を含むＢ型肝炎ワクチンのマウス血清中のＨＢｓＡｇ抗原特異的ＩｇＧ抗体及びそのサブタイプレベルに対する影響を示す。図中、パネルＡは各群のマウスの血清ＨＢｓＡｂＩｇＧレベルである。パネルＢは各群のマウスの血清ＨＢｓＡｂＩｇＧ１レベルである。パネルＣは各群のマウスの血清ＨＢｓＡｂＩｇＧ２ａレベルである。パネルＤは各群のマウスの血清ＨＢｓＡｂＩｇＧ２ａとＩｇＧ１の比の値である。本発明に係る免疫刺激性組成物を含むＢ型肝炎ワクチンのマウス血清中のＨＢｃＡｇ抗原特異的ＩｇＧ抗体及びそのサブタイプレベルに対する影響を示す。図中、パネルＡは各群のマウスの血清ＨＢｃＡｂＩｇＧレベルである。パネルＢは各群のマウスの血清ＨＢｃＡｂＩｇＧ１レベルである。パネルＣは各群のマウスの血清ＨＢｃＡｂＩｇＧ２ａレベルである。パネルＤは各群のマウスの血清ＨＢｃＡｂＩｇＧ２ａとＩｇＧ１の比の値である。異なるサポニンを含む免疫刺激性組成物のＨＢｓＡｇ抗原特異的ＩＦＮ－γの分泌レベルに対する影響を示す。異なるサポニンを含む免疫刺激性組成物のＨＢｃＡｇ抗原特異的ＩＦＮ－γの分泌レベルに対する影響を示す。

「定義」
特に定義がない限りは、本明細書で使用する全ての技術用語は当業者が理解しているのと同じ意味である。本分野の定義と用語に関して、当業者はＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照することができる。アミノ酸残基の略号は本分野で通常の２０のＬ－アミノ酸の１つを指す標準的な３文字及び／又は１文字コードである。

本発明において広い範囲で数値範囲とパラメータの近似値を示しているが、具体例で数値はなるべく正確に記載する。しかし、いずれの数値もその測定に標準偏差があるため、程度の差こそあれ必ず誤差が含まれる。また、本明細書において開示される範囲はいずれも、その中に含まれる任意の又は全ての部分範囲をカバーしていると理解される。例えば、「１．１～４２」と記載される範囲は最小値１．１と最大値４２の間（端点を含む）の任意の又は全ての部分範囲であって、つまり、全ての、最小値１．１又はそれより大きい数値から始まる部分範囲（例えば、１．１～６．１）と最大値４２又はそれより小さい数値で終わる部分範囲（例えば、５．５～４２）を含むと見なされる。また、参照文献が「本明細書に組み込まれる」とは、全体として組み込まれると理解される。

なお、本明細書で使用する単数形は、１つの指示対象との明確な限定がない限りは、指示対象の複数形を含む。用語「又は」は、文脈において明示がない限り、用語「及び／又は」と入れ替えて使用される。

本明細書で用語「医薬組成物」、「組み合わせ薬物」と「薬物組み合わせ」は、組み合わせて特定の目的を達成する少なくとも１つの薬物と任意選択での薬学的に許容される賦形剤又は添加物との組み合わせを表すように入れ替えて使用される。一部の実施形態において、前記医薬組成物は、共に機能して本発明の目的を達成できるものであれば、時間的及び／又は空間的に分離した組み合わせを含む。例えば、前記医薬組成物に含まれる成分（例えば、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ、ＱＳ－２１、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド）は全体として対象に投与されてもよいし、又は別々に対象に投与されてもよい。前記医薬組成物に含まれる成分が別々に対象に投与される場合に、前記成分は同時に又は順次対象に投与されることができる。

本明細書で使用する用語「ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド」又は「ＣｐＧ－ＯＤＮ」とは、１つ又はそれ以上の「ＣｐＧ」単位を含む、短い一本鎖合成ＤＮＡ分子を指し、ここでＣはシトシンを、Ｇはグアニンを、ｐはホスホジエステル結合を表す。特に、前記ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドはメチル化されていない。一部の実施形態において、前記ＣｐＧ－ＯＤＮはホスホロチオエート結合又はホスホロチオエート骨格を含む。つまり、一部の実施形態において、前記ＣｐＧ－ＯＤＮはホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド（即ちチオオリゴデオキシヌクレオチド）である。好ましくは、前記ＣｐＧ－ＯＤＮにおいてヌクレオチド同士の結合は全てホスホロチオエート結合であり、つまり前記ＣｐＧ－ＯＤＮはペルチオオリゴデオキシヌクレオチドである。他の一部の実施形態において、前記ＣｐＧ－ＯＤＮは２つ又は２つ以上のコピーの５’－ＴＴＣＧＴＴ－３’モチーフ又は５’－ＴＣＧＴＣＧＴＣＧ－３’モチーフを含む。特に、前記ＣｐＧ－ＯＤＮは、ＴＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＴＴ（配列番号６）、ＴＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＴＴ（配列番号７）、ＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧ（配列番号８）から選ばれる配列を有し、好ましくは、ＴＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＴＴ（配列番号６）である。

本明細書で使用する「ギンセノシド、プラチコジン、アストラガロシド、ノトギンセノシド、グリチルリチン、ジュリブロシド、オフィオポゴニン、サイコシド又はチクセツサポニン」とは対応の植物に存在する活性成分を指し、例えば、ギンセノシドは主にジンセン属生薬に存在するステロール化合物であり、ジンセンにおける活性成分である。一部の実施形態において、前記ギンセノシドは、ギンセノシドＲｇ１、ギンセノシドＲｇ３、ギンセノシドＲｂ１、ギンセノシドＲｅなどのモノマー又はそれらの２つ若しくは２つ以上のサポニンモノマーの混合物であることが好ましく、プラチコジンはプラチコジンＤ、プラチコジンＤ２又はその両方の混合物であることが好ましく、アストラガロシドはアストラガロシドＡ（アストラガロシドＩＶ）、アストラガロシドＩ、アストラガロシドＩＩなどのモノマー又はそれらの２つ若しくは２つ以上のサポニンモノマーの混合物であることが好ましく、ノトギンセノシドはノトギンセノシドＲ１などであることが好ましく、オフィオポゴニンはオフィオポゴニンＤなどであることが好ましく、サイコシドはサイコシドａ、サイコシドｄ又はその両方の混合物であることが好ましく、ジュリブロシドはゴウカンヒの総サポニンなどであることが好ましく、グリチルリチンはカンゾウの総サポニンなどであることが好ましく、チクセツサポニンはチクセツニンジンの総サポニンなどであることが好ましい。

本明細書で使用される「Ｉｓｃｏｍアジュバント」は免疫刺激性複合体アジュバントであり、具体的には、抗原を含まないＩｓｃｏｍマトリックス（ＩＳＣＯＭＭＡＴＲＩＸ）で、リン脂質、サポニン、コレステロールからなるケージ様構造のアジュバントである。

本明細書で使用する「治療有効量」又は「有効量」とは、投与対象にメリットを表すのに十分な用量を指す。投与に係る実際の用量、投与速度と持続時間は治療対象自身の状況と疾患の程度により決定される。治療処方（例えば、用量の決定など）は最終的には一般開業医又は他の医師が責任を持って決定を下し、一般に考慮するのは治療の対象疾患、患者個体の状況、送達部位、投与方法、医師にとって既知の他の要因である。

本明細書で使用する用語「哺乳類」とはヒトを指し、他の動物、例えば、野生動物（例えば、アオサギ、コウノトリ、ツルなど）、家畜（例えば、アヒル、ガチョウなど）又は実験動物（例えば、オランウータン、サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、マーモット、ジリスなど）であってもよい。

他の一部の実施形態において、本発明に係る組成物は薬学的に許容される担体又は添加物など他の添加物を含んでもよく、特に、薬物製剤として存在する場合はそうである。

医薬担体として特に好ましいのは水、水系緩衝液であり、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝液）などの等張塩溶液、グルコース、マンニトール、デキストロース、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、炭酸マグネシウム、０．３％グリセリン、ヒアルロン酸、エタノール、又はポリアルキレングリコール（例えばポリプロピレングリコール）、トリグリセリドなどが好ましい。使用される医薬担体のタイプは、特に、本発明に係る組成物が経口、経鼻、皮内、皮下、筋肉内又は静脈内投与用に製剤化されるかどうかにより決定される。本発明に係る組成物は、湿潤剤、乳化剤又は液体緩衝物質を添加物として含んでもよい。

本発明に係る医薬組成物、ワクチン又は薬物製剤は、任意の適切な経路投与により、例えば、経口、経鼻、皮内、皮下、筋肉内又は静脈内にて投与されることができる。

以下、各図を参照して具体的な実施形態で本発明をさらに説明するが、これは本発明への限定ではない。当業者は本発明の趣旨に基づいて、様々な修正又は改善を行うことができ、本発明の趣旨から逸脱していなければ、本発明の範囲に含まれる。

以下、特定の実施例を用いて本発明を説明する。これらの実施例が本発明を説明するものに過ぎず、何らかの形で本発明の範囲を限定するものではないことは、当業者にとって理解できるであろう。

下記の実施例における実験方法は、特段の説明がない限り、いずれも従来の方法である。下記の実施例で使用する原料、試薬材料などは、特段の説明がない限り、いずれも市販品である。

実施例１：免疫刺激性組成物のスクリーニング実験の準備
１．ＨＢｓＡｇストック溶液：ＨＢｓＡｇタンパク質のアミノ酸配列は配列番号１に示すとおりである。

ＨＢｓＡｇタンパク質はＨＢｓＡｇ遺伝子組換え酵母細胞より調製され、酵母細胞の種類は、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）を含み、好ましくは、ハンセヌラ・ポリモルファである。調製ステップの詳細は中国特許出願ＣＮ１０８３３０１４５Ａを参照し、ＨＢｓＡｇ遺伝子組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞を発酵及び培養して、菌体を得た。菌体破砕処理とシリカゲル吸着、カラムクロマトグラフィー、ＴＦＦなどの精製ステップを行った。

２．ＨＢｃＡｇストック溶液：ＨＢｃＡｇタンパク質のアミノ酸配列は配列番号２に示すとおりである。

ＨＢｃＡｇタンパク質はＨＢｃＡｇ遺伝子組換え酵母細胞より調製され、酵母細胞の種類は、ハンセヌラ・ポリモルファ、出芽酵母、ピキア・パストリスを含み、好ましくは、ハンセヌラ・ポリモルファである。調製ステップの詳細は中国特許出願ＣＮ１０８０４７３１６Ａを参照し、ＨＢｃＡｇ遺伝子組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞を発酵及び培養して、菌体を得た。菌体破砕処理と硫酸アンモニウム、カラムクロマトグラフィー、ＴＦＦなどの精製ステップを行って、ＨＢｃＡｇストック溶液を得た。

３．ＱＳ－２１：ＢＲＥＮＮＴＡＧ社より購入され、ＣＡＳ番号はＡ０１０－０２３である。

４．ＣＰＧオリゴデオキシヌクレオチド原料の調製方法：
オリゴデオキシヌクレオチドは合成的に調製されたオリゴデオキシヌクレオチド配列フラグメントで、１つ又は複数のＣｐＧモチーフを含み、本実施例で使用するＣＰＧ配列は表１を参照する。

調製方法の詳細は次のとおりである。従来の固相ホスホロアミダイトトリエステル法という化学合成法を用いて調製する。３’末端から開始し、１）脱保護基であって、次のステップの縮合反応への使用に備えるために、最初にトリクロロ酢酸でＣｐＧと結合したヌクレオチドの保護基ＤＭＴ（ジメトキシトリチル基）を除去して、遊離５’ヒドロキシ基を得た。２）活性化であって、ホスホロアミダイトで保護したヌクレオチドモノマーとテトラゾリウム活性化因子とを混合し合成カラムに入れて、ホスホロアミダイトテトラゾール活性中間体を生成し、当該中間体がＣｐＧにおける脱保護されたヌクレオチドと縮合反応する。３）接続であって、ホスホロアミダイトテトラゾール活性中間体がＣｐＧにおける脱保護されたヌクレオチドと遭遇すると、その５’ヒドロキシ基と求核反応を行い、縮合してテトラゾールを除去し、この時にオリゴヌクレオチド鎖が前方に１塩基延長した。４）酸化であって、縮合反応時はヌクレオチドモノマーが亜リン酸エステル結合を介してＣｐＧと結合したオリゴヌクレオチドと接続するが、亜リン酸エステル結合が安定せず、酸又は塩基によって加水分解されやすいので、この場合にチオ試薬を使用してホスホロアミダイトを酸化して硫黄－リン二重結合リン酸トリエステルを得て、安定的なオリゴヌクレオチドを得た。５）ブロッキングであって、縮合反応後はＣｐＧと結合した未反応の５’ヒドロキシ基が次の循環反応において伸長されることを防ぐために、一般にアセチル化によって当該末端ヒドロキシ基をブロッキングする。この５つのステップを経て、１つのデオキシヌクレオチドがＣｐＧのヌクレオチドに接続される。上記の脱保護基、活性化、接続、酸化、ブロッキングのプロセスを繰り返すと粗ＤＮＡフラグメントを得ることができる。最後にそれに切断、脱保護基、精製、定量などの合成後処理を行って完了した。

５．ＰＢＳ溶液（Ｈｙｃｌｏｎｅ社より購入）を使用してＨＢｓＡｇストック溶液、ＨＢｃＡｇストック溶液をそれぞれ２００μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌに希釈した。次のステップへの使用に備えるために、ＰＢＳ溶液を使用して各ＣＰＧ原料をそれぞれ溶解し１００μｇ／ｍｌに希釈した。

実施例２：ＣＰＧオリゴデオキシヌクレオチドのスクリーニング実験
１．実験動物：Ｃ５７ＢＬ／６（Ｎ）マウス、雄、４週齢、１３５匹、上海霊暢実験動物技術有限公司提供。

２．実験群設定：表２を参照し、１回の注射量は１００μＬ／匹であった。Ａ群は陰性コントロールで、ＰＢＳ溶液１００μＬ／匹であった。

３．実験ステップは次のとおりである。免疫後７日目にマウスから脾臓を摘出し、従来の方法で次のとおりに脾臓リンパ球を用意した。無菌操作による脾臓の摘出であって、滅菌鉗子とはさみで脾臓を取り出して、７０μｍセルストレーナーに入れ、２ｍｌの予冷後の２％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ社より購入）－ＰＢＳを含むプレートに置いた。乳棒で脾臓を研磨し、脾臓細胞がメッシュからプレートに入って、細胞懸濁液を得、パスツールピペットで懸濁液を４０μｍセルストレーナーで濾過した（ＢＤ社より購入）５０ｍｌ滅菌遠心管に入れた。５００×ｇで、４℃下５分間遠心分離した。上清を捨て、２ｍｌの１×赤血球破壊剤（ＢＤ社より購入）を加えて細胞を再懸濁し、４℃下で暗所に５分間静置して、赤血球を破砕させた。１０ｍｌの２％ＦＢＳ－ＰＢＳを加えて赤血球破壊反応を停止させた。５００×ｇで、４℃下５分間遠心分離した。上清を捨て、５ｍｌの２％ＦＢＳ－ＰＢＳを加えて細胞を再懸濁しておいた。刺激剤としてＨＢｓＡｇ特異的ペプチドプールＰＳ４、ＨＢｃＡｇ特異的ペプチドプールＰＣＰをそれぞれ使用して脾細胞を刺激した。キットの取扱説明書に従って、ＥＬＩＳＰＯＴキット（ＢＤ社）を使用してＨＢｓＡｇとＨＢｃＡｇ抗原特異的ＩＦＮ－γの分泌レベルを検出した。ＩｍｍｕｎｏＳＰＯＴＳｅｒｉｅｓ３エリスポットアナライザーを用いてＥＬＩＳＰＯＴキットで測定したスポット数を読み取った（操作ステップの詳細は中国特許ＣＮ１０４０４３１２０Ｂの実施例７を参照する）。

ＨＢｓＡｇ特異的ペプチドプール配列は中国特許ＣＮ１０４０４３１２０Ｂの実施例７を参照し、ＨＢｃＡｇ特異的ペプチドプール配列は配列番号１６～３０を参照する。

４．実験結果：ＥＬＩＳＰＯＴスポット結果を図１、図２に示し、結果に示すように、配列の異なるタイプＢＣｐＧアジュバントは異なる免疫効果を有し、ＣｐＧＴ１～Ｔ３、ＣｐＧ１０１８、ＣｐＧ７９０９、ＣｐＧ１８２６、ＣｐＧ６８４は全体としてタイプＡＣｐＧアジュバント、タイプＣＣｐＧアジュバントより優れており、ＣｐＧ１６１８、ＣＰＧＤ２は免疫効果が悪く、誘導産生されたＨＢｓＡｇとＨＢｃＡｇ特異的ＩＦＮ－γレベルはいずれもタイプＡＣｐＧアジュバント、タイプＣＣｐＧアジュバントより低かった。

実施例３：免疫刺激性組成物のスクリーニング実験
１．実験動物：Ｃ５７ＢＬ／６（Ｎ）マウス：雄、４週齢、８１匹、上海霊暢実験動物技術有限公司提供。
２．実験群設定：表３を参照し、１回の注射量は１００μＬ／匹であった。Ａ群は陰性コントロールで、ＰＢＳ溶液１００μＬ／匹であった。

３．実験ステップ：実施例２と同じであった。

４．実験結果：ＥＬＩＳＰＯＴスポット結果を図３、図４に示し、結果に示すように、ＣｐＧＴ１～Ｔ３はＱＳ２１と併用すると効率的な相乗効果が得られ、誘導産生されたＨＢｓＡｇとＨＢｃＡｇ特異的ＩＦＮ－γレベルはＣｐＧ１０１８、ＣｐＧ７９０９など他のいくつかのＣｐＧアジュバントより明らかに高く、予期しなかった免疫効果がある。

実施例４：含有量の異なるアジュバントの医薬組成物の免疫効果に対する影響
１．実験動物：Ｃ５７ＢＬ／６（Ｎ）マウス、雄、４週齢、６０匹、上海霊暢実験動物技術有限公司提供。

２．試薬材料：
１）ＨＢｓＡｇタンパク質、ＨＢｃＡｇタンパク質、ＣｐＧＴ１はいずれも実施例１より調製した。
２）ＱＳ－２１（ＣＡＳ番号Ａ０１０－０２３、ＢＲＥＮＮＴＡＧ社より購入）
３）次のステップへの使用に備えるために、ＰＢＳ溶液（Ｈｙｃｌｏｎｅ社より購入）を使用してＨＢｓＡｇストック溶液、ＨＢｃＡｇストック溶液をそれぞれ２００μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌに希釈し、ＱＳ２１をそれぞれ５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌに希釈し、ＰＢＳ溶液を使用してＣｐＧＴ１を溶解しそれぞれ５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌに希釈し、ＰＢＳ溶液を使用してＣＰＧ７９０９を溶解し１００μｇ／ｍｌに希釈した。

３．実験群設定：表４を参照し、１回の注射量は１００μＬ／匹であった。Ａ群は陰性コントロールで、ＰＢＳ溶液１００μＬ／匹であった。

４．実験ステップ：実施例２と同じであった。

５．実験結果：ＥＬＩＳＰＯＴスポット結果は図５、図６を参照し、結果に示すように、ＣｐＧＴ１とＱＳ２１の用量変化はいずれもワクチン組成物に明らかな影響があり、用量５の免疫刺激性組成物より高く、誘導産生されたＨＢｓＡｇとＨＢｃＡｇ特異的ＩＦＮ－γレベルはＣＰＧ７９０９群より明らかに高く、しかし種間差異により、アジュバント用量がさらに増えると誘導効果には明らかな増加が認められず、その理由としてマウスにおいてはアジュバントの免疫力が正しく反映されないことが想定される。

用量１、２、４はＣＰＧ７９０９群の免疫刺激効果と同等であるものの、アジュバントの使用量は同等なＣＰＧ７９０９群より低いため、利点はある。

実施例５：Ｂ型肝炎ワクチンの実験群設定と免疫化プロセス
１．実験動物とモデル確立：
Ｃ５７ＢＬ／６（Ｎ）マウス：雄、４週齢、８１匹、上海霊暢実験動物技術有限公司提供、ｒＡＡＶ８－ＨＢＶアデノウイルス：北京五加和分子医学研究所有限公司より購入。Ｃ５７ＢＬ／６（Ｎ）マウスにｒＡＡＶ８－ＨＢＶアデノウイルスを尾静脈注射して、ｒＡＡＶ８－ＨＢＶがＣ５７ＢＬ／６（Ｎ）を持続的に感染させるマウスモデルを確立した。

２．試薬材料：
１）ＨＢｓＡｇタンパク質：実施例１より調製した。

２）ＨＢｃＡｇタンパク質：実施例１より調製した。

３）次のステップへの使用に備えるために、ＰＢＳ溶液（Ｈｙｃｌｏｎｅ社より購入）を使用してＨＢｓＡｇストック溶液、ＨＢｃＡｇストック溶液、ＱＳ－２１をそれぞれ２００μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌに希釈し、ＰＢＳ溶液を使用してＣｐＧを溶解し１００μｇ／ｍｌに希釈した。

３．実験群設定：表５を参照し、各マウスへの１回の注射量は１００μＬ／匹であり、Ａ群は陰性コントロールで、ＰＢＳ溶液を１００μＬ／匹注射した。

４．動物の免疫化：全ての群は２週間ごとに１回筋肉内注射を行い、接種部位は右後腿で、合計６回の投与とし、それぞれｒＡＡＶ８－ＨＢＶウイルスの尾静脈注射後４週目、６週目、８週目、１０週目、１２週目、１４週目に投与した。投与開始後に２週間ごとに１回採血し、採血時間はそれぞれ４週目、６週目、８週目、１０週目、１２週目、１４週目、１６週目、１８週目、２０週目、２２週目であった。２２週目に全てのマウスを殺した。

実施例６：Ｂ型肝炎ワクチンの血清中のＨＢｓＡｇレベルに対する影響
１．血清ＨＢｓＡｇの検出ステップ：検出の実施は南京鼓楼病院であった。

２段階イムノアッセイを用い、最初に検出サンプルがＢ型肝炎表面抗体によってコーティングされた常磁性微粒子と結合し、洗浄して、アクリジニウムエステル標識Ｂ型肝炎表面抗体コンジュゲートを加え、また洗浄して、予備励起溶液と励起溶液を反応混合物に加え、検出サンプルの相対発光量（ＲＬＵ）を測定し、サンプルにおけるＨＢｓＡｇ含有量がＲＬＵと正の相関関係であり、生成されるＡＲＣＨＴＩＴＥＣＴＨＢｓＡｇ標準曲線によりマウス血清サンプル中のＨＢｓＡｇ濃度を測定し、最終にマウス血清サンプル中のＨＢｓＡｇ濃度は測定値の５０～２００倍であった。

２．結果分析（図７）：本発明に係る免疫刺激剤を含むＨ群ワクチンは、対応するＨＢｓＡｇレベルが明らかに低下する傾向であり、免疫化プロセス終了後（１４週目より）は、安定した長期な免疫効果が保たれ、単独のＣｐＧ群（Ｆ群）とＱＳ－２１群（Ｇ群）と比べて、明らかな利点があった。Ｈ群はＨＢｓＡｇレベルが最初に６３５０ＩＵ／ｍｌを超えていて約５０ＩＵ／ｍｌに低下し、当該群は２回目の免疫後（６週目）にＨＢｓＡｇレベルが３０％以上低下し、３回目の免疫後（８週目）にＨＢｓＡｇレベルが７０％以上低下し、しかも１４週目の免疫終了後に平均低下率は約９２％と維持されていた。優れた免疫効果がある。二重アジュバントコントロール（Ｉ群）と比べ、Ｈ群は１４週目の免疫終了後に依然として安定的免疫効果が維持され、免疫レベルが明らかにＩ群より優れている。

実施例７：Ｂ型肝炎ワクチンの体液性免疫効果評価
１．血清ＨＢｓＡｂの検出ステップ：検出の実施は南京鼓楼病院であった。

２段階イムノアッセイを用い、最初に検出サンプルが組換えＨＢｓＡｇ（ｒＨＢｓＡｇ）によってコーティングされた常磁性微粒子と混合し、洗浄して、アクリジニウムエステル標識ｒＨＢｓＡｇコンジュゲートを加え、また洗浄して、予備励起溶液と励起溶液を反応混合物に加え、検出サンプルの相対発光量（ＲＬＵ）を測定し、サンプルにおけるＨＢｓＡｂ含有量がＲＬＵと正の相関関係であり、生成されるＡＲＣＨＴＩＴＥＣＴＨＢｓＡｂ標準曲線によりマウス血清サンプル中のＨＢｓＡｂ濃度を測定し、最終にマウス血清サンプル中のＨＢｓＡｂ濃度は測定値の５０～２００倍であった。

２．結果分析（図８）：前記免疫刺激剤を含むＨ群ワクチンは２回目の免疫後（６週目）にＨＢｓＡｂ（１０ｍＩＵ／ｍｌを超えている）を産生し始め、しかも免疫回数の増加につれて、ＨＢｓＡｂレベルは増加し続ける傾向であり、増加傾向が明らかに単独のＣｐＧ群（Ｆ群）とＱＳ－２１群（Ｇ群）より優れている。免疫終了２週後（１６週目）にＨＢｓＡｂレベルがほぼ飽和となり、４．０の対数値、即ち約１００００ｍＩＵ／ｍｌのＨＢｓＡｂレベルに達し、二重アジュバントコントロール（Ｉ群）と比べ、抗体産生レベルも明らかな優位性があった。

実施例８：Ｂ型肝炎ワクチンの細胞性免疫効果評価
１．検出ステップ：実施例２と同じであった。実験群設定は表６を参照する。

２．評価指標：コントロールウェルのスポット数が５ＳＦＣ以下で、サンプルウェルのスポット数が１０ＳＦＣ以上である場合に、陽性とする。コントロールウェルのスポット数が５ＳＦＣを超えていて１０ＳＦＣ以下であり、サンプルウェルのスポット数／コントロールウェルのスポット数が２以上である場合に、陽性とする。コントロールウェルのスポット数が１０ＳＦＣを超えており、サンプルウェルのスポット数／コントロールウェルのスポット数が３以上である場合に、陽性とする。

３．実験結果：
細胞性免疫レベル検出結果：ＥＬＩＳＰＯＴスポット結果は図９、１０を参照し、分析結果に示すように、Ｆ群～Ｉ群においてＨＢｓＡｇ特異的ＩＦＮ－γ陽転率はいずれも１００％であり、ＨＢｃＡｇ特異的ＩＦＮ－γ陽転率はいずれも１００％であった。前記免疫刺激剤を含むＨ群ワクチンは比較的高いＨＢｓＡｇとＨＢｃＡｇ特異的ＩＦＮ－γレベルを誘導産生させることができ、それぞれが２３５０ＳＦＣ／１０^６脾細胞より大きく１２５０ＳＦＣ／１０^６脾細胞より大きく、単独のＣｐＧ群（Ｆ群）とＱＳ－２１群（Ｇ群）と比べて、明らかな差があった。Ｈ群と二重アジュバントコントロール（Ｉ群）を比べ、後者が誘導産生させるＨＢｓＡｇとＨＢｃＡｇ特異的ＩＦＮ－γレベルは約１６３０ＳＦＣ／１０^６脾細胞、約７５０ＳＦＣ／１０^６脾細胞で、明らかにＨ群より低かった。

実施例９：医薬組成物による血清中のＨＢｓＡｇとＨＢｃＡｇ特異的抗体の検出
１．検出ステップ：精製したＨＢｓＡｇとＨＢｃＡｇで９６ウェルマイクロプレートをコーティングして、固相抗原を形成し、ブロッキング処理をした後、被験血清を一定の開始希釈度から倍数希釈し、複数の希釈度を設定し、９６ウェルマイクロプレートに倍数希釈後の血清サンプルを加え、次にＨＲＰ標識抗ＩｇＧ／ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ抗体と結合して、抗原－抗体（血清）－酵素標識抗体複合体を形成し、最後に基質ＴＭＢを加えて発色させ、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍの波長における吸光度（ＯＤ値）を測定し、発色の濃淡は検出サンプルにおけるＨＢｓＡｇとＨＢｃＡｇ特異的抗体ＩｇＧ／ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａレベルと正の相関であり、「吸光度ＯＤ値－血清サンプル希釈倍数（Ｌｏｇ）」の関係曲線を当てはめして、抗体価を判定した。

２．結果分析：
１）血清中のＨＢｓＡｂＩｇＧ抗体とサブタイプの検出結果：
各群における異なる時間のＥＬＩＳＡ方法でのマウス血清中のＨＢｓＡｂＩｇＧ抗体とサブタイプレベルの検出は図１１に示すとおりである。前記免疫刺激剤を含むＨ群ワクチンは力価の比較的高い抗ＨＢｓＡｇ特異的ＩｇＧ／ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ抗体を産生させ、しかも免疫回数の増加につれて、抗体レベルが増加し続け、６回目の免疫（１４週目）に抗体レベルがほぼ飽和となり、特異的抗体価が５．４の対数値以上に達している。Ａ群～Ｄ群では特異的抗体が検出されず、Ｅ群～Ｇ群ではＨＢｓＡｇ特異的ＩｇＧ／ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ抗体レベルは産生されるが、抗体レベルは明らかにＨ群より低く、二重アジュバントコントロール（Ｉ群）が産生する抗ＨＢｓＡｇ特異的ＩｇＧ抗体とＩｇＧ２ａ抗体レベルは明らかにＨ群より低かった。

２）血清中のＨＢｃＡｂＩｇＧ抗体とサブタイプの検出結果：
各群における異なる時間のＥＬＩＳＡ方法でのマウス血清中のＨＢｃＡｂＩｇＧ抗体とサブタイプレベルの検出は図１２に示すとおりである。前記免疫刺激剤を含むＨ群ワクチンは力価の比較的高い抗ＨＢｃＡｇ特異的ＩｇＧ／ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ抗体を産生させ、しかも免疫回数の増加につれて、抗体レベルが増加し続け、６回目の免疫（１４週目）に抗体レベルがほぼ飽和となり、特異的抗体価が４．８の対数値以上に達している。Ａ群～Ｄ群では特異的抗体が検出されず、Ｅ群～Ｇ群ではＨＢｃＡｇ特異的ＩｇＧ／ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ抗体レベルは産生されるが、抗体レベルは明らかにＨ群より低かった。しかもＨ群はＴｈ１経路となる傾向が高く、パネルＤには特異的抗体ＩｇＧ２ａが明らかに上昇する傾向が見られることから分かるように、Ｈ群ワクチンは抗ＨＢｃＡｇ抗体のサブタイプ変換を促進でき、しかも変換効率が明らかに二重アジュバントコントロール（Ｉ群）より高い。

実施例１０：異なるサポニンの医薬組成物の免疫効果に対する影響
１．実験動物：Ｃ５７ＢＬ／６（Ｎ）マウス、雄、４週齢、４０匹、上海霊暢実験動物技術有限公司提供。

２．試薬材料：
１）ＨＢｓＡｇタンパク質、ＨＢｃＡｇタンパク質、ＣｐＧＴ１はいずれも実施例１より調製した。
２）ＱＳ－２１（ＣＡＳ番号Ａ０１０－０２３、ＢＲＥＮＮＴＡＧ社より購入）、ギンセノシドＲｇ１（ＣＡＳ：２２４２７－３９－０、南京春秋生物工程有限公司より購入）、アストラガロシドＡ（ＣＡＳ：８４６８７－４３－４、南京春秋生物工程有限公司より購入）、プラチコジンＤ（ＣＡＳ：５８４７９－６８－８、湖北雲▲ビ▼科技有限公司より購入）、Ｉｓｃｏｍアジュバント（上海熹垣生物科技有限公司より購入）。

３）次のステップへの使用に備えるために、ＰＢＳ溶液（Ｈｙｃｌｏｎｅ社より購入）を使用してＨＢｓＡｇストック溶液、ＨＢｃＡｇストック溶液をそれぞれ２００μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌに希釈し、各サポニンをそれぞれ５０μｇ／ｍｌに希釈し、ＰＢＳ溶液を使用してＣｐＧＴ１を溶解し１００μｇ／ｍｌに希釈した。

３．実験群設定：表７を参照し、１回の注射量は１００μＬ／匹であった。Ａ群は陰性コントロールであり、ＰＢＳ溶液１００μＬ／匹であった。

４．実験ステップ：実施例２と同じであった。

５．実験結果：ＥＬＩＳＰＯＴスポット結果は図１３、図１４を参照し、結果に示すように、ＣｐＧＴ１は各サポニンと併用するといずれも効率的な相乗効果が得られ、誘導産生されたＨＢｓＡｇとＨＢｃＡｇ特異的ＩＦＮ－γレベルは明らかに他のＣｐＧとサポニンの組成物より高く、そのなか、ＱＳ２１の効果が最も優れている。

以上から分かるように、本発明に係る医薬組成物は２つのアジュバントの組み合わせを使用しており、単一のアジュバント、他のＣＰＧアジュバントとＱＳ２１の組み合わせと比べ、本発明のＣｐＧＴ１～Ｔ３は様々なアジュバント、特にＱＳ－２１と効率的な相乗効果を表しており、より強い免疫応答を媒介することができる。当該免疫刺激性組成物を含む医薬組成物は明らかな優位性を有し、効率的な免疫治療効果を表しており、臨床上の使用価値が高く幅広い市場が見込まれる。

上記で本発明を詳細に説明しているが、当業者は、本発明の趣旨と範囲から逸脱しない限り本発明に様々な修正と変更を行うことが可能であると理解するべきである。本発明の保護範囲は上記の詳細な説明に限定されず、前記修正と変更も特許請求の範囲に属する。上記では例示的に本発明の特定の実施形態を説明しているが、これらは例を挙げて説明するものであり、本発明の保護範囲は特許請求の範囲により限定されることは当業者にとって明らかである。当業者は本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、これらの実施形態に様々な変更と修正を行うことができ、このような変更と修正はいずれも本発明の保護範囲に入る。

Claims

ｉ）Ｂ型肝炎表面抗原、前記抗原の活性フラグメント、前記抗原の変異体、又はそれらの少なくとも２つの混合物と、
ｉｉ）Ｂ型肝炎コア抗原、前記抗原の活性フラグメント、前記抗原の変異体、又はそれらの少なくとも２つの混合物と、
ｉｉｉ）サポニンとＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドとを含み、又はサポニンを含むアジュバントとＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドとからなり、前記ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド配列は２つ又は２つ以上のコピーの５’－ＴＴＣＧＴＴ－３’モチーフ又は５’－ＴＣＧＴＣＧＴＣＧ－３’モチーフを有する免疫刺激性組成物とを含む、医薬組成物。
前記ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの配列は、
ＣｐＧＴ１：ＴＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＴＴ（配列番号６）、ＣｐＧＴ２：ＴＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＴＴ（配列番号７）、ＣｐＧＴ３：ＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧ（配列番号８）から選ばれるいずれか１つであり、
好ましくは、前記ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの配列はＣｐＧＴ１：ＴＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＴＴ（配列番号６）である、請求項１に記載の医薬組成物。
前記サポニンはキラヤサポニン、ギンセノシド、プラチコジン、アストラガロシド、ノトギンセノシド、グリチルリチン、ジュリブロシド、オフィオポゴニン、サイコシド又はチクセツサポニンから選ばれる１つ又は複数である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
前記キラヤサポニンはＱＳ－７、ＱＳ－１７、ＱＳ－１８又はＱＳ－２１であり、好ましくは、前記キラヤサポニンはＱＳ－２１であり、前記ギンセノシドはギンセノシドＲｇ１、ギンセノシドＲｇ３、ギンセノシドＲｂ１又はギンセノシドＲｅであり、前記プラチコジンはプラチコジンＤ、プラチコジンＤ２又はその両方の混合物であり、前記アストラガロシドはアストラガロシドＡ、アストラガロシドＩ、アストラガロシドＩＩ又はそれらの２つ若しくは２つ以上のサポニンモノマーの混合物であり、前記ノトギンセノシドはノトギンセノシドＲ１であり、前記オフィオポゴニンはオフィオポゴニンＤであり、前記サイコシドはサイコシドａ、サイコシドｄ又はその両方の混合物であり、前記ジュリブロシドはゴウカンヒの総サポニンであり、前記グリチルリチンはカンゾウの総サポニンであり、前記チクセツサポニンはチクセツニンジンの総サポニンである、請求項３に記載の医薬組成物。
サポニンを含む前記アジュバントはＩｓｃｏｍアジュバントである、請求項１～４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
前記ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドはホスホロチオエート結合を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
前記ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドはチオオリゴデオキシヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
前記ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドはペルチオオリゴデオキシヌクレオチドである、請求項１～７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
前記ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドとサポニンの重量比は１～４０：０．１～２であり、好ましくは、２～４０：０．１～２である、請求項１～８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
前記ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドとサポニンの重量比は２：１である、請求項１～９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
前記Ｂ型肝炎表面抗原は、配列番号１に示す配列を含み、又はそれからなり、前記Ｂ型肝炎コア抗原は配列番号２に示す配列を含み、又はそれからなる、請求項１～１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
前記Ｂ型肝炎コア抗原の活性フラグメントは配列番号２における１位～Ｘ位の連続のアミノ酸を含み、又はそれからなり、Ｘは１４９～１８３との間の整数である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
前記Ｂ型肝炎コア抗原の活性フラグメントは配列番号２における１位～Ｘ位の連続のアミノ酸を含み、又はそれからなり、Ｘは１５２～１８３との間の整数である、請求項１２に記載の医薬組成物。
前記医薬組成物の成分ｉ）、ｉｉ）とｉｉｉ）の重量比は４：２：１．１～４２であり、好ましくは、４：２：２．１～４２である、請求項１～１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
前記医薬組成物の成分ｉ）、ｉｉ）とｉｉｉ）の重量比は４：２：３である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
前記医薬組成物はｉｖ）薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
請求項１～１６のいずれか１項に記載の医薬組成物を含む、Ｂ型肝炎予防用ワクチン又はＢ型肝炎治療用ワクチン。
Ｂ型肝炎ウイルス感染及び／又はＢ型肝炎ウイルス媒介性疾患を予防及び／又は治療するための薬物の製造における請求項１～１６のいずれか１項に記載の医薬組成物の用途。
前記Ｂ型肝炎ウイルス感染及び／又はＢ型肝炎ウイルス媒介性疾患はＢ型肝炎、肝硬変、肝がんから選ばれる、請求項１８に記載の用途。
対象においてＢ型肝炎ウイルスに対する体液性免疫及び／又は細胞性免疫応答を産生させるための薬物の製造における請求項１～１６のいずれか１項に記載の医薬組成物の用途。
対象におけるＢ型肝炎コア抗体にサブタイプを変換させるための薬物の製造における請求項１～１６のいずれか１項に記載の医薬組成物の用途。
対象においてＢ型肝炎ウイルスの免疫寛容を突破するための薬物の製造における請求項１～１６のいずれか１項に記載の医薬組成物の用途。
それを必要とする被験者に予防及び／又は治療有効量の請求項１～１６のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを含む、Ｂ型肝炎ウイルス感染及び／又はＢ型肝炎ウイルス媒介性疾患を予防及び／又は治療する方法。
前記Ｂ型肝炎ウイルス感染及び／又はＢ型肝炎ウイルス媒介性疾患はＢ型肝炎、肝硬変、肝がんから選ばれる、請求項２３に記載の方法。
それを必要とする被験者に有効量の請求項１～１６のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを含む、対象においてＢ型肝炎ウイルスに対する体液性免疫及び／又は細胞性免疫応答を産生させる方法。
それを必要とする被験者に有効量の請求項１～１６のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを含む、対象におけるＢ型肝炎コア抗体にサブタイプを変換させる方法。
それを必要とする被験者に有効量の請求項１～１６のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを含む、対象においてＢ型肝炎ウイルスの免疫寛容を突破する方法。