CN112972670A - 免疫刺激组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种免疫刺激组合物，其包含皂苷和CpG寡聚脱氧核苷酸或者其由包含皂苷的佐剂和CpG寡聚脱氧核苷酸组成，其中，所述CpG寡聚脱氧核苷酸序列中具有两个或两个以上拷贝的5’‑TTCGTT‑3’基序或5’‑TCGTCGTCG‑3’基序。本发明提供了所述免疫刺激组合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途。

Description

免疫刺激组合物及其用途
技术领域
本发明属于生物制药领域。具体地，本发明涉及一种免疫刺激组合物，所述免疫刺激组合物包含皂苷和CpG寡聚脱氧核苷酸，或者所述免疫刺激组合物由包含皂苷的佐剂和CpG寡聚脱氧核苷酸组成。其中，所述CpG寡聚脱氧核苷酸序列具有两个或两个以上拷贝的5’-TTCGTT-3’基序或5’-TCGTCGTCG-3’基序。本发明还涉及所述免疫刺激组合物的制药用途。
背景技术
CpG寡聚脱氧核苷酸是近年来发现的一类新型免疫刺激剂，其化学本质为含有胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸的脱氧寡核苷酸，具有与天然CpG模式识别受体相似的免疫反应，能与细胞膜上的Toll样受体结合，通过TLR9信号通路有效引发哺乳动物免疫反应。CpG引起的免疫反应以Th1型为主，可诱导Th2型免疫应答向Th1转换，从而激发细胞免疫。通过激活T细胞、B细胞、NK细胞等免疫活性细胞，大量地产生多种细胞因子，从而增强机体的特异性和非特异性免疫效应，是连接天然免疫和获得性免疫的重要纽带。
皂苷是苷元为三萜或螺旋甾烷类化合物的一类糖苷，属植物来源佐剂。其中，皂树皂苷(QS)是从皂树中提取得到的皂苷，在QS系列中QS-21是目前报道最广泛的一类佐剂，但QS-21可诱导细胞溶血，有一定系统毒副作用和局部的毒副作用。Alving等(ALVING CR,MATYAS G,BECK Z,et al.Revue Roumaine de Chimie,2016,61(8):631-635.)研究发现，以ALF脂质体结合MPLA和QS-21作为佐剂对抗HIVgp140蛋白可有效增加血清中抗体滴度。Ng等(NG H,FERNANDO G J P,DEPELSENAIRE A C I,et al.Scientific Reports,2016,6(1):228-230.)使用一种皮下传递技术-纳米贴片，与QS-21构成佐剂复合物。结果表明，纳米贴片与传统肌内注射相比，可显著减少抗原和QS-21的使用剂量以及诱导更高的IgG滴度(韩子怡，曾忠良，现代农业科技，2019(14):220-221.)。
现有技术(WO2001051083A3)曾报道关于包含皂苷与CpG寡聚脱氧核苷酸的免疫刺激组合物，其中CpG寡聚脱氧核苷酸涉及CpG1826和CpG7909。然而，由于CpG寡聚脱氧核苷酸具备结构多样性，不同序列的CpG佐剂间的效果差异巨大。
因此，当前对免疫效果更强的佐剂以及药物存在需求。
发明内容
针对现有技术的不足，发明人在进行了大量研究之后，出乎意料的发现了免疫效果更强的免疫刺激组合物，在所述组合物中，皂苷和CpG寡聚脱氧核苷酸之间表现出高效的协同作用，可以介导更强烈的免疫应答。将所述免疫刺激组合物应用于不同的抗原或抗原组合物中，均具有显著性优势。
因此，本发明的一个目的是提供一种免疫刺激组合物，所述组合物可用于制备多种药物，以获得高效的免疫刺激原性。
本发明的另一个目的是提供一种疫苗佐剂，所述疫苗佐剂能强烈地引发哺乳动物的免疫反应。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一方面，本发明提供了一种免疫刺激组合物，所述免疫刺激组合物包含皂苷和CpG寡聚脱氧核苷酸，或者由包含皂苷的佐剂和CpG寡聚脱氧核苷酸组成，其中所述CpG寡聚脱氧核苷酸序列具有两个或两个以上拷贝的5’-TTCGTT-3’基序或5’-TCGTCGTCG-3’基序。
根据本发明所述的免疫刺激组合物，其中，所述CpG寡聚脱氧核苷酸的序列选自以下中的任一种：CpG T1：TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT(SEQ ID NO:6)、CpG T2：TCG TTCGTT CGT TCG TTC GTT CGT T(SEQ ID NO:7)和CpG T3：TCG TCG TCG TCG TCG TCG TCG(SEQ ID NO:8)。
优选地，所述CpG寡聚脱氧核苷酸的序列为CpG T1：TCG TTC GTT CGT TCG TTCGTT(SEQ ID NO:6)。
根据本发明所述的免疫刺激组合物，其中，所述皂苷选自皂树皂苷、人参皂苷、桔梗皂苷、黄芪皂苷、三七皂苷、甘草皂苷、合欢皮皂苷、麦冬皂苷、柴胡皂苷或竹节参皂苷的一种或多种；优选地，所述皂苷为皂树皂苷、人参皂苷、桔梗皂苷或黄芪甲苷；更优选地，所述皂树皂苷为QS-7、QS-17、QS-18或QS-21；更优选地，所述皂树皂苷为QS-21；所述人参皂苷可以为人参皂苷Rg1、人参皂苷Rg3、人参皂苷Rb1或人参皂苷Re；所述桔梗皂苷为桔梗皂苷D、桔梗皂苷D2或其两者的混合物；所述黄芪皂苷可以为黄芪甲苷(黄芪皂苷IV)、黄芪皂苷I、黄芪皂苷II或其中两种或两种以上皂苷单体的混合物；所述三七皂苷可以为三七皂苷R1；所述麦冬皂苷可以为麦冬皂苷D；所述柴胡皂苷可以为柴胡皂苷a、柴胡皂苷d或其两者的混合物；所述合欢皮皂苷可以为合欢皮总皂苷；所述甘草皂苷可以为甘草总皂苷；所述竹节参皂苷可以为竹节参总皂苷。
根据本发明所述的免疫刺激组合物，其中，所述包含皂苷的佐剂为免疫刺激复合物佐剂(Iscom佐剂)。
根据本发明所述的免疫刺激组合物，其中，所述CpG寡聚脱氧核苷酸包含硫代磷酸酯连接。特别地，所述CpG寡聚脱氧核苷酸为硫代寡聚脱氧核苷酸，优选为全硫代寡聚脱氧核苷酸。
根据本发明所述的免疫刺激组合物，其中，所述CpG寡聚脱氧核苷酸与所述皂苷的重量比为1～40∶0.1～2，优选为2～40∶0.1～2，进一步优选为2∶1。
另一方面，本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含所述免疫刺激组合物，以及抗原或抗原组合物。
根据本发明所述的药物组合物，其中，所述抗原或抗原组合物选择下述中任一种：人体免疫缺陷病毒，人疱疹病毒，水痘-带状疱疹病毒，人体细胞肥大病毒，甲、乙、丙或戊型肝炎病毒，呼吸合胞体病毒，人体乳头状瘤病毒，流感病毒，结核分枝杆菌，沙门氏菌，奈瑟菌如脑膜炎奈瑟菌或淋病奈瑟菌，疏螺旋体属如回归热螺旋体或杜通氏螺旋体，衣原体属如沙眼衣原体，博德特氏杆菌属如百日咳博德特氏菌，疟原虫属如恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)、卵形疟原虫(Plasmodium ovale)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)或诺氏疟原虫(Plasmodium knowlesi)或弓形虫属如弓形虫。
根据本发明所述的药物组合物，其中，所述人疱疹病毒是HSV1或HSV2。
根据本发明所述的药物组合物，其中，所述抗原为肿瘤抗原。
再一方面，本发明提供了一种疫苗，所述疫苗包含所述免疫刺激组合物。
根据本发明所述的疫苗，其中所述疫苗为用于预防病毒、细菌和/或寄生虫感染的疫苗，或所述疫苗为以免疫疗法治疗病毒、细菌和/或寄生虫感染的疫苗。
再一方面，本发明提供了所述免疫刺激组合物在制备用于引起细胞溶解的T细胞应答的药物中的用途。
在一些具体实施方案中，本发明提供了所述免疫刺激组合物在制备用于在哺乳动物中诱发干扰素γ应答的药物中的用途。
在一些具体实施方案中，本发明提供了所述免疫刺激组合物在制备用于预防病毒、细菌和/或寄生虫感染的疫苗中的用途。
在一些具体实施方案中，本发明提供了所述免疫刺激组合物在制备用于以免疫疗法治疗病毒、细菌和/或寄生虫感染的疫苗中的用途。
在一些具体实施方案中，本发明提供了所述免疫刺激组合物在制备用于以免疫疗法治疗肿瘤的疫苗中的用途。
本发明还提供了一种引起细胞溶解的T细胞应答的方法，所述方法包括给予有需要的受试者有效量的包含本发明所述的免疫刺激组合物的药物组合物。
本发明还提供了一种在哺乳动物中诱发干扰素γ应答的方法，所述方法包括给予有需要的受试者有效量的包含本发明所述的免疫刺激组合物的药物组合物。
本发明还提供了一种预防病毒、细菌和/或寄生虫感染的方法，所述方法包括给予有需要的受试者预防有效量的包含本发明所述的免疫刺激组合物的疫苗。
本发明还提供了一种以免疫疗法治疗病毒、细菌和/或寄生虫感染的方法，所述方法包括给予有需要的受试者有效量的包含本发明所述的免疫刺激组合物的疫苗。
本发明还提供了一种治疗肿瘤的方法，所述方法包括给予有需要的受试者治疗有效量的包含本发明所述的免疫刺激组合物的药物组合物。
本发明提供的免疫刺激组合物达到了出乎意料的技术效果，可介导更强的免疫应答。单独使用CpG T1～T3的免疫刺激作用弱于CpG1018、CpG7909和CpG1826等，但与QS-21联合应用后，所述免疫刺激组合物表现出出人意料的协同作用，免疫效果显著增强。
本发明研究发现，含有所述免疫刺激组合物的乙肝治疗性疫苗可以突破转基因小鼠的免疫耐受，产生高滴度的抗HBsAg抗体、抗HBcAg抗体、中和抗体。各项检测结果均显示，该疫苗通过多次免疫可以显著清除转基因小鼠体内的乙肝病毒，在免疫过程结束后，HBsAb水平接近饱和，可以保持稳定长效的免疫效果，HBsAg平均下降率维持在92％左右。同时含有所述免疫刺激组合物的乙肝疫苗可诱导产生较强的HBsAg和HBcAg特异性IFN-γ水平，免疫效果显著优于单独佐剂，也显著优于现有的CPG佐剂和QS-21的组合。
含有该免疫刺激组合物的带状疱疹疫苗也证明该免疫刺激组合物具有优越的免疫刺激作用。细胞免疫实验证明该疫苗可诱导产生较强的疱疹gE蛋白特异性IFN-γ水平，蛋白免疫效果显著优于单一佐剂。体液免疫实验也证明该疫苗可产生较高的疱疹gE蛋白特异性IgG/IgG1/IgG2a抗体水平，且效果优于单一佐剂，也显著优于现有的CPG佐剂和QS-21的组合。
综上，本发明提供的免疫刺激组合物具有优越的免疫刺激作用，相比单一佐剂、现有的CPG佐剂和QS21的组合，本发明的免疫刺激组合物中CpG T1～T3与QS-21表现出高效的协同作用，可以介导更强烈的免疫应答。应用于不同的抗原或抗原组合物，均有显著性优势。因此，本发明的免疫刺激组合物作为一种新型佐剂，具有很高的临床应用价值和广阔的市场前景。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1显示了不同的CPG寡聚脱氧核苷酸对HBsAg抗原特异性IFN-γ分泌水平的影响；
图2显示了不同的CPG寡聚脱氧核苷酸对HBcAg抗原特异性IFN-γ分泌水平的影响；
图3显示了根据本发明的不同的免疫刺激组合物对HBsAg抗原特异性IFN-γ分泌水平的影响；
图4显示了根据本发明的不同的免疫刺激组合物对HBcAg抗原特异性IFN-γ分泌水平的影响；
图5显示了根据本发明的不同剂量的免疫刺激组合物对HBsAg抗原特异性IFN-γ分泌水平的影响；
图6显示了根据本发明的不同剂量的免疫刺激组合物对HBcAg抗原特异性IFN-γ分泌水平的影响；
图7显示了含有本发明所述的免疫刺激组合物的乙肝疫苗对血清中HBsAg水平的影响；
图8显示了含有本发明所述的免疫刺激组合物的乙肝疫苗对血清中HBsAb水平的影响；
图9显示了含有本发明所述的免疫刺激组合物的乙肝疫苗对HBsAg抗原特异性IFN-γ分泌水平的影响；
图10显示了含有本发明所述的免疫刺激组合物的乙肝疫苗对HBcAg抗原特异性IFN-γ分泌水平的影响；
图11显示了含有本发明所述的免疫刺激组合物的乙肝疫苗对小鼠血清中HBsAg抗原特异性IgG抗体及其亚型水平的影响；
其中，A图：各组小鼠血清的HBsAb IgG水平；B图：各组小鼠血清的HBsAb IgG1水平；C图：各组小鼠血清的HBsAb IgG2a水平；D图：各组小鼠血清的HBsAb IgG2a与IgG1的比值；
图12显示了含有本发明所述的免疫刺激组合物的乙肝疫苗对小鼠血清中HBcAg抗原特异性IgG抗体及其亚型水平的影响；
其中，A图：各组小鼠血清的HBcAb IgG水平；B图：各组小鼠血清的HBcAb IgG1水平；C图：各组小鼠血清的HBcAb IgG2a水平；D图：各组小鼠血清的HBcAb IgG2a与IgG1的比值；
图13显示了含有本发明所述的免疫刺激组合物的带状疱疹疫苗对疱疹gE抗原特异性IFN-γ分泌水平的影响；
图14显示了含有本发明所述的免疫刺激组合物的带状疱疹疫苗对小鼠血清中抗原特异性IgG抗体及其亚型水平的影响
其中，A图：各组小鼠血清的IgG水平；B图：各组小鼠血清的IgG1水平；C图：各组小鼠血清的IgG2a水平；D图：各组小鼠血清的IgG2a与IgG1的比值。
图15显示了根据本发明的包含不同皂苷的免疫刺激组合物对疱疹gE抗原特异性IFN-γ分泌水平的影响。
定义
除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考Current Protocols in MolecularBiology(Ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。
尽管本发明以广义范围显示数字范围和参数近似值，但是具体实施例中所示的数值尽可能准确的进行记载。然而，任何数值本来就必然含有一定的误差，其是由它们各自的测量中存在的标准偏差所致。另外，本文公开的所有范围应理解为涵盖其中包含的任何和所有子范围，例如记载的“2至40”的范围应认为包含最小值2和最大值40之间(包含端点)的任何和所有子范围，也就是说，所有以最小值2或更大起始的子范围，例如2至6.1，以及以最大值40或更小终止的子范围，例如5.5至40。另外，任何称为“并入本文”的参考文献应理解为以其整体并入。
另外应注意，如本说明书中所使用的，单数形式包括其所指对象的复数形式，除非清楚且明确的限于一个所指对象。术语“或”可与术语“和/或”互换使用，除非上下文另有清楚指明。
本文使用的术语“药物组合物”、“组合药物”和“药物组合”可互换地使用，其表示组合在一起以实现某种特定目的的至少一种药物以及任选的可药用赋形剂或辅料的组合。在某些实施方案中，所述药物组合物包括在时间和/或空间上分开的组合，只要其能够共同作用以实现本发明的目的。例如，所述药物组合物中所含的成分(例如gE蛋白、QS-21、CpG寡聚脱氧核苷酸)可以以整体施用于对象，或者分开施用于对象。当所述药物组合物中所含的成分分开地施用于对象时，所述成分可以同时或依次施用于对象。
本文使用的术语“CpG寡聚脱氧核苷酸”或“CpG-ODN”是指短的单链合成DNA分子，其含有一个或更多个“CpG”单元，其中C表示胞嘧啶，G表示鸟嘌呤，p表示磷酸二酯键。特别地，所述CpG寡聚脱氧核苷酸是非甲基化的。在一些实施方案中，所述CpG-ODN包含硫代磷酸酯连接或硫代磷酸酯骨架。也就是说，在一些实施方案中，所述CpG-ODN为硫代磷酸酯寡聚脱氧核苷酸(即硫代寡聚脱氧核苷酸)。优选地，所述CpG-ODN中所有核苷酸间连接均为硫代磷酸酯连接，即所述CpG-ODN为全硫代寡聚脱氧核苷酸。在另一些实施方案中，所述CpG-ODN包含两个或两个以上拷贝的5’-TTCGTT-3’基序或5’-TCGTCGTCG-3’基序。特别地，所述CpG-ODN具有选自下列的序列：TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT(SEQ ID NO:6)、TCG TTC GTTCGT TCG TTC GTT CGT T(SEQ ID NO:7)或TCG TCG TCG TCG TCG TCG TCG(SEQ ID NO:8)，优选地为TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT(SEQ ID NO:6)。
本文使用的“人参皂苷、桔梗皂苷、黄芪皂苷、三七皂苷、甘草皂苷、合欢皮皂苷、麦冬皂苷、柴胡皂苷或竹节参皂苷”是指是存在于对应植物中的活性成分，例如人参皂苷是一种固醇类化合物，主要存在于人参属药材中，是人参中的活性成分。在一些实施方案中，所述人参皂苷优选为人参皂苷Rg1、人参皂苷Rg3、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re等单体或其中两个或两个以上皂苷单体的混合物；桔梗皂苷优选为桔梗皂苷D、桔梗皂苷D2或其两者的混合物；黄芪皂苷优选为黄芪甲苷(黄芪皂苷IV)、黄芪皂苷I、黄芪皂苷II等单体或其中两个或两个以上皂苷单体的混合物；三七皂苷优选为三七皂苷R1等；麦冬皂苷优选为麦冬皂苷D等；柴胡皂苷优选为柴胡皂苷a、柴胡皂苷d或其两者的混合物；合欢皮皂苷优选为合欢皮总皂苷等；甘草皂苷优选为甘草总皂苷等；竹节参皂苷优选为竹节参总皂苷等。
本文使用的“Iscom佐剂”为免疫刺激复合物佐剂，具体地为不包含抗原的Iscom基质(ISCOM MATRIX)，是由磷脂、皂苷、胆固醇组成的笼状结构的佐剂。
本文使用的“治疗和/或预防有效量”或“有效量”是指足以显示其对于所施用对象益处的剂量。施用的实际量，以及施用的速率和时间过程会取决于所治疗者的自身情况和严重程度。治疗的处方(例如对剂量的决定等)最终是全科医生及其它医生的责任并依赖其做决定，通常考虑所治疗的疾病、患者个体的情况、递送部位、施用方法以及对于医生来说已知的其它因素。
本文所使用的术语“哺乳动物”是指人类，也可以是其它动物，如野生动物(如苍鹭、鹳、鹤等)，家畜(如鸭、鹅等)或实验动物(如猩猩、猴子、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠、土拨鼠、地松鼠等)。
在另一些实施方案中，本发明组合物还可包含另外的添加剂，如可药用载体或添加剂，尤其是当它以药物制剂形式存在时。
优选的药物载体尤其是水，缓冲水溶液，优选等渗盐溶液如PBS(磷酸盐缓冲液)、葡萄糖、甘露醇、右旋葡萄糖、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维素、碳酸镁、0.3％甘油、透明质酸、乙醇或聚亚烷基二醇如聚丙二醇、甘油三酯等。所用药物载体的类型尤其依赖于根据本发明的组合物是否配制为用于口服、鼻、皮内、皮下、肌内或静脉施用。根据本发明的组合物可包含润湿剂、乳化剂或缓冲液物质作为添加剂。
根据本发明的药物组合物、疫苗或者药物制剂可通过任何适宜的途径施用，例如可口服、鼻、皮内、皮下、肌内或静脉内施用。
以下结合附图通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以作出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例1制备本发明的免疫刺激组合物和乙肝疫苗
1、HBsAg原液：HBsAg蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
HBsAg蛋白由HBsAg基因重组酵母细胞制备，酵母细胞种类包括汉逊酵母、酿酒酵母和毕赤酵母，优选为汉逊酵母。具体制备步骤参考中国专利申请CN108330145A，HBsAg基因重组汉逊酵母细胞经发酵培养，收获菌体。经破菌处理和硅胶吸附、柱层析和TFF等步骤纯化。
2、HBcAg原液：HBcAg蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
HBcAg蛋白由HBcAg基因重组酵母细胞制备，酵母细胞种类包括汉逊酵母、酿酒酵母和毕赤酵母，优选汉逊酵母。具体制备步骤参考中国专利申请CN108047316A，HBcAg基因重组汉逊酵母细胞经发酵培养，收获菌体。经破菌处理和硫酸铵、柱层析和TFF等步骤纯化，制备HBcAg原液。
3、QS-21：购自BRENNTAG公司，CAS.NO.A010-023。
4、CPG寡聚脱氧核苷酸原料的制备方法：
寡聚脱氧核苷酸是合成制备的寡聚脱氧核苷酸序列片段，其含有一个或多个CpG基序，本实施例使用寡聚脱氧核苷酸序列见表1：
表1 CPG寡聚脱氧核苷酸的具体序列
Figure BDA0002829397650000091
具体制备方法：使用常规固相亚磷酰胺三酯法化学合成方法制备，由3’端开始，1)脱保护基：先用三氯乙酸脱去连接在CpG上的核苷酸的保护基团DMT(二甲氧基三苯甲基)，获得游离的5’羟基，以供下一步缩合反应使用；2)活化：将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体，此中间体与CpG上已脱保护基的核苷酸发生缩合反应；3)连接：亚磷酰胺四唑活性中间体遇到CpG上已脱保护基的核苷酸时，将与其5’羟基发生亲和反应，缩合并脱去四唑，此时寡核苷酸链向前延长一个碱基；4)氧化：缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在CpG上的寡核苷酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸或碱水解，此时使用硫代试剂将亚磷酰胺氧化为硫磷双键的磷酸三酯，从而得到稳定的寡核苷酸；5)封闭：缩合反应后为了防止连在CpG上的未参与反应的5’羟基在随后的循环反应中被延伸，常通过乙酰化来封闭此端羟基；经过以上五个步骤后，一个脱氧核苷酸就连到CpG的核苷酸上；重复以上的脱保护基、活化、连接、氧化、封闭过程即可得到一个DNA片段粗品；最后对其进行切割、脱保护基、纯化、定量等合成后处理即可。
5、使用PBS溶液(购自Hyclone公司)将HBsAg原液和HBcAg原液分别稀释至200μg/ml和100μg/ml；使用PBS溶液将各CPG原料分别溶解并稀释至100μg/ml，供下一步使用。
实施例2 CPG寡聚脱氧核苷酸的筛选实验
1、实验动物：C57BL/6(N)小鼠，雄性，4周龄，135只，上海灵畅实验动物技术有限公司。
2、实验分组：见表2，每次注射量为100μL/只。其中A组为阴性对照，PBS溶液100μL/只。
表2实验动物分组
Figure BDA0002829397650000101
3、实验步骤：小鼠免疫后第7天取脾，按常规方法制备脾淋巴细胞，具体如下：无菌操作取脾脏：用无菌镊子及剪刀剪取脾脏，放于70μm细胞滤网中，置于含有2ml预冷处理的2％FBS(购自GIBCO公司)-PBS的平皿中；用研磨棒研磨脾脏，脾脏细胞通过筛目进入平皿中，得到细胞悬液，用巴氏吸管将悬液放入经40μm细胞滤网过滤(购自BD公司)的50ml无菌离心管；500×g，4℃离心5分钟；弃去上清，加入2ml 1×破红剂(购自BD公司)重悬细胞，4℃避光静置5分钟，以破碎红细胞；加入10ml 2％FBS-PBS终止破红反应；500×g，4℃离心5分钟；弃去上清，加入5ml 2％FBS-PBS重悬细胞备用。分别使用刺激物HBsAg特异性肽库PS4和HBcAg特异性肽库PCP刺激脾细胞；按照试剂盒说明书，使用ELISPOT试剂盒(BD公司)检测HBsAg和HBcAg抗原特异性IFN-γ分泌水平；使用ImmunoSPOT Series3酶联斑点分析仪读取ELISPOT试剂盒测出的斑点数(具体操作步骤参考中国专利CN104043120B的实施例7)。
其中，HBsAg特异性肽库序列参考中国专利CN104043120B的实施例7；HBcAg特异性肽库序列见SEQ ID NO：16～30。
4、实验结果：ELISPOT斑点结果见图1和图2，结果显示，不同序列的B型CpG佐剂具有不同的免疫效果，其中，CpG T1～T3、CpG1018、CpG7909、CpG 1826和CpG 684整体优于A型CpG佐剂和C型CpG佐剂，而CpG1618和CPG D2的免疫效果较差，诱导产生HBsAg和HBcAg特异性IFN-γ水平均低于A型CpG佐剂和C型CpG佐剂。
实施例3免疫刺激组合物的筛选实验
1、实验动物：C57BL/6(N)小鼠，雄性，4周龄，81只，上海灵畅实验动物技术有限公司，
2、实验分组：见表3，每次注射量为100μL/只。其中A组为阴性对照，PBS溶液100μL/只。
表3实验动物分组
Figure BDA0002829397650000111
Figure BDA0002829397650000121
3、实验步骤：同实施例2。
4、实验结果：ELISPOT斑点结果见图3和图4，结果显示，CpG T1～T3与QS21联合应用后产生了高效的协同作用，诱导产生HBsAg和HBcAg特异性IFN-γ水平显著高于CpG1018、CpG7909等其他几种CpG佐剂，具有出人意料的免疫效果。
实施例4不同含量佐剂对药物组合物免疫效果的影响
1、实验动物：C57BL/6(N)小鼠，雄性，4周龄，60只，上海灵畅实验动物技术有限公司。
2、试剂材料：
1)HBsAg蛋白、HBcAg蛋白和CpG T1均由实施例1制得；
2)QS-21(CAS.NO.A010-023，购自BRENNTAG公司)
3)使用PBS溶液(购自Hyclone公司)将HBsAg原液、HBcAg原液分别稀释至200μg/ml、100μg/ml，使用PBS溶液将QS21分别稀释至5μg/ml、50μg/ml、100μg/ml，使用PBS溶液将CpG T1溶解并分别稀释至50μg/ml、100μg/ml、2mg/ml，使用PBS溶液将CPG7909溶解并稀释至100μg/ml，供下一步使用。
3、实验分组：见表4，每次注射量为100μL/只。其中A组为阴性对照，PBS溶液100μL/只。
4、实验步骤：同实施例2。
5、实验结果：ELISPOT斑点结果见图5和图6，结果显示，CpG T1与QS21的剂量变化对疫苗组合物的均有显著性影响，高于剂量5的免疫刺激组合物，诱导产生HBsAg和HBcAg特异性IFN-γ水平显著高于CPG7909组，但由于种属差异性，佐剂剂量进一步增加诱导效果并无显著性增加，推测原因为小鼠无法准确反映佐剂的免疫强度。
剂量1、2、4与CPG7909组的免疫刺激效果相当，但是使用的佐剂剂量低于同等CPG7909组，因此也具有一定优势。
表4实验动物分组
Figure BDA0002829397650000131
实施例5乙肝疫苗的实验组设置及免疫流程
1、实验动物及模型建立：
C57BL/6(N)小鼠，雄性，4周龄，81只，上海灵畅实验动物技术有限公司，rAAV8-HBV腺病毒，购自北京五加和分子医学研究所有限公司。在C57BL/6(N)小鼠上尾静脉注射rAAV8-HBV腺病毒，建立rAAV8-HBV持续感染C57BL/6(N)的小鼠模型。
2、试剂材料：
1)HBsAg蛋白：实施例1制得。
2)HBcAg蛋白：实施例1制得。
3)使用PBS溶液(购自Hyclone公司)将HBsAg原液、HBcAg原液和QS-21分别稀释至200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml，使用PBS溶液将CpG溶解并稀释至100μg/ml，供下一步使用。
3、实验分组：见表5，每只小鼠每次注射量为100μL/只，其中A组为阴性对照，注射PBS溶液100μL/只。
表5实验动物分组及每组注射量
Figure BDA0002829397650000141
4、动物免疫：所有组别每2周进行1次肌肉注射，接种部位为右侧后大腿，共给药6次，分别于尾静脉注射rAAV8-HBV病毒后第4周、第6周、第8周、第10周、第12周、第14周给药。给药开始后每2周采1次血，采血时间分别为第4周、第6周、第8周、第10周、第12周、第14周、第16周、第18周、第20周、第22周。第22周将所有小鼠处死。
实施例6乙肝疫苗对血清中HBsAg水平的影响
1、血清HBsAg的检测步骤：委托南京鼓楼医院检测。
使用两步免疫测定法，首先检测样本和包被乙型肝炎表面抗体的顺磁微粒子结合，经过洗涤，加入吖啶酯标记的乙型肝炎表面抗体结合物，再经过洗涤，加入预激发液和激发液到反应混合物中，测定检测样本的相对发光值(RLU)，样本中的HBsAg含量与RLU之间成正相关性，通过产生的ARCHTITECT HBsAg标准曲线测定小鼠血清样本中HBsAg浓度，最终小鼠血清样本中HBsAg浓度为测定值的50～200倍。
2、结果分析(图7)：含有本发明所述免疫刺激物的H组疫苗，对应的HBsAg水平呈明显下降趋势，在免疫过程结束后(第14周起)，保持稳定长效的免疫效果，相比单独的CpG组(F组)和QS-21组(G组)，具有显著性优势。H组HBsAg水平从起始>6350IU/ml降低到50IU/ml左右，该组在第二次免疫(第6周)后HBsAg水平即下降30％以上，在第三次免疫(第8周)后HBsAg水平下降70％以上，且在第14周免疫结束后平均下降率维持在92％左右。具有优越的免疫效果。与双佐剂对照(I组)相比，H在第14周免疫结束后依旧维持稳定的免疫效果，免疫水平显著优于I组。
实施例7乙肝疫苗的体液免疫效果评价
1、血清HBsAb的检测步骤：委托南京鼓楼医院检测。
使用两步免疫测定法，即首先检测样本和重组HBsAg(rHBsAg)包被顺磁微粒子混合，经过洗涤，加入吖啶酯标记的rHBsAg结合物，再经过洗涤，加入预激发液和激发液到反应混合物中，测定检测样本的相对发光值(RLU)，样本中的HBsAb含量与RLU之间成正相关性，通过产生的ARCHTITECT HBsAb校准曲线测定小鼠血清样本中HBsAb浓度，最终小鼠血清样本中HBsAb浓度为测定值的50～200倍。
2、结果分析(图8)：含有所述免疫刺激物的H组疫苗在第二次免疫(第6周)后开始产生HBsAb(>10mIU/ml)，且随着免疫次数的增加，HBsAb水平呈现不断增长的趋势，且增长趋势显著优于单独的CpG组(F组)和QS-21组(G组)。免疫结束后两周(第十六周)之后HBsAb水平接近饱和，可达4.0个对数值即10000mIU/ml左右的HBsAb水平，与双佐剂对照(I组)相比，产生的抗体水平也具有显著性优势。
实施例8乙肝疫苗的细胞免疫效果评价
1、检测步骤：同实施例2。
2、评价指标：若对照孔斑点数≤5SCF，样品孔斑点数≥10SCF，判定为阳性；若5SFC＜对照孔斑点数≤10SCF，样品孔斑点数/对照孔斑点数≥2，判定为阳性；若对照孔斑点数＞10SFC，样品孔斑点数/对照孔斑点数≥3，判定为阳性。
3、实验结果：
表6脾细胞分泌的HBsAg和HBcAg特异性IFN-γ的转阳率
Figure BDA0002829397650000151
细胞免疫水平检测结果：ELISPOT斑点结果见图9和10，分析结果显示，F组-I组的HBsAg特异性IFN-γ阳转率均为100％，HBcAg特异性IFN-γ阳转率均为100％。含有所述免疫刺激物的H组疫苗可诱导产生较高的HBsAg和HBcAg特异性IFN-γ水平，分别大于2350SFC/106脾细胞和大于1250SFC/106脾细胞，与单独的CpG组(F组)和QS-21组(G组)相比，具有显著性差异。H组与双佐剂对照(I组)相比，后者诱导产生的HBsAg和HBcAg特异性IFN-γ水平约为1630SFC/106脾细胞和750SFC/106脾细胞左右，显著低于H组。
实施例9药物组合物在血清中HBsAg和HBcAg特异性抗体检测
1、检测步骤：用纯化的HBsAg和HBcAg包被96孔酶标板，形成固相抗原，经过封闭处理后，将待测血清以一定的起始稀释度作倍比稀释，设多个稀释度，在96孔酶标板中加入倍比稀释后的血清样本，再与HRP标记的抗IgG/IgG1/IgG2a抗体结合，形成抗原-抗体(血清)-酶标抗体复合物，最后加入底物TMB显色，并用酶标仪测定450nm波长下的吸光度(OD值)，显色颜色的深浅与检测样本中的HBsAg和HBcAg特异性抗体IgG/IgG1/IgG2a水平呈正相关，通过拟合“吸光度OD值-血清样本稀释倍数(Log)”的关系曲线，进行抗体滴度的判定。
2、结果分析：
1)血清中HBsAb IgG抗体及亚型检测结果：
各组不同时间用ELISA方法检测小鼠血清中HBsAb IgG抗体及亚型水平如图11所示。含有所述免疫刺激物的H组疫苗产生较高滴度的抗HBsAg特异性IgG/IgG1/IgG2a抗体，且随着免疫次数的增加，抗体水平不断增长，在第六次免疫(第14周)时抗体水平接近饱和，特异性抗体滴度可达5.4个对数值以上；A组-D组未检测到特异性抗体，E组-G组虽然产生一定的HBsAg特异性IgG/IgG1/IgG2a抗体水平，但抗体水平显著低于H组，双佐剂对照(I组)产生的抗HBsAg特异性IgG抗体和IgG2a抗体水平显著低于H组。
2)血清中HBcAb IgG抗体及亚型检测结果：
各组不同时间用ELISA方法检测小鼠血清中HBcAb IgG抗体及亚型水平如图12所示。含有所述免疫刺激物的H组疫苗产生较高滴度的抗HBcAg特异性IgG/IgG1/IgG2a抗体，且随着免疫次数的增加，抗体水平不断增长，在第六次免疫(第14周)时抗体水平接近饱和，特异性抗体滴度可达4.8个对数值以上；A组-D组未检测到特异性抗体，E组-G组虽然产生一定的HBcAg特异性IgG/IgG1/IgG2a抗体水平，但抗体水平显著低于H组。且H组更偏向于Th1通路，D图可见特异性抗体IgG2a呈显著上升趋势，反映出H组疫苗可以促进抗HBcAg抗体亚型转变，且转变效率显著高于双佐剂对照(I组)。
实施例10带状疱疹疫苗的实验组设置
1、实验动物及模型建立：
C57BL/6(N)小鼠，雌性，5周龄，48只，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。
2、试剂材料：
1)疱疹gE蛋白：氨基酸序列如SEQ ID NO：31所示。
制备步骤参考文献Thomsson E,Persson L等在《Journal of VirologicalMethods》2011，第175卷，第1期，第53-59页中的报道，具体步骤如下：根据目的蛋白序列对其核酸序列进行优化，使其密码子符合哺乳动物表达体系，并对目的基因进行合成；将合成的目的基因通过酶切连接的方式与pcDNA3.1(+)质粒连接，转化Top 10感受态，挑取阳性单克隆，对阳性单克隆进行测序验证；大量扩增单克隆菌体，用无内毒素质粒抽提试剂盒进行大量抽提符合细胞转染的质粒；通过瞬时转染方式用质粒转染CHO悬浮细胞，CHO细胞活力低于70％或发酵时间大于7天时，在4℃下用5000rpm离心30min收集发酵液上清。将发酵液在4℃层析柜中透析至含50mMTris-HCl、500mM NaCl、20mM咪唑的溶液中，透析比例1:100，每4h透析一次，共透析3次；通过镍柱对收集样品经行纯化，对收集目的蛋白峰样品进行SDS-PAGE检测，合并较纯的纯化液，用含20mM磷酸盐、150mM NaCl的溶液在4℃层析柜中透析24h，透析比例1:100，每8h换液一次；将样品过0.22um无菌滤膜，4℃冰箱中保存备用。
制备的疱疹gE蛋白原液要求其纯度大于95％，蛋白含量不低于200μg/ml，内毒素水平不高于0.1Eu/ug。
2)使用PBS溶液(购自Hyclone公司)将疱疹gE原液分别稀释至50μg/ml和10μg/ml，使用PBS溶液将QS-21分别稀释至50μg/ml和10μg/ml，使用PBS溶液将CpG分别稀释至100μg/ml和20μg/ml，使用PBS溶液将CpG7909分别稀释至100μg/ml和20μg/ml。
3、实验分组：见表7，每只小鼠每次注射量为100μL/只，其中A组为阴性对照，注射PBS溶液100μL/只。
表7实验动物分组及每组注射量
Figure BDA0002829397650000181
4、动物免疫：所有组别每2周进行1次肌肉注射，接种部位为右侧后大腿，连续给药2次，即分别于第0周和第2周注射给药，第4周将所有小鼠处死。
实施例11带状疱疹疫苗的细胞免疫药效验证
1、检测步骤和评价指标同实施例2；其中gE特异性肽库序列见SEQ ID NO.32～46。
2、实验结果：各组小鼠脾细胞分泌gE特异性IFN-γ的T淋巴细胞斑点数水平如图13所示，gE特异性IFN-γ阳转率结果如表8所示。结果表明：免疫高剂量的E、F组对应的脾细胞分泌gE特异性IFN-γ的T淋巴细胞斑点数水平(>4000SFC/106脾细胞)均显著高于低剂量的G、H组；其中，E组、G组(CpGT1+QS-21)对应的脾细胞分泌gE特异性IFN-γ的T淋巴细胞斑点数水平高于同剂量的F组、H组(CpG7909+QS-21)，E-H组IFN-γ的转阳率均为100％。
表8脾细胞分泌的SgE特异性IFN-γ的转阳率
组别 A B C D E F G H
转阳数量/只 1/6 0/6 4/6 5/6 6/6 6/6 6/6 6/6
转阳率/％ 16.7 0 66.7 83.3 100 100 100 100
实施例12带状疱疹疫苗的体液免疫药效验证
1、检测步骤：免疫后第28天进行采血，分离血清(全血置于37℃恒温培养箱放置40min，12000rpm、4℃离心10min；吸取上清，冻存于-20℃备用)，按照试剂盒说明书，使用ELISA试剂盒(上海科华)检测产生的疱疹gE蛋白特异性抗体阳转率。检测设空白对照、阴性对照和待测样品，每种两个平行孔，其中阴性对照为阴性小鼠血清；除空白对照外，各孔分别加入阴性对照或待测样品，再加入酶结合物，混匀封板后37℃孵育30分钟；使用洗涤液洗涤各孔，每孔加入显色剂A液和显色剂B液，混匀封板后37℃孵育15分钟；每孔加入终止液混匀；使用酶标仪读取450nm波长处的各孔OD值。
2、实验结果：ELISA检测小鼠血清中抗原特异性IgG抗体及亚型水平如图14所示，结果表明：含有本发明所述免疫刺激物的E组免疫效果显著优于单独的CpG组(C组)和QS-21组(D组)和双佐剂对照(F组)，且对应的IgG和IgG2a抗体水平与两组均存在显著差异，即在QS-21中加入CpG可提高相应的体液免疫水平。
实施例13不同皂苷对重组带状疱疹疫苗组合物的药效影响
1、实验动物及模型建立：
C57BL/6(N)小鼠，雌性，5周龄，48只，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。
2、试剂材料：
1)疱疹gE蛋白由实施例10获得、CpG T1、CpG 7909均由实施例1制得；
2)QS-21(CAS.NO.A010-023，购自BRENNTAG公司)；人参皂苷Rg1(CAS:22427-39-0，购自南京春秋生物工程有限公司)、黄芪甲苷(CAS:84687-43-4，购自南京春秋生物工程有限公司)、桔梗皂苷D(CAS:58479-68-8，购自湖北云镁科技有限公司)，Iscom佐剂(购自上海熹垣生物科技有限公司)
3)使用PBS溶液(购自Hyclone公司)将疱疹gE原液稀释至50μg/mL，使用PBS溶液将各皂苷分别稀释至50μg/mL，使用PBS溶液将CpG T1和CpG 7909分别溶解并稀释至100μg/mL，供下一步使用。
3、实验分组：
见表9，每次注射量为100μL/只。其中对照组注射PBS溶液100μL/只。
4、实验步骤：同实施例2。
5、实验结果：
ELISPOT斑点结果见图15，结果显示，CpG T1与各皂苷联合应用后均产生了高效的协同作用，诱导产生gE特异性IFN-γ水平显著高于其他CpG和皂苷的组合物，其中，QS21的效果最佳。
表9实验动物分组
Figure BDA0002829397650000201
综上所述，本发明提供的免疫组合物具有优越的免疫刺激作用，相比单一佐剂、其他CPG佐剂和QS21的组合，CpG T1～T3与QS-21表现出高效的协同作用，可以介导更强烈的免疫应答。应用于不同的抗原或抗原组合物，均有显著性优势。因此，该免疫组合物作为一种新型佐剂，具有很高的临床应用价值和广阔的市场前景。
尽管以上已经对本发明作了详细描述，但是本领域技术人员理解，在不偏离本发明的精神和范围的前提下可以对本发明进行各种修改和改变。本发明的权利范围并不限于上文所作的详细描述，所述修改和改变应归属于权利要求书的范围。虽然以上仅描述了本发明的具体实施方式的范例，但本领域的技术人员应当理解，以上这些仅为举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改，但这些变更或修改均应落入本发明的保护范围。
序列表
<110> 南京远大赛威信生物医药有限公司
<120> 免疫刺激组合物及其用途
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<150> 2019112795360
<151> 2019-12-13
<160> 46
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 226
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln
1 5 10 15
Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu
20 25 30
Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ser Pro Val Cys
35 40 45
Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser
50 55 60
Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe
65 70 75 80
Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val
85 90 95
Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly
100 105 110
Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala
115 120 125
Gln Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp
130 135 140
Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys
145 150 155 160
Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu
165 170 175
Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu
180 185 190
Ser Ala Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile
195 200 205
Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val
210 215 220
Tyr Ile
225
<210> 2
<211> 183
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65 70 75 80
Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys
85 90 95
Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
100 105 110
Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
115 120 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
130 135 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr
145 150 155 160
Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
165 170 175
Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
180
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
tgactgtgaa cgttcgagat ga 22
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
tccatgacgt tcctgacgtt 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
tcgttcgttc gttcgttcgt t 21
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
tcgttcgttc gttcgttcgt tcgtt 25
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
tcgtcgtcgt cgtcgtcgtc g 21
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
tcgacgttcg tcgttcgtcg ttc 23
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
tccatgacgt tcctgatgct 20
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
tgtcgtcgtc gtttgtcgtt tgtcgtt 27
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
gggggacgat cgtcgggggg 20
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
ggggacgacg tcgtgggggg g 21
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
tcgtcgtttc gcgcgcgccg 20
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
tcgtcgttcg ttcgtcgaac gacgtttgat 30
<210> 16
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 16
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly
1 5 10 15
<210> 17
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 17
Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Asn
1 5 10 15
<210> 18
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 18
Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp
1 5 10 15
<210> 19
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 19
Cys Trp Gly Glu Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn
1 5 10 15
<210> 20
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 20
Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro
1 5 10 15
<210> 21
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 21
Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Glu
1 5 10 15
<210> 22
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 22
Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Glu Leu Val Val Ser
1 5 10 15
<210> 23
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 23
Glu Asp Pro Ala Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val
1 5 10 15
<210> 24
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 24
Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu
1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 25
Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln
1 5 10 15
<210> 26
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 26
Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe
1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 27
Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys
1 5 10 15
<210> 28
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 28
Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly
1 5 10 15
<210> 29
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 29
Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
1 5 10 15
<210> 30
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 30
Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu
1 5 10 15
<210> 31
<211> 518
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 31
Ser Val Leu Arg Tyr Asp Asp Phe His Ile Asp Glu Asp Lys Leu Asp
1 5 10 15
Thr Asn Ser Val Tyr Glu Pro Tyr Tyr His Ser Asp His Ala Glu Ser
20 25 30
Ser Trp Val Asn Arg Gly Glu Ser Ser Arg Lys Ala Tyr Asp His Asn
35 40 45
Ser Pro Tyr Ile Trp Pro Arg Asn Asp Tyr Asp Gly Phe Leu Glu Asn
50 55 60
Ala His Glu His His Gly Val Tyr Asn Gln Gly Arg Gly Ile Asp Ser
65 70 75 80
Gly Glu Arg Leu Met Gln Pro Thr Gln Met Ser Ala Gln Glu Asp Leu
85 90 95
Gly Asp Asp Thr Gly Ile His Val Ile Pro Thr Leu Asn Gly Asp Asp
100 105 110
Arg His Lys Ile Val Asn Val Asp Gln Arg Gln Tyr Gly Asp Val Phe
115 120 125
Lys Gly Asp Leu Asn Pro Lys Pro Gln Gly Gln Arg Leu Ile Glu Val
130 135 140
Ser Val Glu Glu Asn His Pro Phe Thr Leu Arg Ala Pro Ile Gln Arg
145 150 155 160
Ile Tyr Gly Val Arg Tyr Thr Glu Thr Trp Ser Phe Leu Pro Ser Leu
165 170 175
Thr Cys Thr Gly Asp Ala Ala Pro Ala Ile Gln His Ile Cys Leu Lys
180 185 190
His Thr Thr Cys Phe Gln Asp Val Val Val Asp Val Asp Cys Ala Glu
195 200 205
Asn Thr Lys Glu Asp Gln Leu Ala Glu Ile Ser Tyr Arg Phe Gln Gly
210 215 220
Lys Lys Glu Ala Asp Gln Pro Trp Ile Val Val Asn Thr Ser Thr Leu
225 230 235 240
Phe Asp Glu Leu Glu Leu Asp Pro Pro Glu Ile Glu Pro Gly Val Leu
245 250 255
Lys Val Leu Arg Thr Glu Lys Gln Tyr Leu Gly Val Tyr Ile Trp Asn
260 265 270
Met Arg Gly Ser Asp Gly Thr Ser Thr Tyr Ala Thr Phe Leu Val Thr
275 280 285
Trp Lys Gly Asp Glu Lys Thr Arg Asn Pro Thr Pro Ala Val Thr Pro
290 295 300
Gln Pro Arg Gly Ala Glu Phe His Met Trp Asn Tyr His Ser His Val
305 310 315 320
Phe Ser Val Gly Asp Thr Phe Ser Leu Ala Met His Leu Gln Tyr Lys
325 330 335
Ile His Glu Ala Pro Phe Asp Leu Leu Leu Glu Trp Leu Tyr Val Pro
340 345 350
Ile Asp Pro Thr Cys Gln Pro Met Arg Leu Tyr Ser Thr Cys Leu Tyr
355 360 365
His Pro Asn Ala Pro Gln Cys Leu Ser His Met Asn Ser Gly Cys Thr
370 375 380
Phe Thr Ser Pro His Leu Ala Gln Arg Val Ala Ser Thr Val Tyr Gln
385 390 395 400
Asn Cys Glu His Ala Asp Asn Tyr Thr Ala Tyr Cys Leu Gly Ile Ser
405 410 415
His Met Glu Pro Ser Phe Gly Leu Ile Leu His Asp Gly Gly Thr Thr
420 425 430
Leu Lys Phe Val Asp Thr Pro Glu Ser Leu Ser Gly Leu Tyr Val Phe
435 440 445
Val Val Tyr Phe Asn Gly His Val Glu Ala Val Ala Tyr Thr Val Val
450 455 460
Ser Thr Val Asp His Phe Val Asn Ala Ile Glu Glu Arg Gly Phe Pro
465 470 475 480
Pro Thr Ala Gly Gln Pro Pro Ala Thr Thr Lys Pro Lys Glu Ile Thr
485 490 495
Pro Val Asn Pro Gly Thr Ser Pro Leu Leu Arg Gly Gly Gly Gly Ser
500 505 510
His His His His His His
515
<210> 32
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 32
Ser Val Leu Arg Tyr Asp Asp Phe His Ile Asp Glu Asp Lys Leu
1 5 10 15
<210> 33
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 33
Tyr Asp Asp Phe His Ile Asp Glu Asp Lys Leu Asp Thr Asn Ser
1 5 10 15
<210> 34
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 34
His Ile Asp Glu Asp Lys Leu Asp Thr Asn Ser Val Tyr Glu Pro
1 5 10 15
<210> 35
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 35
Asp Lys Leu Asp Thr Asn Ser Val Tyr Glu Pro Tyr Tyr His Ser
1 5 10 15
<210> 36
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 36
Thr Asn Ser Val Tyr Glu Pro Tyr Tyr His Ser Asp His Ala Glu
1 5 10 15
<210> 37
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 37
Tyr Glu Pro Tyr Tyr His Ser Asp His Ala Glu Ser Ser Trp Val
1 5 10 15
<210> 38
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 38
Tyr His Ser Asp His Ala Glu Ser Ser Trp Val Asn Arg Gly Glu
1 5 10 15
<210> 39
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 39
His Ala Glu Ser Ser Trp Val Asn Arg Gly Glu Ser Ser Arg Lys
1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 40
Ser Trp Val Asn Arg Gly Glu Ser Ser Arg Lys Ala Tyr Asp His
1 5 10 15
<210> 41
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 41
Arg Gly Glu Ser Ser Arg Lys Ala Tyr Asp His Asn Ser Pro Tyr
1 5 10 15
<210> 42
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 42
Ser Arg Lys Ala Tyr Asp His Asn Ser Pro Tyr Ile Trp Pro Arg
1 5 10 15
<210> 43
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 43
Tyr Asp His Asn Ser Pro Tyr Ile Trp Pro Arg Asn Asp Tyr Asp
1 5 10 15
<210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 44
Ser Pro Tyr Ile Trp Pro Arg Asn Asp Tyr Asp Gly Phe Leu Glu
1 5 10 15
<210> 45
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 45
Trp Pro Arg Asn Asp Tyr Asp Gly Phe Leu Glu Asn Ala His Glu
1 5 10 15
<210> 46
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 46
Asp Tyr Asp Gly Phe Leu Glu Asn Ala His Glu His His Gly Val
1 5 10 15

Claims (18)

1.一种免疫刺激组合物，其包含皂苷和CpG寡聚脱氧核苷酸，或者其由包含皂苷的佐剂和CpG寡聚脱氧核苷酸组成，其中所述CpG寡聚脱氧核苷酸序列具有两个或两个以上拷贝的5’-TTCGTT-3’基序或5’-TCGTCGTCG-3’基序。
2.根据权利要求1所述的免疫刺激组合物，其中，所述CpG寡聚脱氧核苷酸的序列选自以下中的任一种：CpG T1：TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT(SEQ ID NO:6)、CpG T2：TCG TTCGTT CGT TCG TTC GTT CGT T(SEQ ID NO:7)和CpG T3：TCG TCG TCG TCG TCG TCG TCG(SEQ ID NO:8)；
优选地，所述CpG寡聚脱氧核苷酸的序列为CpG T1：TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT(SEQ ID NO:6)。
3.根据权利要求1或2所述的免疫刺激组合物，其中，所述皂苷选自皂树皂苷、人参皂苷、桔梗皂苷、黄芪皂苷、三七皂苷、甘草皂苷、合欢皮皂苷、麦冬皂苷、柴胡皂苷或竹节参皂苷中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的免疫刺激组合物，其中，所述皂树皂苷为QS-7、QS-17、QS-18或QS-21，优选地，所述皂树皂苷为QS-21；所述人参皂苷为人参皂苷Rg1、人参皂苷Rg3、人参皂苷Rb1或人参皂苷Re；所述桔梗皂苷为桔梗皂苷D、桔梗皂苷D2或其两者的混合物；所述黄芪皂苷为黄芪甲苷、黄芪皂苷I、黄芪皂苷II或其中两种或两种以上皂苷单体的混合物；所述三七皂苷为三七皂苷R1；所述麦冬皂苷为麦冬皂苷D；所述柴胡皂苷为柴胡皂苷a、柴胡皂苷d或其两者的混合物；所述合欢皮皂苷为合欢皮总皂苷；所述甘草皂苷为甘草总皂苷；所述竹节参皂苷为竹节参总皂苷。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的免疫刺激组合物，其中所述包含皂苷的佐剂为Iscom佐剂。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的免疫刺激组合物，其中所述CpG寡聚脱氧核苷酸包含硫代磷酸酯连接。
7.根据权利要求5所述的免疫刺激组合物，其中所述CpG寡聚脱氧核苷酸是全硫代寡聚脱氧核苷酸。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的免疫刺激组合物，所述CpG寡聚脱氧核苷酸与皂苷的重量比为1～40:0.1～2，优选为2～40:0.1～2；更优选地为2:1。
9.一种药物组合物，其包含权利要求1至8中任一项所述的免疫刺激组合物，以及抗原或抗原组合物。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其中，所述抗原或抗原组合物选自下述中的任一种：人体免疫缺陷病毒，人疱疹病毒，水痘-带状疱疹病毒，人体细胞肥大病毒，甲、乙、丙或戊型肝炎病毒，呼吸合胞体病毒，人体乳头状瘤病毒，流感病毒，结核分枝杆菌，沙门氏菌，奈瑟菌如脑膜炎奈瑟菌或淋病奈瑟菌，疏螺旋体属如回归热螺旋体或杜通氏螺旋体，衣原体属如沙眼衣原体，博德特氏杆菌属如百日咳博德特氏菌，疟原虫属如恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)、卵形疟原虫(Plasmodiumovale)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)或诺氏疟原虫(Plasmodium knowlesi)或弓形虫属如弓形虫。
11.根据权利要求10所述的药物组合物，其中，所述人疱疹病毒是HSV1或HSV2。
12.根据权利要求9所述的药物组合物，其中，所述抗原为肿瘤抗原。
13.一种疫苗，其包含权利要求1至8中任一项所述的免疫刺激组合物；
优选地，所述疫苗为用于预防病毒、细菌和/或寄生虫感染的疫苗，或所述疫苗为以免疫疗法治疗病毒、细菌和/或寄生虫感染的疫苗。
14.权利要求1至8中任一项所述的免疫刺激组合物在制备用于引起细胞溶解的T细胞应答的药物中的用途。
15.权利要求1至8中任一项所述的免疫刺激组合物在制备用于在哺乳动物中诱发干扰素γ应答的药物中的用途。
16.权利要求1至8中任一项所述的免疫刺激组合物在制备用于预防病毒、细菌和/或寄生虫感染的疫苗中的用途。
17.权利要求1至8中任一项所述的免疫刺激组合物在制备用于以免疫疗法治疗病毒、细菌和/或寄生虫感染的疫苗中的用途。
18.权利要求1至8中任一项所述的所述免疫刺激组合物在制备用于以免疫疗法治疗肿瘤的疫苗中的用途。
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