CN102333538A - 免疫刺激性寡核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及免疫刺激性寡核苷酸，以及使用免疫刺激性寡核苷酸诱导抗原特异性免疫应答的方法。本发明还涉及包含免疫刺激性寡核苷酸和抗原以及包含药物可接受载体的疫苗。在一些实施方案实施方案中，本发明免疫刺激性寡核苷酸包括一或多个经修饰的键。

Description

免疫刺激性寡核苷酸
技术领域
本发明涉及免疫刺激性寡核苷酸以及使用免疫刺激性寡核苷酸来诱导抗原特异性免疫应答的方法。
背景技术
细菌DNA具有活化B细胞和天然杀伤细胞的免疫刺激性效应，但脊椎动物DNA无此效应(Tokunaga，T.等人，1988.Jpn.J.Cancer Res.79：682-686；Tokunaga，T.等人，1984，JNCI 72：955-962；Messina，J.P.等人，1991，J.Immunol.147：1759-1764；且综述于Krieg，1998，Applied OligonucleotideTechnology，C.A.Stein及A.M.Krieg(Eds.)，John Wiley and SonsInc.，NewYork，N.Y.，pp.431-448)。现已知细菌DNA的这些免疫刺激性效应是在特定碱基背景中存在未甲基化的CpG二核苷酸(CpG基序)的结果，该基序在细菌DNA中常见，但其在脊椎动物DNA中被甲基化且比率不足(Krieg等人，1995 Nature 374：546-549；Krieg，1999 Biochim.Biophys.Acta1489：107-116)。可以用含有这些CpG基序的合成寡脱氧核苷酸(ODN)来模拟细菌DNA的免疫刺激性效应。此类CpG ODN对人类及鼠类白细胞具有高刺激性效应，其诱导B细胞增殖；细胞因子及免疫球蛋白分泌；天然杀伤(NK)细胞裂解活性及IFN-γ分泌；以及活化树突细胞(DC)及其它抗原呈递细胞以表达共刺激分子并分泌细胞因子，特别是在促进Th1样T细胞应答的发展中很重要的Th1样细胞因子。天然磷酸二酯骨架CpG ODN的这些免疫刺激性效应是高度CpG特异的，因为在CpG基序被甲基化、变为GpC、或以其它方式被去除或改变时所述效应显著降低(Krieg等人，1995Nature 374：546-549；Hartmann等人，1999 Proc.Natl.Acad.Sci.USA96：9305-10)。
此前已有报导，CpG寡核苷酸的免疫刺激性活性取决于CpG基序的数量、CG二核苷酸两侧的序列、CpG基序的位置及CpG基序之间的间隔(Ballas等人，1996，J.Immunol.157(5)：1840-5；Hartmann等人，2000，J.Immunol.，164(3)：1617-24；Klinman等人，2003，Clin.Exp.Immunol.，133(2)：227-32)。本文公开了3′CpG基序被移除的免疫刺激性寡核苷酸，其令人惊讶地仍保留其免疫刺激性活性。本文还公开了包含所述免疫刺激性寡核苷酸和抗原的疫苗，以及使用该疫苗的方法。
发明简述
在本发明各方面中，提供了包含核苷酸序列5′TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT 3′(SEQ ID NO：1)的免疫刺激性寡核苷酸。在一些实施方案中，免疫刺激性寡核苷酸包含一或多个经修饰的键。在某些实施方案中，免疫刺激性寡核苷酸包含一或多个硫代磷酸酯键。在某些实施方案中，寡核苷酸所有的核苷酸间键均为硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，免疫刺激性寡核苷酸包含至少一个亲脂性经取代的核苷酸类似物以及嘧啶-嘌呤二核苷酸。
在本发明各方面中，提供了疫苗，其包含抗原及含有核苷酸序列SEQ IDNO：1的免疫刺激性寡核苷酸、还包含药物可接受的载体。在一些实施方案中，免疫刺激性寡核苷酸为可诱导抗原特异性免疫应答的有效量。在另外的实施方案中，所诱导的抗原特异性免疫应答是Th1免疫应答。在一些实施方案中，所述抗原是微生物抗原、自身抗原或成瘾性物质。在另外的实施方案中，所述细菌抗原与金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)有关，或者所述细菌抗原与引起龋齿的细菌有关。在另外的实施方案中，所述细菌是变异链球菌(Streptococcus mutans)、龋齿链球菌(Streptococcus sobrinus)、血链球菌(Streptococcus sanguis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilis)、或粘液放线菌(Actinomyces viscosus)。在另外的实施方案中，所述细菌抗原与引起牙周病的细菌有关。在另外的实施方案中，所述细菌是牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)或伴放线放线杆菌(Actinobacillusactinomycetemcomitans)。在一些实施方案中，所述病毒抗原与呼吸道合胞病毒(RSV)、单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒2、人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)或HIV-2有关。在另外的实施方案中，所述寄生虫抗原与引起疟疾的寄生虫有关。在一些实施方案中，所述自身抗原是肿瘤抗原、与阿尔茨海默病(Alzheimer′s Disease)有关的抗原、针对人抗体的抗原、或从人内源性逆转录病毒元件表达的抗原。在另外的实施方案中，所述肿瘤抗原是HER2、MAGE、NY-ESO、PSA、CEA或EGFR的变体形式。在另外的实施方案中，其中所述抗原与阿尔茨海默病有关，该抗原是τ-或β-淀粉状蛋白。在一些实施方案中，所述抗原是IgE。在一些实施方案中，所述抗原是缀合至载体的尼古丁半抗原。在另外的实施方案中，与尼古丁半抗原缀合的载体是白喉毒素(DT)。在另外的实施方案中，所述抗原为肽、重组蛋白、纯化蛋白、全灭活病原体、活的减毒病毒或病毒载体、活的减毒细菌或细菌载体、多糖、半抗原、或由质粒DNA所编码的。
在一些实施方案中，抗原缀合至载体。在另外的实施方案中，所述载体是白喉毒素(DT)。在另外的实施方案中，所述载体是病毒样颗粒。在另外的实施方案中，所述病毒样颗粒是RNA噬菌体Q-β、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、或乙型肝炎核心抗原(HBcAg)。在一些实施方案中，疫苗还包含一或多种佐剂。在另外的实施方案中，佐剂是非TLR 9的Toll样受体(Toll-like receptor)(TLR)的激动剂。在另外的实施方案中，所述激动剂针对TLR 3。在另外的实施方案中，所述TLR 3激动剂是经稳定的聚I:C。在某些实施方案中，所述激动剂针对TLR 4。在另外的实施方案中，所述TLR 4激动剂是脂多糖(LPS)衍生物。在另外的实施方案中，所述LPS衍生物是MPL或GLA。在另外的实施方案中，所述激动剂针对TLR 5。在另外的实施方案中，所述TLR 5激动剂是鞭毛蛋白。在某些实施方案中，所述激动剂针对TLR 7或8。在另外的实施方案中，所述TLR 7或8的激动剂是咪唑并喹啉家族的小分子。在另外的实施方案中，所述佐剂是铝盐。在另外的实施方案中，所述铝盐是氢氧化铝。在某些实施方案中，所述佐剂是免疫刺激性复合物(ISCOM)。在另外的实施方案中，所述佐剂是水包油或油包水乳液。在某些实施方案中，所述佐剂是脂质体。在另外的实施方案中，所述佐剂是递送系统。在另外的实施方案中，所述递送系统是纳米颗粒或微粒。
在某些实施方案中，免疫刺激性寡核苷酸包含一或多个经修饰的键。在另外的实施方案中，免疫刺激性寡核苷酸包含一或多个硫代磷酸酯键。在某些实施方案中，寡核苷酸所有的核苷酸间键均为硫代磷酸酯键。在另外的实施方案中，免疫刺激性寡核苷酸包含至少一个亲脂性经取代的核苷酸类似物以及嘧啶-嘌呤二核苷酸。在某些实施方案中，疫苗经配制以用于施用。在另外的实施方案中，疫苗经配制以通过肠胃外途径来施用，其中所述肠胃外途径是肌内、皮下、皮内、静脉内或腹膜内。在另外的实施方案中，疫苗经配制以用于通过体表途径施用，其中所述体表途径是皮肤、经皮或粘膜表面。在另外的实施方案中，粘膜途径是口服、鼻内、阴道内、直肠内、口内或眼内。
在本发明的某些方面，在有需要的对象中诱导抗原特异性免疫应答的方法包括以有效量对该对象施用抗原及包含核苷酸序列SEQ ID NO：1的免疫刺激性寡核苷酸以在该对象中诱导抗原特异性免疫应答。在某些实施方案中，所述抗原是微生物抗原、自身抗原或成瘾性物质。在另外的实施方案中，所述微生物抗原是细菌抗原、病毒抗原或寄生虫抗原。在另外的实施方案中，所述细菌抗原与金黄色葡萄球菌有关，或者所述细菌抗原与引起龋齿的细菌有关。在另外的实施方案中，所述细菌是变异链球菌、龋齿链球菌、血链球菌、嗜酸乳杆菌、或粘液放线菌。在另外的实施方案中，所述细菌抗原与引起牙周病的细菌有关。在另外的实施方案中，所述细菌是牙龈卟啉单胞菌或伴放线放线杆菌。在某些实施方案中，所述病毒抗原与呼吸道合胞病毒(RSV)、单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒2、人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)或HIV-2有关。在另外的实施方案中，所述寄生虫抗原与引起疟疾的寄生虫有关。在某些实施方案中，所述自身抗原是肿瘤抗原、与阿尔茨海默病有关的抗原、针对人类抗体的抗原、或从人类内源性逆转录病毒元件表达的抗原。在另外的实施方案中，所述肿瘤抗原是HER2、MAGE、NY-ESO、PSA、CEA或EGFR的变体形式。在另外的实施方案中，其中所述抗原与阿尔茨海默病有关，该抗原是τ-或β-淀粉状蛋白。在某些实施方案中，所述抗原是IgE。在某些实施方案中，所述抗原是与载体缀合的尼古丁半抗原。在另外的实施方案中，与尼古丁半抗原缀合的载体是白喉毒素(DT)。在另外的实施方案中，所述抗原为肽、重组蛋白、纯化蛋白、去灭活病原体、活的减毒病毒或病毒载体、活的减毒细菌或细菌载体、多糖、半抗原、或由质粒DNA所编码的。
在某些实施方案中，所述抗原与载体缀合。在另外的实施方案中，所述载体是白喉毒素(DT)。在另外的实施方案中，所述载体是病毒样颗粒。在另外的实施方案中，所述病毒样颗粒是RNA噬菌体Q-β、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、或乙型肝炎核心抗原(HBcAg)。在某些实施方案中，疫苗还包含一或多种佐剂。在另外的实施方案中，所述佐剂是非TLR 9的Toll样受体(TLR)的激动剂。在另外的实施方案中，所述激动剂针对TLR 3。在另外的实施方案中，所述TLR 3激动剂是经稳定聚I:C。在某些实施方案中，所述激动剂针对TLR 4。在另外的实施方案中，所述TLR 4激动剂是脂多糖(LPS)衍生物。在另外的实施方案中，所述LPS衍生物是MPL或GLA。在另外的实施方案中，所述激动剂针对TLR 5。在另外的实施方案中，所述TLR 5激动剂是鞭毛蛋白。在某些实施方案中，所述激动剂针对TLR 7或8。在另外的实施方案中，所述TLR 7或8激动剂是咪唑并喹啉家族的小分子。在另外的实施方案中，佐剂是铝盐。在另外的实施方案中，铝盐是氢氧化铝。在某些实施方案中，佐剂是免疫刺激性复合物(ISCOM)。在另外的实施方案中，佐剂是水包油或油包水乳液。在某些实施方案中，佐剂是脂质体。在另外的实施方案中，佐剂是递送系统。在另外的实施方案中，所述递送系统是纳米颗粒或微粒。
在某些实施方案中，免疫刺激性寡核苷酸包含一或多个经修饰的键。在另外的实施方案中，免疫刺激性寡核苷酸包含一或多个硫代磷酸酯键。在某些实施方案中，寡核苷酸所有的核苷酸间键均为硫代磷酸酯键。在另外的实施方案中，免疫刺激性寡核苷酸包含至少一个亲脂性经取代的核苷酸类似物以及嘧啶-嘌呤二核苷酸。在某些实施方案中，抗原和/或免疫刺激性寡核苷酸经配制以用于施用。在另外的实施方案中，抗原和/或免疫刺激性寡核苷酸经配制以通过肠胃外途径施用，其中所述肠胃外途径是肌内、皮下、皮内、静脉内或腹膜内。在另外的实施方案中，抗原和/或免疫刺激性寡核苷酸经配制以通过体表途径施用，其中所述体表途径是皮肤、经皮或粘膜表面。在另外的实施方案中，所述粘膜途径是口服、鼻内、阴道内、直肠内、口内或眼内。在某些实施方案中，抗原及免疫刺激性寡核苷酸通过相同、类似或不同的途径来施用。在另外的实施方案中，抗原和免疫刺激性寡核苷酸是联合、同时或分别施用。在另外的实施方案中，抗原和免疫刺激性寡核苷酸在彼此相隔24小时以内施用。在某些实施方案中，所述对象是被兽医治疗的物种。在另外的实施方案中，所述对象是非啮齿动物对象。在某些实施方案中，所述对象为人类。
附图说明
图1：小鼠中体液免疫应答的提高。用无佐剂或者组合了CPG 24555、10103或7909(10μg)或非CpG对照ODN 2137(10μg；仅与OVA一起使用)的1μg HBsAg(左图)或者20μg OVA(右图)对成年(6-8wk；n＝10/gp)小鼠进行免疫。对最后一次加强后第2周(对于HBsAg)或第1周(对于OVA)的血浆测定抗原特异性总IgG、IgG1及IgG2a/c水平(抗HBs或抗OVA)。各条柱代表总IgG的几何平均(±SEM)效价。效价定义为导致光吸收值为截断值0.05的未免疫血浆两倍的最高稀释度。各条柱上方的数字代表抗原特异性IgG2a(或2c)/IgG1的比率。
图2：在小鼠中所诱导体液免疫应答的性质。用无佐剂或者组合了CPG24555、10103或7909(10μg)或非CpG对照ODN 2137(10μg；仅与OVA一起使用)的1μg HBsAg(左图)或者20μg OVA(右图)对成年(6-8wk；n＝10/gp)小鼠进行免疫。对最后一次加强后第2周(对于HBsAg)或第1周(对于OVA)的血浆测定针对HBsAg(抗HBs)或OVA(抗OVA)的IgG1(空白条柱)及IgG2a或IgG2c(黑色条柱)的水平。各条柱代表整格组(n＝10)的ELISA终点稀释效价的几何平均(±SEM)。效价定义为导致吸光度值为截断值0.05的未免疫血浆两倍的最高稀释度。
图3：在小鼠中所诱导的细胞毒性T淋巴细胞应答。用无佐剂或者组合了CPG 24555、10103或7909(10μg)或非CpG对照ODN 2137(10μg；仅与OVA一起使用)的1μg HBsAg(左图)或20μg OVA(右图)对成年(6-8wk；n＝5/gp)小鼠进行免疫。对最后一次加强后第2周(对于HBsAg)或第1周(对于OVA)的脾细胞用标准51Cr释放测定法来测定抗原特异性CTL应答。
图4：在TLR9缺陷型小鼠的CTL应答中无CpG介导的提高。用无佐剂或者组合了CPG 24555、10103或7909(10μg)或非CpG对照ODN 2137(10μg)的20μg OVA来对TLR9缺陷型成年(6-8wk；n＝5gp)小鼠进行免疫。对最后一次加强后第1周的脾细胞用标准51Cr释放测定法来测定OVA特异性CTL应答。
图5：野生型vs.TLR9缺陷型小鼠中de OVA特异性CD8T细胞。用无佐剂或者组合了CPG 24555、10103或7909(10μg)或非CpG对照ODN 2137(10μg)的20μg OVA来对野生型及TLR9缺陷型成年(6-8wk；n＝5/gp)小鼠进行免疫。对最后一次加强后第1周的脾细胞使用MHC I类H-2Kb-SIINFEKL四聚体来测定OVA特异性CD8T细胞。
图6：小鼠中的抗原特异性IFN-g分泌。用无佐剂或者组合了CPG24555、10103或7909(10μg)或非CpG对照ODN 2137(10μg；仅与OVA一起使用)的1μg HBsAg(左图)或20μg OVA(右图)对成年(6-8wk；n＝5/gp)小鼠进行免疫。对最后一次加强后第2周(对于HBsAg)或第1周(对于OVA)的脾细胞用图中所示相关抗原将刺激72hr，并用ELISA来测定培养物上清的IFN-γ。
图7：在TLR9缺陷型小鼠的抗原特异性IFN-g分泌中无CpG介导的提高。用无佐剂或者组合了CPG 24555、10103或7909(10μg)或非CpG对照ODN 2137(10μg)的20μg OVA来对TLR9缺陷型成年(6-8wk；n＝5gp)小鼠进行免疫。对最后一次加强后第1周的脾细胞用OVA以0、0.5及1mg/ml的浓度刺激72hr，并用ELISA测定培养物上清的IFN-γ。
图8：小鼠中的抗原特异性多细胞因子分泌型T细胞群。用1μg HBsAg单独与抗原、或者用1μg HBsAg及抗原并组合CPG 24555、10103或7909(10μg)对成年(6-8wk；n＝5/gp)小鼠进行免疫。对加强后第2周的脾细胞用HBsAg抗原(对于CD4)或HBs I类肽(对于CD8)进行再刺激，并使用流式细胞术来对分泌IFN-γ、TNF-α和/或IL-2的CD4(图A)和CD8(图B)T细胞群进行定量。
图9：人类PBMC中的先天免疫。将人类PBMC(5×106/ml)与不同浓度的CPG 10103、CPG 24555或非CpG对照ODN 22881一起温育24或48h。收集细胞上清并使用市售ELISA试剂盒对细胞因子/趋化因子的分泌进行测定。图9A显示了IFN-α、MCP-1及IP-10的分泌。图9B显示了IL-6、IL-10及IL-2R的分泌。
图10：BALB/c小鼠中的体内先天免疫。以100μg的剂量水平对BALB/c小鼠(n＝5/组)皮下注射PBS(安慰剂对照)、CPG 24555、CPG 10103或非CpG对照ODN 2137。在注射后3小时对动物取血并用市售ELISA测定血浆的IP-10(图10A)及IL-12(图10B)或IL-6(图10C)。
图11：BALB/c小鼠中的体内体液免疫。用HBsAg(1μg)±CPG 24555或10103(10μg)、OVA(20μg)±CPG 24555或10103(10μg)、或用来自Texas 1/77、H3N2的流感A HA(1μg)+明矾(25μg Al3+)、±CPG 24555或10103(10μg)来对BALB/c小鼠进行肌内免疫。在第0天及第14天(HBsAg)、在第0天、第7天及第21天(OVA)者或仅在第0天(HA)对小鼠进行免疫。图11A显示了在加强后第2周用终点ELISA测量的HBsAg特异性总IgG效价。图11B显示了在最后一次加强后第1周的OVA特异性总IgG效价。图11C显示了在免疫后各个时间用终点ELISA测量的HA特异性总IgG的动力学。
图12：BALB/c小鼠中的T细胞应答。用HBsAg(1μg)与10μg的CPGODN 2455、CPG 10103或非CpG对照ODN 2137、或单独的HBsAg(1μg)对BALB/c小鼠进行肌内注射。在第0天及第14天对小鼠进行注射。图12A显示了在加强后第2周用51Cr释放所测量的HBsAg特异性CTL。用OVA(20μg)与10μg的CPG ODN 2455、CPG 10103或非CpG对照ODN 2137、或单独的OVA(20μg)对C57bl/6小鼠进行肌内注射。在第0天、第7天及第21天对小鼠进行注射。图12B显示了在最后一次加强后第1周用51Cr释放所测量的OVA特异性CTL。
图13：BALB/c小鼠中的T细胞应答。用HBsAg(1μg)与10μg的CPGODN 2455、CPG 10103或非CpG对照ODN 2137、或单独的HBsAg(1μg)对BALB/c小鼠进行肌内注射。在第0天及第14天对小鼠实施进行注射。自将最后一次加强免疫后第2周将的脾细胞与各自的抗原一起全无奈与培养72小时且并藉由用ELISA来测试培养物上清液的中之IFN-γ(图13A)。向C57bl/6小鼠肌内注射用OVA(20μg)与以及10μg的CPG ODN 2455、CPG 10103或非无CpG对照ODN 2137(10μg)、或单独的注射OVA(20μg)对C57bl/6小鼠进行肌内注射。在第0天、第7天及第21天对小鼠实施进行注射。自将最后一次加强免疫后第1周将的脾细胞与各自的抗原一起温育72小时且用ELISA来测试培养物上清的IFN-γ(图13B)。图14：在免疫后第6周的抗HA。用HA(1μg)±CpG或对照ODN(10μg)±明矾(25μg Al3+)以50μl的总体积对雌性BALB/c小鼠进行免疫。在免疫后第6周测量抗HA的量。
图15：在免疫后第4周的血凝抑制(HIA)效价。使用血凝抑制测定(HIA)来评估抗体的功能。测量了单独或与明矾组合提高HIA效价的能力。
图16：HA特异性IFNγ分泌。用HA(1μg)±CpG或对照ODN(10μg)±明矾(25μg Al3+)以50μl的总体积对雌性BALB/c小鼠进行免疫。免疫后第6周摘除的脾细胞被用于测定抗原特异性IFNγ的分泌。
图17：非人灵长类中的体液应答。在第0周、第4周及第8周通过肌内注射单独用Engerix-B(10μg HBsAg；250μg Al3+)或用其与0.5mg pf CPG7909或CPG 24555的组合对食蟹猴(3-5岁龄；n＝5/组进行免疫。以规则的时间间隔对动物取血，并使用市售试剂盒(MONOLISATM抗HBS)来测量HBsAg特异性抗体效价。
图18：非人灵长类中的体液应答。在第0周、第4周及第8周通过肌内注射单独用Engerix-B(10μg HBsAg；250μg Al3)或用其与0.5mg CPG7909或CPG 24555的组合对食蟹猴(3-5岁龄；n＝5/组)进行免疫。对第2次免疫后第4周及第3次免疫后第2周的血浆使用硫氰酸钠乳液法测定抗体亲和力。
图19：非人灵长类中的T细胞应答。在第0周、第4周及第8周通过肌内注射单独用Engerix-B(10μg HBsAg；250μg Al3)或用其与0.5mg CPG7909或CPG 24555的组合对食蟹猴(3-5岁龄；n＝5/组)进行免疫。在疫苗接种前、及在疫苗接种后的若干时间点，通过流式细胞术来测试外周血单核细胞(PBMC)中HBsAg特异性CD4 T细胞所介导的细胞内细胞因子分泌。图19A显示了IFN-γ的分泌。图19B显示了IL-2的分泌。图19C显示了TNF-α的分泌。
图20：T细胞应答：多功能CD4 T细胞；定量分析。在第0周、第4周及第8周通过肌内注射单独用Engerix-B(10μg HBsAg；250μg Al3)或用其与0.5mg CPG 7909或CPG 24555的组合对食蟹猴(3-5岁龄；n＝5/组)进行免疫。对第3次免疫后第2周外周血单核细胞(PBMC)用流式细胞术来测试分泌一种、两种或三种细胞因子的HBsAg特异性CD4 T细胞。图20A显示了每一百万所分析的CD4 T细胞中分泌一种、两种或三种细胞因子的HBsAg特异性CD4 T细胞的数目。图20B显示了产生单、双及三细胞因子的T细胞在总HBsAg特异性CD4 T细胞群中的比例。
图21：T细胞应答：多功能CD4 T细胞；定性分析。测量了分泌IL-2、IFN-γ及TNFα或这些细胞因子组合的细胞的数目。在第0周、第4周及第8周通过肌内注射单独用Engerix-B(10μg HBsAg；250μg Al3)或用其与0.5mg CPG 7909或CPG 24555的组合对食蟹猴(3-5岁龄；n＝5/组)进行免疫。对第3次免疫后第2周的外周血单核细胞(PBMC)用流式细胞术来测试分泌IL-2、IFN-γ及TNFα或这些细胞因子组合的HBsAg特异性CD4 T细胞的数目。
序列说明
SEQ ID NO：1-免疫刺激性寡核苷酸ODN CPG 24555的核苷酸序列。
SEQ ID NO：2-免疫刺激性寡核苷酸CPG 10103的核苷酸序列。
SEQ ID NO：3-免疫刺激性寡核苷酸CPG 7909的核苷酸序列。
SEQ ID NO：4-非CpG寡核苷酸22881的核苷酸序列。
SEQ ID NO：5-非CpG寡核苷酸2137的核苷酸序列。
发明详述
本发明各方面部分基于以下出人意料的发现：从免疫刺激性寡核苷酸移除CpG基序对该免疫刺激性寡核苷酸提高抗原特异性免疫应答的能力无负面影响。出人意料的是也发现所述CpG基序的移除使得可生成不同的抗原特异性T细胞群。具体而言，已发现所述抗原特异性T细胞群包含更多的IFN-γ分泌型T细胞及更多的多功能T细胞。
在本发明各方面中，免疫刺激性寡核苷酸具有核酸序列5′TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT 3′(ODN CPG 24555；SEQ ID NO：1)。SEQID NO：1的免疫刺激性寡核苷酸核酸序列与此前报导的免疫刺激性寡核苷酸(ODN 10103)5′TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT 3′(SEQ ID NO：2)之的不同之处在于最靠近3′之的CG二核苷酸之的颠倒反转。该此两种免疫刺激性寡核苷酸之间活性的相似性具有令人惊奇惊人相似性，此乃因先前这是因为此前已有报导CpG寡核苷酸的之免疫刺激性活性取决于CpG基序之的数量数目、CG二核苷酸两侧之的序列、CpG基序之的位置以及CpG基序之间之的间距间隔(Ballas等人，1996，J.Immunol.157(5)：1840-5；Hartmann等人，2000，J.Immunol.，164(3)：1617-24；Klinman等人，2003，Clin.Exp.Immunol.，133(2)：227-32)。如根据先前揭示内容所预期，移除免疫刺激性寡核苷酸CPG ODN 24555(SEQ ID NO：1)中最靠近3′之的CG二核苷酸的去除，并未像此前公开的内容所预期的那样不会对此对该免疫刺激性寡核苷酸提高抗原特异性免疫反应免疫应答之的能力产生负面影响。与CPGODN10103相比，CPGODN24555表现出类似的、且在某些情况下增强了的免疫刺激性活性。此外已发现，与CPGODN10103相比，CPGODN24555诱导不同的抗原特异性T细胞群(参见图8、表1及表2)。具体而言，出人意料地发现，与使用CPG ODN 10103或CPG ODN 7909所产生的抗原特异性T细胞群相比，使用CPG ODN 24555作为佐剂所产生的抗原特异性T细胞群(具体而言抗原特异性CD4+ T细胞群)包含更多的IFN-γ分泌T细胞和更多的多功能T细胞。
例如，与用CpG ODN 10103所获得抗原特异性CD4+ T细胞群相比，获得更高比例的产生IFN-γ的抗原特异性CD4+T细胞。与用CPG ODN10103或CPG ODN 7909所获得的抗原特异性CD4+ T细胞群相比，还可获得更高比例的产生IFN-γ及TNF-α二者、IFN-γ及IL-2二者或TNF-α及IL-2二者的多功能抗原特异性CD4+ T细胞、或者甚至是分泌IFN-γ、TNF-α及IL-2的三细胞因子产生细胞。与用CPG ODN 10103所获得抗原特异性CD8+ T细胞群相比，同样获得较高比例的产生TNF-α的抗原特异性CD8+ T细胞。与用CPG ODN 10103或CPG ODN 7909所获得的抗原特异性CD8+ T细胞群相比，还获得较高比例的产生IFN-γ及IL-2二者、TNF-α及IL-2二者的原特异性CD8+ T细胞、或者甚至是分泌IFN-γ、TNF-α及IL-2的三细胞因子产生细胞。
最近已突显出T细胞的多功能性在免疫原性方面的重要性。具体而言，在某些情形下，抗原特异性T细胞在产生趋化因子(例如IFN-γ、TNF-α及IL-2)方面的多功能性与其防卫潜力相关联(例如，参见Harari A等人，Immunol Rev.2006；211：236-54，Makedonas G及Betts MR.Springer SeminImmunopathol.2006；28(3)：209-19，Precopio ML等人，J Exp Med.2007204(6)：1405-16，Xu R等人，Vaccine.2008；26(37)：4819-29)，这被认为是由于其与仅分泌单一细胞因子的T细胞相比更好的效应子功能。
CPG ODN 24555被在用作佐剂时有利地使得产生多功能抗原特异性T细胞群，着在疫苗的设置中具有重要性。
免疫刺激性核酸可为双链或单链。通常，双链分子在体内更稳定，而单链分子具有提高的免疫活性。在本发明的某些方面，优选核酸为单链；而在另外的方面，优选核酸为双链。
术语“核酸”及“寡核苷酸”在本文中可互换使用，意指多个核苷酸，即包含与磷酸酯基团及可替换的有机碱相连的糖(例如核糖或脱氧核糖)的分子，所述有机碱是经取代的嘧啶(例如胞嘧啶(C)、胸苷(T)或尿嘧啶(U))或经取代的嘌呤(例如腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G))。如本文所用，该术语是指寡脱氧核糖核苷酸、寡核糖核苷酸(即去除磷酸酯的多核苷酸)及任何其他含有机碱的聚合物。核酸分子可得自已有的核酸来源(例如基因组或cDNA)，但优选是合成的(例如通过核酸合成来产生的)。
在本发明的各方面，免疫刺激性寡核苷酸与天然RNA及DNA相比可涵盖各种化学修饰及取代，涉及核苷间磷酸二酯桥、β-D-核糖单元和/或天然核苷碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶)。化学修饰的例子是本领域技术人员已知的，并且在以下文献中有阐述，例如：Uhlmann E.等人(1990)，Chem.Rev.90：543；“Protocols for Oligonucleotides and Analogs”Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques，S.AgrawalEd.，Humana Press，Totowa，USA 1993；Crooke，S.T.等人(1996)Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.36：107-129；及Hunziker J.等人(1995)，Mod.Synth.Methods 7：331-417。本发明寡核苷酸可具有一或多处修饰，其中各修饰与具有由天然DNA或RNA组成的相同序列的寡核苷酸相比位于特定核苷间磷酸二酯桥处和/或位于特定的β-D-核糖单元处和/或位于特定的天然核苷碱基的位置处。
在本发明各方面中，所述寡核苷酸可包含一或多处修饰。此种修饰可选自：a)用经修饰的核苷间桥替代位于核苷3′和/或5′末端的核苷间磷酸二酯桥，b)用去磷桥替代位于核苷3′和/或5′末端的磷酸二酯桥，c)用另一单元替代糖磷酸酯骨架中的糖磷酸酯单元，d)用经修饰的糖单元替代β-D-核糖单元，及e)天然核苷碱基的替代。
核酸也包括经取代的嘌呤和嘧啶，例如C-5丙炔嘧啶和7-去氮-7-经取代嘌呤修饰的碱基(Wagner等人，1996，Nat.Biotechnol.14：840-4)。嘌呤和嘧啶包括但不限于，腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸苷、5-甲基胞嘧啶、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤、及其他天然及和非天然存在之的核碱基、经取代及和未经取代的之芳香族部分。其他该等此类修饰为熟习此项技术者本领域技术人员所熟知。
经修饰的碱基是化学上与通常在DNA及RNA中所发现的天然存在的碱基(例如T、C、G、A及U)不同的任何碱基，但它们与这些天然存在的碱基共有基本的化学结构。经修饰的核苷碱基可以是，例如选自次黄嘌呤、二氢尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、5-(C1-C6)-烷基尿嘧啶、5-(C2-C6)-烯基尿嘧啶、5-(C2-C6)-炔基尿嘧啶、5-(羟甲基)尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-(C1-C6)-烷基胞嘧啶、5-(C2-C6)-烯基胞嘧啶、5-(C2-C6)-炔基胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、N2-二甲基鸟嘌呤、2，4-二胺氨基-嘌呤、8-氮杂嘌呤、经取代的7-去氮嘌呤、较佳优选7-去氮-7-取代的及和/或7-去氮-8-经取代的嘌呤、5-羟基甲基胞嘧啶、N4-烷基胞嘧啶(例如N4-乙基胞嘧啶)、5-羟基去脱氧胞苷、5-羟甲基脱去氧胞苷、N4-烷基去氧脱氧胞苷(例如N4-乙基去氧脱氧胞苷)、6-硫脱去氧鸟苷、硝基吡咯之的脱去氧核糖核苷、C5-丙炔基嘧啶、二胺氨基嘌呤(例如2，6-二胺氨基嘌呤)、肌苷、5-甲基胞嘧啶、2-胺氨基嘌呤、2-胺氨基-6-氯嘌呤、次黄嘌呤或天然核苷碱基之的其他修饰。此列表意欲具有是示例性实例性且的而不应被欲理解为是具有限制性的。在本发明的某些方面中，本文所述免疫刺激性寡核苷酸的CpG二核苷酸优选未甲基化。未甲基化的CpG基序是未甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸序列(即未甲基化的5′胞嘧啶及随后由磷酸键连接的3′鸟苷)。在另外的方面，CpG基序是经甲基化的。甲基化的CpG基序是甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸序列(即甲基化的5′胞嘧啶以及随后由磷酸键连接的3′鸟苷)。
在本发明的某些方面，免疫刺激性寡核苷酸可含有经修饰的胞嘧啶。经修饰的胞嘧啶是胞嘧啶的天然存在或非天然存在的嘧啶碱基类似物，其可替代此碱基而不损害该寡核苷酸的免疫刺激性活性。经修饰的胞嘧啶包括但不限于，5-取代胞嘧啶(例如5-甲基-胞嘧啶、5-氟-胞嘧啶、5-氯-胞嘧啶、5-溴-胞嘧啶、5-碘-胞嘧啶、5-羟基-胞嘧啶、5-羟甲基-胞嘧啶、5-二氟甲基-胞嘧啶、及未经取代或经取代的5-炔基-胞嘧啶)、6-取代胞嘧啶、N4-取代胞嘧啶(例如N4-乙基-胞嘧啶)、5-氮杂-胞嘧啶、2-巯基-胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、具有稠环体系的胞嘧啶类似物(例如N，N′-丙烯胞嘧啶或吩恶嗪)。某些优选的胞嘧啶包括5-甲基-胞嘧啶、5-氟-胞嘧啶、5-羟基-胞嘧啶、5-羟甲基-胞嘧啶、及N4-乙基-胞嘧啶。在本发明另一实施方案中，胞嘧啶碱基是经通用碱基(例如3-硝基吡咯、P-碱基)、芳香环体系(例如氟苯或二氟苯)或氢原子(无碱基间隔基(dSpacer))取代的。在某些方面中，免疫刺激性寡核苷酸可含有尿嘧啶及/或和/或其衍生物(例如5-氟-尿嘧啶、5-溴-尿嘧啶、5-溴乙烯基-尿嘧啶、4-硫-尿嘧啶、5-羟基-尿嘧啶、5-丙炔基-尿发明的某些方面，免疫刺激性寡核苷酸可含有经修饰的鸟嘌呤。经修饰的鸟嘌呤是鸟嘌呤俄天然存在或非天然存在的嘌呤碱基类似物，其可替代此碱基而不损害该寡核苷酸的免疫刺激性活性。经修饰的鸟嘌呤包括(但不限于)7-去氮鸟嘌呤、7-去氮-7-取代鸟嘌呤、次黄嘌呤、N2-取代鸟嘌呤(例如N2-甲基-鸟嘌呤)、5-氨基-3-甲基-3H，6H-噻唑并[4，5-d]嘧啶-2，7-二酮、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、嘌呤、吲哚、腺嘌呤、经取代的腺嘌呤(例如N6-甲基-腺嘌呤、8-氧代-腺嘌呤)、8-取代鸟嘌呤(例如8-羟基鸟嘌呤或8-溴鸟嘌呤)、及6-硫鸟嘌呤。在本发明的另一实施例实施方案中，鸟嘌呤碱基是经通用碱基(例如4-甲基-吲哚、5-硝基-吲哚、或K-碱基)、芳香环系统体系(例如苯并咪唑或二氯-苯并咪唑、1-甲基-1H-[1，2，4]三唑-3-甲酰胺)或氢原子(无碱基间隔子基)取代的。
在某些方面，寡核苷酸可包括经修饰的核苷酸间键。这些经修饰俄键可部分地抗降解(例如经稳定的)。“经稳定的核酸分子”应意指对体内降解(例如通过外切或内切核酸酶的)相对具有抗性的核酸分子。稳定性可以是长度或二级结构的函数。长数万至数十万碱基的核酸对体内降解相对具有抗性。对于较短核酸而言，二级结构可稳定且增强其效应。茎环结构的形成可稳定核酸分子。例如，如果核酸的3′末端对上游区域具有自身互补性从而其可向后折叠并形成茎环结构，则该核酸可变得稳定且展现出更多的活性。
核酸的稳定也可通过磷酸酯骨架的修饰来达成。在某些实施方案中，具有硫代磷酸酯键的寡核苷酸可提供最大活性并保护该寡核苷酸免受细胞内外切及内切核酸酶的降解。
对于体内应用，优选核酸对降解(例如通过内切及外切核酸酶的)相对具有抗性。已证实对核酸骨架的修饰可在体内施用时增强核酸的活性。二级结构如茎环等可针对降解而稳定核酸。或者，核酸稳定可通过磷酸酯骨架的修饰来达成。优选的经稳定的核酸具有至少部分硫代磷酸酯修饰的骨架。硫代磷酸酯可以通过采用氨基磷酸酯或H-磷酸酯化学方法的自动化技术来合成。芳基-及烷基-磷酸酯可以如例如美国专利No.4,469,863中所述来制备；且烷基磷酸三酯(其中带电的氧部分如美国专利No.5,023,243及欧洲专利No.092,574所述经烷基化)可通过自动化的固相合成使用市售的试剂来制备。制备其他DNA骨架修饰及取代的方法已有描述(Uhlmann，E.及Peyman，A.(1990)，Chem.Rev.90：544；Goodchild，J.(1990)BioconjugateChem.1：165)。具有CpG基序的2′-O-甲基核酸也引起免疫活化，乙氧基修饰的CpG核酸也是如此。事实上，尚未发现任何骨架修饰可完全消除CpG效应，虽然可通过用5-甲基C替代C来显著降低该效应。具有硫代磷酸酯键的构建物提供最大活性并保护该核酸免受细胞内的外切及内切核酸酶的降解。其他经修饰的核酸包括磷酸二酯修饰的核酸、磷酸二酯与硫代磷酸酯核酸的组合、甲基磷酸酯、甲基硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、p-乙氧基、及其组合。这些组合中的每一种及其对免疫细胞的特定效应对于CpG核酸而言的更多细节在PCT公开专利申请PCT/US95/01570(WO 96/02555)及PCT/US97/19791(WO 98/18810)以及于2001年2月27日发布的美国专利No.6,194,388 B1及于2001年5月29日发布的美国专利No.6,239,116 B1中有论述。据信这些经修饰的核酸由于增强的核酸酶抗性、提高了的细胞吸收、提高了的蛋白质结合、和/或改变了的细胞内定位而可以展现出更多的刺激性活性。
对于体内施用，核酸可与某种分子相连，该分子可导致与靶细胞(例如B-细胞、单核细胞或天然杀伤(NK)细胞)表面的较高亲和力的结合和/或提高了的靶细胞的细胞吸收，从而形成“核酸递送复合物”。可使用本领域熟知的技术将核酸以离子方式或共价方式与适宜的分子相连。可使用多种偶合或交联剂，例如蛋白质A、碳二亚氨、或N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)。或者可使用已知技术将核酸包囊于脂质体或病毒体中。
其他经稳定核酸包括但不限于，非离子型DNA类似物，如烷基-及芳基-磷酸酯(其中带电的磷酸酯氧被烷基或芳基替代)、磷酸二酯及烷基磷酸三酯(其中带电的氧部分被烷基化)。含有二醇(如四乙二醇或六乙二醇)的核酸在一个或两个末端处也被显示出实质上可抵抗核酸酶降解。在某些实施方案中，本发明免疫刺激性寡核苷酸可包括至少一个亲脂性经取代的核苷酸类似物和/或嘧啶-嘌呤二核苷酸。
寡核苷酸可具有一个或两个可及的5′末端。可产生具有两个此种可及5′末端的经修饰的寡核苷酸，例如，通过由3′-3′键连接两个寡核苷酸以产生具有一个或两个可及5′末端的寡核苷酸。该3′-3′键可以为磷酸二酯、硫代磷酸酯或任何其他经修饰的核苷间桥。达成此种键的方法为本领域所熟知。例如，此种等键已在以下文献中有阐述：Seliger，H.等人，Oligonucleotideanalogs with terminal 3′-3′-and 5′-5′-internucleotidic linkages as antisenseinhibitors of viral gene expression，Nucleosides & Nucleotides(1991)，10(1-3)，469-77；及Jiang等人，Pseudo-cyclic oligonucleotides：in vitro and in vivoproperties，Bioorganic & Medicinal Chemistry(1999)，7(12)，2727-2735。
此外，可使用额外的间隔区如三-或四-乙二醇磷酸酯部分来制备3′末端核苷之间的键并非磷酸二酯、硫代磷酸酯或其他经修饰桥的3′-3′连接的寡核苷酸(Durand，M.等人，Triple-helix formation by an oligonucleotidecontaining one(dA)12 and two(dT)12 sequences bridged by two hexaethyleneglycol chains，Biochemistry(1992)，31(38)，9197-204，美国专利No.5,658,738及美国专利No.5,668,265)。或者，该非核苷酸接头可用标准的亚磷酰胺化学方法而衍生自乙二醇、丙二醇或无碱基脱氧核糖(无碱基间隔基)单元(Fontanel，Marie Laurence等人，Sterical Recognition by T4 polynucleotidekinase of non-nucleosidic moieties 5′-attached to oligonucleotides；NucleicAcids Research(1994)，22(11)，2022-7)。可一次或多次掺入该非核苷酸接头，或可将其彼此组合，从而允许要连接的两个寡核苷酸的3′末端之间可具有任意期望的间距。
可用经修饰的核苷间桥来替代位于核苷3′和/或5′末端的核苷间磷酸二酯桥，其中经修饰的核苷间桥例如选自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、NR1R2-氨基磷酸酯、硼烷磷酸酯、α-羟基苄基磷酸酯、磷酸-(C1-C21)-O-烷基酯、磷酸-[(C6-C12)芳基-(C1-C21)-O-烷基]酯、(C1-C8)烷基磷酸酯和/或(C6-C12)芳基磷酸酯桥、(C7-C12)-α-羟甲基-芳基(例如WO 95/01363中所公开的)，其中(C6-C12)芳基、(C6-C20)芳基及(C6-C14)芳基任选地经卤素、烷基、烷氧基、硝基、氰基取代，且其中R1及R2彼此独立地为氢、(C1-C18)-烷基、(C6-C20)-芳基、(C6-C14)-芳基、(C1-C8)-烷基，优选为氢、(C1-C8)-烷基，优选为(C1-C4)-烷基和/或甲氧基乙基，或者R1与R2与携带其的氮原子一起形成可另外含有来自组O、S和N的另外的杂原子的5元或6元杂环。
用去磷桥来替代位于核苷3′和/或5′末端的磷酸二酯桥(去磷桥在例如以下文献中有阐述：Uhlmann E.及Peyman A.，“Methods in Molecular Biology”，第20卷，“Protocols for Oligonucleotides and Analogs”，S.AgrawalEd.，Humana Press，Totowa 1993，第16章，pp.355 ff)，其中去磷桥例如选自以下去磷桥：甲缩醛、3′-硫代甲缩醛、甲基羟氨、肟、亚甲基二甲基-亚肼基、二甲砜和/或甲硅烷基。
本发明的免疫刺激性寡核苷酸可任选具有嵌合骨架。嵌合骨架是一种包含超过一种类型键的骨架。在一个实施方案中，嵌合骨架可由下式表示：5′Y1N1ZN2Y23′。Y1及Y2是具有1至10个核苷酸的核酸分子。Y1及Y2各自包括至少一个经修饰的核苷酸间键。由于嵌合寡核苷酸中至少2个核苷酸包括骨架修饰，所以这些核酸是一类经稳定的免疫刺激性核酸的例子。
对于嵌合寡核苷酸而言，Y1与Y2被认为是彼此独立。这是指在同一分子中，Y1及Y2可各自具有或不具有彼此不同的序列及彼此不同的骨架键。在某些实施方案中，Y1和/或Y2具有3至8个核苷酸。N1及N2是具有0至5个核苷酸的核酸分子，只要N1ZN2总共具有至少6个核苷酸即可。N1ZN2的核苷酸具有磷酸二酯骨架且不包括具有经修饰骨架的核酸。Z是免疫刺激性核酸基序，其优选选自本文所列举的免疫刺激性寡核苷酸。
公式Y1N1ZN2Y2的中心核苷酸(N1ZN2)具有磷酸二酯核苷酸间键，且Y1及Y2具有至少一个经修饰的核苷酸间键，但可能具有超过一个经修饰的核苷酸间键，或者甚至可以具有所有经修饰的核苷酸间键。在优选的实施方案中，Y1和/或Y2具有至少两个或2至5个经修饰的核苷酸间键，或者Y1具有5个经修饰的核苷酸间键且Y2具有2个经修饰的核苷酸间键。在某些实施方案中，所述经修饰的核苷酸间键是硫代磷酸酯修饰的键、二硫代磷酸酯键或p-乙氧基修饰的键。
核酸也包括骨架糖共价连接至除了2′位置的羟基和5′位置的磷酸酯基以外的低分子量有机基团的核酸。因此，经修饰的核酸可包括2′-O-烷基化核糖基团。此外，经修饰的核酸可包括如阿拉伯糖或2′-氟阿拉伯糖等的糖来代替核糖。因此，各核酸可具有不同的骨架组成，由此含有连接在一起的聚合物单元的任何可能的组合，如肽-核酸(其具有氨基酸骨架及核酸碱基)。在某些实施方案中，核酸具有相同的骨架组成。
糖磷酸酯骨架中的糖磷酸酯单元(即β-D-核糖及核苷间磷酸二酯桥一起形成糖磷酸酯单元)(即糖磷酸酯骨架是由糖磷酸酯单元组成)可用另一单元来替代，其中所述另一单元例如可适合构建“吗啉代衍生物”寡聚体(例如，如Stirchak E.P.等人(1989)，Nucleic Acid Res.17：6129-41所述)，也就是例如用吗啉代衍生物来替代；或构建聚酰胺核酸(“PNA”；例如，如Nielsen P.E.等人(1994)，Bioconjug.Chem.5：3-7所述)，也就是例如用PNA骨架单元(例如2-氨基乙基甘氨酸)来替代。寡核苷酸可具有其他碳水化合物骨架修饰和替代，如具有磷酸酯基(PHONA)的肽核酸、锁定核酸(LNA)、以及骨架区段具有烷基接头或氨基接头的寡核苷酸。烷基接头可具有支链或无支链，经取代或未经取代，且为手性纯的或外消旋混合物。
β-核糖单元或β-D-2′脱氧核糖单元可用经修饰的糖单元来替代，其中所述经修饰的糖单元例如选自β-D-核糖、α-D-2′-脱氧核糖、L-2′-脱氧核糖、2′-F-2′-脱氧核糖、2′-F-阿拉伯糖、2′-O-(C1-C6)烷基-核糖，优选2′-O-(C1-C6)烷基-核糖是2′-O-甲基核糖、2′-O-(C1-C6)烯基-核糖、2′-[O-(C1-C6)烷基-O-(C1-C6)烷基]-核糖、2′-NH2-2′-脱氧核糖、β-D-二甲苯-呋喃糖、α-阿拉伯呋喃糖、2，4-二脱氧-β-D-赤-己-吡喃糖、碳环(例如Froehler J.(1992)Am.Chem.Soc.114：8320中所述)和/或开链糖类似物(例如Vandendriessche等人(1993)，Tetrahedron 49：7223中所述)和/或二环糖类似物(例如Tarkoy M.等人(1993)，Helv.Chim.Acta.76：481中所述)。
在某些实施方案中，所述糖是2′-O-甲基核糖，对于一个或两个由磷酸二酯或磷酸二酯样核苷间键连接的核苷酸而言尤其如此。
本发明的寡核苷酸可使用多种本领域熟知方法中的任一种来从头合成。例如，b-氰基乙基亚磷酰氨方法(Beaucage，S.L及Caruthers，M.H.，(1981)Tet.Let.22：1859)；核苷H-磷酸酯方法(Garegg等人，(1986)Tet.Let.27：4051-4054；Froehler等人，(1986)Nucl.Acid Res.14：5399-5407；Garegg等人，(1986)27：4055-4058；Gaffney等人，(1988)Tet.Let.29：2619-2622)。这些化学方法可用多种市售自动化核酸合成器来实施。这些寡核苷酸被称作合成寡核苷酸。或者，可在质粒中大规模制备富含T的核酸和/或TG二核苷酸(参见Sambrook T.等人，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”，Cold Spring Harbor laboratory Press，New York，1989)，并分离成较小部分或以完整质粒来施用。可由已存在的核酸序列(例如基因组或cDNA)使用已知技术来制备核酸，例如哪些采用限制性酶、外切核酸酶或内切核酸酶的技术。
在本发明的实施方案中，免疫刺激性寡核苷酸中的所有核苷酸间键均为硫代磷酸酯键。
诸如硫代磷酸酯等经修饰的骨架可通过采用氨基磷酸酯或H-磷酸酯化学方法的自动化技术来合成。芳基-及烷基-磷酸酯可如例如美国专利No.4,469,863中所述来制备，且烷基磷酸三酯(其中带电氧部分是如美国专利No.5,023,243中所述来烷基化)可通过自动化固相合成使用市售试剂来制备。制备其他DNA骨架修饰及取代方法已有描述(例如Uhlmann，E.及Peyman，A.，Chem.Rev.90：544，1990；Goodchild，J.，Bioconjugate Chem.1：165，1990)。
以此方式制备的核酸被称作分离的核酸。“分离的核酸”一般是指从细胞、从细胞核、从线粒体或从染色质中与其一起的组份及任何其他可视作污染物的组份分开的核酸。
在实施方案中，本发明的免疫刺激性寡核苷酸由5′T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*G*C*T*T*T*T 3′构成，其中*表示硫代磷酸酯键。
在实施方案中，本发明的免疫刺激性寡核苷酸诱导高比例的抗原特异性CD4+ T-细胞分泌IFN-γ。在实施方案中，本发明的免疫刺激性寡核苷酸能在分泌IFN-γ、TNF-α和/或IL-2的抗原特异性CD4+ T-细胞群中诱导至少40％、优选至少45％、更优选至少50％、更优选约53％的抗原特异性CD4+T-细胞来分泌IFN-γ。在实施方案中，用多色流式细胞术来确定所述分泌IFN-γ的抗原特异性CD4+ T-细胞的比例。此确定的例子在本文的实施例1中公开(参见“抗原特异性多细胞因子分泌型T细胞群”的段落)。
在实施方案中，本发明的免疫刺激性寡核苷酸能在分泌IFN-γ、TNF-α和/或IL-2的抗原特异性CD4+ T-细胞群中诱导至少10％、优选至少15％、更优选至少20％、更优选约22％的抗原特异性CD4+ T-细胞来分泌IFN-γ及TNF-α二者。在实施方案中，用多色流式细胞术来确定所述分泌IFN-γ及TNF-α二者的多功能抗原特异性CD4+ T-细胞的比例。此确定的例子在本文的实施例1中有公开(参见“抗原特异性多细胞因子分泌型T细胞群”的段落)。
在实施方案中，本发明的免疫刺激性寡核苷酸能在分泌IFN-γ、TNF-α和/或IL-2的抗原特异性CD8+ T-细胞群中诱导至少30％、优选至少40％、更优选至少45％、更优选约47％的抗原特异性CD8+ T-细胞来分泌IFN-γ及TNF-α二者。在实施方案中，用多色流式细胞术来确定所述分泌IFN-γ及TNF-α二者的多功能抗原特异性CD8+ T-细胞的比例。此确定的例子在本文的实施例1中有公开(参见“抗原特异性多细胞因子分泌型T细胞群”的段落)。
本发明的核酸可被用作独立疗法。独立疗法是可通过施用单一的药剂或组合物来达成预防性或治疗性有益结果的疗法。因此，可单独使用本文所公开的核酸来预防或治疗传性染病因为这些核酸能诱导对此类疾病的治疗结果有益的免疫应答。本文所提及的某些方法涉及这些核酸组合其他治疗药剂的用途。
可在疫苗中使用本发明的核酸。当用于疫苗中时，核酸可与抗原一起施用。抗原对要预防或治疗的病症优选具有特异性。例如，若所述病症是传染病，则抗原优选源自传染性生物体(例如细菌、病毒、寄生虫、真菌等)；若所述病症涉及自身抗原(例如肿瘤、神经变性病症如阿尔茨海默病等，针对人类抗体的抗原、或自人类内源性逆转录病毒元件所表达的抗原)，则抗原优选源自与该抗原相关的特定病症。若所述病症涉及成瘾性物质，则抗原优选源自与该抗原(例如尼古丁半抗原)相关的特定成瘾性物质。
本文所用术语“病症”及“疾病”可互换使用。
在实施方案中，本发明涉及在治疗或预防疾病的疫苗中被用作佐剂的本发明的免疫刺激性寡核苷酸，其中所述疫苗包含至少一种抗原且其中所述疾病可从多功能抗原特异性T细胞的生成中受益。
已发现，与用CPG ODN 10103所获得的抗原特异性CD4+ T细胞群相比，CPG ODN 24555可诱导更高比例的产生IFN-γ的抗原特异性CD4+ T细胞。与用CPG ODN 10103或CPG ODN 7909所获得的抗原特异性CD4+T细胞群相比，同样可获得更高比例的产生IFN-γ及TNF-α二者、IFN-γ及IL-2二者、TNF-α及IL-2二者的多功能抗原特异性CD4+ T细胞、或者甚至产生IFN-γ、TNF-α及IL-2的三细胞因子产生细胞。与用CPG ODN10103或CPG ODN 7909所获得的抗原特异性CD8+ T细胞群相比，还可获得更高比例的产生IFN-γ及IL-2二者、TNF-α及IL-2二者的多功能抗原特异性CD8+ T细胞、或者甚至产生IFN-γ、TNF-α及IL-2的三细胞因子产生细胞。
在多种疾病中均涉及IFN-γ、TNF-α及IL-2。例如，癌症涉及TNF-α而传染病如病毒感染等涉及IFN-γ。因此，在实施方案中，本发明涉及在治疗或预防癌症的疫苗中被用作佐剂的本发明的免疫刺激性寡核苷酸。在实施方案中，本发明涉及在治疗或预防癌症的疫苗中被用作佐剂的本发明的免疫刺激性寡核苷酸，其中所述疫苗包含至少一种肿瘤抗原，优选为本文所公开的任意的肿瘤抗原。
在实施方案中，本发明涉及在治疗或预防传染病的疫苗中被用作佐剂的本发明的免疫刺激性寡核苷酸。在实施方案中，本发明涉及在治疗或预防传染病的疫苗中被用作佐剂的本发明免疫刺激性寡核苷酸，其中所述疫苗包含至少一种微生物抗原，优选为本文所公开的任意微生物抗原。
免疫刺激性寡核苷酸可在本发明某些方面中被用作预防感染(即传染病)、与自身抗原相关的病症、或与成瘾性物质相关的病症的预防性疫苗。优选地，在未诊断出患有疫苗所针对病况的对象中使用预防性疫苗接种，且更优选的是被视为具有发展出这些病况之一的风险的对象。例如，所述对象可以是具有发展出经传染性生物体感染的风险、或易患与自身抗原相关的病症、或易患与成瘾性物质相关病症的对象。
如本文所用的具有风险的对象是具有任何暴露于引起感染的病原体、与自身抗原相关的病症、或与成瘾性物质相关的病症的风险的对象。具有风险的对象还包括具有发生这些病症倾向的对象。某些倾向可能是遗传性的(且因此可通过遗传分析或家族病史来确定)。某些倾向是环境性的(例如此前曾暴露于传染原、自身抗原或成瘾性物质)。对于具有发展出感染的风险的对象来说，此种对象的例子为居住在可发现或已发现特定类型传染原的区域或预期要旅行至该区域的对象，或者可以是因生活方式或医疗过程而直接暴露于生物体或通过接触可能含有传染性生物体的体液而间接暴露于该生物体的对象。具有发展出感染风险的对象还包括医疗机构建议针对特定传染性生物体实施疫苗接种的一般人群。
对象是由兽医学治疗的对象、啮齿动物或非啮齿动物对象。非啮齿动物对象包括但不限于，人类或脊椎动物，例如犬、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、鸡、灵长类(例如猴子)及鱼(水生物种，例如鲑鱼)。啮齿动物对象包括但不限于，大鼠及小鼠。在某些实施方案中，对象为人类。
也可将无免疫刺激性的寡核苷酸给予无抗原的对象用于针对感染的较短期的保护。在此情形下，重复给药使得可达到更长期的保护。
患有感染的对象是已暴露于传染性病原体且体内或身体排出物中具有急性或慢性可检测水平的病原体的对象。在治疗性使用时，免疫刺激性寡核苷酸可独立使用或与另外的治疗药剂组合使用。例如，免疫刺激性寡核苷酸可与抗原一起以治疗性方式使用以产生抗原特异性的全身或粘膜免疫应答，其能降低传染病原体的水平或根除该传染病原体。
如本文所用，传染病是因体内存在外来微生物而产生的疾病。其对研发保护身体粘膜表面的有效疫苗策略及治疗尤为重要，粘膜表面是病原体进入的主要位点。
与自身抗原相关的病症是任何由对象自身细胞或细胞产物中可引起该对象免疫应答的抗原所引起的病症。例如，在某些实施方案中，自身抗原是肿瘤抗原、与阿尔茨海默病有关的抗原、针对抗体的抗原、或由人类内源性逆转录病毒元件所表达的抗原。肿瘤抗原可以是HER2、MAGE、NYESO-1、PSA、CEA或EGFR的变体形式。与阿尔茨海默病有关的抗原可以是τ-或β-淀粉状蛋白。针对抗体俄抗原可以是针对人类抗体的抗原，例如在某些实施方案中所述抗原为IgE。
在某些实施方案中，所述肿瘤抗原为MAGE A1、MAGE A2、MAGE A3、MAGE A4、MAGE A6、MAGE A10、MAGE A12、HAGE(CT13)、BAGE、BORIS、SSX-2、LAGE-1、CAMEL(LAGE-1 alt阅读框)、GAGE 1，2，3、TRAG-3、NY-ESO-1、Melan-A/MART-1、酪氨酸酶、tyrp1(gp75)、tyrp2、gp100/pmel17、PAP、PSA、CEA、Ep-CAM、PSMA、MUC1、MUC2、HER-2、AFP、EphA2、FGF-5、htert、iCE、Livin(ML-IAP)、RAGE、RU2、存活蛋白、存活蛋白2B、WT1、Thomsen-Friedenreich(TF)抗原、5T4、PSCA、STEAP、TGR、亲脂素(Adipophilin)、AIM-2、G250、OGT、TGFaRII、CO-95(KIAA1416)、CO-94(seb4D)、CO-9(HDAC 5)、CO-61(HIP1R)、CO-58(KNSL6)、CO-45、CO-42(TRIP4)、CO-41(MBD2)、Ren-32(Lamin C)、TNKL(BC-203)、CO-26(MNK 1)、SDCCAG3、GA733-2、STn、CA125、EGFRvIII、BCR-abl、高亲和力叶酸盐受体、间皮素(Mesothelin)、hCG、FAP α、细胞周期蛋白1、拓扑异构酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin)B5/乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂(Maspin)、豆类天冬氨酸蛋白内切酶(Legumain)、CDK4、PRAME、ADAM 17、EDDR1、CDC2、复制蛋白A、CDK2、GM2、Globo H、TF(c)、Ley、Tn(c)、STn(c)、GD2、GD3或GD3L。
与成瘾性物质相关的病症是任何涉及可导致对象对成瘾性物质产生成瘾性的化学或生物物质的病症。例如，在某些实施方案中，成瘾性物质可以是尼古丁或可卡因。在某些实施方案中，尼古丁抗原可以是与载体结合的尼古丁半抗原。在某些实施方案中，与尼古丁半抗原结合的载体是白喉毒素。
本文所用术语“治疗”、“经治疗”或“在治疗”在用于传染病时是指提高对象(具有感染风险的对象)对病原体感染的抗性或者说降低对象受到病原体感染可能性的预防性治疗，以及在对象(已感染对象)被感染后用于抵抗感染(例如降低或消除感染或防止感染加剧)的治疗。
术语“治疗”、“经治疗”或“在治疗”在用于与自身抗原相关的病症时是指提高对象(具有患与自身抗原相关病症的风险的对象)对发生此种病症的抗性或降低对象发生与自身抗原相关病症的可能性的预防性治疗，以及在对象(具有患与自身抗原相关病症风险的对象)已发生此种病症或开始出现发生此种病症的体征或症状后降低病症影响(例如降低或消除与病症相关的体征或症状或防止其加剧)的治疗。
术语“治疗”、“经治疗”或“在治疗”在用于与成瘾性物质相关病症时是指提高对象(具有患与成瘾性物质相关病症风险的对象)对发生此种病症的抗性或降低对象发生与成瘾性物质相关病症可能性的预防性治疗，以及在对象(具有患与成瘾性物质相关病症风险的对象)已发生此种病症或开始出现发生此种病症的体征或症状后降低病症影响(例如降低或消除病症相关体征或症状或防止其加剧)的治疗。
用本文所述的免疫刺激性寡核苷酸治疗对象可导致降低感染或完全消除感染，减少与与自身抗原相关病症的相关体征/症状或完全消除该病症，或减少与成瘾性物质相关病症的相关体征/症状或完全消除该病症。若这些传染病、与自身抗原相关病症或与成瘾性物质相关病症的相关症状因所述治疗而减少、受到控制或被消除，则可将对象看做经治疗。对于传染病，所述治疗也涵盖降低对象中所存在传染原的数量(例如此数量可使用诸如ELISA等本领域技术人员已知的标准测定方法来测量)。对于与自身抗原相关的病症，所述治疗也涵盖降低对象中所存在自身抗原的数量或减少因自身抗原所诱导的免疫应答。对于与成瘾性物质相关的病症，该治疗也涵盖减少与对成瘾性物质的成瘾性相关的体征/症状。
本文所用“抗原”是能激发免疫应答的分子。抗原包括但不限于，细胞、细胞提取物、蛋白质、重组蛋白、纯化蛋白、多肽、肽、多糖、多糖缀合物、多糖的肽及非肽模拟物及其他质粒DNA编码的分子、半抗原、小分子、脂质、糖脂、碳水化合物、全灭活病原体、病毒及病毒提取物、活的减毒病毒或病毒载体、活的减毒细菌或细菌载体及多细胞生物体，例如寄生虫及变应原。术语抗原广义上包括可由宿主免疫系统识别为外来物的任何类型的分子。抗原包括但不限于，微生物抗原、自身抗原及成瘾性物质。
在某些方面，抗原与载体结合。在某些实施方案中，载体是白喉毒素或病毒样颗粒。在某些实施方案中，病毒样颗粒包括RNA噬菌体Q-β、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、或乙型肝炎核心抗原(HBcAg)。
本文所用“微生物抗原”是微生物的抗原且包括但不限于，病毒、细菌、寄生虫及真菌。在某些实施方案中，细菌抗原与细菌金黄色葡萄球菌相关。在另外的实施方案中，细菌抗原与引起龋齿的细菌相关，例如变异链球菌、龋齿链球菌、血链球菌、嗜酸乳杆菌或粘液放线菌。在某些实施方案中，细菌抗原与引起牙周病的细菌相关，例如牙龈卟啉单胞菌或伴放线放线杆菌。在某些实施方案中，病毒抗原与呼吸道合胞病毒(RSV)、单纯疱疹病毒1(HSV1)、单纯疱疹病毒2(HSV2)或人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)或HIV-2相关。在某些实施方案中，寄生虫抗原与引起疟疾的寄生虫相关。
此类抗原包括完整的微生物以及其天然分离物及片段或衍生物，以及与天然微生物抗原相同或类似且可诱导对该微生物具有特异性的免疫应答的合成化合物。若化合物可诱导针对天然微生物抗原的免疫应答(体液和/或细胞)，则该化合物类似于该天然微生物抗原。此类抗原为本领域所常用且为本领域技术人员所熟知。
在本发明的某些方面，对象“暴露于”抗原中。本文所用术语“暴露于”是指使对象主动接触抗原的步骤或对象被动暴露于体内抗原。使对象主动暴露于抗原的方法为本领域所熟知。一般而言，通过任何方式将抗原直接施用给对象，例如静脉内、肌内、口服、经皮、粘膜、鼻内、气管内、或皮下施用。可局部或全身施用抗原。施用抗原及免疫刺激性寡核苷酸的方法在下文更详细的描述。若使抗原暴露于体内免疫细胞，则对象就会被动暴露于抗原中。例如，可通过使外来病原体进入体内来使对象被动暴露于抗原。
使对象被动暴露于抗原的方法可特别取决于施用免疫刺激性寡核苷酸的时机。例如，在具有发生传染病风险的对象中，可在风险最大时定期向该对象施用免疫刺激性寡核苷酸。此外，可在旅行者旅行至可使其具有暴露于传染原风险的外地之前向其施用免疫刺激性寡核苷酸。也可向具有暴露于生物战风险的士兵或市民施用免疫刺激性寡核苷酸，以在对象暴露于抗原时诱导针对抗原的全身或粘膜免疫应答。
已在人类中发现的病毒的例子包括但不限于：逆转录病毒科(Retroviridae)(例如人类免疫缺陷病毒，如HIV-1(亦称作HTLV-III、LAV或HTLV-III/LAV或HIV-III；及其他分离物，例如HIV-LP)；细小RNA病毒科(Picornaviridae)(例如脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒；肠道病毒、人类柯萨奇病毒(Coxsackie virus)、鼻病毒、埃克病毒(echovirus))；嵌杯病毒科(Caliciviridae)(例如引起胃肠炎的菌株)；披膜病毒科(Togaviridae)(例如马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(Flaviridae)(例如登革热病毒(dengue virus)、昏睡性脑炎病毒、黄热病毒)；冠状病毒科(Coronaviridae)(例如冠状病毒)；弹状病毒科(Rhabdoviridae)(例如水疱性口炎病毒、狂犬病病毒)；纤丝病毒科(Filoviridae)(例如埃博拉病毒(ebola viruses))；副粘液病毒科(Paramyxoviridae)(例如副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如流感病毒)；布尼亚病毒科(Bungaviridae)(例如汉坦病毒(Hantaan virus)、布尼亚病毒(bunya virus)、白蛉病毒(phlebovirus)及内罗毕病毒(Nairo virus))；沙粒病毒科(Arenaviridae)(出血热病毒)；呼肠病毒科(Reoviridae)(例如呼肠孤病毒、环状病毒(orbiviurs)及轮状病毒)；双RNA病毒科(Birnaviridae)；嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)(乙型肝炎病毒)；细小病毒科(Parvoviridae)(细小病毒)；乳多瘤病毒科(Papovaviridae)(乳头状瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(Adenoviridae)(大多数腺病毒)；疱疹病毒科(Herpesviridae)(单纯疱疹病毒(HSV)1及2、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、疱疹病毒)；痘病毒科(Poxviridae)(天花病毒、痘苗病毒、痘病毒)；及虹膜病毒科(Iridoviridae)(例如非洲猪瘟病毒)；及未分类病毒(例如海绵状脑病的病原体、δ肝炎的病原体(认为是乙型肝炎病毒的缺陷型卫星体)、非甲非乙型肝炎病原体(1类＝内部传播；2类＝肠胃外传播(即丙型肝炎)；诺瓦克病毒(Norwalk)及相关病毒、及星状病毒)。在某些实施方案中，病毒是呼吸道合胞病毒(RSV)、单纯疱疹病毒1(HSV1)、单纯疱疹病毒2(HSV2)、人类免疫缺陷病毒-1(HIV1)或HIV2。
尽管本文所述多种微生物抗原涉及人类病症，但本发明亦可用于治疗其他非人脊椎动物。非人脊椎动物也能发生感染，其可用本文所公开的免疫刺激性核酸来预防或治疗。例如，除传染性人类疾病的治疗外，本发明的方法可用于治疗动物感染。
在脊椎动物中使用革兰氏阴性及革兰氏阳性细菌作为抗原。这些革兰氏阳性细菌包括但不限于，巴斯德菌属(Pasteurella)物种、葡萄球菌属(Staphylococci)物种，及链球菌属(Streptococcus)物种。革兰氏阴性细菌包括但不限于，大肠杆菌(Escherichia coli)、假单胞菌属(Pseudomonas)物种、及沙门菌属(Salmonella)物种。传染性细菌的具体例子包括但不限于，幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、伯氏疏螺旋体(Borelia burgdorferi)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)、分支杆菌(Mycobacteria)物种(例如结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、鸟分支杆菌(M.avium)、胞内分支杆菌(M.intracellulare)、堪萨斯分支杆菌(M.kansaii)、戈登分支杆菌(M.gordonae))、金黄色葡萄球菌、淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(A组链球菌)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)(B组链球菌)、链球菌(草绿色链球菌(viridans)组)、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、链球菌(厌氧物种)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、病原性弯曲杆菌属(Campylobacter)物种、肠杆菌属(Enterococcus)物种、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、白喉棒杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)、棒杆菌属(Corynebacterium)物种、红斑丹毒丝菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、多杀巴斯德菌(Pasturella multocida)、拟杆菌属(Bacteroides)物种、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、念珠状链杆菌(Streptobacillus moniliformis)、苍白密螺旋体(Treponema pallidium)、细弱密螺旋体(Treponema pertenue)、钩端螺旋体属(Leptospira)、立克次体属(Rickettsia)、及伊斯雷尔放线菌(Actinomyces israeli)。在某些实施方案中，细菌是引起龋齿的细菌，例如变异链球菌、龋齿链球菌、血链球菌、嗜酸乳杆菌、或粘液放线菌。在其他实施方案中，细菌是引起牙周病的细菌，例如牙龈卟啉单胞菌或伴放线放线杆菌。
细菌病原体多肽包括但不限于，引起疖病的杀鲑气单胞菌(Aeromonissalmonicida)的铁调外膜蛋白(IROMP)、外膜蛋白(OMP)、及A-蛋白；引起细菌性肾病(BKD)的鲑鱼肾菌(Renibacterium salmoninarum)的p57蛋白；耶尔森氏菌(Yersiniosis)的主要表面相关抗原(msa)、表面表达细胞毒素(mpr)、表面表达溶血素(ish)、及鞭毛抗原；巴斯德菌的细胞外蛋白(ECP)、IROMP、及结构蛋白；鳗弧菌(Vibrosis anguillarum)及病海弧菌(V.ordalii)的OMP及鞭毛蛋白；鲶鱼爱德华菌(Edwardsiellosis ictaluri)及缓慢爱德华菌(E.tarda)的鞭毛蛋白、OMP蛋白、aroA及purA；及小瓜虫属(Ichthyophthirius)的表面抗原；及柱状嗜纤维菌(Cytophaga columnari)的结构及调节蛋白；及立克次体属的结构及调节蛋白。
真菌的例子包括新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、白色念珠菌(Candida albicans)。其他传染性生物体(即原生生物)包括疟原虫属(Plasmodium spp.)，例如恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)、卵形疟原虫(Plasmodium ovale)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)及鼠弓形虫(Toxoplasma gondii)。血源性和/或组织寄生虫包括疟原虫属、果氏巴贝虫(Babesia microti)、分歧巴贝虫(Babesiadivergens)、热带利什曼原虫(Leishmania tropica)、利什曼原虫属(Leishmaniaspp.)、巴西利什曼原虫(Leishmania braziliensis)、杜氏利什曼原虫(Leishmaniadonovani)、冈比亚锥虫(Trypanosoma gambiense)及罗德西亚锥虫(Trypanosoma rhodesiense)(非洲昏睡病)、克鲁斯锥虫(Trypanosoma cruzi)(南美洲锥虫病(Chagas′disease))、及鼠弓形虫。在某些实施方案中，寄生虫与疟疾相关。其他医学相关微生物已在文献中有广泛描述，例如参见C.G.AThomas，Medical Microbiology，Bailliere Tindall，Great Britain 1983。
治疗非人脊椎动物的多种疫苗在Bennett，K.，Compendium of VeterinaryProducts，第3版，NorthAmerican Compendiums公司，1995中有描述。如上所述，抗原包括传染性微生物，例如病毒、寄生虫、细菌及真菌及其得自天然来源或以合成方式获得的片段。人类及非人脊椎动物的传染性病毒包括逆转录病毒、RNA病毒及DNA病毒。此逆转录病毒组包括简单逆转录病毒及复杂逆转录病毒二者。简单逆转录病毒包括B型逆转录病毒、C型逆转录病毒及D型逆转录病毒亚组。B型逆转录病毒的例子有小鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)。C型逆转录病毒包括C型A类(包括劳斯肉瘤病毒(Roussarcoma virus)(RSV)、禽白血病病毒(ALV)、及禽髓母细胞白血病病毒(AMV))及C型B类(包括猫白血病病毒(FeLV)、长臂猿白血病病毒(GALV)、脾坏死病毒(SNV)、网状内皮组织增殖病病毒(RV)及猿猴肉瘤病毒(SSV))亚组。D型逆转录病毒包括Mason-Pfizer猴病毒(MPMV)及猿猴逆转录病毒1型(SRV-1)。复杂逆转录病毒包括慢病毒、T-细胞白血病病毒及泡沫病毒亚组。慢病毒包括HIV-1，且还包括HIV-2、SIV、绵羊髓鞘脱落病毒(Visna virus)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、及马传染性贫血病毒(EIAV)。T-细胞白血病病毒包括HTLV-1、HTLV-II、猿猴T-细胞白血病病毒(STLV)、及牛白血病病毒(BLV)。泡沫病毒包括人类泡沫病毒(HFV)、猿猴泡沫病毒(SFV)及牛泡沫病毒(BFV)。
作为脊椎动物抗原的其他RNA病毒的例子包括但不限于，呼肠病毒科成员，包括正呼肠孤病毒属(Orthoreovirus)(哺乳动物及禽逆转录病毒二者的多种血清型)、环状病毒属(蓝舌病毒(Bluetongue virus)、尤比纳奇病毒(Eugenangee virus)、克麦罗沃病毒(Kemerovo virus)、非洲马瘟病毒、及科罗拉多壁虱热病毒(Colorado Tick Fever virus))、轮状病毒属(人类轮状病毒、内布拉斯加牛腹泻病毒(Nebraska calf diarrhea virus)、猿猴轮状病毒、牛或羊轮状病毒、禽轮状病毒)；细小RNA病毒科，包括肠道病毒属(脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒A及B、人肠道细胞病变孤儿(ECHO)病毒、甲型肝炎病毒、猿猴肠道病毒、鼠脑脊髓炎(ME)病毒、鼠脊髓灰质炎病毒、牛肠道病毒、猪肠道病毒、心病毒(Cardiovirus)属(脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus)(EMC)、门哥病毒(Mengovirus))、鼻病毒属(人鼻病毒，其包括至少113种亚型；其他鼻病毒)、口蹄疫病毒属(Apthovirus)(口蹄疫(FMDV))；嵌杯病毒科，包括猪水疱疹病毒(Vesicular exanthema of swinevirus)、圣米格尔海狮病毒(San Miguel sea lion virus)、猫小核糖核酸病毒(Feline picornavirus)及诺瓦克病毒；披膜病毒科，包括甲病毒属(Alphavirus)(东方马脑炎病毒、西门力克森林病毒(Semliki forest virus)、辛德比斯病毒(Sindbis virus)、切昆贡亚病毒(Chikungunya virus)、奥尼永尼永病毒(O′Nyong-Nyong virus)、罗斯河病毒(Ross river virus)、委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)、西方马脑炎病毒)、黄病毒属(Flavivirus)(蚊媒黄热病毒(Mosquito borne yellow fever virus)、登革热病毒、日本昏睡性脑炎病毒、圣路易斯昏睡性脑炎病毒、墨累河谷昏睡性脑炎病毒(Murray Valley encephalitis virus)、西尼罗病毒(West Nile virus)、库宁病毒(Kunjin virus)、中欧蜱媒病毒(Central European tick borne virus)、远东蜱媒病毒(Far Eastern rick borne virus)、科萨努尔森林病毒(Kyasanur forest virus)、路平III型病毒(Louping III virus)、波瓦森病毒(Powassan virus)、鄂木斯克出血热病毒(Omsk hemorrhagic fever virus))、风疹病毒属(Rubivirus)(风疹病毒)、瘟病毒属(Pestivirus)(粘膜病病毒、猪霍乱病毒(Hog cholera virus)、边缘病病毒(Border disease virus))；布尼亚病毒科，包括布尼亚病毒属(Bunyavirus)(布尼亚维拉病毒(Bunyamwera)及相关病毒、加利福尼亚脑炎(California encephalitis)类病毒)、白蛉病毒属(白蛉热西西里病毒(Sandflyfever Sicilian virus)、立夫特山谷热病毒(Riff Valley fever virus))、内罗毕病毒属(克里米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus)、内罗毕绵羊病病毒(Nairobi sheep disease virus))、及吴孔病毒属(Uukuvirus)(吴孔涅米病毒(Uukuniemi)及相关病毒)；正粘病毒科，包括流感病毒属(A型流感病毒、多种人类亚型)；猪流感病毒、及禽及马流感病毒；B型流感(多种人类亚型)、及C型流感(可能的独立属)；副粘液病毒科，包括副粘病毒属(Paramyxovirus)(1型副流感病毒、仙台病毒(Sendai virus)、血细胞吸附病毒(Hemadsorption virus)、2至5型副流感病毒、新城疫病毒(NewcastleDisease Virus)、腮腺炎病毒)、麻疹病毒属(Morbillivirus)(麻疹病毒、亚急性硬化性全脑炎病毒(subacute sclerosing panencephalitis virus)、温热病病毒(distemper virus)、牛瘟病毒(Rinderpest virus))、肺炎病毒属(Pneumovirus)(呼吸道合胞病毒(RSV)、牛呼吸道合胞病毒及肺炎病毒)；弹状病毒科，包括水疱病毒属(Vesiculovirus)(VSV)(水疱性口炎-印度病毒属(Chandipuravirus)、费兰杜-哈克公园病毒(Flanders-Hart Park virus))、狂犬病病毒属(Lyssavirus)(狂犬病病毒)、鱼弹状病毒、及两种可能的弹状病毒(马尔堡病毒(Marburg virus)及埃博拉病毒)；沙粒病毒科，包括淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(Lymphocytic choriomeningitis virus)(LCM)、塔卡里伯病毒(Tacaribevirus)复合体、及拉沙病毒(Lassa virus)；冠状病毒科，包括传染性支气管炎病毒(IBV)、肝炎病毒、人肠道日晷形病毒(Human enteric corona virus)、及猫传染性腹膜炎(猫冠状病毒)。
作为脊椎动物抗原的说明性DNA病毒包括但不限于，痘病毒科，包括正痘病毒属(Orthopoxvirus)(重型天花(Variola major)、类天花(Variola minor)、猴痘病毒(Monkey pox Vaccinia)、牛痘、水牛痘、兔痘、鼠痘)、兔病毒属(Leporipoxvirus)(粘液瘤(Myxoma)、纤维瘤(Fibroma))、禽痘病毒属(Avipoxvirus)(鸡痘、其他禽痘病毒)、山羊痘病毒属(Capripoxvirus)(绵羊痘、山羊痘)、猪痘病毒属(Suipoxvirus)(猪痘)、副痘病毒属(Parapoxvirus)(绵羊接触性脓疱皮炎病毒、假牛痘、小牛侵蚀性口炎病毒)；虹膜病毒科(非洲猪瘟病毒、蛙病毒2及3、鱼淋巴囊肿病毒)；疱疹病毒科，包括α-疱疹病毒(单纯疱疹1型及2型、水痘带状疱疹、马流产病毒(Equine abortion virus)、马疱疹病毒2及3、假狂犬病病毒、牛传染性角结膜炎病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、猫鼻气管炎病毒、禽传染性喉气管炎病毒)、β-疱疹病毒(人类巨细胞病毒、及猪及猴巨细胞病毒)；γ-疱疹病毒(爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barrvirus)(EBV)、马雷克病疱疹病毒(Marek′s disease virus)、松鼠猴疱疹病毒、蛛猴疱疹病毒、棉尾兔疱疹病毒、荷兰猪疱疹病毒、蛙肾瘤病毒(Lucke tumorvirus))；腺病毒科，包括哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)(人类A、B、C、D、E亚组及未分组病毒；猿猴腺病毒(至少23种血清型)、犬传染性肝炎、及牛、猪、绵羊、蛙及多种其他物种的腺病毒、禽腺病毒属(Aviadenovirus)(禽腺病毒)；及不可接种腺病毒；乳多瘤病毒科，包括乳头状瘤病毒属(人类乳头状瘤病毒、牛乳头状瘤病毒、肖普兔(Shope rabbit)乳头状瘤病毒、及其他物种的各种病原性乳头状瘤病毒)、多瘤病毒属(多瘤病毒、猿猴致空泡因子(SV-40)、兔致空泡因子(RKV)、K病毒、BK病毒、JC病毒、及其他灵长类多瘤病毒，例如亲淋巴乳头状瘤病毒(Lymphotrophic papilloma virus))；细小病毒科，包括腺病毒伴随病毒属(Adeno-associated virus)、细小病毒属(猫泛白细胞减少症病毒(Feline panleukopenia virus)、牛细小病毒、犬细小病毒、阿留申水貂病病毒(Aleutian mink disease virus)等)。此外，DNA病毒可包括不属于上述各科的病毒，例如库鲁病病毒(Kuru)及克雅氏病病毒(Creutzfeldt-Jacob disease virus)及慢性传染性神经病病毒(CHINA病毒)。
在实施方案中，本发明涉及诱导抗原特异性免疫应答的方法，其包含施用抗原及本发明的免疫刺激性寡核苷酸，其中在分泌IFN-γ、TNF-α和/或IL-2的抗原特异性CD4+ T-细胞群中至少40％、优选至少45％、更优选至少50％、更优选约53％的经诱导的抗原特异性CD4+ T-细胞分泌IFN-γ。在实施方案中，用多色流式细胞术来确定该分泌IFN-γ的抗原特异性CD4+T-细胞的比例。该确定的例子在本文的实施例1中公开(参见“抗原特异性多细胞因子分泌型T细胞群”的段落)。在实施方案中，以有效量施用抗原及免疫刺激性寡核苷酸以在对象中诱导抗原特异性免疫应答。在实施方案中，所述抗原为本文所公开的任意抗原。
在实施方案中，本发明涉及诱导抗原特异性免疫应答的方法，其包括施用抗原及本发明的免疫刺激性寡核苷酸，其中在分泌IFN-γ、TNF-α和/或IL-2的抗原特异性CD4+ T-细胞群中至少10％、优选至少15％、更优选至少20％、更优选约22％的经诱导抗原特异性CD4+ T-细胞是优选分泌IFN-γ及TNF-α二者的双细胞因子产生细胞。在实施方案中，用多色流式细胞术来确定该分泌IFN-γ及TNF-α二者的抗原特异性CD4+ T-细胞的比例。该测定的例子在本文献的实施例1中公开(参见“抗原特异性多细胞因子分泌型T细胞群”的段落)。在实施方案中，以有效量施用抗原及免疫刺激性寡核苷酸以在对象中诱导抗原特异性免疫应答。在实施方案中，所述抗原为本文所公开的任意抗原。
在实施方案中，本发明涉及诱导抗原特异性免疫应答的方法，其包括施用抗原及本发明的免疫刺激性寡核苷酸，其中在分泌IFN-γ、TNF-α和/或IL-2的抗原特异性CD8+ T-细胞群中至少30％、优选至少40％、更优选至少45％、更优选约47％的经诱导的抗原特异性CD8+ T-细胞是优选分泌IFN-γ及TNF-α二者的双细胞因子产生细胞。在实施方案中，用多色流式细胞术来确定该分泌IFN-γ及TNF-α二者的抗原特异性CD8+ T-细胞的比例。此确定的例子在本文的实施例1中公开(参见“抗原特异性多细胞因子分泌型T细胞群”的段落)。在实施方案中，以有效量施用抗原及免疫刺激性寡核苷酸以在对象中诱导抗原特异性免疫应答。在实施方案中，抗原为本文所公开的任意抗原。
在实施方案中，本发明涉及用于诱导针对抗原的免疫应答的本发明免疫刺激性寡核苷酸，其中在分泌IFN-γ、TNF-α和/或IL-2的抗原特异性CD4+ T-细胞群中至少40％、优选至少45％、更优选至少50％、更优选约53％的经诱导抗原特异性CD4+ T-细胞分泌IFN-γ。在实施方案中，用多色流式细胞术来确定该分泌IFN-γ的抗原特异性CD4+ T-细胞的比例。此确定的例子在本文的实施例1中公开(参见“抗原特异性多细胞因子分泌型T细胞群”的段落)。在实施方案中，抗原为本文所公开的任意抗原。
在实施方案中，本发明涉及用于诱导针对抗原的免疫应答的本发明免疫刺激性寡核苷酸，其中在分泌IFN-γ、TNF-α和/或IL-2的抗原特异性CD4+ T-细胞群中至少10％、优选至少15％、更优选至少20％、更优选约22％的经诱导抗原特异性CD4+ T-细胞是优选分泌IFN-γ及TNF-α二者的双细胞因子产生细胞。在实施方案中，用多色流式细胞术来确定该分泌IFN-γ及TNF-α二者的抗原特异性CD4+ T-细胞的比例。此确定的例子在本文的实施例1中公开(参见“抗原特异性多细胞因子分泌型T细胞群”的段落)。在实施方案中，抗原为本文所公开的任意抗原。
在实施方案中，本发明涉及用于诱导针对抗原的免疫应答的本发明免疫刺激性寡核苷酸，其中在分泌IFN-γ、TNF-α和/或IL-2的抗原特异性CD8+ T-细胞群中至少30％、优选至少40％、更优选至少45％、更优选约47％的经诱导抗原特异性CD8+ T-细胞为优选分泌IFN-γ及TNF-α二者的双细胞因子产生细胞。在实施方案中，用多色流式细胞术来确定所述分泌IFN-γ及TNF-α二者的抗原特异性CD4+ T-细胞的比例。此确定的例子在本文的实施例1中公开(参见“抗原特异性多细胞因子分泌型T细胞群”的段落)。在实施方案中，抗原为本文所公开的任意抗原。
在实施方案中，本发明涉及在疫苗中被用作佐剂的本发明免疫刺激性寡核苷酸，其中所述疫苗诱导针对抗原的免疫应答，且其中在分泌IFN-γ、TNF-α和/或IL-2的抗原特异性CD4+ T-细胞群中至少40％、优选至少45％、更优选至少50％、更优选约53％的经诱导抗原特异性CD4+ T-细胞分泌IFN-γ。在实施方案中，用多色流式细胞术来确定该分泌IFN-γ的抗原特异性CD4+ T-细胞的比例。此确定的例子在本文的实施例1中公开(参见“抗原特异性多细胞因子分泌型T细胞群”的段落)。在实施方案中，抗原为本文所公开的任意抗原。
在实施方案中，本发明涉及在疫苗中被用作佐剂的本发明免疫刺激性寡核苷酸，其中所述疫苗诱导针对抗原的免疫应答，且其中在分泌IFN-γ、TNF-α和/或IL-2的抗原特异性CD4+ T-细胞群中至少10％、优选至少15％、更优选至少20％、更优选约22％的经诱导抗原特异性CD4+ T-细胞为优选分泌IFN-γ及TNF-α二者的双细胞因子产生细胞。在实施方案中，用多色流式细胞术来确定该分泌IFN-γ及TNF-α二者的双细胞因子产生抗原特异性CD4+ T-细胞的比例。此确定的例子在本文的实施例1中公开(参见“抗原特异性多细胞因子分泌型T细胞群”的段落)。在实施方案中，抗原为本文所公开的任意抗原。
在实施方案中，本发明涉及在疫苗中被用作佐剂的本发明免疫刺激性寡核苷酸，其中所述疫苗诱导针对抗原的免疫应答，且其中在分泌IFN-γ、TNF-α和/或IL-2的抗原特异性CD8+ T-细胞群中至少30％、优选至少40％、更优选至少45％、更优选约47％的经诱导抗原特异性CD8+ T-细胞为优选分泌IFN-γ及TNF-α二者的双细胞因子产生细胞。在实施方案中，用多色流式细胞术来确定该分泌IFN-γ及TNF-α二者的双细胞因子产生抗原特异性CD8+ T-细胞的比例。此确定的例子在本文的实施例1中公开(参见“抗原特异性多细胞因子分泌型T细胞群”的段落)。在实施方案中，抗原为本文所公开的任意抗原。
在实施方案中，本发明涉及包含抗原及本发明免疫刺激性寡核苷酸的疫苗，其用于诱导针对该抗原的免疫应答，其中在分泌IFN-γ、TNF-α和/或IL-2的抗原特异性CD4+ T-细胞群中至少40％、优选至少45％、更优选至少50％、更优选约53％的经诱导抗原特异性CD4+ T-细胞分泌IFN-γ。在实施方案中，用多色流式细胞术来确定该分泌IFN-γ生物抗原特异性CD4+T-细胞生物比例。此确定的例子在本文实施例1中公开(参见“抗原特异性多细胞因子分泌型T细胞群”的段落)。在实施方案中，抗原为本文所公开的任意抗原。
在实施方案中，本发明涉及包含抗原及本发明免疫刺激性寡核苷酸的疫苗，其用于诱导针对该抗原的免疫应答，其中在分泌IFN-γ、TNF-α和/或IL-2的抗原特异性CD4+ T-细胞群中至少10％、优选至少15％、更优选至少20％、更优选约22％的经诱导抗原特异性CD4+ T-细胞为优选分泌IFN-γ及TNF-α二者的双细胞因子产生细胞。在实施方案中，用多色流式细胞术来确定该分泌IFN-γ及TNF-α二者的抗原特异性CD4+ T-细胞的比例。此确定的例子在本文的实施例1中公开(参见“抗原特异性多细胞因子分泌型T细胞群”的段落)。在实施方案中，抗原为本文所公开的任意抗原。
在实施方案中，本发明涉及包含抗原及本发明免疫刺激性寡核苷酸的疫苗，其用于诱导针对该抗原的免疫应答，其中在分泌IFN-γ、TNF-α和/或IL-2的抗原特异性CD8+ T-细胞群中至少30％、优选至少40％、更优选至少45％、更优选约47％的经诱导抗原特异性CD8+ T-细胞为优选分泌IFN-γ及TNF-α二者的双细胞因子产生细胞。在实施方案中，用多色流式细胞术来确定该分泌IFN-γ及TNF-α二者的抗原特异性CD8+ T-细胞的比例。此确定的例子在本文的实施例1中公开(参见“抗原特异性多细胞因子分泌型T细胞群”的段落)。在实施方案中，抗原为本文所公开的任意抗原。
表述核酸分子的“有效量”是指实现所期望的生物学效应所必需的量或足够的量。例如，含有至少一个未甲基化CpG的核酸治疗病症的有效量可以是消除微生物感染或肿瘤所必须的量。用作疫苗佐剂的有效量可为可用于加强对象针对疫苗的免疫应答的量。治疗传染病、与自身抗原相关病症或与成瘾性物质相关病症的“有效量”可以是可用于诱导抗原特异性免疫应答的量。任何具体应用的有效量均可根据诸如以下等因素而改变：所治疗疾病或病况、所施用的具体CpG免疫刺激性寡核苷酸、对象的尺寸或所述疾病或病况的严重程度。本领域技术人员无需过多实验即可凭经验确定具体寡核苷酸的有效量。
在本发明的各方面，疫苗可另外包括佐剂。在某些实施方案中，佐剂是非TLR9的Toll样受体(TLR)的激动剂。在某些实施方案中，TLR的激动剂是TLR3的激动剂(例如经稳定的聚I:C)、TLR4的激动剂(例如脂多糖(LPS)衍生物，例如MPL或GLA)、TLR5的激动剂(例如鞭毛蛋白)、TLR7的激动剂(例如咪唑并喹啉家族的小分子)或TLR8的激动剂(例如咪唑并喹啉家族的小分子)。在某些实施方案中，佐剂是铝盐(例如氢氧化铝)、免疫刺激性复合物(ISCOM)、水包油或油包水乳液、脂质体或递送系统(例如纳米颗粒或微粒)。
术语CpG免疫刺激性寡核苷酸的有效量是指实现所期望生物学效应所必需的量或足够的量。例如，与抗原一起施用的CpG免疫刺激性寡核苷酸诱导抗原特异性免疫应答的有效量是在暴露于抗原后为抗原诱导免疫应答所必需的量。结合本文所提供的教示，通过选择不同活性免疫刺激性寡核苷酸及权衡诸如效能、相对生物利用度、患者体重、不利副作用严重程度及优选施用模式等因素，可设计出不引起实质毒性但仍可有效治疗具体对象的有效预防性或治疗性治疗方案。任何具体应用的有效量均可根据诸如以下等因素而变化：所治疗疾病或病况、所施用的具体CpG免疫刺激性寡核苷酸、对象的尺寸或所述疾病或病况的严重程度。本领域技术人员无需过多实验根据本揭示内容即可凭经验确定具体CpG免疫刺激性寡核苷酸和/或抗原和/或其他治疗药剂的有效量。
本文所述化合物用于局部递送的对象剂量通常介于每次施用约0.1μg至50mg之间，其依据应用可每日给予、每周给予、或每月给予、及以介于其间的任何其他时间间隔来给予。更典型地局部剂量介于每次施用约10μg至10mg之间，且根据需要为约100μg至1mg，其中施用2-4次，每次间隔数日或数周。更典型地，免疫刺激剂剂量介于每次施用1μg至10mg之间，且最典型为10μg至1mg，其中每日或每周施用。本文所述化合物用于肠胃外递送以达到诱导抗原特异性免疫应答的目的(其中化合物是与抗原而非另一治疗药剂一起递送)的对象剂量典型为疫苗佐剂或免疫刺激剂施用的有效局部剂量的5至10,000倍，且更典型为10至1,000倍，且最典型为20至100倍。本文所述化合物用于肠胃外递送以例如诱导先天免疫应答、提高ADCC、诱导抗原特异性免疫应答(其中CpG免疫刺激性寡核苷酸是与其他治疗药剂组合施用或在专门的递送载剂(vehicle)中)的剂量通常介于每次施用约0.1μg至10mg之间，其依据应用可每日给予、每周给予、或每月给予、及以介于其间的任何其他时间间隔来给予。更典型地，用于这些目的的肠胃外剂量介于每次施用约10μg至5mg之间，且最典型地为约100μg至1mg，其中施用2-4次，每次间隔数日或数周。然而，在某些实施方案中，用于这些目的的肠胃外剂量可在上述常用剂量的5至10,000倍范围内。
对于本文所述的任何化合物而言，可首先根据动物模型来确定治疗有效量。治疗有效剂量也可根据已在人类中测试(例如已开始人类临床试验)的CpG寡核苷酸及已知可表现类似药理学活性的化合物(例如其他佐剂，例如LT及其他疫苗接种用抗原)的人类数据来确定。肠胃外施用可能需要较高剂量。所施加剂量可根据所施用化合物的相对生物利用度及效能来调节。根据上述方法及本领域熟知的其他方法调节剂量以达到最大效率已为本领域技术人员所熟知。
本发明的配制物是以药物可接受的溶液施用，这些溶液通常可含有药物可接受浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、相容载体、佐剂及任选存在的其他治疗性成份。
对于治疗中的用途，可通过将寡核苷酸递送至所期望的表面的任何模式来将有效量的CpG免疫刺激性寡核苷酸施用给对象。可通过任何本领域技术人员熟知的方式来进行本发明药物组合物的施用。优选施用途径包括但不限于，肠胃外(例如肌内、皮下、皮内、静脉内、膀胱内或腹膜内)、局部(例如皮肤(经皮)、粘膜)、口服、鼻内、阴道内、直肠内、经口、眼内或舌下。
可由本文所述的任意途径单独施用免疫刺激性寡核苷酸或将其与其他治疗药剂组合施用。在某些优选的实施方案中，施用是局部施用。局部施用可包括体表(topical)施用至粘膜表面，例如皮肤，如口腔及生殖器中的那些。
在期望以全身方式递送免疫刺激性寡核苷酸时，可将其配制以用于通过注射(例如，推注(bolus injection)或连续输注)而肠胃外施用。注射用配制物可以单位剂型存在，例如在添加有防腐剂的安瓿或多剂量容器中。组合物可采取于油性或水性载剂中的悬浮液、溶液或乳液的形式，且可含有诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂等配制剂。
肠胃外施用用药物组合物包括水溶性形式的免疫刺激性寡核苷酸的水溶液。另外，可将免疫刺激性寡核苷酸的悬浮液制备成适宜的油性注射悬浮液。适宜的亲脂溶剂或载剂包括脂肪油(例如芝麻油)或合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯或甘油三酯)或脂质体。水性注射悬浮液可含有能提高该悬浮液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，悬浮液还可含有适宜的稳定剂或可提高免疫刺激性寡核苷酸溶解性的试剂，从而使得能够制备高浓缩溶液。
在期望以全身方式递送免疫刺激性寡核苷酸时，可将其配制以用于通过注射(例如，推注或连续输注)而肠胃外施用。注射用配制物可以单位剂型存在，例如在添加有防腐剂的安瓿或多剂量容器中。组合物可采取于油性或水性载剂中的悬浮液、溶液或乳液的形式，且可含有诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂等配制剂。
可用惰性材料稀释治疗剂或增加其体积。此类稀释剂可包括碳水化合物，特别是甘露醇、α-乳糖、无水乳糖、纤维素、蔗糖、经修饰的葡聚糖和/或淀粉。还可使用某些无机盐作为填充剂，包括三磷酸钙、碳酸镁和/或氯化钠。某些市售稀释剂为Fast-Flo、Emdex、STA-Rx 1500、Emcompress及Avicell。
为辅助治疗剂溶解于水性环境中，可添加表面活性剂作为润湿剂。表面活性剂可包括阴离子型洗涤剂，例如月桂基硫酸钠、二辛基磺琥珀酸钠和/或二辛基磺酸钠。可使用阳离子型洗涤剂且其可包括苯扎氯铵(benzalkonium chloride)或苄索氯铵(benzethomium chloride)。配制物中可引入作为表面活性剂的可能的非离子洗涤剂列表为聚桂醇(lauromacrogol)400、聚烃氧(polyoxyl)40硬脂酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50及60、甘油单硬脂酸酯、聚山梨醇酯40、60、65和/或80、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素及羧甲基纤维素。这些表面活性剂可单独或以不同比例的混合物存在于免疫刺激性寡核苷酸的配制物中。
肠胃外施用用的药物配制物包括为水溶性形式的免疫刺激性寡核苷酸的水溶液。另外，可将免疫刺激性寡核苷酸的悬浮液制备成适宜的油性注射悬浮液。适宜的亲脂溶剂或载剂包括脂肪油(例如芝麻油)或合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯或甘油三酯)或脂质体。水性注射悬浮液可含有能提高该悬浮液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，悬浮液还可含有适宜的稳定剂或可提高免疫刺激性寡核苷酸溶解性的试剂，从而使得能够制备高浓缩溶液。
或者，免疫刺激性寡核苷酸可呈粉剂形式，以便在使用前用适宜的载剂(例如无菌无致热原水)来进行构成。
对于口服施用，所述化合物(即，CpG免疫刺激性寡核苷酸、抗原及其他治疗药剂)可由免疫刺激性寡核苷酸与本领域熟知的药物可接受载体组合而容易地配制。所述载体使得本发明的免疫刺激性寡核苷酸可被配制成要治疗对象口服摄取的锭剂、丸剂、糖衣锭(dragees)、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液及诸如此类。口服使用的药物制剂可以固体赋形剂获得，任选研磨所得的混合物，若需要，在添加适宜的助剂后，处理颗粒混合物以获得锭剂或糖衣锭核心。适宜的赋形剂特别为填充剂，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制剂，例如玉米淀粉、小麦淀粉、水稻淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯啶酮(PVP)。若需要，可添加崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯啶酮、琼脂、或海藻酸或其盐，例如海藻酸钠。任选地，口服配制物亦可在盐水或缓冲剂(即中和内部酸性条件的EDTA)中配制，或可以无任何载体而施用。
也涵盖在内的是上述药剂或配制物的口服剂型。可以化学方式修饰药剂或配制物以使该衍生物的口服递送有效。一般而言，所涵盖的化学修饰是将至少一个部分连接至药剂或配制物自身，其中该部分容许(a)抑制蛋白水解；及(b)自胃或肠吸收至血流中。还期望增加药剂或配制物的整体稳定性并延长在体内的循环时间。所述部分的例子包括：聚乙二醇、乙二醇与丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯啶酮及聚脯氨酸。Abucho-wski及Davis，1981，“Soluble Polymer-Enzyme Adducts”，Enzymes as Drugs，Hocenberg及RobertsEd.，Wiley-Interscience，New York，N.Y.，第367-383页；Newmark等人，1982，J.Appl.Biochem.4：185-189。其他可使用的聚合物是聚-1，3-二氧戊环及聚-1，3，6-三氧八环(poly-1，3，6-tioxocane)。如上所述，用于药物用途优选的是聚乙二醇部分。
也涵盖在内的是本发明药物组合物的鼻内递送。鼻内递送使得治疗性产品被施用至鼻后本发明药物组合物可直接流至血流中，产品不需在肺中沉积。鼻递送配制物包括具有葡聚糖或环葡聚糖的那些。
对于鼻内施用而言，可用的装置是附有定量剂量喷雾器的小硬瓶子。在一个实施方案中，通过将本发明的药物组合物抽入一定体积的室中来递送此定量的剂量，所述室孔隙的尺寸使得在压缩室内液体时可形成喷雾来雾化气溶胶配制物。压缩该室以施用本发明的药物组合物。在一个具体的实施方案中，所述室是活塞的配置。此类装置可在市场上购得。
或者，可使用具有孔隙或开口的塑料挤压瓶，其孔隙或开口的尺寸在挤压该瓶时可通过形成喷雾来雾化气溶胶配制物。开口通常在瓶子顶部，且顶部通常呈锥形以部分插入鼻道中，从而有效地施用气溶胶配制物。优选地，鼻吸入器可提供经计量的量的气溶胶配制物用于施用所测量剂量的药物。
对于经口施用，组合物可采取以常用方式配制的锭剂或菱形锭剂的形式。
还可在直肠或阴道组合物中配制所述化合物，例如栓剂或保留灌肠剂，其含有例如常用的栓剂基质，例如可可油或其他甘油酯。
除上述配制物外，还可将化合物配制为储存制剂。此类长效配制物可与适宜的聚合物或疏水材料(例如作为在可接受的油中的乳液)或离子交换树脂一起配制，或作为微溶性衍生物(例如微溶性盐)来配制。
药物组合物还可包含适宜的固相或凝胶相载体或赋形剂。所述载剂或赋形剂的例子包括但不限于，碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶、及聚合物(例如聚乙二醇)。
适宜的液体或固体药物制剂形式为例如吸入用水溶液或盐水溶液、经微囊封的、内螺旋状、涂布于微小金颗粒上、含于脂质体中、呈喷雾状、气溶胶、植入皮肤中的丸粒、或干燥后附着在尖锐物体上以刺入皮肤中的形式。药物组合物还包括颗粒、粉剂、锭剂、包衣锭剂、(微)胶囊、栓剂、糖浆、乳液、悬浮液、乳霜、滴剂或活性化合物缓释的制剂，其中通常如上所述使用制剂赋形剂及添加剂和/或助剂，例如崩解剂、粘合剂、包衣剂、溶胀剂、润滑剂、矫味剂、甜味剂或增溶剂。药物组合物适用于各种药物递送系统中。药物递送的简略综述参见Langer，Science 249：1527-1533，1990。
CpG免疫刺激性寡核苷酸及任选存在的其他治疗剂和/或抗原可以自身(纯净)的形式或以药物可接受的盐形式来施用。在用于药品中时，所述盐应为药物可接受的盐，但可方便地使用药物不可接受的盐来制备其药物可接受的盐。所述盐包括但不限于，由以下酸所制备的那些：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、对甲苯磺酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸、萘-2-磺酸、及苯磺酸。同样，可将所述盐制备为碱金属盐或碱土金属盐，例如羧酸基团的钠盐、钾盐或钙盐。
适宜的缓冲剂包括：乙酸及盐(1-2％w/v)；柠檬酸及盐(1-3％w/v)；硼酸及盐(0.5-2.5％w/v)；以及磷酸及盐(0.8-2％w/v)。适宜的防腐剂包括苯扎氯铵(0.003-0.03％w/v)；氯丁醇(0.3-0.9％w/v)；对羟基苯甲酸酯(0.01-0.25％w/v)及硫柳汞(thimerosal)(0.004-0.02％w/v)。
本发明的药物组合物含有有效量的CpG免疫刺激性寡核苷酸及任选存在的抗原和/或任选引入药物可接受的载体中的其他治疗药剂。术语药物可接受的载体意指一或多种适合施用于人类或其他脊椎动物的相容固体或液体填充剂、稀释剂或囊封物质。术语载体表示天然或合成的有机或无机成份，活性成份与其组合以有利于施用。药物组合物中的各组份也能以不存在实质上损害所期望的药物功效的交互作用方式与本发明的化合物掺合及彼此掺合。
通过以下实施例进一步阐述本发明，无论如何不应将其视为进一步的限制。本申请全文所引用的所有参考资料(包括参考文献、已授予专利、公开专利申请案及共同待审查的专利申请)的全部内容以全文引用的方式明确并入本文中。
实施例
实施例1：
在以肌内(IM)方式使用乙型肝炎表面抗原(HBsAg)或卵白蛋白(OVA)作为模型抗原实施免疫后，比较免疫刺激性寡核苷酸CPG 24555与寡核苷酸CPG 10103及CPG 7909提高小鼠抗原特异性免疫应答的能力。
方法及材料
所有ODN均从冻干的寡脱氧核苷酸(ODN)制备。简言之，使ODN溶于pH 8.0的无内毒素Tris-EDTA缓冲液中(OmniPur
Figure BPA00001387919100371
；EM Science，Gibbstown，NJ)并在无菌条件下在pH 7.2的无菌无内毒素磷酸盐缓冲盐水(PBS)(Sigma Chemical公司，St.Louis，MO)中稀释以防止微生物及内毒素污染。在4℃下储存原液待用。
从Charles River Canada(Quebec，Canada)购得雌性野生型BALB/c及C57Bl/6小鼠。在Taconic Farms饲养C57背景的TLR9缺陷型小鼠并将其转移至Coley动物保护中心以供研究。在Coley Pharmaceutical Group Canada的动物保护中心中于微隔离笼中饲养小鼠。所有研究均根据Coley Canada的动物保护委员会在实验动物保护评价认证协会(AAALAC International)及加拿大动物保护协会指导下实施。在研究开始时动物重约18-20g。
小鼠的免疫
乙型肝炎表面抗原(HBsAg)
在左胫骨前肌处以50μl的总体积单独用1μg的HBsAg或用1μgHBsAg与10μg CPG 24555、CPG 10103或CPG 7909的组合以肌内(IM)方式对BALB/c小鼠(n＝10/组)实施免疫；所述HBsAg为ad亚型(Cliniqa，4076)。在初次免疫后第2周，从颌下静脉用肝素作为抗凝血剂对动物抽血，并使用与初次免疫所用相同的疫苗配制物进行加强。在加强后第2周，通过心脏穿刺用肝素作为抗凝血剂对动物抽血，通过颈椎脱位实施无痛致死，并以无菌方式摘除脾以用于检测抗原特异性CTL活性、IFN-γ分泌(培养物上清)及多细胞因子(IFN-γ、TNF-α及IL-2)分泌型CD4与CD8 T细胞的免疫分析中。使用各抽血时间点的血浆来检测抗原特异性总IgG及IgG同种型IgG1及IgG2a。
鸡卵白蛋白(OVA)
在左胫骨前肌处以肌内(IM)方式及50μl的总体积单独用20μg的VII级OVA(Sigma，A7641)或用其与10μg CPG 24555、CPG 10103、CPG 7909或非CpG对照ODN 2137的组合对C57Bl/6野生型及TLR9缺陷型(C57Bl/6TLR9-/-)小鼠(n＝10/组)进行免疫。在初次免疫后第14天及第21天使用与初次免疫所用相同的疫苗配制物对动物进行加强。在最后一次加强免疫后第7天，通过心脏穿刺用肝素作为抗凝血剂对动物抽血，通过颈椎脱位实施无痛致死，并以无菌方式摘除脾以用于检测抗原特异性CTL活性、IFN-γ分泌(培养物上清)、四聚体阳性CD8T细胞及多细胞因子(IFN-γ、TNF-α及IL-2)分泌型CD4与CD8 T细胞的免疫分析中。使用血浆来检测抗原特异性总IgG及IgG同种型IgG1及IgG2c。
免疫测定
抗原特异性抗体效价的确定
通过终点稀释ELISA测定法来检测并定量对HBsAg(抗HBs)或卵白蛋白(抗OVA)具有特异性的抗体(总IgG、IgG1及IgG2a/c)，并对各动物的样品重复三次。终点效价定义为导致光吸收值(OD 450nm)为截断值0.05的未免疫血浆两倍的最高血浆稀释度。这些结果以各组几何平均效价(GMT)±SEM的形式报告。
CTL应答的评估
使用在最后一次免疫后第1周(对于OVA)或第2周(对于HBsAg)摘除的脾来分析抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。在补加有10％胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)、青霉素-链霉素溶液(终浓度分别为1000U/ml及1mg/ml；Invitrogen，Burlington，ON)、L-谷氨酰胺(终浓度为2mM；Invitrogen，Burlington，ON)及5×10-5M β-巯基乙醇(Invitrogen，Burlington，ON)的RPMI1640(Hyclone，Logan，UT)组织培养基中将脾匀浆为单细胞悬浮液。通过与表达HBsAg的经辐射的鼠类细胞系(P815/S)一起培养将在脾细胞悬浮液(3×106细胞/ml)中的HBsAg特异性淋巴细胞再刺激5天，并通过与表达OVA的经辐射的鼠类细胞系(EG.7)一起培养将在脾细胞悬浮液(3×106细胞/ml)中的OVA特异性淋巴细胞再刺激5天。在再刺激后，通过使用51Cr释放分析来确定淋巴细胞杀伤表达HBsAg或OVA的细胞的潜力。结果表示为在效应子与靶(E∶T)的不同比率下的特异性溶胞％。
脾细胞的抗原特异性IFN-γ分泌的评估
使用在最后一次免疫后第1周(对于OVA)或第2周(对于HBsAg)获得的脾细胞在抗原再刺激后来测量IFN-γ分泌。简言之，根据CTL分析在补加有2％正常小鼠血清(Cedarlane Laboratories，Ontario，Canada)、青霉素-链霉素溶液(终浓度分别为1000U/ml及1mg/ml；Invitrogen，Burlington，ON)、L-谷氨酰胺(终浓度为2mM；Invitrogen，Burlington，ON)及5×10-5M β-巯基乙醇(Invitrogen，Burlington，ON)的RPMI 1640(Hyclone，Logan，UT)组织培养基[完全RPMI 1640]中制备脾细胞悬浮液并将其调节至终浓度为5×106细胞/ml。将脾细胞悬浮液(100μl/孔)与在完全RPMI 1640中稀释至适宜浓度的100μl各种刺激剂(如适当的图例中所述)一起平铺于96孔U形底组织培养板上。使用伴刀豆球蛋白A(10μg/ml，Sigma)作为阳性对照并使用单独与培养基一起培养的细胞作为阴性对照。一式三份平铺各脾细胞样品并在增湿的5％CO2温育器中于37℃下温育72hr。在温育期结束时收集培养物上清并在-80℃下储存待测定。根据制造商说明书使用市售测定试剂盒(小鼠IFN-γOptEIA；BD Pharmingen，Mississauga，ON)来测定培养物上清中的IFN-γ水平。
OVA四聚体阳性CD8细胞群的定量
也使用如上所述获得的脾细胞悬浮液通过FACS来对OVA四聚体阳性CD8细胞群进行定量。将来自各脾的脾细胞(2×106)转移至含有500μl如下染色缓冲液的12×75mm试管中：含有1％胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)及0.1％迭氮化钠(Sigma)的DPBS。以1200rpm将细胞离心5分钟并移除上清。通过在4℃下将细胞与抗小鼠CD16/CD32(Fc阻断剂)(BD Pharmingen)一起温育10分钟来阻断Fc受体。用染色缓冲液洗涤细胞并在4℃下使用1类OVA特异性(SIINFEKL)四聚体(Beckman Coulter)染色20分钟。然后再次用染色缓冲液洗涤细胞并在4℃下用抗小鼠CD8a-FITC(BD Pharmingen)染色20分钟。用染色缓冲液洗涤细胞，使其重悬浮于500μl染色缓冲液中并使用FC500流式细胞计(Beckman coulter)来进行测定。经鉴定OVA特异性CD8 T细胞为针对CD8a以及四聚体二者的阳性细胞。将数据表示为CD8及四聚体阳性细胞的％。
抗原特异性多细胞因子分泌型T细胞群的定量
在24孔组织培养板上补加有2％正常小鼠血清(Cedarlane Laboratories，Ontario，Canada)、青霉素-链霉素溶液(终浓度分别为1000U/ml及1mg/ml；Invitrogen，Burlington，ON)、L-谷氨酰氨(终浓度为2mM；Invitrogen，Burlington，ON)及5×10-5M β-巯基乙醇(Invitrogen，Burlington，ON)的RPMI1640(Hyclone，Logan，UT)组织培养基中对各组汇集的脾细胞悬浮液进行再刺激。
对于CD4再刺激：在含有5μg/ml HBsAg的1ml终体积中将5×106细胞刺激过夜。
对于CD8再刺激：在含有5μg/ml HBs肽(IPQSLDSWWTSL)的1ml终体积中将5×106细胞刺激5小时。
使用不含刺激剂的培养基作为阴性对照，并使用10ng/ml PMA(Sigma)及1μg/ml离子霉素(Sigma)(在培养最后4小时期间添加)作为阳性对照。此外，在再刺激最后4小时期间，添加Brefelden A(BD Pharmingen)及莫能星(monensin)(BD Pharmingen)以使蛋白质运输停止。
在再刺激后，用染色缓冲液洗涤细胞并通过在4℃下将细胞与抗小鼠CD16/CD32(Fc阻断剂)(BD Pharmingen)一起温育10分钟来阻断Fc受体。然后将细胞离心并使其再悬浮于含有5μg/ml抗小鼠CD4-ECD(Invitrogen)或抗小鼠CD8-ECD(Invitrogen)的染色缓冲液中并在4℃下温育30分钟。用染色缓冲液洗涤细胞并使其重悬浮于BD Fix/Perm溶液(BD Pharmingen)中并在4℃下保持20分钟。再次用BD Perm洗涤溶液(BD Pharmingen)洗涤细胞并使其重悬浮于含有5μg/ml IL-2-FITC(BD Pharmingen)、TNF-APC(BD Pharmingen)及IFN-γ-PeCy7(BD Pharmingen)的1x BD Perm洗涤溶液(BD Pharmingen)中，并在室温及避光条件下温育20分钟。用1X BD Perm洗涤溶液(BD Pharmingen)洗涤细胞并使其重悬浮于正常染色缓冲液中并使用FC500流式细胞计(Beckman Coulter)进行测定。
结果
体液免疫应答
所测试的所有三种CpG ODN(CPG 24555、10103及7909)均显著增强野生型小鼠中的HBsAg及OVA特异性总IgG效价(P＜0.05)。三种CpG ODN在其提高小鼠中HBsAg或OVA特异性总IgG的能力方面无显著差异(图1)。
使用OVA来测试CPG 24555、CPG 10103及CPG 7909在TLR9缺陷型动物中提高抗体效价的能力。在以任意疫苗接种方案进行加强后第1周所检测总抗体效价小于100，且与单独使用疫苗或使用疫苗与非CpG ODN2137的组合(数据未显示)时相比，各种CpG ODN均不能显著提高针对OVA的抗体效价。
在小鼠中，广泛使用IgG同种型分布作为免疫应答性质的指示物，其中高IgG2a或IgG2c含量表示Th1型免疫应答，而高IgG1效价表示Th2型免疫应答。所有三种CpG ODN均有助于诱导强Th1型免疫应答，该免疫应答中IgG2a/IgG1及IgG2c/IgG1的比率＞1(图1)且IgG2a/c效价相对于单独使用抗原时(图2)显著提高(P＜0.05)。
细胞免疫应答：CTL应答
测量基于Th1的应答的功能性方式是测量针对抗原呈递靶细胞的CTL活性。如图3中所示，相对于单独或与非CPG ODN 2137组合使用的抗原，所测试的所有CpG ODN均能显著增强小鼠中针对OVA的抗原特异性CTL应答(P＜0.05；图3右图)。除在6.25∶1 E∶T比率下，所测试的CpG ODN在促进OVA特异性CTL诱导方面无显著差异，其中CPG 24555及CPG 7909二组均显示显著高于接受CPG 10103的组的OVA特异性CTL。
对于HBsAg，CPG 24555及10103二者而不是CPG 7909能诱导显著高于单独使用抗原时的抗原特异性CTL应答。(P＜0.05；图3左图)。CPG24555与CPG 10103在其促进小鼠中的HBsAg特异性CTL应答诱导方面无显著差异。
在TLR9缺陷型小鼠中未观察到CpG ODN介导的CTL应答的提高(图4)。
抗原特异性CD8 T细胞
使用MHC I类H-2Kb-SIINFEKL特异性四聚体来对经OVA免疫的小鼠中的CD8 T细胞应答进行定量。与单独或与非CpG对照ODN 2137组合使用OVA时相比，所测试的所有CpG ODN均增强抗原特异性CD8 T细胞(图5)。CPG 7909在促进OVA特异性CD8 T细胞诱导方面优于CPG 24555及10103(P＜0.05)。CPG 24555与10103在其诱导OVA特异性CD8 T细胞的能力方面无显著差异(P＞0.05)。
在TLR9缺陷型小鼠中未观察到CpG介导的OVA特异性CD8 T细胞的提高(图5)。
抗原特异性IFN-γ分泌
通过使用酶免疫测定来检测在经接种抗原再刺激的脾细胞培养物上清中的细胞因子以研究由于抗原刺激而产生的干扰素γ(IFN-γ)作为细胞免疫的量度。从使用CPG 24555或CPG 10103经HBsAg或OVA免疫的动物收集的脾细胞培养物上清显示显著高于单独经抗原免疫者的IFN-γ水平。在与HBsAg一起使用时，CPG 24555在促进抗原特异性IFN-γ分泌方面显著优于CPG 10103或CPG 7909(图6；左图)。在与OVA一起使用时，CPG 24555在促进抗原特异性IFN-γ分泌方面等同于CPG 10103但优于CPG 7909(图6；右图)。
在TLR9缺陷型动物中未观察到CpG ODN介导的抗原特异性IFN-γ分泌的提高(图7)。
抗原特异性多细胞因子分泌型T细胞群
根据最近的发现，T细胞单独产生的IFN-γ不能预示抗原特异性T细胞诱导保护性免疫应答的能力。因此，在此研究中使用多色流式细胞术来评估抗原特异性CD4及CD8 T细胞产生IL-2、TNF-α及IFN-γ的能力。
对于CD4及CD8 T细胞二者，与IFN-γ及TNF-α分泌相比所观察到的IL-2分泌量相对较低(图8)。对于CD4 T细胞，CPG 24555有助于诱导相对于CPG 10103及7909较高百分比的双细胞因子分泌型T细胞(使用CPG24555时为23％，而使用CPG 10103及7909时分别为4％及6％)。总之，观察到极低百分比的三细胞因子产生型HBsAg特异性CD4 T细胞(使用CPG 24555、10103及7909时分别为2％、0％及1％)(图8A)。
对于CD8 T细胞，CPG 24555及CPG 7909二者有助于诱导含量高于CPG 10103的双细胞因子分泌型T细胞(使用CPG 24555及CPG 7909时分别为48％及56％，而使用CPG 10103时仅为19％)。与CD4细胞类似，观察到极低百分比的三细胞因子产生型HBsAg特异性CD8+ T细胞(使用CPG24555、10103及7909时分别为1％、0％及0％)(图8B)。
表1：作为分泌IFN-γ和/或IL-2和/或TNF-α的单、双及三细胞因子产生型细胞的HBsAg特异性CD4+ T细胞的百分比
  CD4+T细胞   仅Ag   Ag+CpG 24555   Ag+CpG 10103
  IFN-γ*   69％   53％   36％
  TNF-α*   41％   65％   62％
  IL-2*   15％   9％   6％
  IFN-γ/IL-2#   7％   2％   0％
  IFN-γ/TNF-α#   10％   22％   2％
  TNF-α/IL-2#   8％   5％   2％
  IFN-γ/IL-2/TNF-α   0％   2％   0％
  单细胞因子产生细胞的％   75％   75％   96％
  产生至少两种细胞因子的％   25％   25％   4％
*表示产生这些细胞因子的细胞的总比例，不论其为单、双还是三细胞因子产生型细胞
#表示产生该两种细胞因子的细胞的总比例，不论其为双亦或三细胞因子产生型细胞
表2：作为分泌IFN-γ和/或IL-2和/或TNF-α的单、双或三细胞因子产生型细胞的HBsAg特异性CD8+ T细胞的百分比
  CD8+T细胞   仅Ag   Ag+CpG 24555   Ag+CpG 10103
  IFN-γ*   63％   67％   76％
  TNF-α*   42％   76％   37％
  IL-2*   10％   7％   6％
  IFN-γ/IL-2#   5％   2％   0％
  IFN-γ/TNF-α#   10％   47％   18％
  TNF-α/IL-2#   2％   2％   1％
  IFN-γ/IL-2/TNF-α   2％   1％   0％
  单细胞因子产生型细胞的％   87％   51％   81％
  产生至少两种细胞因子的％   13％   49％   19％
*表示产生该等细胞因子的细胞的总比例，不论其为单、双还是三细胞因子产生型细胞
#表示产生该两种细胞因子的细胞的总比例，不论其为双还是三细胞因子产生型细胞
讨论
将研究设计为比较CPG 24555与CPG 10103及CPG 7909在与2种模型抗原(HBsAg及OVA)一起使用时提高小鼠抗原特异性免疫应答的能力。CPG24555及CPG 10103具有相同的核苷酸序列，但CPG 24555中最靠近3′的CG二核苷酸发生反转，从而导致CPG 24555中的CpG基序消失。CPG 7909是B类CpG ODN，其辅助活性已在用多种疫苗抗原进行的人类临床实验中得到证实。
CPG 24555中3′CpG基序的消失对其提高抗原特异性免疫应答的能力无任何负面影响，且与CPG 10103相比显示相等(抗体应答及抗原特异性CD8 T细胞，如通过四聚体染色所测量的)或更佳(抗原特异性IFN-γ分泌)的适应性免疫应答的提高。类似地，CPG 24555在提高抗原特异性抗体应答以及CTL应答方面等同于CPG 7909。CPG 24555在促进抗原特异性IFN-g分泌方面优于CPG 7909。
使用所测试的所有三种CpG ODN达成的适应性免疫应答的提高具有TLR9依赖性，因为在TLR9缺陷型小鼠中未观察到适应性免疫应答的提高。
如表1中所示，使用CPG 24555可获得较高比例的产生IFN-γ的抗原特异性CD4+ T细胞。同样可获得较高比例的多功能抗原特异性CD4+ T细胞，其产生IFN-γ、TNF-α及IL-2中至少两种细胞因子(即IFN-γ及TNF-α二者、IFN-γ及IL-2二者、或TNF-α及IL-2二者，或者甚至分泌IFN-γ、TNF-α及IL-2生物三细胞因子产生型细胞)。
对于CD8+ T细胞(表2)，可获得较高比例的多功能抗原特异性CD8+ T细胞，其产生两种细胞因子，且具体而言产生IFN-γ及TNF-α、IFN-γ及IL-2二者。
总体而言，这些结果表明，在用作佐剂时，CPG 24555在产生多功能抗原特异性T细胞群方面优于CPG 10103。这可具有重要意义，因为普遍认为多功能T细胞尤其在产生趋化因子(例如IFN-γ、TNF-α及IL-2)方面优于分泌单一细胞因子的T细胞的效应子细胞。
实施例2：
CPG 24555与CPG 10103的比较
所测试ODN的核苷酸序列
CPG ODN 10103
5′T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T 3′(SEQ ID NO：2)
CPG ODN 24555
5′T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*G*C*T*T*T*T 3′(SEQ ID NO：1)
无CpG ODN 22881
5′T*G*C*T*G*C*T*T*T*T*T*G*G*C*T*G*C*T*T*T*T 3′(SEQ ID NO：4)
无CpG ODN 2137
5′T*G*C*T*G*C*T*T*T*T*G*T*G*C*T*T*T*T*G*T*G*C*T*T 3′(SEQ ID NO：5)
*表示硫代磷酸酯键(PS)
序列中的下划线部分代表CPG ODN 10103与CPG ODN 24555之间的差异。
人类的最佳CpG基序：GTCGTT
人类PBMC中的先天免疫
将人类PBMC(5×106/ml)与各种浓度的CPG 10103、CPG 24555或非CpG对照ODN 22881一起培养24或48h。收集细胞上清并使用市售ELISA试剂盒测定细胞因子/趋化因子的分泌(图9A及图9B)。
BALB/c小鼠中的体内先天免疫
以100μg的剂量水平向BALB/c小鼠(n＝5/组)皮下注射PBS(安慰剂对照)、CPG 24555、CPG 10103或非CpG对照ODN 2137。在注射后第3小时对动物抽血，并使用市售ELISA测定血浆中的IP-10(图10A)及IL-12(图10B)或IL-6(图10C)。所显示结果为各组平均值±平均值标准误差(NS＝不显著)。
BALB/c小鼠中的体内体液免疫
向BALB/c小鼠肌内注射HBsAg(1μg)以及CPG 2455、CPG 10103或非CpG对照ODN 2137(10μg)或单独注射HBsAg(1μg)。在第0天及第14天对小鼠进行注射。所显示结果为在加强后2周通过终点ELISA测量的HBsAg特异性总IgG效价(图11A)。
向C57bl/6小鼠肌内注射OVA(20μg)以及CPG ODN 2455、CPG 10103或非CpG对照ODN 2137(10μg)或单独注射OVA(20μg)。在第0天、第7天及第21天对小鼠进行注射。所显示结果为在最后一次加强后1周的OVA特异性总IgG效价(图11B)。
向BALB/c小鼠肌内注射来自Texas 1/77(H3N2)的流感A HA(1μg)±明矾(25μg Al3+)，以及10μg CPG ODN 2455、CPG 10103或非CpG对照ODN2137，或单独注射流感A HA(1μg)±明矾(25μg Al3+)。所显示结果为在免疫后不同时间通过终点ELISA测量的HA特异性总IgG的动力学(图11C)。
BALB/c小鼠中的T细胞应答
向BALB/c小鼠肌内注射HBsAg(1μg)以及CPG ODN 2455、CPG 10103或非CpG对照ODN 2137(10μg)或单独注射HBsAg(1μg)。在第0天及第14天对小鼠进行注射。所显示结果为在加强后2周通过51Cr释放测量的HBsAg特异性CTL(图12A)。
向C57bl/6小鼠肌内注射OVA(20μg)以及CPG ODN 2455、CPG 10103或非CpG对照ODN 2137(10μg)或单独注射OVA(20μg)。在第0天、第7天及第21天对小鼠进行注射。所显示结果为在最后一次加强后1周通过51Cr释放测量的OVA特异性CTL(图12B)。
向BALB/c小鼠肌内注射HBsAg(1μg)以及CPG ODN 2455、CPG 10103或非CpG对照ODN 2137(10μg)或单独注射HBsAg(1μg)。在第0天及第14天对小鼠进行注射。从最后一次加强后第2周将脾细胞与各抗原一起温育72小时并通过ELISA来测试培养上清中的IFN-γ(图13A)。
向C57bl/6小鼠肌内注射OVA(20μg)以及CPG ODN 2455、CPG 10103或非CpG对照ODN 2137(10μg)或单独注射OVA(20μg)。在第0天、第7天及第21天对小鼠进行注射。从最后一次加强后第1周将脾细胞与各抗原一起温育72小时并通过ELISA来测试培养上清中的IFN-γ(图13B)。
结果与讨论
CPG 10103及CPG 24555具有相同的核苷酸序列，但在CPG 10103中最靠近3′的CG二核苷酸反转为CPG 24555中的GC，从而导致CPG 24555中的CpG基序消失。根据此前的报道，在两侧序列、基序位置及间距相同时，CPG基序数量增加应该可以导致免疫刺激的增强。根据此前的知识，预计CPG 24555的免疫刺激性可能会低于CPG 10103且作为疫苗佐剂的有效性可能较低。然而，上述结果表明，CPG 24555的免疫刺激性潜力及佐剂活性类似于或大于CPG 10103。
实施例3
在BALB/C小鼠中比较作为疫苗佐剂的CPG 10103、CPG 24555及CPG7909与流感血凝素抗原(HA)
方法及材料
通过将来自Texas 1/77(H3N2)的流感A血凝素(HA)(1μg)±CpG或对照ODN(10mg)±明矾(25mg Al3+)以50μl总体积肌内(IM)注射至左胫骨前肌(TA)中来对雌性BALB/c小鼠(10/gp)进行免疫。在免疫后以不同时间间隔对小鼠抽血以评价HA特异性抗体应答。在免疫后第6周对每组中的一半动物实施无痛处死以评价细胞介导的免疫应答(CTL、HA特异性IFN-g分泌及T-细胞细胞因子分泌的流式细胞检测测定)。
表3
Figure BPA00001387919100461
Figure BPA00001387919100471
结果及讨论
在免疫后第6周的抗HA
在免疫后第6周测量抗HA的量。CPG 24555在提高HA特异性IgG方面优于CPG 10103及CPG 7909(图14)。
在免疫后第4周的血凝抑制(HLA)效价
使用血凝抑制分析(HLA)来评估抗体的功能性。在单独用作佐剂时，CPG 24555在提高HIA效价方面优于CPG 10103(p＝0.009)且等同于CPG7909(p＝0.1)(图15)。所测试的所有3种CpG ODN在与明矾组合使用时可同等程度地提高HIA效价。
HA特异性IFNγ分泌
测量所分泌IFNγ的浓度。在单独用作佐剂时，CPG 24555在提高HA特异性IFN-γ分泌(细胞介导免疫的标记)方面优于CPG 10103(图16)。在与明矾组合使用时，CPG 24555在提高HA特异性IFN-γ分泌方面优于CPG10103及CPG 7909(图16)。
实施例4
CPG 24555与CPG 7909作为针对乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的疫苗佐剂在食蟹猴中的比较
材料及方法
以肌内方式(在右四头肌0.6ml IM注射)用以下试剂对食蟹猴(3-5岁；2.5至5.5kg；n＝5/gp；但在HBsAg+IMX组中n＝4)进行免疫：
1)Engerix-B(儿科剂量；10mg HBsAg)
2)Engerix-B+CPG 7909(0.5mg)
3)Engerix-B+CPG 24555(0.5mg)
动物接受3次免疫；在第0周(初次免疫)、第4周(加强1)及第8周(加强2)。在初次免疫前、初次免疫后第4周(第4周)、加强1后第2周(第6周)、加强1后第4周(第8周)及加强2后第2周(第10周)对动物抽血。如下所述进行HBsAg特异性免疫测定：
1)抗体效价及亲和力
2)胞内细胞因子分泌(IL-2、IFN-γ、TNF-α)
3)多功能T细胞
4)ELISPOT分析：IL2、TNF-α、IFN-γ、穿孔蛋白(Perforin)
结果与讨论
体液应答
通过在疫苗接种前所检测较高程度的HBsAg特异性抗体效价可了解动物在此研究中预先暴露于乙型肝炎病毒的可能性。此外，通过血清学检测，所测试批次中一只动物对HBV呈阳性，此表明其可能暴露于HBV。然而，通过PCR来检测，此研究中所测试的所有动物均对HBV呈阴性。每次加强均使抗HBsAg效价有所提高。相对于单独使用Engerix-B，向Engerix-B添加CpG可提高HBsAg特异性抗体效价(图17)。此外，相对于单独使用Engerix-B，添加CpG可增强抗体亲和力(图18)。在提高抗体效价及亲和力二者方面CPG 24555等同于CPG 7909。
T细胞应答：CD4 T细胞的胞内细胞因子分泌
向Engerix-B添加CpG倾向于提高CD4 T细胞介导的IFN-γ及TNF-α而非IL-2分泌的频率(图19A、B及C)。总之，CPG 24555在诱导CD4介导细胞因子方面等同于或优于CPG 7909。
T细胞应答：多功能CD4 T细胞；定量分析
在第10周(加强2后第2周)测量分泌一种、两种或三种细胞因子的细胞的数量。CPG 24555在诱导分泌一种细胞因子的Engerix-B特异性CD4 T细胞方面等同于CPG 7909。总之，检测到相对低含量的三细胞因子产生型CD4 T细胞。然而，CPG 24555所诱导的三细胞因子产生型CD4 T细胞多于CPG 7909或单独使用Engerix-B(图20A)。此外，经Engerix-B+CPG 24555免疫的动物的三细胞因子产生型T细胞的比例高于经Engerix-B单独免疫或经Engerix-B+CPG 7909免疫的动物(图20B)。
T细胞应答：多功能CD4 T细胞；定性分析
测量分泌IL-2、IFN-γ及TNFα、或这些细胞因子组合的细胞的数量。CPG 24555在诱导多功能T细胞方面等同于或优于CPG 7909(图21A及图21B)。
T细胞应答：CD4 T细胞的多功能性
在加强2后第2周测量三细胞因子产生型CD4 T细胞的比例。使用CPG24555时所观察到的三细胞因子产生型CD4 T细胞的比例高于使用CPG7909时的比例。
结论
根据数据，CPG 24555中3′CpG基序的消失对其提高抗原特异性免疫应答的能力无任何负面影响，且其显示等同于或优于CPG 10103及CPG7909的适应性免疫应答的提高。在小鼠中使用多种抗原观察到的CPG24555的佐剂活性也可在非人灵长类中使用CPG 24555来达成，其相对于在食蟹猴中使用乙型肝炎表面抗原时CPG 7909的佐剂活性显示相等(体液免疫)或较优(Ag特异性多功能T细胞)的佐剂活性。
本领域技术人员仅使用常规实验即可确认或能确定本文所述本发明的具体实施方案具有许多等效形式。这些等效形式均要涵盖在下述权利要求的范围中。
Figure ISB00000688866400011
Figure ISB00000688866400021

Claims (30)

1.一种免疫刺激性寡核苷酸，其包含核苷酸序列
5′TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT 3′(SEQ ID NO：1)。
2.权利要求1的免疫刺激性寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含一或多个经修饰的键。
3.权利要求2的免疫刺激性寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含一或多个硫代磷酸酯键。
4.权利要求1的免疫刺激性寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个亲脂性经取代的核苷酸类似物以及嘧啶-嘌呤二核苷酸。
5.一种疫苗，其包含
抗原以及含有核苷酸序列SEQ ID NO：1的免疫刺激性寡核苷酸，还包含药物可接受的载体。
6.权利要求5的疫苗，其中所述免疫刺激性寡核苷酸为诱导抗原特异性免疫应答的有效量。
7.权利要求6的疫苗，其中所诱导的抗原特异性免疫应答是Th1免疫应答。
8.权利要求5的疫苗，其中所述抗原是微生物抗原、自身抗原或成瘾性物质。
9.权利要求8的疫苗，其中所述微生物抗原是细菌抗原、病毒抗原或寄生虫抗原。
10.权利要求9的疫苗，其中
a)所述细菌抗原与金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、引起龋齿的细菌、或引起牙周病的细菌相关；
b)所述病毒抗原与呼吸道合胞病毒(RSV)、单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒2、人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)或HIV-2相关，或者
c)所述寄生虫抗原与引起疟疾的寄生虫相关。
11.权利要求10的疫苗，其中
a)所述引起龋齿的细菌是变异链球菌(Streptococcus mutans)、龋齿链球菌(Streptococcus sobrinus)、血链球菌(Streptococcus sanguis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilis)、或粘液放线菌(Actinomyces viscosus)；或者b)所述引起牙周病的细菌是牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)或伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)。
12.权利要求8的疫苗，其中所述自身抗原是肿瘤抗原、与阿尔茨海默病(Alzheimer′s Disease)有关的抗原、针对人抗体的抗原、从人内源性逆转录病毒元件表达的抗原、或者与载体缀合的尼古丁半抗原。
13.权利要求12的疫苗，其中
a)所述肿瘤抗原是HER2、MAGE、NY-ESO、PSA、CEA或EGFR的变体形式；
b)所述与阿尔茨海默病有关的抗原是τ-或β-淀粉状蛋白；
c)所述抗原是IgE；或者
d)与所述尼古丁半抗原缀合的载体是白喉毒素(DT)。
14.权利要求5的疫苗，其中所述抗原是肽、重组蛋白、纯化蛋白、全灭活病原体、活的减毒病毒或病毒载体、活的减毒细菌或细菌载体、多糖、半抗原、或由质粒DNA所编码的。
15.权利要求5的疫苗，其中所述抗原缀合至载体。
16.权利要求15的疫苗，其中所述载体是白喉毒素(DT)或病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒是RNA噬菌体Q-β、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、或乙型肝炎核心抗原(HBcAg)。
17.权利要求5的疫苗，其还包含一或多种佐剂。
18.权利要求17的疫苗，其中所述佐剂是非TLR9的Toll样受体(TLR)的激动剂。
19.权利要求18的疫苗，其中所述激动剂是TLR 3、TLR 4、TLR 5、TLR 7或TLR 8的激动剂。
20.权利要求19的疫苗，其中
a)所述TLR 3激动剂是经稳定的聚I:C；
b)所述TLR 4激动剂是脂多糖(LPS)衍生物；
c)所述TLR 5激动剂是鞭毛蛋白；或者
d)所述TLR 7或TLR 8激动剂是咪唑并喹啉家族的小分子。
21.权利要求20的疫苗，其中所述LPS衍生物是MPL或GLA。
22.权利要求17的疫苗，其中所述佐剂是铝盐、免疫刺激性复合物(ISCOM)、水包油或油包水乳液、脂质体或递送系统。
23.权利要求22的疫苗，其中
a)所述铝盐是氢氧化铝；或
b)所述递送系统是纳米颗粒或微粒。
24.权利要求5的疫苗，其中所述免疫刺激性寡核苷酸包含一或多个经修饰的键。
25.权利要求24的疫苗，其中
a)所述免疫刺激性寡核苷酸包含一或多个硫代磷酸酯键；或者
b)所述免疫刺激性寡核苷酸包含至少一个亲脂性经取代的核苷酸类似物及嘧啶-嘌呤二核苷酸。
26.权利要求5的疫苗，其中所述疫苗经配制用于施用。
27.权利要求5的疫苗，其中
a)所述疫苗经配制以通过肠胃外途径施用，其中所述肠胃外途径是肌内、皮下、皮内、静脉内或腹膜内；或者
b)所述疫苗经配制以通过体表途径施用，其中所述体表途径是皮肤、经皮或粘膜表面。
28.权利要求27的疫苗，其中所述粘膜途径是口服、鼻内、阴道内、直肠内、口内或眼内。
29.一种在有需要的对象中诱导抗原特异性免疫应答的方法，包括对对象施用抗原以及有效量的包含核苷酸序列SEQ ID NO：1的免疫刺激性寡核苷酸，以在所述对象中诱导抗原特异性免疫应答。
30.权利要求29的方法，其中所述抗原是微生物抗原、自身抗原或成瘾性物质。
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