JP5016733B2 - 免疫賦活性オリゴヌクレオチド - Google Patents

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Description

本発明は、免疫賦活性オリゴヌクレオチドと、免疫賦活性オリゴヌクレオチドを使用して、抗原特異的免疫応答を誘発する方法とに関する。
細菌ＤＮＡには、脊椎動物ＤＮＡにはない、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞を活性化する免疫賦活作用がある（Ｔｏｋｕｎａｇａ，Ｔ．ら、１９８８、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７９：６８２〜６８６；Ｔｏｋｕｎａｇａ，Ｔ．ら、１９８４、ＪＮＣＩ ７２：９５５〜９６２；Ｍｅｓｓｉｎａ，Ｊ．Ｐ．ら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：１７５９〜１７６４；ならびにＫｒｉｅｇ、１９９８による総説：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃ．Ａ．ＳｔｅｉｎおよびＡ．Ｍ．Ｋｒｉｅｇ（編）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、４３１〜４４８）。現在では、細菌ＤＮＡのこれらの免疫賦活作用は、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドが、特定の塩基構成（ＣｐＧモチーフ）中に存在する結果であることが理解されており、これらの塩基構成は、細菌ＤＮＡにおいては一般的であるが、脊椎動物ＤＮＡにおいてはメチル化されており、過小提示されている（Ｋｒｉｅｇら、１９９５ Ｎａｔｕｒｅ ３７４：５４６〜５４９；Ｋｒｉｅｇ、１９９９ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １４８９：１０７〜１１６）。細菌ＤＮＡのこうした免疫賦活作用を、これらのＣｐＧモチーフを含有する合成オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を用いて模倣することができる。そのようなＣｐＧ ＯＤＮには、ヒトおよびマウスの白血球に対する高い賦活作用があり、Ｂ細胞増殖；サイトカインおよび免疫グロブリンの分泌；ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の溶解活性およびＩＦＮ−．ガンマ．分泌；ならびに共刺激分子を発現させ、サイトカイン、とりわけ、Ｔｈ１様Ｔ細胞応答の発生を促すのに重要であるＴｈ１様サイトカインを分泌させるための、樹状細胞（ＤＣ）および他の抗原提示細胞の活性化を誘発する。このＣｐＧモチーフが、メチル化されている場合、ＧｐＣに変化している場合、またはそれ以外の排除もしくは変化を受けている場合には、これらの作用が劇的に低下することから、天然のリン酸ジエステル骨格のＣｐＧ ＯＤＮの、これらの免疫賦活作用は、非常にＣｐＧ特異的である（Ｋｒｉｅｇら、１９９５ Ｎａｔｕｒｅ ３７４：５４６〜５４９；Ｈａｒｔｍａｎｎら、１９９９ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：９３０５〜１０）。
ＣｐＧオリゴヌクレオチドの免疫賦活活性は、ＣｐＧモチーフの数、ＣＧジヌクレオチドに隣接する配列、（１つまたは複数の）ＣｐＧモチーフの場所、およびＣｐＧモチーフ間の間隔に依存することが以前に報告されている（Ｂａｌｌａｓら、１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７（５）：１８４０〜５；Ｈａｒｔｍａｎｎら、２０００、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６４（３）：１６１７〜２４；Ｋｌｉｎｍａｎら、２００３、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３（２）：２２７〜３２）。３’ＣｐＧモチーフが除去されているが驚くべきことに免疫賦活活性を保持する免疫賦活性オリゴヌクレオチドを本明細書では開示する。さらに、この免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよび抗原を含むワクチン、ならびにそのようなワクチンを使用する方法も開示する。
本発明の態様では、ヌクレオチド配列５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴ３’（配列番号１）を含む免疫賦活性オリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、この免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の改変された連結を含む。特定の実施形態では、この免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のホスホロチオエート連結を含む。特定の実施形態では、このオリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチド間連結が、ホスホロチオエート連結である。いくつかの実施形態では、この免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの親油性の置換されているヌクレオチド類似体、およびピリミジン−プリンジヌクレオチドを含む。
本発明の態様では、抗原と配列番号１のヌクレオチド配列を含む免疫賦活性オリゴヌクレオチドとを含み、薬学的に許容できる担体をさらに含むワクチンを提供する。いくつかの実施形態では、この免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、抗原特異的免疫応答を誘発するのに有効な量である。他の実施形態では、誘発される抗原特異的免疫応答は、Ｔｈ１免疫応答である。いくつかの実施形態では、この抗原は、微生物抗原、自己抗原または習慣性物質（ａｄｄｉｃｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）である。他の実施形態では、この細菌抗原は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）と関連があり、またはう歯を引き起こす細菌と関連がある。さらなる実施形態では、この細菌は、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）、ストレプトコッカス・サンギス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｓ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、またはアクチノミセス・ビスコーサス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓ）である。他の実施形態では、この細菌抗原は、歯周疾患を引き起こす細菌と関連がある。さらなる実施形態では、この細菌は、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、またはアクチノバチルス・アクチノミセタムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）である。いくつかの実施形態では、このウイルス抗原は、呼吸器多核体ウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）（ＲＳＶ）、単純ヘルペスウイルス１（Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ１）、単純ヘルペスウイルス２（Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ２）、ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ）−１（ＨＩＶ−１）またはＨＩＶ−２と関連がある。他の実施形態では、この寄生生物抗原は、マラリアを引き起こす寄生生物と関連がある。いくつかの実施形態では、この自己抗原は、腫瘍抗原、アルツハイマー病と関連がある抗原、ヒト抗体に対する抗原、またはヒト内因性レトロウイルスエレメントから発現される抗原である。さらなる実施形態では、この腫瘍抗原は、ＨＥＲ２、ＭＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ＰＳＡ、ＣＥＡ、またはＥＧＦＲの変異型である。他の実施形態では、この抗原は、アルツハイマー病と関連があり、そうした抗原は、タウまたはβ−アミロイドである。いくつかの実施形態では、この抗原はＩｇＥである。いくつかの実施形態では、この抗原は、担体にコンジュゲートさせたニコチンハプテンである。さらなる実施形態では、このニコチンハプテンをコンジュゲートさせた担体は、ジフテリア毒素（ＤＴ）である。他の実施形態では、この抗原は、ペプチド、組換えタンパク質、精製タンパク質、死滅させた全病原体、弱毒化生ウイルスもしくはウイルスベクター、弱毒化生細菌もしくは細菌ベクター、多糖、ハプテンであり、またはプラスミドＤＮＡによってコードされている。
いくつかの実施形態では、この抗原を、担体にコンジュゲートさせる。さらなる実施形態では、この担体は、ジフテリア毒素（ＤＴ）である。他の実施形態では、この担体は、ウイルス様粒子である。さらなる実施形態では、このウイルス様粒子は、ＲＮＡファージＱ−β、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、またはＢ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）である。いくつかの実施形態では、このワクチンは、１つまたは複数のアジュバントをさらに含む。さらなる実施形態では、このアジュバントは、ＴＬＲ９ではないＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）に対するアゴニストである。他の実施形態では、このアゴニストは、ＴＬＲ３に対するアゴニストである。さらなる実施形態では、このＴＬＲ３アゴニストは、安定化ポリＩ：Ｃである。いくつかの実施形態では、このアゴニストは、ＴＬＲ４に対するアゴニストである。さらなる実施形態では、このＴＬＲ４アゴニストは、リポ多糖（ＬＰＳ）の誘導体である。その上さらなる実施形態では、このＬＰＳ誘導体は、ＭＰＬまたはＧＬＡである。他の実施形態では、このアゴニストは、ＴＬＲ５に対するアゴニストである。さらなる実施形態では、このＴＬＲ５アゴニストは、フラジェリンである。いくつかの実施形態では、このアゴニストは、ＴＬＲ７またはＴＬＲ８に対するアゴニストである。さらなる実施形態では、このＴＬＲ７アゴニストまたはＴＬＲ８アゴニストは、低分子のイミダゾキノリンファミリーである。他の実施形態では、このアジュバントは、アルミニウム塩である。さらなる実施形態では、このアルミニウム塩は、水酸化アルミニウムである。いくつかの実施形態では、このアジュバントは、免疫賦活複合体（ＩＳＣＯＭ）である。他の実施形態では、このアジュバントは、水中油型または油中水型の乳剤である。いくつかの実施形態では、このアジュバントは、リポソームである。他の実施形態では、このアジュバントは、送達系である。さらなる実施形態では、この送達系は、ナノ粒子またはマイクロ粒子である。
いくつかの実施形態では、この免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の改変された連結を含む。さらなる実施形態では、この免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のホスホロチオエート連結を含む。特定の実施形態では、このオリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチド間連結が、ホスホロチオエート連結である。他の実施形態では、この免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの親油性の置換されているヌクレオチド類似体、およびピリミジン−プリンジヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、このワクチンは、投与のために製剤化される。さらなる実施形態では、このワクチンは、非経口経路を介する投与のために製剤化され、この非経口経路は、筋肉内、皮下、皮内、静脈内または腹腔内である。その上さらなる実施形態では、このワクチンは、外用経路を介する投与のために製剤化され、この外用経路は、皮膚、経皮または粘膜表面である。さらなる実施形態では、この粘膜経路は、経口、鼻腔内、膣内、直腸内、頬側内または眼内である。
本発明のいくつかの態様では、抗原特異的免疫応答を、それを必要とする対象において誘発する方法は、抗原と配列番号１のヌクレオチド配列を含む免疫賦活性オリゴヌクレオチドとを、前記対象において抗原特異的免疫応答を誘発するのに有効な量で対象に投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、この抗原は、微生物抗原、自己抗原または習慣性物質である。さらなる実施形態では、この微生物抗原は、細菌抗原、ウイルス抗原または寄生生物抗原である。他の実施形態では、この細菌抗原は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）と関連があり、またはう歯を引き起こす細菌と関連がある。さらなる実施形態では、この細菌は、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）、ストレプトコッカス・サンギス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｓ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、またはアクチノミセス・ビスコーサス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓ）である。他の実施形態では、この細菌抗原は、歯周疾患を引き起こす細菌と関連がある。さらなる実施形態では、この細菌は、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、またはアクチノバチルス・アクチノミセタムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）である。いくつかの実施形態では、このウイルス抗原は、呼吸器多核体ウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）（ＲＳＶ）、単純ヘルペスウイルス１（Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ１）、単純ヘルペスウイルス２（Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ２）、ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ）−１（ＨＩＶ−１）またはＨＩＶ−２と関連がある。他の実施形態では、この寄生生物抗原は、マラリアを引き起こす寄生生物と関連がある。いくつかの実施形態では、この自己抗原は、腫瘍抗原、アルツハイマー病と関連がある抗原、ヒト抗体に対する抗原、またはヒト内因性レトロウイルスエレメントから発現される抗原である。さらなる実施形態では、この腫瘍抗原は、ＨＥＲ２、ＭＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ＰＳＡ、ＣＥＡ、またはＥＧＦＲの変異型である。他の実施形態では、この抗原は、アルツハイマー病と関連があり、そうした抗原は、タウまたはβ−アミロイドである。いくつかの実施形態では、この抗原はＩｇＥである。いくつかの実施形態では、この抗原は、担体にコンジュゲートさせたニコチンハプテンである。さらなる実施形態では、このニコチンハプテンをコンジュゲートさせた担体は、ジフテリア毒素（ＤＴ）である。他の実施形態では、この抗原は、ペプチド、組換えタンパク質、精製タンパク質、死滅させた全病原体、弱毒化生ウイルスもしくはウイルスベクター、弱毒化生細菌もしくは細菌ベクター、多糖、ハプテンであるか、またはプラスミドＤＮＡによってコードされている。
いくつかの実施形態では、この抗原を、担体にコンジュゲートさせる。さらなる実施形態では、この担体は、ジフテリア毒素（ＤＴ）である。他の実施形態では、担体は、ウイルス様粒子である。さらなる実施形態では、このウイルス様粒子は、ＲＮＡファージＱ−β、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、またはＢ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）である。いくつかの実施形態では、このワクチンは、１つまたは複数のアジュバントをさらに含む。さらなる実施形態では、このアジュバントは、ＴＬＲ９ではないＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）に対するアゴニストである。他の実施形態では、このアゴニストは、ＴＬＲ３に対するアゴニストである。さらなる実施形態では、このＴＬＲ３アゴニストは、安定化ポリＩ：Ｃである。いくつかの実施形態では、このアゴニストは、ＴＬＲ４に対するアゴニストである。さらなる実施形態では、このＴＬＲ４アゴニストは、リポ多糖（ＬＰＳ）の誘導体である。その上さらなる実施形態では、このＬＰＳ誘導体は、ＭＰＬまたはＧＬＡである。他の実施形態では、このアゴニストは、ＴＬＲ５に対するアゴニストである。さらなる実施形態では、このＴＬＲ５アゴニストは、フラジェリンである。いくつかの実施形態では、このアゴニストは、ＴＬＲ７またはＴＬＲ８に対するアゴニストである。さらなる実施形態では、このＴＬＲ７アゴニストまたはＴＬＲ８アゴニストは、低分子のイミダゾキノリンファミリーである。他の実施形態では、このアジュバントは、アルミニウム塩である。さらなる実施形態では、このアルミニウム塩は、水酸化アルミニウムである。いくつかの実施形態では、このアジュバントは、免疫賦活複合体（ＩＳＣＯＭ）である。他の実施形態では、このアジュバントは、水中油型または油中水型の乳剤である。いくつかの実施形態では、このアジュバントは、リポソームである。他の実施形態では、このアジュバントは、送達系である。さらなる実施形態では、この送達系は、ナノ粒子またはマイクロ粒子である。
いくつかの実施形態では、この免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の改変された連結を含む。さらなる実施形態では、この免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のホスホロチオエート連結を含む。特定の実施形態では、このオリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチド間連結が、ホスホロチオエート連結である。他の実施形態では、この免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの親油性の置換されているヌクレオチド類似体、およびピリミジン−プリンジヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、この抗原および／または免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、投与のために製剤化される。さらなる実施形態では、この抗原および／または免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、非経口経路を介する投与のために製剤化され、この非経口経路は、筋肉内、皮下、皮内、静脈内または腹腔内である。その上さらなる実施形態では、この抗原および／または免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、外用経路を介する投与のために製剤化され、この外用経路は、皮膚、経皮または粘膜表面である。さらなる実施形態では、この粘膜経路は、経口、鼻腔内、膣内、直腸内、頬側内または眼内である。いくつかの実施形態では、この抗原およびこの免疫賦活性オリゴヌクレオチドを、同じ、類似のまたは異なる経路を介して投与する。他の実施形態では、この抗原およびこの免疫賦活性オリゴヌクレオチドを、併せて、同時にまたは別個に投与する。さらなる実施形態では、この抗原およびこの免疫賦活性オリゴヌクレオチドを相互に２４時間以内に投与する。いくつかの実施形態では、この対象は、獣医用薬によって治療される種である。他の実施形態では、この対象は、非げっ歯類対象である。いくつかの実施形態では、この対象はヒトである。
マウスにおける、液性免疫応答の増大を示すグラフである。成体（６〜８週齢；ｎ＝１０／ｇｐ）マウスを、１μｇのＨＢｓＡｇ（左パネル）または２０μｇのＯＶＡ（右パネル）を用いて、アジュバントなしで、あるいはＣＰＧ２４５５５、ＣＰＧ１０１０３もしくはＣＰＧ７９０９（１０μｇ）または非ＣｐＧ対照ＯＤＮ２１３７（１０μｇ；ＯＶＡの場合のみ）と組み合わせて免疫化した。最後の追加免疫の２週間後（ＨＢｓＡｇの場合）または１週間後（ＯＶＡの場合）に得られた血漿を、抗原に特異的な全ＩｇＧレベル、ＩｇＧ１レベルおよびＩｇＧ２ａ／ｃレベル（抗ＨＢｓまたは抗ＯＶＡ）について、アッセイした。各バーは、全ＩｇＧについての幾何平均（±ＳＥＭ）力価を示す。力価を、カットオフ値を０．０５とし、非免疫血漿の吸光度値の２倍の吸光度値を生じる最も高い希釈度と定義した。各バーの上の数字は、抗原に特異的なＩｇＧ２ａ（または２ｃ）／ＩｇＧ１の比を示す。 マウスにおいて誘発した液性免疫応答性を示すグラフである。成体（６〜８週齢；ｎ＝１０／ｇｐ）マウスを、１μｇのＨＢｓＡｇ（左パネル）または２０μｇのＯＶＡ（右パネル）を用いて、アジュバントなしで、あるいはＣＰＧ２４５５５、ＣＰＧ１０１０３もしくはＣＰＧ７９０９（１０μｇ）または非ＣｐＧ対照ＯＤＮ２１３７（１０μｇ；ＯＶＡの場合のみ）と組み合わせて免疫化した。最後の追加免疫の２週間後（ＨＢｓＡｇの場合）または１週間後（ＯＶＡの場合）に得られた血漿を、ＨＢｓＡｇ（抗ＨＢｓ）またはＯＶＡ（抗ＯＶＡ）に対するＩｇＧ１レベル（透明のバー）およびＩｇＧ２ａレベルまたはＩｇＧ２ｃレベル（黒色のバー）についてアッセイした。各バーは、群（ｎ＝１０）全体についてのＥＬＩＳＡエンドポイントの希釈度の力価の幾何平均（±ＳＥＭ）を示す。力価を、カットオフ値を０．０５とし、非免疫血漿の吸光度値の２倍の吸光度値を生じる最も高い希釈度と定義した。 マウスにおいて誘発した細胞傷害性Ｔリンパ球応答を示すグラフである。成体（６〜８週齢；ｎ＝５／ｇｐ）マウスを、１μｇのＨＢｓＡｇ（左パネル）または２０μｇのＯＶＡ（右パネル）を用いて、アジュバントなしで、あるいはＣＰＧ２４５５５、ＣＰＧ１０１０３もしくはＣＰＧ７９０９（１０μｇ）または非ＣｐＧ対照ＯＤＮ２１３７（１０μｇ；ＯＶＡの場合のみ）と組み合わせて免疫化した。最後の追加免疫の２週間後（ＨＢｓＡｇの場合）または１週間後（ＯＶＡの場合）に得られた脾細胞を、抗原特異的ＣＴＬ応答について、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイを使用してアッセイした。 ＴＬＲ９欠損マウスにおける、非ＣｐＧ媒介型のＣＴＬ応答の増大を示すグラフである。ＴＬＲ９欠損成体（６〜８週齢；ｎ＝５ｇｐ）マウスを、２０μｇのＯＶＡを用いて、アジュバントなしで、あるいはＣＰＧ２４５５５、ＣＰＧ１０１０３もしくはＣＰＧ７９０９（１０μｇ）または非ＣｐＧ対照ＯＤＮ２１３７（１０μｇ）と組み合わせて免疫化した。最後の追加免疫の１週間後に得られた脾細胞を、ＯＶＡ特異的ＣＴＬ応答について、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイを使用してアッセイした。 ＯＶＡ特異的ＣＤ８Ｔ細胞について、野生型の場合とＴＬＲ９欠損マウスの場合とを比較したグラフである。野生型およびＴＬＲ９欠損の成体（６〜８週齢；ｎ＝５／ｇｐ）マウスを、２０μｇのＯＶＡを用いて、アジュバントなしで、あるいはＣＰＧ２４５５５、ＣＰＧ１０１０３もしくはＣＰＧ７９０９（１０μｇ）または非ＣｐＧ対照ＯＤＮ２１３７（１０μｇ）と組み合わせて免疫化した。最後の追加免疫の１週間後に得られた脾細胞を、ＯＶＡ特異的ＣＤ８Ｔ細胞について、ＭＨＣクラスＩ Ｈ−２Ｋｂ−ＳＩＩＮＦＥＫＬテトラマーを使用してアッセイした。 マウスにおける、抗原特異的ＩＦＮ−ｇの分泌を示すグラフである。成体（６〜８週齢；ｎ＝５／ｇｐ）マウスを、１μｇのＨＢｓＡｇ（左パネル）または２０μｇのＯＶＡ（右パネル）を用いて、アジュバントなしで、あるいはＣＰＧ２４５５５、ＣＰＧ１０１０３もしくはＣＰＧ７９０９（１０μｇ）または非ＣｐＧ対照ＯＤＮ２１３７（１０μｇ；ＯＶＡの場合のみ）と組み合わせて免疫化した。最後の追加免疫の２週間後（ＨＢｓＡｇの場合）または１週間後（ＯＶＡの場合）に得られた脾細胞を、図に示す関連抗原を用いて７２時間賦活し、培養物上清を、ＩＦＮ−γについてＥＬＩＳＡによりアッセイした。 ＴＬＲ９欠損マウスにおける、非ＣｐＧ媒介型の抗原特異的ＩＦＮ−ｇ分泌の増大を示すグラフである。ＴＬＲ９欠損成体（６〜８週齢；ｎ＝５／ｇｐ）マウスを、２０μｇのＯＶＡを用いて、アジュバントなしで、あるいはＣＰＧ２４５５５、ＣＰＧ１０１０３もしくはＣＰＧ７９０９（１０μｇ）または非ＣｐＧ対照ＯＤＮ２１３７（１０μｇ）と組み合わせて免疫化した。最後の追加免疫の１週間後に得られた脾細胞を、０、０．５および１ｍｇ／ｍｌの濃度のＯＶＡを用いて７２時間賦活し、培養物上清を、ＩＦＮ−γについてＥＬＩＳＡによりアッセイした。 マウスにおける抗原特異的複数サイトカイン分泌型Ｔ細胞集団を示すグラフである。成体（６〜８週齢；ｎ＝５／ｇｐ）マウスを、１μｇのＨＢｓＡｇを用いて、抗原を、単独で、またはＣＰＧ２４５５５、ＣＰＧ１０１０３もしくはＣＰＧ７９０９（１０μｇ）と組み合わせて免疫化した。追加免疫の２週間後に得られた脾細胞を、ＨＢｓＡｇ抗原（ＣＤ４の場合）またはＨＢｓクラスＩペプチド（ＣＤ８の場合）を用いて再賦活し、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−２を分泌するＣＤ４Ｔ細胞集団（パネルＡ）およびＣＤ８Ｔ細胞集団（パネルＢ）を、フローサイトメトリーを使用して定量化した。 ヒトＰＢＭＣにおける自然免疫を示す表である。ヒトＰＢＭＣ（５×１０６／ｍｌ）を、各種の濃度のＣＰＧ１０１０３、ＣＰＧ２４５５５または非ＣｐＧ対照ＯＤＮ２２８８１と共に２４または４８時間インキュベートした。細胞上清を収集し、サイトカイン／ケモカインの分泌について、市販のＥＬＩＳＡキットを使用してアッセイした。ＩＦＮ−α、ＭＣＰ−１およびＩＰ−１０の分泌を示す表である。 ヒトＰＢＭＣにおける自然免疫を示す表である。ヒトＰＢＭＣ（５×１０６／ｍｌ）を、各種の濃度のＣＰＧ１０１０３、ＣＰＧ２４５５５または非ＣｐＧ対照ＯＤＮ２２８８１と共に２４または４８時間インキュベートした。細胞上清を収集し、サイトカイン／ケモカインの分泌について、市販のＥＬＩＳＡキットを使用してアッセイした。ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ−２Ｒの分泌を示す表である。 ＢＡＬＢ／ｃマウスのｉｎ ｖｉｖｏにおける自然免疫を示すグラフである。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５／群）に、ＰＢＳ（プラセボ対照）、ＣＰＧ２４５５５、ＣＰＧ１０１０３または非ＣｐＧ対照ＯＤＮ２１３７を１００μｇの用量レベルで皮下注射した。動物を、注射の３時間後に出血させ、ＩＰ−１０について市販のＥＬＩＳＡを使用して、血漿をアッセイした。 ＢＡＬＢ／ｃマウスのｉｎ ｖｉｖｏにおける自然免疫を示すグラフである。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５／群）に、ＰＢＳ（プラセボ対照）、ＣＰＧ２４５５５、ＣＰＧ１０１０３または非ＣｐＧ対照ＯＤＮ２１３７を１００μｇの用量レベルで皮下注射した。動物を、注射の３時間後に出血させ、ＩＬ−１２について市販のＥＬＩＳＡを使用して、血漿をアッセイした。 ＢＡＬＢ／ｃマウスのｉｎ ｖｉｖｏにおける自然免疫を示すグラフである。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５／群）に、ＰＢＳ（プラセボ対照）、ＣＰＧ２４５５５、ＣＰＧ１０１０３または非ＣｐＧ対照ＯＤＮ２１３７を１００μｇの用量レベルで皮下注射した。動物を、注射の３時間後に出血させ、ＩＬ−６について市販のＥＬＩＳＡを使用して、血漿をアッセイした。 ＢＡＬＢ／ｃマウスのｉｎ ｖｉｖｏにおける液性免疫を示すグラフである。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＨＢｓＡｇ（１μｇ）±ＣＰＧ２４５５５またはＣＰＧ１０１０３（１０μｇ）を用いて筋肉内免疫化した。これらのマウスを、第０および１４日（ＨＢｓＡｇ）に免疫化した。追加免疫の２週間後にエンドポイントＥＬＩＳＡにより測定したＨＢｓＡｇに特異的な全ＩｇＧ力価を示すグラフである。 ＢＡＬＢ／ｃマウスのｉｎ ｖｉｖｏにおける液性免疫を示すグラフである。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＯＶＡ（２０μｇ）±ＣＰＧ２４５５５またはＣＰＧ１０１０３（１０μｇ）を用いて筋肉内免疫化した。これらのマウスを、第０、７および２１日（ＯＶＡ）に免疫化した。最後の追加免疫の１週間後のＯＶＡに特異的な全ＩｇＧ力価を示すグラフである。 ＢＡＬＢ／ｃマウスのｉｎ ｖｉｖｏにおける液性免疫を示すグラフである。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、インフルエンザＡ型ＨＡ、Ｔｅｘａｓ１／７７、Ｈ３Ｎ２由来（１μｇ）＋ミョウバン（２５μｇのＡｌ３＋）、±ＣＰＧ２４５５５またはＣＰＧ１０１０３（１０μｇ）を用いて筋肉内免疫化した。これらのマウスを、第０日のみ（ＨＡ）免疫化した。免疫化後の種々の時間にエンドポイントＥＬＩＳＡにより測定したＨＡに特異的な全ＩｇＧの動態を示すグラフである。 ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＴ細胞応答を示すグラフである。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、１０μｇのＣＰＧ ＯＤＮ２４５５、ＣＰＧ１０１０３または非ＣｐＧ対照ＯＤＮ２１３７と併用してまたは併用せずにＨＢｓＡｇ（１μｇ）を筋肉内注射した。これらのマウスには、第０および１４日に注射した。追加免疫の２週間後に５１Ｃｒの放出により測定したＨＢｓＡｇに特異的なＣＴＬを示すグラフである。 Ｃ５７ｂｌ／６マウスにおけるＴ細胞応答を示すグラフである。Ｃ５７ｂｌ／６マウスに、ＯＶＡ（２０μｇ）を、１０μｇのＣＰＧ ＯＤＮ２４５５、ＣＰＧ１０１０３または非ＣｐＧ対照ＯＤＮ２１３７と併用してまたは併用せずに筋肉内注射した。これらのマウスには、第０、７および２１日に注射した。最後の追加免疫の１週間後に５１Ｃｒの放出により測定したＯＶＡに特異的なＣＴＬを示すグラフである。 ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＴ細胞応答を示すグラフである。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＨＢｓＡｇ（１μｇ）を、１０μｇのＣＰＧ ＯＤＮ２４５５、ＣＰＧ１０１０３または非ＣｐＧ対照ＯＤＮ２１３７と併用してまたは併用せずに筋肉内注射した。これらのマウスには、第０および１４日に注射した。最後の追加免疫の２週間後に得られた脾細胞を、それぞれの抗原と共に７２時間インキュベートし、培養物上清を、ＩＦＮ−γについてＥＬＩＳＡにより試験したグラフである。 Ｃ５７ｂｌ／６マウスにおけるＴ細胞応答を示すグラフである。Ｃ５７ｂｌ／６マウスに、ＯＶＡ（２０μｇ）を、１０μｇのＣＰＧ ＯＤＮ２４５５、ＣＰＧ１０１０３または非ＣｐＧ対照ＯＤＮ２１３７と併用してまたは併用せずに筋肉内注射した。これらのマウスには、第０、７および２１日に注射した。最後の追加免疫の１週間後に得られた脾細胞を、それぞれの抗原と共に７２時間インキュベートし、培養物上清を、ＩＦＮ−γについてＥＬＩＳＡにより試験したグラフである。 免疫化の６週間後の抗ＨＡを示すグラフである。雌のＢＡＬＢ／ｃマウスをＨＡ（１μｇ）±ＣｐＧまたは対照ＯＤＮ（１０μｇ）±ミョウバン（２５μｇのＡｌ３＋）を用いて、全量５０μｌとして免疫化した。抗ＨＡの量を、免疫化の６週間後に測定した。 免疫化の４週間後の赤血球凝集阻害（ＨＩＡ）力価を示すグラフである。これらの抗体の機能を、赤血球凝集阻害アッセイ（ＨＩＡ）を使用して評価した。ＨＩＡ力価を、単独でまたはミョウバンと組み合わせて増大させる能力を評価した。 ＨＡに特異的なＩＦＮγの分泌を示すグラフである。雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＨＡ（１μｇ）±ＣｐＧまたは対照ＯＤＮ（１０μｇ）±ミョウバン（２５μｇのＡｌ３＋）を用いて、全量５０μｌとして免疫化した。免疫化の６週間後に取り出した脾細胞を使用して、抗原に特異的なＩＦＮγの分泌についてアッセイした。 非ヒト霊長類における液性応答を示すグラフである。カニクイザル（３〜５歳齢；１群当たりｎ＝５）を、Ｅｎｇｅｒｉｘ−Ｂ（１０μｇのＨＢｓＡｇ；２５０μｇのＡｌ３＋）を用いて、単独でまたは０．５ｍｇのＣＰＧ７９０９もしくはＣＰＧ２４５５５と組み合わせて、第０、４および８週に筋肉内注射により免疫化した。動物を、定期的に出血させ、ＨＢｓＡｇに特異的な抗体力価を、市販のキット（ＭＯＮＯＬＩＳＡ（商標）抗ＨＢＳ）を使用して測定した。 非ヒト霊長類における液性応答を示すグラフである。カニクイザル（３〜５歳齢；１群当たりｎ＝５）を、Ｅｎｇｅｒｉｘ−Ｂ（１０μｇのＨＢｓＡｇ；２５０μｇのＡｌ３＋）を用いて、単独でまたは０．５ｍｇのＣＰＧ７９０９もしくはＣＰＧ２４５５５と組み合わせて、第０、４および８週に筋肉内注射により免疫化した。２回目の免疫化の４週間後および３回目の免疫化の２週間後に得られた血漿を、抗体のアビディティーについて、チオシアン酸ナトリウム溶出法を使用してアッセイした。 非ヒト霊長類におけるＴ細胞応答を示すグラフである。カニクイザル（３〜５歳齢；１群当たりｎ＝５）を、Ｅｎｇｅｒｉｘ−Ｂ（１０μｇのＨＢｓＡｇ；２５０μｇのＡｌ３＋）を用いて、単独でまたは０．５ｍｇのＣＰＧ７９０９もしくはＣＰＧ２４５５５と組み合わせて、第０、４および８週に筋肉内注射により免疫化した。ワクチン接種前およびワクチン接種後のいくつかの時点における末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、ＨＢｓＡｇ特異的ＣＤ４Ｔ細胞媒介型細胞内サイトカインの分泌について、フローサイトメトリーにより試験した。ＩＦＮ−γの分泌を示すグラフである。 非ヒト霊長類におけるＴ細胞応答を示すグラフである。カニクイザル（３〜５歳齢；１群当たりｎ＝５）を、Ｅｎｇｅｒｉｘ−Ｂ（１０μｇのＨＢｓＡｇ；２５０μｇのＡｌ３＋）を用いて、単独でまたは０．５ｍｇのＣＰＧ７９０９もしくはＣＰＧ２４５５５と組み合わせて、第０、４および８週に筋肉内注射により免疫化した。ワクチン接種前およびワクチン接種後のいくつかの時点における末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、ＨＢｓＡｇ特異的ＣＤ４Ｔ細胞媒介型細胞内サイトカインの分泌について、フローサイトメトリーにより試験した。ＩＬ−２の分泌を示すグラフである。 非ヒト霊長類におけるＴ細胞応答を示すグラフである。カニクイザル（３〜５歳齢；１群当たりｎ＝５）を、Ｅｎｇｅｒｉｘ−Ｂ（１０μｇのＨＢｓＡｇ；２５０μｇのＡｌ３＋）を用いて、単独でまたは０．５ｍｇのＣＰＧ７９０９もしくはＣＰＧ２４５５５と組み合わせて、第０、４および８週に筋肉内注射により免疫化した。ワクチン接種前およびワクチン接種後のいくつかの時点における末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、ＨＢｓＡｇ特異的ＣＤ４Ｔ細胞媒介型細胞内サイトカインの分泌について、フローサイトメトリーにより試験した。ＴＮＦ−αの分泌を示すグラフである。 Ｔ細胞応答：多機能性ＣＤ４Ｔ細胞；定量分析を示すグラフである。カニクイザル（３〜５歳齢；１群当たりｎ＝５）を、Ｅｎｇｅｒｉｘ−Ｂ（１０μｇのＨＢｓＡｇ；２５０μｇのＡｌ３＋）を用いて、単独でまたは０．５ｍｇのＣＰＧ７９０９またはＣＰＧ２４５５５と組み合わせて、第０、４および８週に筋肉内注射により免疫化した。３回目の免疫化の２週間後の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、１つ、２つまたは３つのサイトカインを分泌するＨＢｓＡｇ特異的ＣＤ４Ｔ細胞について、フローサイトメトリーにより試験した。解析したＣＤ４Ｔ細胞１００万個当たりの、１つ、２つまたは３つのサイトカインを分泌するＨＢｓＡｇ特異的ＣＤ４Ｔ細胞の数を示すグラフである。 Ｔ細胞応答：多機能性ＣＤ４Ｔ細胞；定量分析を示すグラフである。カニクイザル（３〜５歳齢；１群当たりｎ＝５）を、Ｅｎｇｅｒｉｘ−Ｂ（１０μｇのＨＢｓＡｇ；２５０μｇのＡｌ３＋）を用いて、単独でまたは０．５ｍｇのＣＰＧ７９０９またはＣＰＧ２４５５５と組み合わせて、第０、４および８週に筋肉内注射により免疫化した。３回目の免疫化の２週間後の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、１つ、２つまたは３つのサイトカインを分泌するＨＢｓＡｇ特異的ＣＤ４Ｔ細胞について、フローサイトメトリーにより試験した。全ＨＢｓＡｇ特異的ＣＤ４Ｔ細胞集団中の、単一サイトカイン産生Ｔ細胞、二重サイトカイン産生Ｔ細胞および三重サイトカイン産生Ｔ細胞の比率を示すグラフである。 Ｔ細胞応答：多機能性ＣＤ４Ｔ細胞；定性分析を示すグラフである。ＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦα、またはこれらのサイトカインの組合せを分泌する細胞の数を測定した。カニクイザル（３〜５歳齢；１群当たりｎ＝５）を、Ｅｎｇｅｒｉｘ−Ｂ（１０μｇのＨＢｓＡｇ；２５０μｇのＡｌ３＋）を用いて、単独でまたは０．５ｍｇのＣＰＧ７９０９もしくはＣＰＧ２４５５５と組み合わせて、第０、４および８週に筋肉内注射により免疫化した。３回目の免疫化の２週間後の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦα、またはこれらのサイトカインの組合せを分泌するＨＢｓＡｇ特異的ＣＤ４Ｔ細胞数について、フローサイトメトリーにより試験した。
配列の説明
配列番号１−免疫賦活性オリゴヌクレオチドＯＤＮ ＣＰＧ２４５５５のヌクレオチド配列。
配列番号２−免疫賦活性オリゴヌクレオチドＣＰＧ１０１０３のヌクレオチド配列。
配列番号３−免疫賦活性オリゴヌクレオチドＣＰＧ７９０９のヌクレオチド配列。
配列番号４−非ＣｐＧオリゴヌクレオチド２２８８１のヌクレオチド配列。
配列番号５−非ＣｐＧオリゴヌクレオチド２１３７のヌクレオチド配列。
本発明の態様は、免疫賦活性オリゴヌクレオチドからのＣｐＧモチーフの除去が、この免疫賦活性オリゴヌクレオチドの、抗原特異的免疫応答を増大させる能力に対して負の影響を及ぼさなかったという驚くべき発見に一部基づいている。また、驚くべきことには、前記ＣｐＧモチーフの除去が、異なる抗原特異的Ｔ細胞集団の生成を可能にすることも見出された。特に、前記抗原特異的Ｔ細胞集団は、より多くのＩＦＮ−ガンマ分泌型Ｔ細胞およびより多くの多機能性Ｔ細胞を含むことが見出された。
本発明の態様では、この免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、核酸配列５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴ３’（ＯＤＮ ＣＰＧ２４５５５；配列番号１）を有する。配列番号１の免疫賦活性オリゴヌクレオチド核酸配列は、以前に報告された免疫賦活性オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ１０１０３）５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＴＣＧＧＴＣＧＴＴＴＴ３’（配列番号２）とは、最も３’側のＣＧジヌクレオチドが反転していることによって異なる。ＣｐＧオリゴヌクレオチドの免疫賦活活性は、ＣｐＧモチーフの数、ＣＧジヌクレオチドに隣接する配列、（１つまたは複数の）ＣｐＧモチーフの場所、およびＣｐＧモチーフ間の間隔に依存することが以前から報告されていることから、これら２つの免疫賦活性オリゴヌクレオチド間の活性が類似していることには驚くべきものがある（Ｂａｌｌａｓら、１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７（５）：１８４０〜５；Ｈａｒｔｍａｎｎら、２０００、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６４（３）：１６１７〜２４；Ｋｌｉｎｍａｎら、２００３、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３（２）：２２７〜３２）。免疫賦活性オリゴヌクレオチドＣＰＧ ＯＤＮ２４５５５（配列番号１）中の最も３’側のＣＧジヌクレオチドを除去しても、この免疫賦活性オリゴヌクレオチドの、抗原特異的免疫応答を増大させる能力に対しては、以前の開示から予想されるような負の影響を生じなかった。ＣＰＧ ＯＤＮ２４５５５は、ＣＰＧ ＯＤＮ１０１０３と比較して、類似の、場合によっては、増強された免疫賦活活性を示した。
さらに、ＣＰＧ ＯＤＮ２４５５５は、ＣＰＧ ＯＤＮ１０１０３と比較して、抗原特異的Ｔ細胞の異なる集団を誘発することも見出された（図８、表１および表２を参照されたい）。特に、驚くべきことには、ＣＰＧ ＯＤＮ２４５５５をアジュバントとして使用して生成させた抗原特異的Ｔ細胞集団（特に、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞集団）は、ＣＰＧ ＯＤＮ１０１０３またはＣＰＧ ＯＤＮ７９０９を使用して生成させた抗原特異的Ｔ細胞集団と比較して、より多くのＩＦＮ−ガンマ分泌型Ｔ細胞およびより多くの多機能性Ｔ細胞を含むことが見出された。
例えば、ＣｐＧ ＯＤＮ１０１０３を用いて得られた抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞集団と比較して、より高い比率の、ＩＦＮ−γを産生する抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞が得られた。また、ＣＰＧ ＯＤＮ１０１０３またはＣＰＧ ＯＤＮ７９０９を用いて得られた抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞集団と比較しても、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの両方、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の両方、もしくはＴＮＦ−αおよびＩＬ−２の両方を産生する多機能性抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞が、またはさらにはＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２を分泌する三重産生細胞が、より高い比率で得られた。また、ＣＰＧ ＯＤＮ１０１０３を用いて得られた抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞集団と比較して、より高い比率の、ＴＮＦ−αを産生する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞も得られた。また、ＣＰＧ ＯＤＮ１０１０３またはＣＰＧ ＯＤＮ７９０９を用いて得られた抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞集団と比較して、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の両方、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２の両方を産生する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が、またはＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２を分泌する三重産生細胞さえもが、より高い比率で得られた。
免疫原性におけるＴ細胞の多機能性の重要性が、最近になって浮かび上がっている。特に、ケモカイン（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２等）の産生の観点からの抗原特異的Ｔ細胞の多機能性が、場合によっては、それらの細胞の潜在的防御力と相関することが示されており（例えば、Ｈａｒａｒｉ Ａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２００６；２１１：２３６〜５４、Ｍａｋｅｄｏｎａｓ ＧおよびＢｅｔｔｓ ＭＲ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．２００６；２８（３）：２０９〜１９、Ｐｒｅｃｏｐｉｏ ＭＬら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２００７ ２０４（６）：１４０５〜１６、Ｘｕ Ｒら、ワクチン、２００８；２６（３７）：４８１９〜２９を参照されたい）、こうした潜在的防御力は、単一のサイトカインのみを分泌するＴ細胞と比較して、それらの細胞のエフェクター機能がより良好であることに起因すると考えられている。
好都合なことに、ＣＰＧ ＯＤＮ２４５５５は、アジュバントとして使用した場合、ワクチンの状況においては重要となり得る多機能性抗原特異的Ｔ細胞集団の生成を可能にする。
これらの免疫賦活性核酸は、二本鎖であってもまたは一本鎖であってもよい。一般に、二本鎖分子は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてより安定であり、一方、一本鎖分子は、免疫活性の増加を示す。本発明のいくつかの態様では、この核酸が一本鎖であることが好ましく、他の態様では、この核酸が二本鎖であることが好ましい。
本明細書では、用語「核酸」と「オリゴヌクレオチド」とを互換的に使用して、複数のヌクレオチド（すなわち、リン酸基、および置換されているピリミジン（例えば、シトシン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）もしくはウラシル（Ｕ））または置換されているプリン（例えば、アデニン（Ａ）もしくはグアニン（Ｇ））のいずれかである、交換可能な有機塩基に連結している糖（例えば、リボースまたはデオキシリボース）を含む分子）を意味する。本明細書で使用する場合、これらの用語は、オリゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド（すなわち、リン酸を有しないポリヌクレオチド）、および任意の他の有機塩基含有ポリマーを指す。核酸分子は、現存する核酸供給源（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ）から得ることができるが、好ましくは、合成（例えば、核酸合成によって産生された）核酸分子である。
本発明の態様では、これらの免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、リン酸ジエステルヌクレオシド間架橋、β−Ｄ−リボース単位および／または天然のヌクレオシド塩基（アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル）が関与する、天然のＲＮＡおよびＤＮＡと比較した場合の種々の化学的な改変および置換を包含することができる。化学的改変の例は、当業者には既知であり、例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ Ｅ．ら（１９９０）、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４３；「Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ」、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ＆ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＵＳＡ １９９３；Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ら（１９９６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３６：１０７〜１２９；およびＨｕｎｚｉｋｅｒ Ｊ．ら、（１９９５）、Ｍｏｄ．Ｓｙｎｔｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ７：３３１〜４１７に記載されている。本発明によるオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の改変を有し得、各改変は、天然のＤＮＡもしくはＲＮＡから構成される同じ配列のオリゴヌクレオチドと比較して、特定のリン酸ジエステルヌクレオシド間架橋に、かつ／または特定のβ−Ｄ−リボース単位に、かつ／または特定の天然のヌクレオシド塩基の位置に位置する。
本発明の態様では、これらのオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の改変を含むことができる。そのような改変は、ａ）ヌクレオシドの３’末端および／または５’末端に位置するリン酸ジエステルヌクレオシド間架橋の、改変ヌクレオシド間架橋による置換、ｂ）ヌクレオシドの３’末端および／または５’末端に位置するリン酸ジエステル架橋の、デホスホ架橋による置換、ｃ）糖リン酸骨格に由来する糖リン酸単位の、別の単位による置換、ｄ）β−Ｄ−リボース単位の、改変糖単位による置換、ならびにｅ）天然のヌクレオシド塩基の置換から選択することができる。
また、核酸として、置換されているプリンおよびピリミジン、例として、Ｃ−５プロピンピリミジンおよび７−デアザ−７−置換プリンの改変塩基（Ｗａｇｎｅｒら、１９９６、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４０〜４）が挙げられる。プリンおよびピリミジンとして、これらに限定されないが、アデニン、シトシン、グアニン、チミジン、５−メチルシトシン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、ならびに他の天然に存在するおよび天然に存在しない核酸塩基、置換されているおよび置換されていない芳香族部分も挙げられる。他のそのような改変は当業者に周知である。
改変塩基は、ＤＮＡおよびＲＮＡ中に典型的に見出される、天然に存在する塩基、例として、Ｔ、Ｃ、Ｇ、ＡおよびＵとは化学的に明確に異なるが、これらの天然に存在する塩基と基本的な化学構造は共有する任意の塩基である。こうした改変ヌクレオシド塩基は、例えば、ヒポキサンチン、ジヒドロウラシル、シュードウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−アミノウラシル、５−（Ｃ１〜Ｃ６）−アルキルウラシル、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルケニルウラシル、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルキルニルウラシル、５−（ヒドロキシメチル）ウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシシトシン、５−（Ｃ１〜Ｃ６）−アルキルシトシン、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルケニルシトシン、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルキルニルシトシン、５−クロロシトシン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、Ｎ２−ジメチルグアニン、２，４−ジアミノ−プリン、８−アザプリン、置換されている７−デアザプリン、好ましくは、７−デアザ−７−置換および／または７−デアザ−８−置換プリン、５−ヒドロキシメチルシトシン、Ｎ４−アルキルシトシン（例えば、Ｎ４−エチルシトシン）、５−ヒドロキシデオキシシチジン、５−ヒドロキシメチルデオキシシチジン、Ｎ４−アルキルデオキシシチジン（例えば、Ｎ４−エチルデオキシシチジン）、６−チオデオキシグアノシン、ニトロピロールのデオキシリボヌクレオシド、Ｃ５−プロピニルピリミジン、ジアミノプリン（例えば、２，６−ジアミノプリン）、イノシン、５−メチルシトシン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチン、または天然のヌクレオシド塩基の他の改変から選択することができる。このリストは、例示を意図し、限定するためのものであると解釈すべきではない。
本発明のいくつかの態様では、本明細書に記載する免疫賦活性オリゴヌクレオチドのＣｐＧジヌクレオチドは、好ましくは、メチル化されていない。非メチル化ＣｐＧモチーフは、非メチル化シトシン−グアニンジヌクレオチド配列（すなわち、３’グアノシンが続き、リン酸結合によって連結している非メチル化５’シトシン）である。他の態様では、これらのＣｐＧモチーフは、メチル化されている。メチル化ＣｐＧモチーフは、メチル化シトシン−グアニンジヌクレオチド配列（すなわち、３’グアノシンが続き、リン酸結合によって連結しているメチル化５’シトシン）である。
本発明のいくつかの態様では、免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、改変シトシンを含有することができる。改変シトシンは、このオリゴヌクレオチドの免疫賦活活性を損なうことなく、ピリミジン塩基を置換することができる、シトシンの天然に存在するまたは天然に存在しないピリミジン塩基の類似体である。改変シトシンとして、これらに限定されないが、５−置換シトシン（例えば、５−メチル−シトシン、５−フルオロ−シトシン、５−クロロ−シトシン、５−ブロモ−シトシン、５−ヨード−シトシン、５−ヒドロキシ−シトシン、５−ヒドロキシメチル−シトシン、５−ジフルオロメチル−シトシン、および置換されていないまたは置換されている５−アルキニル−シトシン）、６−置換シトシン、Ｎ４−置換シトシン（例えば、Ｎ４−エチル−シトシン）、５−アザ−シトシン、２−メルカプト−シトシン、イソシトシン、シュード−イソシトシン、縮合環系を有するシトシン類似体（例えば、Ｎ，Ｎ’−プロピレンシトシンまたはフェノキサジン）が挙げられる。好ましいシトシンのいくつかには、５−メチル−シトシン、５−フルオロ−シトシン、５−ヒドロキシ−シトシン、５−ヒドロキシメチル−シトシン、およびＮ４−エチル−シトシンが挙げられる。本発明の別の実施形態では、こうしたシトシン塩基は、ユニバーサル塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂａｓｅ）（例えば、３−ニトロピロール、Ｐ−塩基）、芳香族環系（例えば、フルオロベンゼンもしくはジフルオロベンゼン）、または水素原子（ｄスペーサー）で置換されている。いくつかの態様では、免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、ウラシルおよび／またはその誘導体（例えば、５−フルオロ−ウラシル、５−ブロモ−ウラシル、５−ブロモビニル−ウラシル、４−チオ−ウラシル、５−ヒドロキシ−ウラシル、５−プロピニル−ウラシル）を含有することができる。
本発明のいくつかの態様では、免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、改変グアニンを含有することができる。改変グアニンは、このオリゴヌクレオチドの免疫賦活活性を損なうことなく、プリン塩基を置換することができる、グアニンの天然に存在するまたは天然に存在しないプリン塩基の類似体である。改変グアニンとして、これらに限定されないが、７−デアザグアニン、７−デアザ−７−置換グアニン、ヒポキサンチン、Ｎ２−置換グアニン（例えば、Ｎ２−メチル−グアニン）、５−アミノ−３−メチル−３Ｈ，６Ｈ−チアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−２，７−ジオン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノプリン、プリン、インドール、アデニン、置換アデニン（例えば、Ｎ６−メチル−アデニン、８−オキソ−アデニン）、８−置換グアニン（例えば、８−ヒドロキシグアニンまたは８−ブロモグアニン）、および６−チオグアニンを挙げることができる。本発明の別の実施形態では、こうしたグアニン塩基は、ユニバーサル塩基（例えば、４−メチル−インドール、５−ニトロ−インドールもしくはＫ−塩基）、芳香族環系（例えば、ベンズイミダゾールもしくはジクロロ−ベンズイミダゾール、１−メチル−１Ｈ−［１，２，４］トリアゾール−３−カルボン酸アミド）、または水素原子（dスペーサー）で置換されている。
特定の態様では、これらのオリゴヌクレオチドは、改変ヌクレオチド間連結を含むことができる。これらの改変された連結は、分解に対して部分的に耐性を示すことができる（例えば、安定化されている）。「安定化核酸分子」は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける（例えば、エキソ−ヌクレアーゼまたはエンド−ヌクレアーゼを介する）分解に対して比較的耐性を示す核酸分子を意味するものとする。安定化は、長さまたは二次構造の機能であり得る。数十〜数百キロベース長である核酸は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける分解に対して比較的耐性を示す。より短い核酸の場合は、二次構造が、それらの核酸の作用を安定化および増加させることができる。ステムループ構造の形成が、核酸分子を安定化させることができる。例えば、核酸の３’末端が、上流領域に対して自己相補性を有し、その結果、折り畳まれ、ステムループ構造を形成することができる場合には、この核酸は、安定化され、より高い活性を示すことができる。
また、核酸の安定化は、リン酸骨格の改変を介しても達成することができる。ホスホロチオエート連結を有するオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、最大の活性をもたらし、このオリゴヌクレオチドは、細胞内のエキソ−ヌクレアーゼおよびエンド−ヌクレアーゼによる分解から保護され得る。
ｉｎ ｖｉｖｏにおいて使用するためには、核酸は、好ましくは、（例えば、エンド−ヌクレアーゼおよびエキソ−ヌクレアーゼを介する）分解に対して比較的耐性を示す。核酸骨格の改変が、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて投与した場合、核酸の活性の増強をもたらすことが実証されている。ステムループ等の二次構造は、核酸を分解に対して安定化させることができる。あるいは、核酸の安定化は、リン酸骨格の改変を介しても達成することができる。好ましい安定化核酸は、少なくとも部分的に改変されたホスホロチオエート骨格を有する。ホスホロチオエートは、ホスホロアミデート化学またはＨ−ホスホネート化学のいずれかを利用する自動化された技法を使用して合成することができる。アリール−ホスホネートおよびアルキル−ホスホネートは、例えば、米国特許第４，４６９，８６３号の記載に従って作製することができ；アルキルリン酸トリエステル（米国特許第５，０２３，２４３号および欧州特許第０９２，５７４号に記載されているように、この中では、帯電した酸素部分がアルキル化されている）は、市販されている試薬を使用して自動化固相合成によって調製することができる。他のＤＮＡ骨格の改変および置換を作製するための方法が記載されている（Ｕｈｌｍａｎｎ，Ｅ．およびＰｅｙｍａｎ，Ａ．（１９９０）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４４；Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｊ．（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１：１６５）。また、ＣｐＧモチーフを有する２’−Ｏ−メチル核酸も、エトキシ改変ＣｐＧ核酸と同様に免疫活性化を引き起こす。実際に、ＣｐＧの作用を完全に無効にする骨格の改変は見出されていないが、ＣｐＧの作用は、このＣを５−メチルＣで置換することによって大幅に低下する。ホスホロチオエート連結を有する構築物は、最大の活性をもたらし、この核酸は、細胞内のエキソ−ヌクレアーゼおよびエンド−ヌクレアーゼによる分解から保護される。他の改変核酸として、リン酸ジエステルによる改変核酸、リン酸ジエステルとホスホロチオエート核酸との組合せ、メチルホスホネート、メチルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ｐ−エトキシ、およびそれらの組合せが挙げられる。これらの組合せのそれぞれ、および免疫細胞に対するそれらの特定の作用が、ＰＣＴ公開特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９５／０１５７０号（ＷＯ９６／０２５５５）および第ＰＣＴ／ＵＳ９７／１９７９１号（ＷＯ９８／１８８１０）、ならびに２００１年２月２７日発行の米国特許第６，１９４，３８８Ｂ１号および２００１年５月２９日発行の米国特許第６，２３９，１１６Ｂ１号に、ＣｐＧ核酸に関してより詳細に論じられている。これらの改変核酸は、ヌクレアーゼに対する耐性の増強、細胞取込みの増加、タンパク質結合性の増加、および／または細胞内局在化の変化に起因して、より高い賦活活性を示すことができると考えられている。
ｉｎ ｖｉｖｏにおいて投与するために、核酸を、標的細胞（例えば、Ｂ細胞、単核球細胞もしくはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）の表面に対するより高い親和結合および／または標的細胞による細胞取込みの増加をもたらす分子につなげて、「核酸送達複合体」を形成することができる。核酸は、適切な分子に当技術分野で周知の技法を使用してイオン性または共有結合性につなぐことができる。多様なカップリング剤または架橋剤、例として、プロテインＡ、カルボジイミドまたはＮ−サクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）を使用することができる。あるいは、核酸を、リポソームまたはビロソーム中に周知の技法を使用して被包することもできる。
他の安定化核酸として、これらに限定されないが、非イオン性ＤＮＡ類似体、例として、アルキル−リン酸およびアリール−リン酸（この中では、帯電したホスホネート酸素が、アルキル基またはアリール基で置換されている）、リン酸ジエステル、ならびにその中で、帯電した酸素部分がアルキル化されているアルキルリン酸トリエステルが挙げられる。また、テトラエチレングリコールまたはヘキサエチレングリコール等のジオールを、一方または両方の末端に含有する核酸も、ヌクレアーゼ分解に対して実質的に耐性を示すことが示されている。いくつかの実施形態では、本発明の免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの親油性の置換されているヌクレオチド類似体、および／またはピリミジン−プリンジヌクレオチドを含むことができる。
これらのオリゴヌクレオチドは、１つまたは２つの接近しやすい５’末端を有し得る。２つのそのような５’末端を有する改変オリゴヌクレオチドを、例えば、２つのオリゴヌクレオチドを３’−３’連結を通してつなげて、１つまたは２つの接近しやすい５’末端を有するオリゴヌクレオチドを生成することによって創出することが可能である。この３’３’−連結は、リン酸ジエステル、ホスホロチオエート、または任意の他の改変ヌクレオシド間架橋であり得る。そのような連結を達成するための方法が、当技術分野では既知である。例えば、そのような連結は、Ｓｅｌｉｇｅｒ，Ｈ．ら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎａｌｏｇｓ ｗｉｔｈ ｔｅｒｍｉｎａｌ ３’−３’− ａｎｄ ５’−５’−ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｉｃ ｌｉｎｋａｇｅｓ ａｓ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（１９９１）、１０（１〜３）、４６９〜７７、およびＪｉａｎｇら、Ｐｓｅｕｄｏ−ｃｙｃｌｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９９）、７（１２）、２７２７〜２７３５に記載されている。
さらに、これら３’末端ヌクレオシド間の連結が、リン酸ジエステル、ホスホロチオエートおよび他の改変架橋ではない３’３’−連結オリゴヌクレオチドも、追加のスペーサー、例として、トリ−エチレングリコールホスフェート部分またはテトラ−エチレングリコールホスフェート部分を使用して調製することができる（Ｄｕｒａｎｄ，Ｍ．ら、Ｔｒｉｐｌｅ−ｈｅｌｉｘ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｙ ａｎ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｏｎｅ（ｄＡ）１２ ａｎｄ ｔｗｏ （ｄＴ）１２ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｂｒｉｄｇｅｄ ｂｙ ｔｗｏ ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｃｈａｉｎｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９２）、３１（３８）、９１９７〜２０４、米国特許第５，６５８，７３８号、および米国特許第５，６６８，２６５号）。あるいは、非ヌクレオチドリンカーを、標準的なホスホラミダイト化学を使用して、エタンジオール、プロパンジオールから、または脱塩基デオキシリボース（ｄスペーサー）単位から誘導することもできる（Ｆｏｎｔａｎｅｌ，Ｍａｒｉｅ Ｌａｕｒｅｎｃｅら、Ｓｔｅｒｉｃａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｔ４ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ ｏｆ ｎｏｎ−ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｉｃ ｍｏｉｅｔｉｅｓ ５’−ａｔｔａｃｈｅｄ ｔｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９４）、２２（１１）、２０２２〜７）。これらの非ヌクレオチドリンカーを、１回もしくは複数回組み込んでもよく、または相互に組み合わせてもよく、連結しようとするこれら２つのオリゴヌクレオチドの３’末端間の任意の望ましい距離が可能になる。
ヌクレオシドの３’末端および／または５’末端に位置するリン酸ジエステルヌクレオシド間架橋を、改変ヌクレオシド間架橋で置換することができ、この改変ヌクレオシド間架橋は、例えば、ホスホロチオエート架橋、ホスホロジチオエート架橋、ＮＲ１Ｒ２−ホスホロアミデート架橋、ボラノホスフェート架橋、α−ヒドロキシベンジルホスホネート架橋、リン酸−（Ｃ１〜Ｃ２１）−Ｏ−アルキルエステル架橋、リン酸−［（Ｃ６〜Ｃ１２）アリール−（Ｃ１〜Ｃ２１）−Ｏ−アルキル］エステル架橋、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルホスホネート架橋、および／または（Ｃ６〜Ｃ１２）アリールホスホネート架橋、（Ｃ７〜Ｃ１２）−α−ヒドロキシメチル−アリール（例えば、ＷＯ９５／０１３６３に開示されているもの）から選択され、式中、（Ｃ６〜Ｃ１２）アリール、（Ｃ６〜Ｃ２０）アリールおよび（Ｃ６〜Ｃ１４）アリールは、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、ニトロ、シアノで置換されていてもよく、Ｒ１およびＲ２は相互に独立して、水素、（Ｃ１〜Ｃ１８）−アルキル、（Ｃ６〜Ｃ２０）−アリール、（Ｃ６〜Ｃ１４）−アリール、（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル、好ましくは、水素、（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル、好ましくは、（Ｃ１〜Ｃ４）−アルキルおよび／またはメトキシエチルであるか、またはＲ１とＲ２とがそれらを担持する窒素原子と一緒になって、Ｏ、ＳおよびＮの群からのさらなるヘテロ原子をさらに含有することができる５員または６員の複素環を形成する。
ヌクレオシドの３’末端および／または５’末端に位置するリン酸ジエステル架橋の、デホスホ架橋（デホスホ架橋は、例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ Ｅ．およびＰｅｙｍａｎ Ａ．、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｖｏｌ．２０、「Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ」、Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ １９９３、Ｃｈａｐｔｅｒ １６、３５５ページ以降に記載されている）による置換、デホスホ架橋は、例えば、デホスホ架橋、すなわち、ホルムアセタール基、３’−チオホルムアセタール基、メチルヒドロキシルアミン基、オキシム基、メチレンジメチル−ヒドラゾ基、ジメチレンスルホン基、および／またはシリル基から選択される。
本発明の免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、キメラ骨格を場合により有し得る。キメラ骨格は、２つ以上の型の連結を含む骨格である。一実施形態では、このキメラ骨格は、式：５’Ｙ１Ｎ１ＺＮ２Ｙ２３’によって表すことができる。Ｙ１およびＹ２は、１つと１０個との間のヌクレオチドを有する核酸分子である。Ｙ１およびＹ２はそれぞれ、少なくとも１つの改変ヌクレオチド間連結を含む。これらのキメラオリゴヌクレオチドの少なくとも２つのヌクレオチドが骨格の改変を含むことから、これらの核酸は、１つの型の安定化免疫賦活性核酸の例である。
これらのキメラのオリゴヌクレオチドに関して、Ｙ１およびＹ２は、相互に独立しているとみなされる。このことは、Ｙ１およびＹ２のそれぞれが、同じ分子中で、相互に異なる配列および異なる骨格の連結を有してもまたは有しなくてもよいことを意味する。いくつかの実施形態では、Ｙ１および／またはＹ２は、３つと８つとの間のヌクレオチドを有する。Ｎ１ＺＮ２が全部で少なくとも６つのヌクレオチドを有する限り、Ｎ１およびＮ２は、０個と５つとの間のヌクレオチドを有する核酸分子である。Ｎ１ＺＮ２のヌクレオチドは、リン酸ジエステル骨格を有し、改変骨格を有する核酸は含まない。Ｚは、免疫賦活性核酸モチーフであり、好ましくは、本明細書に列挙する免疫賦活性オリゴヌクレオチドから選択される。
式Ｙ１Ｎ１ＺＮ２Ｙ２の中心のヌクレオチド（Ｎ１ＺＮ２）は、リン酸ジエステルヌクレオチド間連結を有し、Ｙ１およびＹ２は、少なくとも１つの改変ヌクレオチド間連結を有するが、２つ以上の改変ヌクレオチド間連結を有してもよく、または全てが改変ヌクレオチド間連結であってもよい。好ましい実施形態では、Ｙ１および／またはＹ２は、少なくとも２つ、もしくは２つと５つとの間の改変ヌクレオチド間連結を有するか、またはＹ１が、５つの改変ヌクレオチド間連結を有し、Ｙ２が２つの改変ヌクレオチド間連結を有する。この改変ヌクレオチド間連結は、いくつかの実施形態では、ホスホロチオエートにより改変された連結、ホスホロジチオエート連結、またはｐ−エトキシにより改変された連結である。
また、これらの核酸は、２’位のヒドロキシル基および５’位のリン酸基以外の低い分子量の有機基に共有結合している骨格の糖を有する核酸も含む。したがって、改変核酸は、２’−Ｏ−アルキル化リボース基を含むことができる。さらに、改変核酸は、リボースの代わりに、アラビノースまたは２’−フルオロアラビノース等の糖も含むことができる。したがって、これらの核酸は骨格組成において不均一であり、それによって、任意の可能な組合せの、一緒に連結しているポリマー単位、例として、（核酸塩基を伴うアミノ酸骨格を有する）ペプチド−核酸を含有することができる。いくつかの実施形態では、これらの核酸は、骨格組成において均一である。
糖リン酸骨格（すなわち、糖リン酸骨格は、糖リン酸単位から構成される）に由来する糖リン酸単位（すなわち、一緒になって糖リン酸単位を形成するβ−Ｄ−リボースおよびリン酸ジエステルヌクレオシド間架橋）を、別の単位で置換することができ、その別の単位は、（例えば、Ｓｔｉｒｃｈａｋ Ｅ．Ｐ．ら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１７：６１２９〜４１に記載されているような）「モルホリノ誘導体」オリゴマーの構築、すなわち、例えば、モルホリノ誘導体による置換、または（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ Ｐ．Ｅ．ら（１９９４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．５：３〜７に記載されているような）ポリアミド核酸（「ＰＮＡ」）の構築、すなわち、例えば、ＰＮＡ骨格単位、例えば、２−アミノエチルグリシンによる置換に適している。このオリゴヌクレオチドは、他の炭水化物骨格の改変および置換、例として、リン酸基を伴うペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、およびアルキルリンカーまたはアミノリンカーを伴う骨格セクションをもつオリゴヌクレオチドを有することができる。このアルキルリンカーは、分枝していてもまたは分枝していなくても、置換されていてもまたは置換されていなくてもよく、掌性に純粋であってもまたはラセミ混合物であってもよい。
β−リボース単位またはβ−Ｄ−２’デオキシリボース単位を、改変糖単位で置換することができ、この改変糖単位は、例えば、β−Ｄ−リボース、α−Ｄ−２’−デオキシリボース、Ｌ−２’−デオキシリボース、２’−Ｆ−２’−デオキシリボース、２’−Ｆ−アラビノース、２’−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−リボースから選択され、好ましくは、２’−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−リボースは、２’−Ｏ−メチルリボース、２’−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルケニル−リボース、２’−［Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル］−リボース、２’−ＮＨ２−２’−デオキシリボース、β−Ｄ−キシロ−フラノース、α−アラビノフラノース、２，４−ジデオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ヘキソ−ピラノース、（例えば、Ｆｒｏｅｈｌｅｒ Ｊ．（１９９２）Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：８３２０に記載されている）炭素環、および／または（例えば、Ｖａｎｄｅｎｄｒｉｅｓｓｃｈｅら（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４９：７２２３に記載されている）鎖式糖類似体、および／または（例えば、Ｔａｒｋｏｙ Ｍ．ら（１９９３）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．７６：４８１に記載されている）二環式糖類似体である。
いくつかの実施形態では、この糖は、２’−Ｏ−メチルリボースであり、特に、一方または両方のヌクレオチドが、リン酸ジエステルまたはリン酸ジエステル様のヌクレオシド間連結によって連結している。
本発明のオリゴヌクレオチドは、当技術分野で周知のいくつかの手順のうちのいずれかを使用して新規に合成することができる。例えば、ｂ−シアノエチルホスホラミダイト法（Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．、（１９８１）Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２２：１８５９）；ヌクレオシドＨ−ホスホネート法（Ｇａｒｅｇｇら、（１９８６）Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２７：４０５１〜４０５４；Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、（１９８６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１４：５３９９〜５４０７；Ｇａｒｅｇｇら、（１９８６）２７：４０５５〜４０５８；Ｇａｆｆｎｅｙら、（１９８８）Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２９：２６１９〜２６２２）。これらの化学は、市販されている多様な自動化核酸合成機によって実施することができる。これらのオリゴヌクレオチドは、合成オリゴヌクレオチドと呼ばれる。あるいは、Ｔに富むジヌクレオチドおよび／またはＴＧジヌクレオチドを、プラスミド中で大規模に産生し（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｔ．ら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９を参照されたい）、より小さな部分に分けるかまたは全プラスミドとして投与することができる。核酸を、現存する核酸配列（例えば、ゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡ）から、既知の技法、例として、制限酵素、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを利用する技法を使用して調製することができる。
本発明のある実施形態では、免疫賦活性オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチド間連結が、ホスホロチオエート連結である。
ホスホロチオエート等の改変骨格は、ホスホロアミデート化学またはＨ−ホスホネート化学のいずれかを利用する自動化された技法を使用して合成することができる。アリール−ホスホネートおよびアルキル−ホスホネートは、例えば、米国特許第４，４６９，８６３号の記載に従って作製することができ；アルキルリン酸トリエステル（米国特許第５，０２３，２４３号に記載されているように、この中では、帯電した酸素部分がアルキル化されている）は、市販されている試薬を使用して自動化固相合成によって調製することができる。他のＤＮＡ骨格の改変および置換を作製するための方法が記載されている（例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ，Ｅ．およびＰｅｙｍａｎ，Ａ．、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４４、１９９０；Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｊ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１：１６５、１９９０）。
こうして調製した核酸を、単離核酸と呼ぶ。「単離核酸」は一般に、構成成分から分離された核酸を指し、これらの構成成分と共に、この核酸は、細胞、核、ミトコンドリア、またはクロマチンおよび混入物とみなすことができる任意の他の構成成分から分離される。
ある実施形態では、本発明の免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、５’Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ３’からなり、＊は、ホスホロチオエート連結を示す。
ある実施形態では、本発明の免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、ＩＦＮ−γを分泌する抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を高い比率で誘発する。ある実施形態では、本発明の免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−２を分泌する抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞集団において、少なくとも４０％、好ましくは、少なくとも４５％、より好ましくは、少なくとも５０％、より好ましくは、約５３％の、ＩＦＮ−γを分泌する抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を誘発することができる。ある実施形態では、ＩＦＮ−γを分泌する抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の前記比率を、多染色性フローサイトメトリーによって決定する。そのような決定の例を、本文書の実施例１に開示する（「抗原特異的複数サイトカイン分泌型Ｔ細胞集団」の段落を参照されたい）。
ある実施形態では、本発明の免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−２を分泌する抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞集団において、少なくとも１０％、好ましくは、少なくとも１５％、より好ましくは、少なくとも２０％、より好ましくは、約２２％の、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの両方を分泌する抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を誘発することができる。ある実施形態では、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの両方を分泌する多機能性抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の前記比率を、多染色性フローサイトメトリーによって決定する。そのような決定の例を、本文書の実施例１に開示する（「抗原特異的複数サイトカイン分泌型Ｔ細胞集団」の段落を参照されたい）。
ある実施形態では、本発明の免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−２を分泌する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞集団において、少なくとも３０％、好ましくは、少なくとも４０％、より好ましくは、少なくとも４５％、より好ましくは、約４７％の、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの両方を分泌する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘発することができる。ある実施形態では、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの両方を分泌する多機能性抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の前記比率を、多染色性フローサイトメトリーによって決定する。そのような決定の例を、本文書の実施例１に開示する（「抗原特異的複数サイトカイン分泌型Ｔ細胞集団」の段落を参照されたい）。
本発明の核酸を、独立型療法として使用することができる。独立型療法は、予防的または治療的に有益な結果を単一の薬剤または組成物の投与から達成することができる療法である。したがって、本明細書に開示する核酸を、感染性疾患の予防または治療において、単独で使用することができる。これは、これらの核酸が、これらの疾患の治療成果に有益である免疫応答を誘発することができるからである。本明細書で言及する方法のいくつかは、他の治療剤と組み合わせたこれらの核酸の使用に関する。
本発明の核酸を、ワクチンにおいて使用することができる。この核酸は、ワクチンにおいて使用する場合、抗原と共に投与することができる。好ましくは、この抗原は、予防または治療しようとする障害に対して特異的である。例えば、この障害が感染性疾患である場合には、この抗原は、好ましくは、感染性生物体（例えば、細菌、ウイルス、寄生生物、真菌等）に由来し、この障害に自己抗原（例えば、腫瘍、アルツハイマー病等の神経変性障害、ヒト抗体に対する抗原、またはヒト内因性レトロウイルスエレメントから発現される抗原）が関与する場合には、この抗原は、好ましくは、この抗原と関連がある特定の障害に由来する。この障害に習慣性物質が関与する場合には、この抗原は、好ましくは、この抗原と関連がある特定の習慣性物質（例えば、ニコチンハプテン）に由来する。
本明細書で使用する場合、用語「障害」と「疾患」とを互換的に使用する。
ある実施形態では、本発明は、ワクチン中でアジュバントとして使用して、疾患を治療または予防するための本発明の免疫賦活性オリゴヌクレオチドに関し、前記ワクチンは、少なくとも１つの抗原を含み、前記疾患は、多機能性抗原特異的Ｔ細胞の生成から利益を得る。
ＣＰＧ ＯＤＮ２４５５５は、ＣＰＧ ＯＤＮ１０１０３を用いて得られた抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞集団と比較して、より高い比率の、ＩＦＮ−γを産生する抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を誘発することが見出された。また、ＣＰＧ ＯＤＮ１０１０３またはＣＰＧ ＯＤＮ７９０９を用いて得られた抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞集団と比較して、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの両方、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の両方、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２の両方を産生する多機能性抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞が、またはＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２の三重産生細胞さえもがより高い比率で得られた。また、ＣＰＧ ＯＤＮ１０１０３またはＣＰＧ ＯＤＮ７９０９を用いて得られた抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞集団と比較して、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の両方、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２の両方を産生する多機能性抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が、またはＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２の三重産生細胞さえもがより高い比率で得られた。
ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２は、多様な疾患に関与することが示されている。例えば、ＴＮＦ−αは、癌に関与することが示されており、ＩＦＮ−γは、ウイルス感染症等の感染性疾患に関与することが示されている。したがって、ある実施形態では、本発明は、ワクチン中でアジュバントとして使用して、癌を治療または予防するための本発明の免疫賦活性オリゴヌクレオチドに関する。ある実施形態では、本発明は、ワクチン中でアジュバントとして使用して、癌を治療または予防するための本発明の免疫賦活性オリゴヌクレオチドに関し、前記ワクチンは、少なくとも１つの腫瘍抗原、好ましくは、本明細書に開示する腫瘍抗原のうちのいずれかを含む。
ある実施形態では、本発明は、ワクチン中でアジュバントとして使用して、感染性疾患を治療または予防するための本発明の免疫賦活性オリゴヌクレオチドに関する。ある実施形態では、本発明は、ワクチン中でアジュバントとして使用して、感染性疾患を治療または予防するための本発明の免疫賦活性オリゴヌクレオチドに関し、前記ワクチンは、少なくとも１つの微生物抗原、好ましくは、本明細書に開示する微生物抗原のうちのいずれかを含む。
これらの免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、本発明のいくつかの態様では、感染症（すなわち、感染性疾患）、自己抗原と関連がある障害、または習慣性物質と関連がある障害の予防のための予防ワクチンとして有用である。好ましくは、予防ワクチン接種は、このワクチンが求められる状態を有すると診断されていない対象、より好ましくは、これらの状態のうちの１つを発症するリスクがあるとみなされているそれらの対象において使用する。例えば、この対象は、感染性生物体による感染症を発症するリスクがある対象、または自己抗原と関連がある障害に対して感受性である対象、または習慣性物質と関連がある障害に対して感受性である対象であり得る。
本明細書で使用する場合、リスクがある対象は、感染症を引き起こす病原体への曝露、自己抗原と関連がある障害、または習慣性物質と関連がある障害のうちのいずれかのリスクを有する対象である。また、リスクがある対象は、そのような障害を発症する素因を有する対象も含む。いくつかの素因は、遺伝子に関する場合がある（したがって、遺伝子解析または家族歴のいずれかにより同定することができる）。いくつかの素因は環境に関する（例えば、感染性病原体、自己抗原または習慣性物質への以前の曝露）。感染症を発症するリスクがある対象の場合、そのような対象の例には、特定の型の感染性病原体が見出されているもしくは見出されたことがある地域で生活しているもしくはそうした地域へ旅行することが予測される対象があり、またはライフスタイルもしくは医学的手順を通して、感染性生物体を含有する恐れがある体液と接触することによって、その生物体に直接的もしくは間接的に曝露される対象があり得る。また、感染症を発症するリスクがある対象は、医療機関が特定の感染性生物体についてのワクチン接種を推奨する一般集団も含む。
対象は、獣医用薬によって治療される対象、すなわち、げっ歯類または非げっ歯類の対象である。非げっ歯類対象として、これらに限定されないが、ヒト、または脊椎動物、例として、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、霊長類（例えば、サル）、および魚（水産養殖種、例えば、サケ）が挙げられる。げっ歯類対象として、これらに限定されないが、ラットおよびマウスが挙げられる。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。
また、これらの免疫賦活性オリゴヌクレオチドを、より短期に感染症から防御するためには、抗原なしで対象に与えることもできる。この場合、反復投与により、より長期の防御が可能になるであろう。
感染症を有する対象は、感染性病原体に曝露されたことがあり、体内または体外排泄物中に、急性または慢性の検出可能なレベルのその病原体を有する対象である。これらの免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、治療に使用する場合、独立型としてまたは別の治療剤と組み合わせて使用することができる。例えば、免疫賦活性オリゴヌクレオチドを、抗原と共に治療に使用して、感染性病原体のレベルを低下させることまたは感染性病原体を根絶することができる、抗原特異的な全身性または粘膜の免疫応答を開始させることができる。
本明細書で使用する場合、感染性疾患は、体内の外来微生物の存在によって発生する疾患である。病原体の侵入の主要な部位である身体の粘膜表面を防御するために、有効なワクチン戦略および治療を開発することは特に重要である。
自己抗原と関連がある障害は、対象自体の細胞または細胞の産物の抗原であって、前記対象中で免疫応答を引き起こす抗原によって引き起こされる任意の障害である。例えば、いくつかの実施形態では、自己抗原は、腫瘍抗原、アルツハイマー病と関連がある抗原、抗体に対する抗原、またはヒト内因性レトロウイルスエレメントから発現される抗原である。腫瘍抗原は、ＨＥＲ２、ＭＡＧＥ、ＮＹＥＳＯ−１、ＰＳＡ、ＣＥＡ、またはＥＧＦＲの変異型であり得る。アルツハイマー病と関連がある抗原は、タウまたはβ−アミロイドであり得る。抗体に対する抗原は、ヒト抗体に対する抗原であり得、例えば、いくつかの実施形態では、この抗原はＩｇＥである。
いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、ＭＡＧＥ Ａ１、ＭＡＧＥ Ａ２、ＭＡＧＥ Ａ３、ＭＡＧＥ Ａ４、ＭＡＧＥ Ａ６、ＭＡＧＥ Ａ１０、ＭＡＧＥ Ａ１２、ＨＡＧＥ（ＣＴ１３）、ＢＡＧＥ、ＢＯＲＩＳ、ＳＳＸ−２、ＬＡＧＥ−１、ＣＡＭＥＬ（ＬＡＧＥ−１ 選択的リーディングフレーム）、ＧＡＧＥ１、２、３、ＴＲＡＧ−３、ＮＹ−ＥＳＯ−１、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１、チロシナーゼ、ｔｙｒｐ１（ｇｐ７５）、ｔｙｒｐ２、ｇｐ１００／ｐｍｅｌ１７、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＣＥＡ、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＰＳＭＡ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＨＥＲ−２、ＡＦＰ、ＥｐｈＡ２、ＦＧＦ−５、ｈｔｅｒｔ、ｉＣＥ、Ｌｉｖｉｎ（ＭＬ−ＩＡＰ）、ＲＡＧＥ、ＲＵ２、サバイビン、サバイビン２Ｂ、ＷＴ１、Ｔｈｏｍｓｅｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ（ＴＦ）抗原、５Ｔ４、ＰＳＣＡ、ＳＴＥＡＰ、ＴＧＲ、アディポフィリン、ＡＩＭ−２、Ｇ２５０、ＯＧＴ、ＴＧＦａＲＩＩ、ＣＯ−９５（ＫＩＡＡ１４１６）、ＣＯ−９４（ｓｅｂ４Ｄ）、ＣＯ−９（ＨＤＡＣ５）、ＣＯ−６１（ＨＩＰ１Ｒ）、ＣＯ−５８（ＫＮＳＬ６）、ＣＯ−４５、ＣＯ−４２（ＴＲＩＰ４）、ＣＯ−４１（ＭＢＤ２）、Ｒｅｎ−３２（ラミンＣ）、ＴＮＫＬ（ＢＣ−２０３）、ＣＯ−２６（ＭＮＫ１）、ＳＤＣＣＡＧ３、ＧＡ７３３−２、ＳＴｎ、ＣＡ１２５、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＢＣＲ−ａｂｌ、高親和性葉酸受容体、メソテリン、ｈＣＧ、ＦＡＰアルファ、サイクリン１、トポイソメラーゼ、セルピンＢ５／マスピン、レグマイン、ＣＤＫ４、ＰＲＡＭＥ、ＡＤＡＭ１７、ＥＤＤＲ１、ＣＤＣ２、複製プロテインＡ、ＣＤＫ２、ＧＭ２、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＴＦ（ｃ）、Ｌｅｙ、Ｔｎ（ｃ）、ＳＴｎ（ｃ）、ＧＤ２、ＧＤ３またはＧＤ３Ｌである。
習慣性物質と関連がある障害は、対象に習慣性物質に対する耽溺を発症させる化学物質または生物学的物質が関与する任意の障害である。例えば、いくつかの実施形態では、習慣性物質は、ニコチンまたはコカインであり得る。いくつかの実施形態では、ニコチン抗原は、担体にコンジュゲートさせたニコチンハプテンであり得る。いくつかの実施形態では、ニコチンハプテンをコンジュゲートさせる担体は、ジフテリア毒素である。
本明細書で使用する場合、感染性疾患に関して使用する場合の用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療した（ｔｒｅａｔｅｄ）」または「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、対象（感染症のリスクがある対象）の、病原体による感染症に対する耐性を増加させる、すなわち、その対象がその病原体に感染する可能性を減少させる予防的治療、および感染症と闘う、例えば、感染症を低下させるもしくは排除する、または感染症が悪化するのを阻止するための、対象（感染を経験している対象）が感染してしまった後の治療を指す。
自己抗原と関連がある障害に関して使用する場合の用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療した（ｔｒｅａｔｅｄ）」または「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、対象（自己抗原と関連がある障害のリスクがある対象）の、そのような障害の発症に対する耐性を増加させるまたはその対象が自己抗原と関連がある障害を発症する可能性を減少させる予防的治療、および障害の作用を低下させる、例えば、障害と関連がある徴候もしくは症状を低下させるもしくは排除する、またはそれらの徴候もしくは症状が悪化するのを阻止するための、対象（自己抗原と関連がある障害のリスクがある対象）がそのような障害を発症してしまったまたはそのような障害を発症する徴候もしくは症状を発症し始めてしまった後の治療を指す。
習慣性物質と関連がある障害に関して使用する場合の用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療した（ｔｒｅａｔｅｄ）」または「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、対象（習慣性物質と関連がある障害のリスクがある対象）の、そのような障害の発症に対する耐性を増加させるまたはその対象が習慣性物質と関連がある障害を発症する可能性を減少させる予防的治療、および障害の作用を低下させる、例えば、障害と関連がある徴候もしくは症状を低下させるもしくは排除する、またはそれらの徴候もしくは症状が悪化するのを阻止するための、対象（習慣性物質と関連がある障害のリスクがある対象）がそのような障害を発症してしまったまたはそのような障害を発症する徴候もしくは症状を発症し始めてしまった後の治療を指す。
対象のまたは本明細書に記載する免疫賦活性オリゴヌクレオチドを用いた治療の結果、感染症の低下もしくは感染症の完全な無効化、自己抗原と関連がある障害と関連がある徴候／症状の低下もしくはその障害についての完全な無効化、または習慣性物質と関連がある障害と関連がある徴候／症状の低下もしくはその障害の完全な無効化が得られる。そのような治療の結果として、感染性疾患、自己抗原と関連がある障害、または習慣性物質と関連がある障害に関連するそのような症状が低下した、管理されている、または無効化した場合には、対象を治療されたとみなすことができる。また、感染性疾患の場合には、そのような治療は、対象中に存在する感染性病原体の量の低下も包含する（例えば、そのような量は、ＥＬＩＳＡ等の当業者に既知の標準的なアッセイを使用して測定することができる）。また、自己抗原と関連がある障害の場合には、そのような治療は、対象中に存在する自己抗原の量の低下または自己抗原の結果として誘発された免疫応答の低下も包含する。また、習慣性物質と関連がある障害の場合には、習慣性物質に対する耽溺と関連がある徴候／症状の低下も包含する。
本明細書で使用する場合、「抗原」は、免疫応答を誘発することができる分子である。抗原として、これらに限定されないが、細胞、細胞抽出物、タンパク質、組換えタンパク質、精製タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖、多糖コンジュゲート、ペプチドおよび非ペプチドの多糖模倣物、ならびにプラスミドＤＮＡがコードする他の分子、ハプテン、低分子、脂質、糖脂質、炭水化物、死滅させた全病原体、ウイルスおよびウイルス抽出物、弱毒化生ウイルスもしくはウイルスベクター、弱毒化生細菌もしくは細菌ベクター、ならびに寄生生物等の多細胞生物体、ならびにアレルゲンが挙げられる。抗原という用語は、宿主免疫系が外来性であると認識する任意の型の分子を広く含む。抗原として、これらに限定されないが、微生物抗原、自己抗原および習慣性物質が挙げられる。
いくつかの態様では、抗原を担体にコンジュゲートさせる。いくつかの実施形態では、この担体は、ジフテリア毒素またはウイルス様粒子である。いくつかの実施形態では、ウイルス様粒子は、ＲＮＡファージＱ−β、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、またはＢ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）から構成される。
本明細書で使用する場合、「微生物抗原」は、微生物の抗原であり、それらとして、これらに限定されないが、ウイルス、細菌、寄生生物および真菌が挙げられる。いくつかの実施形態では、細菌抗原は、細菌の黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）と関連がある抗原である。他の実施形態では、細菌抗原は、う歯を引き起こす細菌、例えば、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）、ストレプトコッカス・サンギス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｓ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、またはアクチノミセス・ビスコーサス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓ）と関連がある抗原である。いくつかの実施形態では、細菌抗原は、歯周疾患を引き起こす細菌、例えば、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、またはアクチノバチルス・アクチノミセタムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）と関連がある抗原である。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原は、呼吸器多核体ウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）（ＲＳＶ）、単純ヘルペスウイルス１（Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ１）（ＨＳＶ１）、単純ヘルペスウイルス２（Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ２）（ＨＳＶ２）、またはヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ）−１（ＨＩＶ−１）もしくはＨＩＶ−２と関連がある抗原である。いくつかの実施形態では、寄生生物抗原は、マラリアを引き起こす寄生生物と関連がある抗原である。
そのような抗原は、未変化の微生物、ならびに天然の分離株およびそれらの断片または誘導体を含み、また、天然の微生物抗原と同一であるかもしくはそれに類似し、その微生物に特異的な免疫応答を誘発する合成化合物も含む。化合物は、天然の微生物抗原に対して（液性および／または細胞性の）免疫応答を誘発する場合、天然の微生物抗原に類似する。そのような抗原は、当技術分野では日常的に使用され、当業者には周知である。
本発明のいくつかの態様では、対象は、抗原「に曝露される」。本明細書で使用する場合、用語「に曝露される」は、対象を抗原と接触させる能動的なステップまたはｉｎ ｖｉｖｏにおける対象の抗原への受動的な曝露のいずれかを指す。対象を抗原に能動的に曝露する方法は、当技術分野では周知である。一般に、抗原を、静脈内、筋肉内、経口、経皮、粘膜、鼻腔内、気管内または皮下への投与等の任意の手段によって対象に直接投与する。抗原は、局所または全身に投与することができる。この抗原およびこの免疫賦活性オリゴヌクレオチドを投与するための方法を、以下により詳細に記載する。抗原が、体内の免疫細胞への曝露のために利用可能になった場合、対象は、抗原に受動的に曝露される。対象は、例えば、外来の病原体の身体への侵入によって、抗原に受動的に曝露され得る。
対象を抗原に受動的に曝露させる方法は、この免疫賦活性オリゴヌクレオチドの投与のタイミングに特に依存し得る。例えば、感染性疾患を発症するリスクがある対象においては、このリスクが最も高いときに、この免疫賦活性オリゴヌクレオチドを、対象に定期的に投与することができる。さらに、この免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、旅行者が、彼らが感染性病原体に曝露されるリスクがある外国へ旅行する前に、それらの旅行者に投与することもできる。また、この免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、対象が生物戦に曝露された際に全身性または粘膜の免疫応答を誘発するそうした生物戦に曝露されるリスクがある軍人または民間人に投与することもできる。
ヒトに見出されているウイルスの例として、これらに限定されないが、レトロウイルス科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ）、例として、ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶもしくはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、またはＨＩＶ−ＩＩＩとも呼ばれる；およびＨＩＶ−ＬＰ等の他の分離株）；ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス（ｐｏｌｉｏ ｖｉｒｕｓ）、Ａ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ａ ｖｉｒｕｓ）；エンテロウイルス（ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）、ヒトコクサッキーウイルス（ｈｕｍａｎ Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ ｖｉｒｕｓ）、ライノウイルス（ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）、エコーウイルス（ｅｃｈｏｖｉｒｕｓ））；カリシウイルス科（例えば、胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科（例えば、ウマ脳炎ウイルス（ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、風疹ウイルス（ｒｕｂｅｌｌａ ｖｉｒｕｓ））；フラビウイルス科（例えば、デングウイルス（ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ）、脳炎ウイルス（ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、黄熱病ウイルス（ｙｅｌｌｏｗ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ））；コロナウイルス科（例えば、コロナウイルス（ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ））；ラブドウイルス科（例えば、水疱性口内炎ウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、狂犬病ウイルス（ｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ））；フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス（ｅｂｏｌａ ｖｉｒｕｓ））；パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザウイルス（ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）、流行性耳下腺炎ウイルス（ｍｕｍｐｓ ｖｉｒｕｓ）、麻疹ウイルス（ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ）、呼吸器多核体ウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ））；オルソミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ））；ブニヤウイルス科（例えば、ハンタウイルス（Ｈａｎｔａａｎ ｖｉｒｕｓ）、ブニヤウイルス（ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓ）、フレボウイルス（ｐｈｌｅｂｏｖｉｒｕｓ）およびナイロウイルス（Ｎａｉｒｏ ｖｉｒｕｓ））；アレナウイルス科（出血熱ウイルス（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ））；レオウイルス科（例えば、レオウイルス（ｒｅｏｖｉｒｕｓ）、オルビウイルス（ｏｒｂｉｖｉｒｕｓ）およびロタウイルス（ｒｏｔａｖｉｒｕｓ））；ビルナウイルス科；ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ））；パルボウイルス科（パルボウイルス（ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ））；パポバウイルス科（パピローマウイルス（ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ）、ポリオーマウイルス（ｐｏｌｙｏｍａ ｖｉｒｕｓ））；アデノウイルス科（大部分のアデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ））；ヘルペスウイルス科（単純ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｓ ｖｉｒｕｓ）（ＨＳＶ）１および２、水痘帯状疱疹ウイルス（ｖａｒｉｃｅｌｌａ ｚｏｓｔｅｒ ｖｉｒｕｓ）、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｔａｌｏｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ））；ポックスウイルス科（痘瘡ウイルス（ｖａｒｉｏｌａ ｖｉｒｕｓ）、ワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ）、ポックスウイルス（ｐｏｘ ｖｉｒｕｓ））；さらにイリドウイルス科（例えば、アフリカブタ熱ウイルス（Ａｆｒｉｃａｎ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ））；さらに未分類のウイルス（例えば、海面状脳症の病原体、デルタ肝炎の病原体（Ｂ型肝炎ウイルスの不完全サテライトと考えられている）、非Ａ型、非Ｂ型肝炎の病原体（クラス１＝内部感染性；クラス２＝非経口感染性（すなわち、Ｃ型肝炎）；ノーウォークウイルス（Ｎｏｒｗａｌｋ ｖｉｒｕｓ）および関連のウイルス、ならびにアストロウイルス（ａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ））が挙げられる。いくつかの実施形態では、これらのウイルスは、呼吸器多核体ウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）（ＲＳＶ）、単純ヘルペスウイルス１（Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ１）（ＨＳＶ１）、単純ヘルペスウイルス２（Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ２）（ＨＳＶ２）、ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ）−１（ＨＩＶ−１）またはＨＩＶ−２である。
本明細書に記載する微生物抗原の多くが、ヒト障害に関連するが、また、本発明は、他の非ヒト脊椎動物の治療にも有用である。また、非ヒト脊椎動物も、本明細書に開示する免疫賦活性核酸を用いて予防または治療することができる感染症を発症することが可能である。例えば、感染性ヒト疾患の治療に加えて、本発明の方法は、動物の感染症の治療にも有用である。
グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌の両方が、脊椎動物においては抗原として役立つ。そのようなグラム陽性細菌として、これらに限定されないが、パスツレラ属菌種、ブドウ球菌属菌種および連鎖球菌属菌種が挙げられる。グラム陰性細菌として、これらに限定されないが、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、シュードモナス属菌種およびサルモネラ属菌種が挙げられる。感染性細菌の具体的な例として、これらに限定されないが、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、マイコバクテリア属菌種（例えば、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｅ）、カンサシ菌（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、マイコバクテリウム・ゴルドナエ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ））、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、ナイセリア・ゴノレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ａ群連鎖球菌）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（Ｂ群連鎖球菌）、連鎖球菌属（ビリダンス群）、ストレプトコッカス・フェカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ）、連鎖球菌属（嫌気性菌種）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、病原性カンピロバクター属菌種、エンテロコッカス属菌種、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、バチルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、コリネバクテリウム・ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コリネバクテリウム属菌種、ブタ丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、エンテロバクター・エロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｕｅｍｏｎｉａｅ）、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｕｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、バクテロイデス属菌種、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、ストレプトバチルス・モニリフォルミス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、トレポネーマ・ペルテニュ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｅｒｔｅｎｕｅ）、レプトスピラ属、リケッチア属、およびアクチノマイセス・イスラエリイ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｌｉ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、細菌は、う歯を引き起こす細菌、例えば、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）、ストレプトコッカス・サンギス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｓ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、またはアクチノミセス・ビスコーサス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓ）である。他の実施形態では、細菌は、歯周疾患を引き起こす細菌、例えば、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、またはアクチノバチルス・アクチノミセタムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）である。
細菌性病原体のポリペプチドとして、これらに限定されないが、フルンケル症を引き起こすエロモナス・サルモニシダ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）の鉄調節外膜タンパク質（ＩＲＯＭＰ）、外膜タンパク質（ＯＭＰ）およびＡ−タンパク質、細菌性腎臓疾患（ＢＫＤ）を引き起こす細菌性腎臓病菌（Ｒｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｌｍｏｎｉｎａｒｕｍ）のｐ５７タンパク質、エルシニア症の主要表面関連抗原（ｍａｊｏｒ ｓｕｒｆａｃｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ）（ｍｓａ）、表面発現細胞毒（ｍｐｒ）、表面発現ヘモリジン（ｉｓｈ）および鞭毛抗原；パスツレラ症の細胞外タンパク質（ＥＣＰ）、ＩＲＯＭＰおよび構造タンパク質；ビブロシス・アングイラルム（Ｖｉｂｒｏｓｉｓ ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ）およびビブロシス・オルダリイ（Ｖ．ｏｒｄａｌｉｉ）のＯＭＰおよび鞭毛タンパク質；エドワルドシエロシス・イクタルリ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌｏｓｉｓ ｉｃｔａｌｕｒｉ）およびエドワルドシエロシス・タルダ（Ｅ．ｔａｒｄａ）の鞭毛タンパク質、ＯＭＰタンパク質、ａｒｏＡおよびｐｕｒＡ；ならびにイクチオフチリウス属（Ｉｃｈｔｈｙｏｐｈｔｈｉｒｉｕｓ）の表面抗原；ならびにサイトファーガ・カラムナリス（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ ｃｏｌｕｍｎａｒｉｓ）の構造タンパク質および調節タンパク質；ならびにリケッチアの構造タンパク質および調節タンパク質が挙げられる。
真菌の例として、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）、ブラストミセス・デルマチチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、クラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）が挙げられる。他の感染性生物体（すなわち、原生生物）として、マラリア属菌種、例として、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ）、三日熱マラリア（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）およびトキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）が挙げられる。血液媒介寄生生物および／または組織寄生生物として、マラリア属菌種、ネズミバベシア（Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ）、多型バベシア（Ｂａｂｅｓｉａ ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）、熱帯リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔｒｏｐｉｃａ）、リーシュマニア属菌種、ブラジルリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ドノバンリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ）、ガンビアトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｇａｍｂｉｅｎｓｅ）およびローデシアトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅ）（アフリカ睡眠病）、クルーズトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）（シャーガス病）、ならびにトキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、寄生生物は、マラリアと関連がある寄生生物である。他の医学的に関連性のある微生物が、文献に広範に記載されており、例えば、Ｃ．Ｇ．Ａ Ｔｈｏｍａｓ、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂａｉｌｌｉｅｒｅ Ｔｉｎｄａｌｌ、Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ １９８３を参照されたい。
非ヒト脊椎動物を治療するための多くのワクチンが、Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｋ．、Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、３版、Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍｓ，Ｉｎｃ．、１９９５に開示されている。上記したように、抗原は、感染性微生物、例として、天然の供給源に由来するかまたは合成されたウイルス、寄生生物、細菌および真菌、ならびにそれらの断片を含む。ヒトおよび非ヒト脊椎動物の両方の感染性ウイルスは、レトロウイルス、ＲＮＡウイルスおよびＤＮＡウイルスを含む。この群のレトロウイルスは、単純型レトロウイルスおよび複雑型レトロウイルスの両方を含む。これらの単純型レトロウイルスは、Ｂ型レトロウイルス、Ｃ型レトロウイルスおよびＤ型レトロウイルスのサブグループを含む。Ｂ型レトロウイルスの例が、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）である。これらのＣ型レトロウイルスは、Ｃ型Ａ群のサブグループ（ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）（ＲＳＶ）、トリ白血病ウイルス（ａｖｉａｎ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）（ＡＬＶ）およびトリ骨髄芽球症ウイルス（ａｖｉａｎ ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＡＭＶ）を含む）、ならびにＣ型Ｂ群のサブグループ（ネコ白血病ウイルス（ｆｅｌｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）（ＦｅＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ｇｉｂｂｏｎ ａｐｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）（ＧＡＬＶ）、脾臓壊死ウイルス（ｓｐｌｅｅｎ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＳＮＶ）、細網内皮症ウイルス（ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＲＶ）およびサル肉腫ウイルス（ｓｉｍｉａｎ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）（ＳＳＶ）を含む）を含む。これらのＤ型レトロウイルスは、マソン・ファイザー・サルウイルス（Ｍａｓｏｎ−Ｐｆｉｚｅｒ ｍｏｎｋｅｙ ｖｉｒｕｓ）（ＭＰＭＶ）およびサルレトロウイルス１型（ｓｉｍｉａｎ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １）（ＳＲＶ−１）を含む。これらの複雑型レトロウイルスは、レンチウイルス、Ｔ細胞白血病ウイルスおよび泡沫状ウイルスのサブグループを含む。レンチウイルスは、ＨＩＶ−１を含むが、また、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ビスナウイルス（Ｖｉｓｎａ ｖｉｒｕｓ）、ネコ免疫不全ウイルス（ｆｅｌｉｎｅ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）（ＦＩＶ）およびウマ伝染性貧血ウイルス（ｅｑｕｉｎｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｎｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）（ＥＩＡＶ）も含む。これらのＴ細胞白血病ウイルスは、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−ＩＩ、サルＴ細胞白血病ウイルス（ｓｉｍｉａｎ Ｔ−ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）（ＳＴＬＶ）およびウシ白血病ウイルス（ｂｏｖｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）（ＢＬＶ）を含む。これらの泡沫状ウイルスは、ヒト泡沫状ウイルス（ｈｕｍａｎ ｆｏａｍｙ ｖｉｒｕｓ）（ＨＦＶ）、サル泡沫状ウイルス（ｓｉｍｉａｎ ｆｏａｍｙ ｖｉｒｕｓ）（ＳＦＶ）およびウシ泡沫状ウイルス（ｂｏｖｉｎｅ ｆｏａｍｙ ｖｉｒｕｓ）（ＢＦＶ）を含む。
脊椎動物において抗原となる他のＲＮＡウイルスの例として、これらに限定されないが、レオウイルス科のメンバーが挙げられ、それらは、オルトレオウイルス属（哺乳動物およびトリの両方のレトロウイルスの複数の血清型）、オルビウイルス属（ブルータングウイルス（Ｂｌｕｅｔｏｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ）、ユージナンジーウイルス（Ｅｕｇｅｎａｎｇｅｅ ｖｉｒｕｓ）、ケメロボウイルス（Ｋｅｍｅｒｏｖｏ ｖｉｒｕｓ）、アフリカ馬疫ウイルス（Ａｆｒｉｃａｎ ｈｏｒｓｅ ｓｉｃｋｎｅｓｓ ｖｉｒｕｓ）およびコロラドダニ熱ウイルス（Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｔｉｃｋ Ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ））、ロタウイルス属（ヒトロタウイルス（ｈｕｍａｎ ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）、ネブラスカ仔牛下痢症ウイルス（Ｎｅｂｒａｓｋａ ｃａｌｆ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ）、サルロタウイルス（ｓｉｍｉａｎ ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）、ウシロタウイルス（ｂｏｖｉｎｅ ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）またはヒツジロタウイルス（ｏｖｉｎｅ ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）、トリロタウイルス（ａｖｉａｎ ｒｏｔａｖｉｒｕｓ））を含み；ピコルナウイルス科のメンバーが挙げられ、それらは、エンテロウイルス属（ポリオウイルス（ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ）、コクサッキーウイルスＡ（Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ ｖｉｒｕｓ Ａ）およびコクサッキーウイルスＢ（Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ ｖｉｒｕｓ Ｂ）、腸管内皮細胞ヒト由来みなしごウイルス（ｅｎｔｅｒｉｃ ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｈｕｍａｎ ｏｒｐｈａｎ （ＥＣＨＯ） ｖｉｒｕｓ）、Ａ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ａ ｖｉｒｕｓ）、サルエンテロイウルス（Ｓｉｍｉａｎ ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）、マウス脳脊髄炎（ＭＥ）ウイルス（Ｍｕｒｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、ポリオウイルス・ムリス（Ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ ｍｕｒｉｓ）、ウシエンテロウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）、ブタエンテロウイルス（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ））、カルジオウイルス属（脳心筋炎ウイルス（Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＥＭＣ）、メンゴウイルス（Ｍｅｎｇｏｖｉｒｕｓ）、ライノウイルス属（少なくとも１１３個のサブタイプを含むヒトライノウイルス（Ｈｕｍａｎ ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）；他のライノウイルス）、口蹄疫ウイルス属（口蹄疫ウイルス（Ｆｏｏｔ ａｎｄ Ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）（ＦＭＤＶ））を含み；カリシウイルス科のメンバーが挙げられ、それらは、ブタ水疱疹ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｅｘａｎｔｈｅｍａ ｏｆ ｓｗｉｎｅ ｖｉｒｕｓ）、サンミゲルアシカウイルス（Ｓａｎ Ｍｉｇｕｅｌ ｓｅａ ｌｉｏｎ ｖｉｒｕｓ）、ネコピコルナウイルス（Ｆｅｌｉｎｅ ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ）およびノーウォークウイルス（Ｎｏｒｗａｌｋ ｖｉｒｕｓ）を含み；トガウイルス科のメンバーが挙げられ、それらは、アルファウイルス属（東部ウマ脳炎ウイルス（Ｅａｓｔｅｒｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、セムリキ森林ウイルス（Ｓｅｍｌｉｋｉ ｆｏｒｅｓｔ ｖｉｒｕｓ）、シンドビスウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ ｖｉｒｕｓ）、チクングニアウイルス（Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ ｖｉｒｕｓ）、オニョンニョンウイルス（Ｏ’Ｎｙｏｎｇ−Ｎｙｏｎｇ ｖｉｒｕｓ）、ロスリバーウイルス（Ｒｏｓｓ ｒｉｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、西部ウマ脳炎ウイルス（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、フラビウイルス属（蚊媒介黄熱病ウイルス（Ｍｏｓｑｕｉｔｏ ｂｏｒｎｅ ｙｅｌｌｏｗ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）、デングウイルス（Ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ）、日本脳炎ウイルス（Ｊａｐａｎｅｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、セントルイス脳炎ウイルス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、マレー渓谷脳炎ウイルス（Ｍｕｒｒａｙ Ｖａｌｌｅｙ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、西ナイルウイルス（Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ ｖｉｒｕｓ）、クンジンウイルス（Ｋｕｎｊｉｎ ｖｉｒｕｓ）、中央ヨーロッパダニ媒介性ウイルス（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｔｉｃｋ ｂｏｒｎｅ ｖｉｒｕｓ）、極東ダニ媒介性ウイルス（Ｆａｒ Ｅａｓｔｅｒｎ ｔｉｃｋ ｂｏｒｎｅ ｖｉｒｕｓ）、キャサヌール森林ウイルス（Ｋｙａｓａｎｕｒ ｆｏｒｅｓｔ ｖｉｒｕｓ）、跳躍病ウイルス（Ｌｏｕｐｉｎｇ Ｉｌｌ ｖｉｒｕｓ）、ポワッサンウイルス（Ｐｏｗａｓｓａｎ ｖｉｒｕｓ）、オムスク出血熱ウイルス（Ｏｍｓｋ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ））、ルビウイルス属（風疹ウイルス（Ｒｕｂｅｌｌａ ｖｉｒｕｓ））、ペスチウイルス属（粘膜病ウイルス（Ｍｕｃｏｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）、ブタコレラウイルス（Ｈｏｇ ｃｈｏｌｅｒａ ｖｉｒｕｓ）、ボーダー病ウイルス（Ｂｏｒｄｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ））を含み；ブニヤウイルス科のメンバーが挙げられ、それらは、ブニヤウイルス属（ブニヤムウェラウイルス（Ｂｕｎｙａｍｗｅｒａ ｖｉｒｕｓ）および関連ウイルス、カリフォルニア脳炎群ウイルス（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｇｒｏｕｐ ｖｉｒｕｓ）、フレボウイルス属（サシチョウバエ熱ウイルス（Ｓａｎｄｆｌｙ ｆｅｖｅｒ Ｓｉｃｉｌｉａｎ ｖｉｒｕｓ）、リフトバレー熱ウイルス（Ｒｉｆｔ Ｖａｌｌｅｙ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ））、ナイロウイルス属（クリミア−コンゴ出血熱ウイルス（Ｃｒｉｍｅａｎ−Ｃｏｎｇｏ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）、ナイロビ羊病ウイルス（Ｎａｉｒｏｂｉ ｓｈｅｅｐ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ））、ならびにウークウイルス属（ウークニエミウイルス（Ｕｕｋｕｎｉｅｍｉ ｖｉｒｕｓ）および関連ウイルス）を含み；オルソミクソウイルス科のメンバーが挙げられ、それらは、インフルエンザウイルス属（インフルエンザウイルスＡ型（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ Ａ）、多くのヒトサブタイプ；ブタインフルエンザウイルス（Ｓｗｉｎｅ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）およびトリインフルエンザウイルス（Ａｖｉａｎ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）およびウマインフルエンザウイルス（Ｅｑｕｉｎｅ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）；インフルエンザＢ型（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ Ｂ）（多くのヒトサブタイプ）、ならびにインフルエンザＣ型（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ Ｃ）（別個の属の可能性もある））を含み；パラミクソウイルス科のメンバーが挙げられ、それらは、パラミクソウイルス属（パラインフルエンザウイルス１型（Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｔｕｐｅ １）、センダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ）、赤血球吸着ウイルス（Ｈｅｍａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｖｉｒｕｓ）、パラインフルエンザウイルス（Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）２〜５型、ニューカッスル病ウイルス（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｖｉｒｕｓ）、流行性耳下腺炎ウイルス（Ｍｕｍｐｓ ｖｉｒｕｓ））、モルビリウイルス属（麻疹ウイルス（Ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ）、亜急性硬化性全脳炎ウイルス（ｓｕｂａｃｕｔｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ ｐａｎｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、ジステンパーウイルス（ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ）、牛疫ウイルス（Ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ ｖｉｒｕｓ））、ニューモウイルス属（呼吸器多核体ウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）（ＲＳＶ）、ウシ呼吸器多核体ウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）および肺炎ウイルス（Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ｖｉｒｕｓ））を含み；ラブドウイルス科のメンバーが挙げられ、それらは、ベジクロウイルス属（ＶＳＶ）、チャンディプラウイルス（Ｃｈａｎｄｉｐｕｒａ ｖｉｒｕｓ）、フランダース−ハートパークウイルス（Ｆｌａｎｄｅｒｓ−Ｈａｒｔ Ｐａｒｋ ｖｉｒｕｓ））、リッサウイルス属（狂犬病ウイルス（Ｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ））、魚のラブドウイルス（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）ならびにラブドウイルスと推定される２つのウイルス（マールブルグウイルス（Ｍａｒｂｕｒｇ ｖｉｒｕｓ）およびエボラウイルス（Ｅｂｏｌａ ｖｉｒｕｓ））を含み；アレナウイルス科のメンバーが挙げられ、それらは、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｃｈｏｒｉｏｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＬＣＭ）、タカリベウイルス（Ｔａｃａｒｉｂｅ ｖｉｒｕｓ）複合体およびラッサウイルス（Ｌａｓｓａ ｖｉｒｕｓ）を含み；コロナウイルス科のメンバーが挙げられ、それらは、伝染性気管支炎ウイルス（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ）（ＩＢＶ）、肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、ヒト腸コロナウイルス（Ｈｕｍａｎ ｅｎｔｅｒｉｃ ｃｏｒｏｎａ ｖｉｒｕｓ）およびネコ伝染性腹膜炎ウイルス（Ｆｅｌｉｎｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｐｅｒｉｔｏｎｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ネココロナウイルス（Ｆｅｌｉｎｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ））を含む。
脊椎動物において抗原となる例示的なＤＮＡウイルスとして、これらに限定されないが、ポックスウイルス科が挙げられ、それらは、オルソポックスウイルス属（大痘瘡ウイルス（Ｖａｒｉｏｌａ ｍａｊｏｒ ｖｉｒｕｓ）、小痘瘡ウイルス（Ｖａｒｉｏｌａ ｍｉｎｏｒ ｖｉｒｕｓ）、サル痘ワクチニアウイルス（Ｍｏｎｋｅｙ ｐｏｘ Ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ）、牛痘ウイルス（Ｃｏｗｐｏｘ ｖｉｒｕｓ）、水牛痘ウイルス（Ｂｕｆｆａｌｏｐｏｘ ｖｉｒｕｓ）、ウサギ痘ウイルス（Ｒａｂｂｉｔｐｏｘ ｖｉｒｕｓ）、エクトロメリアウイルス（Ｅｃｔｒｏｍｅｌｉａ ｖｉｒｕｓ））、レポリポックスウイルス属（粘液腫ウイルス（Ｍｙｘｏｍａ ｖｉｒｕｓ）、線維腫ウイルス（Ｆｉｂｒｏｍａ ｖｉｒｕｓ））、トリポックスウイルス属（鶏痘ウイルス（Ｆｏｗｌｐｏｘ ｖｉｒｕｓ）、他のトリポックスウイルス）、カプリポックスウイルス属（羊痘ウイルス（ｓｈｅｅｐｐｏｘ ｖｉｒｕｓ）、山羊痘ウイルス（ｇｏａｔｐｏｘ ｖｉｒｕｓ））、ブタポックスウイルス属（ブタポックスウイルス（Ｓｗｉｎｅｐｏｘ ｖｉｒｕｓ））、パラポックスウイルス属（伝染性膿胞性皮膚炎ウイルス（ｃｏｎｔａｇｉｏｕｓ ｐｕｓｔｕｌａｒ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、偽牛痘ウイルス（ｐｓｅｕｄｏｃｏｗｐｏｘ ｖｉｒｕｓ）、ウシ丘疹性口炎ウイルス（ｂｏｖｉｎｅ ｐａｐｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ））を含み；イリドウイルス科（アフリカブタ熱ウイルス（Ａｆｒｉｃａｎ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）、カエルウイルス（Ｆｒｏｇ ｖｉｒｕｓ）２および３、魚のリンホシスチス病ウイルス（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｓｔｉｓ ｖｉｒｕｓ））が挙げられ；ヘルペスウイルス科が挙げられ、それらは、アルファ−ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）１型および２型、水痘帯状疱疹ウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ−Ｚｏｓｔｅｒ ｖｉｒｕｓ）、ウマ流産ウイルス（Ｅｑｕｉｎｅ ａｂｏｒｔｉｏｎ ｖｉｒｕｓ）、ウマヘルペスウイルス（Ｅｑｕｉｎｅ ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ）２および３、仮性狂犬病ウイルス（ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ）、ウシ伝染性角結膜炎ウイルス（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｏｖｉｎｅ ｋｅｒａｔｏｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、ウシ伝染性鼻気管炎ウイルス（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｏｖｉｎｅ ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、ネコ鼻腔気管炎ウイルス（ｆｅｌｉｎｅ ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｌａｒｙｎｇｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ））；ベータ−ヘルペスウイルス（ヒトサイトメガロウイルス（Ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）ならびにブタおよびサルのサイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ））；ガンマ−ヘルペスウイルス（エプスタイン−バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）（ＥＢＶ）、マレック病ウイルス（Ｍａｒｅｋ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）、サイミリヘルペス（Ｈｅｒｐｅｓ ｓａｉｍｉｒｉ）ウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ ｓａｉｍｉｒｉ）、アテレスヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ａｔｅｌｅ）、ワタオウサギヘルペスウイル（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ｓｙｌｖｉｌａｇｕｓ）、モルモットヘルペスウイルス（ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ）、ラック腫瘍ウイルス（Ｌｕｃｋｅ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓ））を含み；アデノウイルス科が挙げられ、それらは、マストアデノウイルス属（ヒトサブグループＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅおよび未分類；サルのアデノウイルス（少なくとも２３個の血清型）、伝染性イヌ肝炎ウイルス（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｃａｎｉｎｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、ならびにウシ、ブタ、ヒツジ、カエルおよび多くの他の種のアデノウイルス）、トリアデノウイルス属（トリのアデノウイルス）；さらに培養不可能なアデノウイルスを含み；パポバウイルス科が挙げられ、それらは、パピローマウイルス属（ヒトパピローマウイルス（Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ）、ウシパピローマウイルス（ｂｏｖｉｎｅ ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ）、ショープウサギパピローマウイルス（Ｓｈｏｐｅ ｒａｂｂｉｔ ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ）、および他の種の種々の病原性パピローマウイルス）、ポリオーマウイルス属（ポリオーマウイルス、サルの空胞化病原体（ＳＶ−４０）、ウサギの空胞化病原体（ＲＫＶ）、Ｋウイルス（Ｋ ｖｉｒｕｓ）、ＢＫウイルス（ＢＫ ｖｉｒｕｓ）、ＪＣウイルス（ＪＣ ｖｉｒｕｓ）、および他の霊長類ポリオーマウイルス（ｐｏｌｙｏｍａ ｖｉｒｕｓ）、例として、リンパ増殖性パピローマウイルス（Ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｈｉｃ ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ））を含み；パルボウイルス科が挙げられ、それらは、アデノ随伴ウイルス属、パルボウイルス属（ネコ汎白血球減少症ウイルス（Ｆｅｌｉｎｅ ｐａｎｌｅｕｋｏｐｅｎｉａ ｖｉｒｕｓ）、ウシパルボウイルス（ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、イヌパルボウイルス（ｃａｎｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、アリューシャンミンク症ウイルス（Ａｌｅｕｔｉａｎ ｍｉｎｋ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）等）を含む。さらに、ＤＮＡウイルスは、上記の科にあてはまらないウイルス、例として、クールー病ウイルス（Ｋｕｒｕ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）およびクロイツフェルト−ヤコブ病ウイルス（Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ−Ｊａｃｏｂ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓｅｓ）、ならびに慢性伝染性神経障害病原体（ＣＨＩＮＡウイルス）も含むことができる。
ある実施形態では、本発明は、抗原特異的免疫応答を誘発する方法に関し、この方法は、抗原および本発明の免疫賦活性オリゴヌクレオチドを投与するステップを含み、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−２を分泌する抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞集団において、少なくとも４０％、好ましくは、少なくとも４５％、より好ましくは、少なくとも５０％、より好ましくは、約５３％の誘発された抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＩＦＮ−γを分泌する。ある実施形態では、ＩＦＮ−γを分泌する抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の前記比率を、多染色性フローサイトメトリーによって決定する。そのような決定の例を、本文書の実施例１に開示する（「抗原特異的複数サイトカイン分泌型Ｔ細胞集団」の段落を参照されたい）。ある実施形態では、こうした抗原および免疫賦活性オリゴヌクレオチドを、前記対象において抗原特異的免疫応答を誘発するのに有効な量で投与する。ある実施形態では、この抗原は、本明細書に開示する抗原のうちのいずれかである。
ある実施形態では、本発明は、抗原特異的免疫応答を誘発する方法に関し、この方法は、抗原および本発明の免疫賦活性オリゴヌクレオチドを投与するステップを含み、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−２を分泌する抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞集団において、少なくとも１０％、好ましくは、少なくとも１５％、より好ましくは、少なくとも２０％、より好ましくは、約２２％の誘発された抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞が、二重サイトカイン産生細胞であり、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの両方を優先的に分泌する。ある実施形態では、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの両方を分泌する抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の前記比率を、多染色性フローサイトメトリーによって決定する。そのような決定の例を、本文書の実施例１に開示する（「抗原特異的複数サイトカイン分泌型Ｔ細胞集団」の段落を参照されたい）。ある実施形態では、こうした抗原および免疫賦活性オリゴヌクレオチドを、前記対象において抗原特異的免疫応答を誘発するのに有効な量で投与する。ある実施形態では、この抗原は、本明細書に開示する抗原のうちのいずれかである。
ある実施形態では、本発明は、抗原特異的免疫応答を誘発する方法に関し、この方法は、抗原および本発明の免疫賦活性オリゴヌクレオチドを投与するステップを含み、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−２を分泌する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞集団において、少なくとも３０％、好ましくは、少なくとも４０％、より好ましくは、少なくとも４５％、より好ましくは、約４７％の誘発された抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が、二重サイトカイン産生細胞であり、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの両方を優先的に分泌する。ある実施形態では、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの両方を分泌する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の前記比率を、多染色性フローサイトメトリーによって決定する。そのような決定の例を、本文書の実施例１に開示する（「抗原特異的複数サイトカイン分泌型Ｔ細胞集団」の段落を参照されたい）。ある実施形態では、こうした抗原および免疫賦活性オリゴヌクレオチドを、前記対象において抗原特異的免疫応答を誘発するのに有効な量で投与する。ある実施形態では、この抗原は、本明細書に開示する抗原のうちのいずれかである。
ある実施形態では、本発明は、抗原に対する免疫応答を誘発するのに使用するための本発明の免疫賦活性オリゴヌクレオチドに関し、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−２を分泌する抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞集団において、少なくとも４０％、好ましくは、少なくとも４５％、より好ましくは、少なくとも５０％、より好ましくは、約５３％の誘発された抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＩＦＮ−γを分泌する。ある実施形態では、ＩＦＮ−γを分泌する抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の前記比率を、多染色性フローサイトメトリーによって決定する。そのような決定の例を、本文書の実施例１に開示する（「抗原特異的複数サイトカイン分泌型Ｔ細胞集団」の段落を参照されたい）。ある実施形態では、この抗原は、本明細書に開示する抗原のうちのいずれかである。
ある実施形態では、本発明は、抗原に対する免疫応答を誘発するのに使用するための本発明の免疫賦活性オリゴヌクレオチドに関し、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−２を分泌する抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞集団において、少なくとも１０％、好ましくは、少なくとも１５％、より好ましくは、少なくとも２０％、より好ましくは、約２２％の誘発された抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞が、二重サイトカイン産生細胞であり、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの両方を優先的に分泌する。ある実施形態では、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの両方を分泌する抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の前記比率を、多染色性フローサイトメトリーによって決定する。そのような決定の例を、本文書の実施例１に開示する（「抗原特異的複数サイトカイン分泌型Ｔ細胞集団」の段落を参照されたい）。ある実施形態では、この抗原は、本明細書に開示する抗原のうちのいずれかである。
ある実施形態では、本発明は、抗原に対する免疫応答を誘発するのに使用するための本発明の免疫賦活性オリゴヌクレオチドに関し、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−２を分泌する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞集団において、少なくとも３０％、好ましくは、少なくとも４０％、より好ましくは、少なくとも４５％、より好ましくは、約４７％の誘発された抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が、二重サイトカイン産生細胞であり、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの両方を優先的に分泌する。ある実施形態では、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの両方を分泌する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の前記比率を、多染色性フローサイトメトリーによって決定する。そのような決定の例を、本文書の実施例１に開示する（「抗原特異的複数サイトカイン分泌型Ｔ細胞集団」の段落を参照されたい）。ある実施形態では、この抗原は、本明細書に開示する抗原のうちのいずれかである。
ある実施形態では、本発明は、ワクチン中でアジュバントとして使用するための本発明の免疫賦活性オリゴヌクレオチドに関し、前記ワクチンは、抗原に対して免疫応答を誘発し、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−２を分泌する抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞集団において、少なくとも４０％、好ましくは、少なくとも４５％、より好ましくは、少なくとも５０％、より好ましくは、約５３％の誘発された抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＩＦＮ−γを分泌する。ある実施形態では、ＩＦＮ−γを分泌する抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の前記比率を、多染色性フローサイトメトリーによって決定する。そのような決定の例を、本文書の実施例１に開示する（「抗原特異的複数サイトカイン分泌型Ｔ細胞集団」の段落を参照されたい）。ある実施形態では、この抗原は、本明細書に開示する抗原のうちのいずれかである。
ある実施形態では、本発明は、ワクチン中でアジュバントとして使用するための本発明の免疫賦活性オリゴヌクレオチドに関し、前記ワクチンは、抗原に対して免疫応答を誘発し、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−２を分泌する抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞集団において、少なくとも１０％、好ましくは、少なくとも１５％、より好ましくは、少なくとも２０％、より好ましくは、約２２％の誘発された抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞が、二重サイトカイン産生細胞であり、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの両方を優先的に分泌する。ある実施形態では、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの両方を分泌する二重産生型抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の前記比率を、多染色性フローサイトメトリーによって決定する。そのような決定の例を、本文書の実施例１に開示する（「抗原特異的複数サイトカイン分泌型Ｔ細胞集団」の段落を参照されたい）。ある実施形態では、この抗原は、本明細書に開示する抗原のうちのいずれかである。
ある実施形態では、本発明は、ワクチン中でアジュバントとして使用するための本発明の免疫賦活性オリゴヌクレオチドに関し、前記ワクチンは、抗原に対して免疫応答を誘発し、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−２を分泌する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞集団において、少なくとも３０％、好ましくは、少なくとも４０％、より好ましくは、少なくとも４５％、より好ましくは、約４７％の誘発された抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が、二重サイトカイン産生細胞であり、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの両方を優先的に分泌する。ある実施形態では、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの両方を分泌する二重産生型抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の前記比率を、多染色性フローサイトメトリーによって決定する。そのような決定の例を、本文書の実施例１に開示する（「抗原特異的複数サイトカイン分泌型Ｔ細胞集団」の段落を参照されたい）。ある実施形態では、この抗原は、本明細書に開示する抗原のうちのいずれかである。
ある実施形態では、本発明は、抗原および本発明の免疫賦活性オリゴヌクレオチドを含む、前記抗原に対する免疫応答を誘発するのに使用するためのワクチンに関し、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−２を分泌する抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞集団において、少なくとも４０％、好ましくは、少なくとも４５％、より好ましくは、少なくとも５０％、より好ましくは、約５３％の誘発された抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞がＩＦＮ−γを分泌する。ある実施形態では、ＩＦＮ−γを分泌する抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の前記比率を、多染色性フローサイトメトリーによって決定する。そのような決定の例を、本文書の実施例１に開示する（「抗原特異的複数サイトカイン分泌型Ｔ細胞集団」の段落を参照されたい）。ある実施形態では、この抗原は、本明細書に開示する抗原のうちのいずれかである。
ある実施形態では、本発明は、抗原および本発明の免疫賦活性オリゴヌクレオチドを含む、前記抗原に対する免疫応答を誘発するのに使用するためのワクチンに関し、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−２を分泌する抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞集団において、少なくとも１０％、好ましくは、少なくとも１５％、より好ましくは、少なくとも２０％、より好ましくは、約２２％の誘発された抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞が、二重サイトカイン産生細胞であり、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの両方を優先的に分泌する。ある実施形態では、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの両方を分泌する抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の前記比率を、多染色性フローサイトメトリーによって決定する。そのような決定の例を、本文書の実施例１に開示する（「抗原特異的複数サイトカイン分泌型Ｔ細胞集団」の段落を参照されたい）。ある実施形態では、この抗原は、本明細書に開示する抗原のうちのいずれかである。
ある実施形態では、本発明は、抗原および本発明の免疫賦活性オリゴヌクレオチドを含む、前記抗原に対する免疫応答を誘発するのに使用するためのワクチンに関し、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−２を分泌する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞集団において、少なくとも３０％、好ましくは、少なくとも４０％、より好ましくは、少なくとも４５％、より好ましくは、約４７％の誘発された抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が、二重サイトカイン産生細胞であり、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの両方を優先的に分泌する。ある実施形態では、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの両方を分泌する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の前記比率を、多染色性フローサイトメトリーによって決定する。そのような決定の例を、本文書の実施例１に開示する（「抗原特異的複数サイトカイン分泌型Ｔ細胞集団」の段落を参照されたい）。ある実施形態では、この抗原は、本明細書に開示する抗原のうちのいずれかである。
核酸分子の「有効量」という言葉は、所望の生物学的効果を実現するのに必要または十分な量を指す。例えば、障害を治療するための、少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧを含有する核酸の有効量は、微生物感染症または腫瘍を排除するのに必要な量である。ワクチンのアジュバントとして使用するのに有効な量は、ワクチンに対する対象の免疫応答を後押しするのに有用な量であり得るであろう。感染性疾患、自己抗原と関連がある障害、または習慣性物質と関連がある障害を治療するのに「有効な量」は、抗原特異的免疫応答を誘発するの有用な量であり得る。任意の特定の適用に有効な量は、治療する疾患もしくは状態、投与する特定のＣｐＧ免疫賦活性オリゴヌクレオチド、対象のサイズ、または疾患もしくは状態の重症度等の要因に応じて変化させることができる。当業者であれば、特定のオリゴヌクレオチドの有効量を、過度の実験を必要とすることなく経験的に決定することができる。
本発明の態様では、ワクチンは、アジュバントをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、アジュバントは、ＴＬＲ９ではないＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）に対するアゴニストである。ＴＬＲに対するアゴニストは、いくつかの実施形態では、ＴＬＲ３に対するアゴニスト（例えば、安定化ポリＩ：Ｃ）、ＴＬＲ４（例えば、リポ多糖（ＬＰＳ）の誘導体、例えば、ＭＰＬもしくはＧＬＡ）、ＴＬＲ５（例えば、フラジェリン）、ＴＬＲ７（例えば、低分子のイミダゾキノリンファミリー）、またはＴＬＲ８（例えば、低分子のイミダゾキノリンファミリー）である。いくつかの実施形態では、このアジュバントは、アルミニウム塩、例えば、水酸化アルミニウム、免疫賦活複合体（ＩＳＣＯＭ）、水中油型もしくは油中水型の乳剤、リポソーム、または送達系、例えば、ナノ粒子もしくはマイクロ粒子である。
ＣｐＧ免疫賦活性オリゴヌクレオチドの有効量という用語は、所望の生物学的効果を実現するのに必要または十分な量を指す。例えば、抗原特異的免疫応答を誘発するための、抗原と共に投与するＣｐＧ免疫賦活性オリゴヌクレオチドの有効量は、抗原への曝露時に抗原に応答した免疫応答を誘発するのに必要な量である。本明細書に提供する教示と組み合わせて、種々の活性な免疫賦活性オリゴヌクレオチドの間から選び、効力、相対的な生物学的利用率、患者の体重、有害な副作用の重症度、および好ましい投与様式等の要因を比較検討することによって、毒性を実質的に引き起こさず、しかも、特定の対象を治療するのに有効である、効果的な予防的または治療的な処置与計画を計画することができる。任意の特定の適用に有効な量は、治療する疾患もしくは状態、投与する特定のＣｐＧ免疫賦活性オリゴヌクレオチド、対象のサイズ、または疾患もしくは状態の重症度等の要因に応じて変化させることができる。当業者であれば、特定のＣｐＧ免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよび／または抗原および／または他の治療剤の有効量を、本開示に照らして、過度の実験を必要とすることなく経験的に決定することができる。
本明細書に記載する化合物を局所送達するための対象への用量は典型的には、投与１回当たり約０．１μｇ〜５０ｍｇの範囲に及び、この用量は、適用に応じて、１日１回、週１回または月１回、およびそれらの間の任意の他の時間間隔で与えることができるであろう。より典型的には、局所用量は、投与１回当たり約１０μｇ〜１０ｍｇ、場合により約１００μｇ〜１ｍｇの範囲に及び、この用量を、数日または数週間の間隔を開けて２〜４回投与する。免疫賦活用量は、投与１回当たり、より典型的には１μｇ〜１０ｍｇ、最も典型的には１０μｇ〜１ｍｇの範囲に及び、この用量を、１日１回または週に１回投与する。抗原特異的免疫応答を誘発する目的で、本明細書に記載する化合物を非経口送達するための対象への用量は、これらの化合物を、抗原と共に送達するが、別の治療剤と共には送達しない場合、ワクチンアジュバントまたは免疫賦活の適用のために有効な局所用量よりも、典型的には５〜１０，０００倍高く、より典型的には１０〜１，０００倍高く、最も典型的には２０〜１００倍高い。非経口送達する、例えば、自然免疫応答を誘発する、ＡＤＣＣを増加させる、抗原特異的免疫応答を誘発するための本明細書に記載する化合物の用量は、これらのＣｐＧ免疫賦活性オリゴヌクレオチドを、他の治療剤と組み合わせてか、または特殊化した送達ビヒクル中で投与する場合、典型的には、投与１回当たり約０．１μｇ〜１０ｍｇの範囲に及び、この用量は、適用に応じて、１日１回、週１回または月１回、およびそれらの間の任意の他の時間間隔で与えることができるであろう。これらの目的の非経口用量は、投与１回当たり、より典型的には約１０μｇ〜５ｍｇ、最も典型的には約１００μｇ〜１ｍｇの範囲に及び、この用量を、数日または数週間の間隔を開けて２〜４回投与する。しかし、いくつかの実施形態では、これらの目的のための非経口用量を、上記の典型的な用量よりも５〜１０，０００倍高い範囲で使用することができる。
本明細書に記載する任意の化合物について、治療有効量を最初は、動物モデルから決定することができる。また、治療有効用量は、ヒトにおいて試験されている（例えば、ヒト臨床治験が開始されている）ＣｐＧオリゴヌクレオチドについて、および類似の薬理活性を示すことが知られている化合物、例として、他のアジュバント、例えば、ワクチン接種の目的のＬＴおよび他の抗原についてのヒトのデータから決定することもできる。非経口投与のためには、より高い用量が必要になる場合がある。適用する用量は、投与する化合物の相対的な生物学的利用率および効力に基づいて調節することができる。上記に記載の方法および当技術分野で周知の他の方法に基づいて、最大の有効性を達成するために用量を調節することは、十分に当業者の能力の範囲内である。
本発明の製剤を、薬学的に許容できる液剤中で投与し、これらの液剤は、薬学的に許容できる濃度の塩、緩衝剤、保存剤、適合性の担体、アジュバントを日常的に含有することができ、他の治療成分を場合により含有してもよい。
療法において使用する場合、有効量のＣｐＧ免疫賦活性オリゴヌクレオチドを、このオリゴヌクレオチドを所望の表面に送達する任意の様式により対象に投与することができる。本発明の医薬組成物の投与は、当業者に既知の任意の手段により達成することができる。好ましい投与経路として、これらに限定されないが、非経口（例えば、筋肉内、皮下、皮内、静脈内、膀胱内もしくは腹腔内）、外用（例えば、皮膚（経皮）、粘膜）、経口、鼻腔内、膣内、直腸内、経頬、眼内、または舌下が挙げられる。
免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、単独でまたは他の治療剤と共に、本明細書に記載する任意の経路を介して投与することができる。いくつかの好ましい実施形態では、投与は局所である。局所投与は、粘膜表面、例えば、皮膚、例として、口腔および生殖器の皮膚への外用適用を含むことができる。
これらの免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、それらが全身に送達されることが望ましい場合には、注射、例えば、ボーラス注射、または連続注入による非経口投与のために製剤化することができる。注射のための製剤は、単位投与剤型として、例えば、アンプル中で提示しても、または複数用量容器中に、保存剤を添加して提示してもよい。これらの組成物は、懸濁剤、液剤、または油性もしくは水性のビヒクル中の乳剤等の剤型をとることができ、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤等の製剤化のための薬剤を含有することができる。
非経口投与のための医薬製剤は、水溶性の形態のこれらの免疫賦活性オリゴヌクレオチドの水性液剤を含む。さらに、これらの免疫賦活性オリゴヌクレオチドの懸濁剤も、適切な油性注射用懸濁剤として調製することができる。適切な親油の溶媒またはビヒクルは、ゴマ油等の脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリド等の合成脂肪酸エステル、あるいはリポソームを含む。水性注射用懸濁剤は、懸濁剤の粘度を増加させる物質、例として、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランを含有することができる。また、この懸濁剤は、適切な安定化剤、またはこれらの免疫賦活性オリゴヌクレオチドの溶解性を増加させて、非常に濃縮された溶液の調製を可能にする薬剤を場合により含有してもよい。
これらの免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、それらが全身に送達されることが望ましい場合には、注射、例えば、ボーラス注射、または連続注入による非経口投与のために製剤化することができる。注射のための製剤は、単位投与剤型として、例えば、アンプル中で提示しても、または複数用量容器中に、保存剤を添加して提示してもよい。これらの組成物は、懸濁剤、液剤、または油性もしくは水性のビヒクル中の乳剤等の剤型をとることができ、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤等の製剤化のための薬剤を含有することができる。
不活性な材料を用いて、この治療剤を希釈しても、またはその体積を増加させてもよい。これらの希釈剤は、炭水化物、とりわけ、マンニトール、ａ−ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、改変デキストランおよび／またはデンプンを含むことができるであろう。また、特定の無機塩も、充填剤として使用することができ、それらは、トリリン酸カルシウム、炭酸マグネシウムおよび／または塩化ナトリウムを含む。いくつかの市販されている希釈剤は、Ｆａｓｔ−Ｆｌｏ、Ｅｍｄｅｘ、ＳＴＡ−Ｒｘ１５００、ＥｍｃｏｍｐｒｅｓｓおよびＡｖｉｃｅｌｌである。
この治療剤の水性環境中への溶解を補助するために、界面活性剤を湿潤剤として添加することができるであろう。界面活性剤は、アニオン性洗剤、例として、ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルソジウムスルホサクシネート、および／またはジオクチルソジウムスルホネートを含むことができる。カチオン性洗剤を使用することもでき、塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゾトニウムを含むことができるであろう。この製剤中に界面活性剤として含むことができるであろう見込みのある非イオン性の洗剤のリストは、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン水素添加ヒマシ油１０、５０および／または６０、モノステアリン酸グリセロール、ポリソルベート４０、６０、６５および／または８０、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース、ならびにカルボキシメチルセルロースである。これらの界面活性剤は、これらの免疫賦活性オリゴヌクレオチドの製剤中に、単独でまたは異なる比の混合物として存在することができるであろう。
非経口投与のための医薬製剤は、水溶性の形態のこれらの免疫賦活性オリゴヌクレオチドの水性液剤を含む。さらに、これらの免疫賦活性オリゴヌクレオチドの懸濁剤も、適切な油性注射用懸濁剤として調製することができる。適切な親油の溶媒またはビヒクルは、ゴマ油等の脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリド等の合成脂肪酸エステル、あるいはリポソームを含む。水性注射用懸濁剤は、懸濁剤の粘度を増加させる物質、例として、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランを含有することができる。また、この懸濁剤は、適切な安定化剤、またはこれらの免疫賦活性オリゴヌクレオチドの溶解性を増加させて、非常に濃縮された溶液の調製を可能にする薬剤を場合により含有してもよい。
あるいは、これらの免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、使用前に、適切なビヒクル、例えば、無菌の発熱性物質を含有しない水を用いて構成するための散剤の剤型をとることもできる。
経口投与のためには、これらの化合物（すなわち、ＣｐＧ免疫賦活性オリゴヌクレオチド、抗原および他の治療剤）を、これらの免疫賦活性オリゴヌクレオチドを当技術分野で周知の薬学的に許容できる担体と組み合わせることによって容易に製剤化することができる。そのような担体によって、本発明の免疫賦活性オリゴヌクレオチドを、錠剤、丸剤、糖衣錠剤、カプセル剤、液剤、ジェル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤等として製剤化して、治療する対象に経口摂取させることが可能になる。経口使用のための薬学的調製物を、固体の賦形剤として得ることができ、得られた混合物を粉砕し、所望により適切な補助剤を添加した後に、顆粒の混合物を加工処理して、錠剤または糖衣錠剤のコアを場合により得る。適切な賦形剤は、特に、充填剤、例として、ラクトース、スクロース、マンニトールもしくはソルビトールを含めた糖；例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース調製物、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。所望により、崩壊剤、例として、架橋結合したポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウム等のその塩を添加することもできる。また、場合により、これらの経口製剤は、食塩水、もしくは内部の酸性状態を中和するための緩衝液、すなわち、ＥＤＴＡ中に製剤化してもよく、またはいずれの担体もなしで投与してもよい。
また、上記の薬剤または製剤の経口投与剤型も企図する。これらの薬剤または製剤は、化学的に改変することができ、その結果、これらの誘導体の経口送達が効能を示す。一般に、企図する化学的改変は、少なくとも１つの部分を、この薬剤または製剤自体につなげることであり、前記部分によって、（ａ）タンパク質分解の阻害；および（ｂ）胃または腸からの血流中への取込みが可能となる。また、この薬剤もしくは製剤の全体的な安定性の増加、および体内における循環時間の増加も望まれる。そのような部分の例として、ポリエチレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、およびポリプロリンが挙げられる。ＡｂｕｃｈｏｗｓｋｉおよびＤａｖｉｓ、１９８１、「Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｅｎｚｙｍｅ Ａｄｄｕｃｔｓ」、Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｓ Ｄｒｕｇｓ、ＨｏｃｅｎｂｅｒｇおよびＲｏｂｅｒｔｓ編、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、ｐｐ．３６７〜３８３；Ｎｅｗｍａｒｋら、１９８２、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４：１８５〜１８９。使用することができるであろう他のポリマーは、ポリ−１，３−ジオキソランおよびポリ−１，３，６−チオキソカンである。ポリエチレングリコール部分が、上記で示した薬学的使用には好ましい。
また、本発明の医薬組成物の鼻腔内送達も企図する。鼻腔内送達によって、この治療用製品を鼻に投与した直後に、本発明の医薬組成物の血流への通過が可能になり、この製品が肺中に堆積する必要はない。経鼻送達ための製剤は、デキストランまたはシクロデキストランを用いた製剤を含む。
鼻腔内投与のために有用な装置は、計量用量型の噴霧器がつながっている小型の硬いボトルである。一実施形態では、本発明の医薬組成物の液剤を画定された容積のチャンバー中に引き出すことによって、計量された用量が送達され、このチャンバー中の液体を圧縮して、しぶきを形成することによってエアロゾル製剤をエアロゾル化する寸法の開口を、このチャンバーは有する。このチャンバーを圧縮して、本発明の医薬組成物を投与する。特定の実施形態では、このチャンバーには、ピストンが配置されている。そのような装置は市販されている。
あるいは、このボトルを圧迫して、しぶきを形成することによってエアロゾル製剤をエアロゾル化する寸法の開口または開口部を有するプラスチック製のスクイズボトル。この開口部は通常、このボトルの上部に見出され、この上部は一般に、このエアロゾル製剤を効率的に投与するために、先細になって、経鼻経路中に部分的にははまる。好ましくは、この薬物の測定された用量を投与するために、この経鼻吸入器は、計量された量のエアロゾル製剤を提供する。
経頬投与のためには、これらの組成物は、従来の様式で製剤化した錠剤またはロゼンジの剤型をとることができる。
また、これらの化合物は、直腸用または膣用の組成物、例として、坐剤または滞留浣腸剤として製剤化することもでき、これらの組成物は、例えば、カカオバター等の従来の坐剤用基剤または他のグリセリドを含有する。
これまでに記載した製剤に加えて、また、これらの化合物は、デポー調製物としても製剤化することができる。そのような長時間作用型製剤は、適切なポリマー性もしくは疎水性の材料（例えば、許容できる油中の乳剤として）またはイオン交換樹脂を用いてか、あるいは難溶性誘導体、例えば、難溶性塩として製剤化することができる。
また、これらの医薬組成物は、適切な固相またはゲル相の担体または賦形剤も含むことができる。そのような担体または賦形剤の例として、これらに限定されないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコール等のポリマーが挙げられる。
適切な液体または固体の薬学的調製物の剤型には、例えば、吸入のための水性液剤もしくは生理食塩水、マイクロカプセル化したもの、渦巻き形のもの、微小金粒子上に被覆したもの、リポソーム中に含有させたもの、ネブライザーとしたもの、エアロゾル、皮膚内への埋込みのためのペレット、または皮膚内に擦り付けるために鋭利な物体上に乾燥させたものがある。また、これらの医薬組成物は、顆粒剤、散剤、錠剤、被覆錠剤、（マイクロ）カプセル剤、坐剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、クリーム剤、ドロップ剤、または活性化合物の持続性の放出を示す調製物も含み、それらの調製物中では、賦形剤ならびに添加剤および／または補助剤、例として、崩壊剤、結合剤、被覆剤、膨張剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、甘味剤または可溶化剤を、上記の記載に従って習慣的に使用する。これらの医薬組成物は、多様な薬物送達系中で使用するのに適している。薬物送達のための方法の短い総説としては、Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７〜１５３３、１９９０を参照されたい。
これらのＣｐＧ免疫賦活性オリゴヌクレオチド、ならびに場合により他の治療剤および／または抗原を、それら自体（そのまま）でまたは薬学的に許容できる塩の形態をとって投与することができる。医薬中で使用する場合、これらの塩は、薬学的に許容できるべきであるが、薬学的に許容できない塩を好都合に使用して、それらの薬学的に許容できる塩を調製することができる。そのような塩として、これらに限定されないが、以下の酸から調製されたものが挙げられる：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン酸およびベンゼンスルホン酸。また、そのような塩を、アルカリ金属またはアルカリ土類の塩、例として、カルボン酸基のナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩として調製することができる。
適切な緩衝剤は、酢酸および塩（１〜２％ｗ／ｖ）；クエン酸および塩（１〜３％ｗ／ｖ）；ホウ酸および塩（０．５〜２．５％ｗ／ｖ）；ならびにリン酸および塩（０．８〜２％ｗ／ｖ）を含む。適切な保存剤は、塩化ベンザルコニウム（０．００３〜０．０３％ｗ／ｖ）；クロロブタノール（０．３〜０．９％ｗ／ｖ）；パラベン（０．０１〜０．２５％ｗ／ｖ）、およびチメロサール（０．００４〜０．０２％ｗ／ｖ）を含む。
本発明の医薬組成物は、有効量のＣｐＧ免疫賦活性オリゴヌクレオチドならびに場合により抗原および／または他の治療剤を含有し、これらは、薬学的に許容できる担体中に場合により含まれる。薬学的に許容できる担体という用語は、１つまたは複数の適合性の固体または液体の充填剤、希釈剤または被包物質を意味し、これらの担体は、ヒトまたは他の脊椎動物への投与に適している。担体という用語は、天然または合成の有機または無機の成分を意味し、こうした担体と、この活性成分を組み合わせて、適用を促進する。また、これらの医薬組成物の構成成分は、本発明の化合物とも、相互にも、所望の薬学的効率を実質的に損なう相互作用がないように混合することもできる。
本発明を、以下の実施例によってさらに例示するが、これらの実施例を、さらに限定するものであるといかなる場合も解釈してはならない。本出願全体を通して引用する（参照文献、発行済み特許、公開特許出願、および同時係属中の特許出願を含めた）参照の全ての全内容が、参照によりそれらの全体として本明細書に明確に組み込まれている。
（実施例１）
Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）または卵白アルブミン（ＯＶＡ）をモデル抗原として使用して、筋肉内（ＩＭ）免疫化した場合の、マウスにおける抗原特異的免疫応答を増大させる能力について、免疫賦活性オリゴヌクレオチドＣＰＧ２４５５５を、オリゴヌクレオチドＣＰＧ１０１０３およびＣＰＧ７９０９と比較した。
方法および材料
全てのＯＤＮを、凍結乾燥オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）から調製した。手短に述べると、微生物および内毒素の両方による汚染を阻止するために無菌条件下で、ＯＤＮを、内毒素を含有しないＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液、ｐＨ８．０（ＯｍｎｉＰｕｒ（登録商標）；ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）中に溶解させ、無菌の内毒素を含有しないリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）中に希釈した。保存液を、使用まで４℃で保管した。
雌の野生型ＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＣ５７Ｂｌ／６マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｃａｎａｄａ （Ｑｕｅｂｅｃ、カナダ）から購入した。Ｃ５７バックグラウンドにおけるＴＬＲ９欠損マウスを、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓで繁殖させ、研究のためにＣｏｌｅｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙに移動させた。マウスを、Ｃｏｌｅｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｇｒｏｕｐ ＣａｎａｄａのＡｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ中のマイクロアイソレーターケージ中で飼育した。Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｉｍａｌ ｃａｒｅ（ＡＡＡＬＡＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）およびＣａｎａｄｉａｎ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅの助言の下、Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ｃｏｌｅｙ Ｃａｎａｄａに従って、全ての研究を実施した。動物の体重は、研究開始時にはおよそ１８〜２０ｇであった。
マウスの免疫化
Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）
ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝１０／群）を、左脛骨前側筋肉において、１μｇのＨＢｓＡｇ；サブタイプａｄ（Ｃｌｉｎｉｑａ、４０７６）を用いて、単独でまたは１０μｇのＣＰＧ２４５５５、ＣＰＧ１０１０３もしくはＣＰＧ７９０９と組み合わせて、全量５０μｌとして筋肉内（ＩＭ）免疫化した。予備刺激の２週間後に、動物を、下顎下静脈を介して、ヘパリンを抗凝血薬として使用して出血させ、一次免疫化のために使用したのと同じワクチン製剤を使用して追加免疫した。追加免疫の２週間後に、動物を、心臓の穿刺により、ヘパリンを抗凝血薬として使用して出血させ、頚椎脱臼により安楽死させ、脾臓を無菌的に取り出して、抗原特異的ＣＴＬ活性、ＩＦＮ−γ分泌（培養物上清）、ならびに複数サイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２）分泌型のＣＤ４Ｔ細胞対ＣＤ８Ｔ細胞を検出するための免疫アッセイにおいて使用した。各出血時点から得た血漿を使用して、抗原特異的な全ＩｇＧならびにＩｇＧアイソタイプＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａを検出した。
ニワトリ卵白アルブミン（ＯＶＡ）
Ｃ５７Ｂｌ／６野生型マウスおよびＴＬＲ９欠損（Ｃ５７Ｂｌ／６ ＴＬＲ９−／−）マウス（ｎ＝１０／群）を、左脛骨前側筋肉において、２０μｇのＯＶＡグレードＶＩＩ（Ｓｉｇｍａ、Ａ７６４１）を用いて、単独でまたは１０μｇのＣＰＧ２４５５５、ＣＰＧ１０１０３、ＣＰＧ７９０９もしくは非ＣｐＧ対照ＯＤＮ２１３７と組み合わせて、全量５０μｌとして筋肉内ｌ（ＩＭ）免疫化した。一次免疫化の１４および２１日後に、動物を、一次免疫化のために使用したのと同じワクチン製剤を使用して追加免疫した。最後の追加免疫の７日後に、動物を、心臓の穿刺により、ヘパリンを抗凝血薬として使用して出血させ、頚椎脱臼により安楽死させ、脾臓を無菌的に取り出して、抗原特異的ＣＴＬ活性、ＩＦＮ−γ分泌（培養物上清）、テトラマー陽性ＣＤ８Ｔ細胞、ならびに複数サイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２）分泌型のＣＤ４Ｔ細胞対ＣＤ８Ｔ細胞を検出するための免疫アッセイにおいて使用した。血漿を使用して、抗原特異的な全ＩｇＧならびにＩｇＧアイソタイプＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃを検出した。
免疫アッセイ
抗原特異的抗体力価の決定
ＨＢｓＡｇ（抗ＨＢｓ）または卵白アルブミン（抗ＯＶＡ）に対して特異的な抗体（全ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ／ｃ）を、検出し、エンドポイント希釈ＥＬＩＳＡアッセイにより定量化し、このアッセイは、個々の動物由来の試料に対して三つ組みで実施した。エンドポイント力価を、カットオフ値を０．０５とし、非免疫血漿の吸光度値よりも２倍高い吸光度値（ＯＤ４５０ｎｍ）を生じる最も高い血漿の希釈度と定義した。これらを、群の幾何平均力価（ＧＭＴ）±ＳＥＭとして報告した。
ＣＴＬ応答の評価
最後の免疫化の１週間後（ＯＶＡの場合）または２週間後（ＨＢｓＡｇの場合）に取り出した脾臓を使用して、抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の応答をアッセイした。脾臓をホモジナイズして、１０％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）、ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（それぞれ、１０００Ｕ／ｍｌおよび１ｍｇ／ｍｌの最終濃度；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＯＮ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭの最終濃度；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＯＮ）および５×１０−５Ｍ β−メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＯＮ）を補ったＲＰＭＩ１６４０（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）組織培養培地中の単一細胞懸濁液とした。脾細胞懸濁液（３×１０６細胞／ｍｌ）中のＨＢｓＡｇ特異的リンパ球を、ＨＢｓＡｇを発現する照射したマウス細胞系（Ｐ８１５／Ｓ）と共にインキュベートすることによって５日間再賦活し、脾細胞懸濁液（３×１０６細胞／ｍｌ）中のＯＶＡ特異的リンパ球を、ＯＶＡを発現する照射したマウス細胞系（ＥＧ．７）と共に５日間インキュベートすることによって再賦活した。再賦活に続き、ＨＢｓＡｇまたはＯＶＡを発現する、細胞を死滅させるリンパ球の可能性を、５１Ｃｒ放出アッセイを使用することによって決定した。これらの結果を、異なるエフェクターの標的に対する比（Ｅ：Ｔ）における特異的溶解の％として提示する。
脾細胞による抗原特異的ＩＦＮ−γ分泌の評価
最後の免疫化の１週間後（ＯＶＡの場合）または２週間後（ＨＢｓＡｇの場合）に得られた脾細胞を使用して、抗原による再賦活に続くＩＦＮ−γ分泌を測定した。手短に述べると、脾臓細胞懸濁液を、ＣＴＬアッセイのために行ったのと同様に調製し、調節して、２％正常マウス血清（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｏｎｔａｒｉｏ、カナダ）、ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（それぞれ、１０００Ｕ／ｍｌおよび１ｍｇ／ｍｌの最終濃度；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＯＮ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭの最終濃度；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＯＮ）および５×１０−５Ｍ β−メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＯＮ）を補ったＲＰＭＩ１６４０（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）組織培養培地［完全ＲＰＭＩ１６４０］中に、１ｍｌ当たり５×１０６細胞の最終濃度とした。脾細胞懸濁液を、９６ウェルのＵ底組織培養プレート（１００μｌ／ウェル）上に、完全ＲＰＭＩ１６４０中で適切な濃度まで希釈した１００μｌの各賦活剤（該当する図の凡例上に記載）と一緒に蒔いた。コンカナバリンＡ（１０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）を、陽性の対照として使用し、培地を単独で用いて培養した細胞を、陰性の対照として使用した。各脾細胞試料をトリプリケートで播種し、これらの細胞を、加湿した５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７２時間インキュベートした。培養物上清を、インキュベーション期間の終わりに収集し、アッセイまで−８０℃で保管した。市販されているアッセイキット（ｍｏｕｓｅ ＩＦＮ−γ ＯｐｔＥＩＡ；ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、ＯＮ）を、製造元の指示に従って使用して、培養物上清中のＩＦＮ−γレベルをアッセイした。
ＯＶＡテトラマー陽性ＣＤ８集団の定量化
また、上記の記載に従って得た脾細胞懸濁液を使用して、ＯＶＡテトラマー陽性ＣＤ８集団もＦＡＣＳにより定量化した。個々の脾臓から得た脾細胞（２×１０６）を、５００μｌの染色用緩衝液、すなわち、１％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）および０．１％アジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を含有するＤＰＢＳを含有する１２×７５ｍｍ試験管に移した。細胞を、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去した。細胞を抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２（Ｆｃ ｂｌｏｃｋ）（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共に４℃で１０分間インキュベートすることによって、Ｆｃ受容体を遮断した。細胞を、染色用緩衝液を用いて洗浄し、クラス１ＯＶＡ特異的（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）テトラマー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して４℃で２０分間染色した。次いで、細胞を、染色用緩衝液を用いて再度洗浄し、抗マウスＣＤ８ａ−ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて４℃で２０分間染色した。細胞を、染色用緩衝液を用いて洗浄し、５００μｌの染色用緩衝液中に再懸濁し、ＦＣ５００フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して解析した。ＯＶＡ特異的ＣＤ８Ｔ細胞を、ＣＤ８ａおよびテトラマーの両方について陽性である細胞として同定した。データを、ＣＤ８およびテトラマーに陽性の細胞の％として表す。
抗原特異的複数サイトカイン分泌型Ｔ細胞集団の定量化
各群についてプールした脾細胞懸濁液を、２４ウェル組織培養プレート中、２％正常マウス血清（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｏｎｔａｒｉｏ、カナダ）、ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（それぞれ１０００Ｕ／ｍｌおよび１ｍｇ／ｍｌの最終濃度；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＯＮ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭの最終濃度；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＯＮ）および５×１０−５Ｍ β−メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＯＮ）を補ったＲＰＭＩ１６４０（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）組織培養培地中で再賦活した。
ＣＤ４の再賦活の場合：５×１０６細胞を、５μｇ／ｍｌのＨＢｓＡｇを含有する１ｍｌの最終容量中で一晩賦活した。
ＣＤ８の再賦活の場合；５×１０６細胞を、５μｇ／ｍｌのＨＢｓペプチド（ＩＰＱＳＬＤＳＷＷＴＳＬ）を含有する１ｍｌの最終容量中で５時間賦活した。
賦活剤を含有しない培地を、陰性の対照として使用し、一方、１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ）および１μｇ／ｍｌイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ）［インキュベーションの最後の４時間の間に添加した］を、陽性の対照として使用した。さらに、再賦活の最後の４時間の間に、Ｂｒｅｆｅｌｄｅｎ Ａ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）およびモネンシン（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）も添加して、タンパク質輸送を停止させた。
再賦活に続き、細胞を、染色用緩衝液を用いて洗浄し、細胞を抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２（Ｆｃ ｂｌｏｃｋ）（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共に４℃で１０分間インキュベートすることによって、Ｆｃ受容体を遮断した。次いで、細胞を、遠心分離し、抗マウスＣＤ４−ＥＣＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）または抗マウスＣＤ８−ＥＣＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のいずれかを５μｇ／ｍｌ含有する染色用緩衝液中に再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を、染色用緩衝液を用いて洗浄し、ＢＤ Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）中に４℃で２０分間再懸濁した。細胞を、ＢＤ Ｐｅｒｍ Ｗａｓｈ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて再度洗浄し、ＩＬ−２−ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＴＮＦ−ＡＰＣ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）およびＩＦＮ−γ−ＰｅＣｙ７（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）のそれぞれを５μｇ／ｍｌ含有する１×ＢＤ Ｐｅｒｍ Ｗａｓｈ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）中に再懸濁し、遮光して室温で２０分間インキュベートした。細胞を、１×ＢＤ Ｐｅｒｍ Ｗａｓｈ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて洗浄し、通常の染色用緩衝液中に再懸濁し、ＦＣ５００フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して解析した。
結果
液性免疫応答
試験した３つのＣｐＧ ＯＤＮ（ＣＰＧ２４５５５、１０１０３および７９０９）は全て、野生型マウスにおいて、ＨＢｓＡｇおよびＯＶＡに特異的な全ＩｇＧ力価を有意に増強した（Ｐ＜０．０５）。これら３つのＣｐＧ ＯＤＮの間には、マウスにおいて、ＨＢｓＡｇまたはＯＶＡに特異的な全ＩｇＧを増大させるそれらの能力の観点からは、有意な差はなかった（図１）。
ＴＬＲ９欠損動物において、抗体価を増大させる、ＣＰＧ２４５５５、ＣＰＧ１０１０３およびＣＰＧ７９０９の能力を、ＯＶＡを使用して試験した。ワクチン接種投与計画のうちのいずれかを用いた追加免疫の１週間後に検出された全体的な抗体力価は、１００未満であり、これらのＣｐＧ ＯＤＮのうちのいずれもが、ワクチンを単独でまたは非ＣｐＧ ＯＤＮ２１３７と組み合わせて使用した場合と比較して、ＯＶＡに対する抗体力価を有意に増大させることはできなかった（データ示さず）。
マウスにおいては、ＩｇＧアイソタイプの分布が、免疫応答性の指標として広く使用され、高いＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｃのレベルは、Ｔｈ１に偏った免疫応答の指標であり、一方、高いＩｇＧ１力価は、Ｔｈ２に偏った免疫応答の指標である。３つのＣｐＧ ＯＤＮの全てが、強力なＴｈ１に偏った免疫応答を誘発するのを支援し、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１の比およびＩｇＧ２ｃ／ＩｇＧ１の比は、＞１であり（図１）、ＩｇＧ２ａ／ｃ力価を、抗原を単独で使用した場合と比較して有意に増強した（Ｐ＜０．０５）（図２）。
細胞性免疫応答：ＣＴＬ応答
Ｔｈ１に偏った応答を測定する機能的な方法は、抗原提示標的細胞に対するＣＴＬ活性を測定することである。図３に見られるように、試験したＣｐＧ ＯＤＮは全て、マウスにおいては、ＯＶＡに対する抗原特異的ＣＴＬ応答を、抗原を単独でまたは非ＣＰＧ ＯＤＮ２１３７と組み合わせて使用した場合と比較して、有意に増強することができた（Ｐ＜０．０５；図３、右のパネル）。試験したこれらのＣｐＧ ＯＤＮ間で、ＯＶＡ特異的ＣＴＬの誘発を促す点では、６．２５：１のＥ：Ｔ比において、ＣＰＧ２４５５５群およびＣＰＧ７９０９群の両方が、ＣＰＧ１０１０３投与群よりも有意に高いＯＶＡ特異的ＣＴＬを示したこと以外は、有意な差はなかった。
ＨＢｓＡｇの場合、抗原を単独で使用した場合と比較して、ＣＰＧ２４５５５およびＣＰＧ１０１０３は共に、有意に高い抗原特異的ＣＴＬ応答を誘発することができたが、ＣＰＧ７９０９はできなかった。（Ｐ＜０．０５；図３、左のパネル）。ＣＰＧ２４５５５とＣＰＧ１０１０３との間には、マウスにおいてＨＢｓＡｇ特異的ＣＴＬ応答の誘発を促すそれらの能力に有意な差はなかった。
ＣｐＧ ＯＤＮが媒介した、ＣＴＬ応答の増大は、ＴＬＲ９欠損マウスにおいては観察されなかった（図４）。
抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞
ＭＨＣクラスＩ Ｈ−２Ｋｂ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的テトラマーを使用して、ＯＶＡを用いて免疫化したマウスにおけるＣＤ８Ｔ細胞応答を定量化した。試験したＣｐＧ ＯＤＮは全て、ＯＶＡを単独でまたは非ＣｐＧ対照ＯＤＮ２１３７と組み合わせて使用した場合と比較して、抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞を増強した（図５）。ＣＰＧ７９０９は、ＣＰＧ２４５５５およびＣＰＧ１０１０３よりも、ＯＶＡ特異的ＣＤ８Ｔ細胞の誘発を促す点では優れていた（Ｐ＜０．０５）。ＣＰＧ２４５５５とＣＰＧ１０１０３との間には、ＯＶＡ特異的ＣＤ８Ｔ細胞を誘発するそれらの能力に有意な差はなかった（Ｐ＞０．０５）。
ＣＰＧが媒介した、ＯＶＡ特異的ＣＤ８Ｔ細胞の増大は、ＴＬＲ９欠損マウスにおいては観察されなかった（図５）。
抗原特異的ＩＦＮ−γの分泌
また、細胞性免疫の尺度としての、抗原による賦活に応答したインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）の産生も、ワクチン接種した抗原により再賦活した脾細胞の培養物上清中のサイトカインを、酵素イムノアッセイを使用して検出することによって検討した。ＨＢｓＡｇまたはＯＶＡのいずれかを用いて、ＣＰＧ２４５５５またはＣＰＧ１０１０３を使用して免疫化した動物から収集した脾細胞の培養物上清は、抗原を単独で用いて免疫化したものと比較して有意に高いレベルのＩＦＮ−γを示した。ＨＢｓＡｇと共に使用した場合、ＣＰＧ２４５５５は、ＣＰＧ１０１０３またはＣＰＧ７９０９と比較して、特異的ＩＦＮ−γの分泌を促す点では有意に良好であった（図６；左のパネル）。ＯＶＡと共に使用した場合、抗原特異的ＩＦＮ−γの分泌を促す点では、ＣＰＧ２４５５５は、ＣＰＧ１０１０３と同等であったが、ＣＰＧ７９０９より優れていた（図６；右のパネル）。
ＣｐＧ ＯＤＮが媒介した、抗原特異的ＩＦＮ−γの分泌の増大は、ＴＬＲ９欠損動物においては観察されなかった（図７）。
抗原特異的複数サイトカイン分泌型Ｔ細胞集団
より最近の知見によれば、Ｔ細胞によるＩＦＮ−γの産生からだけでは、抗原特異的Ｔ細胞の防御免疫応答を誘発する能力は予測されない。したがって、この研究では、我々は、抗原特異的なＣＤ４Ｔ細胞およびＣＤ８Ｔ細胞の、ＩＬ−２、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γを産生する能力を、多染色性フローサイトメトリーを使用して評価した。
ＣＤ４Ｔ細胞およびＣＤ８Ｔ細胞の両方に関しては、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの分泌と比較して、比較的低いレベルのＩＬ−２の分泌が見られた（図８）。ＣＤ４Ｔ細胞に関しては、ＣＰＧ２４５５５は、ＣＰＧ１０１０３およびＣＰＧ７９０９と比較して、より高いパーセントの二重サイトカイン分泌型Ｔ細胞を誘発するのを支援した（ＣＰＧ２４５５５の場合、２３％、一方、ＣＰＧ１０１０３およびＣＰＧ７９０９の場合、それぞれ４および６％）。全体的には、非常に低いパーセントの三重サイトカイン産生型ＨＢｓＡｇ特異的ＣＤ４Ｔ細胞が観察された（ＣＰＧ２４５５５、ＣＰＧ１０１０３およびＣＰＧ７９０９の場合、それぞれ２、０および１％）（図８Ａ）。
ＣＤ８Ｔ細胞に関しては、ＣＰＧ２４５５５およびＣＰＧ７９０９の両方が、ＣＰＧ１０１０３と比較して、高いレベルの二重サイトカイン分泌型Ｔ細胞を誘発するのを支援した（ＣＰＧ２４５５５およびＣＰＧ７９０９の場合、それぞれ４８および５６％、一方、ＣＰＧ１０１０３の場合、わずか１９％）。ＣＤ４細胞と同様に、非常に低いパーセントの三重サイトカイン産生型ＨＢｓＡｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が観察された（ＣＰＧ２４５５５、ＣＰＧ１０１０３およびＣＰＧ７９０９の場合、それぞれの１、０および０％）（図８Ｂ）。
考察
ＣＰＧ２４５５５を、マウスにおいて、２つのモデル抗原、すなわち、ＨＢｓＡｇおよびＯＶＡを使用した場合、抗原特異的免疫応答を増大させるその能力について、ＣＰＧ１０１０３およびＣＰＧ７９０９と比較するように研究を設計した。ＣＰＧ２４５５５では、最も３’側のＣＧジヌクレオチドが反転しており、その結果、ＣＰＧ２４５５５中ではＣｐＧモチーフが排除されていること以外は、ＣＰＧ２４５５５とＣＰＧ１０１０３とは、同一のヌクレオチド配列を有する。ＣＰＧ７９０９は、ヒト臨床治験において、いくつかのワクチン抗原を用いて、アジュバント活性を示すことが証明されているＢクラスのＣｐＧ ＯＤＮである。
ＣＰＧ２４５５５中の３’ＣｐＧモチーフを排除しても、抗原特異的免疫応答を増大させるその能力に対する負の影響はなく、ＣＰＧ１０１０３と比較した場合、適応免疫応答の同等（抗体の応答、およびテトラマー染色により測定した抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞）またはより良好な（抗原特異的ＩＦＮ−γの分泌）増大が示された。同様に、ＣＰＧ２４５５５は、抗原特異的抗体の応答およびＣＴＬ応答を増大させる点では、ＣＰＧ７９０９と同等でもあった。ＣＰＧ２４５５５は、抗原特異的ＩＦＮ−ｇの分泌を促す点では、ＣＰＧ７９０９より優れていた。
ＴＬＲ９欠損マウスにおいては、適応免疫応答の増大が見られなかったことから、試験した３つのＣｐＧ ＯＤＮに関しては全て、適応免疫応答の増大は、ＴＬＲ９依存性であった。
表１に示すように、より高い比率の、ＩＦＮ−γを産生する抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＣＰＧ２４５５５を用いて得られた。また、より高い比率の、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２のうちの少なくとも２つのサイトカインを産生する多機能性抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞（すなわち、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの両方、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の両方もしくはＴＮＦ−αおよびＩＬ−２の両方を産生する細胞、またはＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２を分泌する三重産生細胞さえ）も得られた。
ＣＤ８＋Ｔ細胞に関しては（表２）、より高い比率の、２つのサイトカイン、特に、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の両方を産生する多機能性抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が得られた。
総合すると、これらの結果から、ＣＰＧ２４５５５は、ＣＰＧ１０１０３よりも、アジュバントとして使用した場合、多機能性抗原特異的Ｔ細胞集団の生成について良好であることが示されている。このことは、多機能性Ｔ細胞として、特に、ケモカイン産生（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２等）の観点から重要であり得、多機能性Ｔ細胞は、単一のサイトカインを分泌するＴ細胞と比較して、より良好なエフェクター細胞であると考えられている。
（実施例２）
ＣＰＧ２４５５５とＣＰＧ１０１０３との比較
試験したＯＤＮのヌクレオチド配列
ＣＰＧ ＯＤＮ１０１０３
５’Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｔ＊ Ｃ ＊ Ｇ ＊ Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ３’（配列番号２）
ＣＰＧ ＯＤＮ２４５５５
５’Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｔ＊ Ｇ ＊ Ｃ ＊ Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ３’（配列番号１）
非ＣｐＧ ＯＤＮ２２８８１
５’Ｔ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ３’（配列番号４）
非ＣｐＧ ＯＤＮ２１３７
５’Ｔ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｔ３’（配列番号５）
＊は、ホスホロチオエート連結（ＰＳ）を示す
これらの配列の下線を引いた部分は、ＣＰＧ ＯＤＮ１０１０３とＣＰＧ ＯＤＮ２４５５５との間の差を示す。
ヒトの最適ＣｐＧモチーフ：ＧＴＣＧＴＴ
ヒトＰＢＭＣにおける自然免疫
ヒトＰＢＭＣ（５×１０６／ｍｌ）を、各種の濃度のＣＰＧ１０１０３、ＣＰＧ２４５５５または非ＣｐＧ対照ＯＤＮ２２８８１と共に、２４または４８時間インキュベートした。細胞上清を収集し、サイトカイン／ケモカインの分泌について、市販のＥＬＩＳＡキットを使用してアッセイした（図９Ａおよび図９Ｂ）。
ＢＡＬＢ／ｃマウスのｉｎ ｖｉｖｏにおける自然免疫
ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５／群）に、ＰＢＳ（プラセボ対照）、ＣＰＧ２４５５５、ＣＰＧ１０１０３または非ＣｐＧ対照ＯＤＮ２１３７を１００μｇの用量レベルで皮下注射した。動物を、注射の３時間後に出血させ、ＩＰ−１０（図１０Ａ）およびＩＬ−１２（図１０Ｂ）またはＩＬ−６（図１０Ｃ）について、市販のＥＬＩＳＡを使用して、血漿をアッセイした。示した結果は、群の平均±平均の標準誤差である（ＮＳ＝有意ではない）。
ＢＡＬＢ／ｃマウスのｉｎ ｖｉｖｏにおける液性免疫
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＨＢｓＡｇ（１μｇ）を、１０μｇのＣＰＧ２４５５、ＣＰＧ１０１０３または非ＣｐＧ対照ＯＤＮ２１３７と併用してまたは併用せずに筋肉内注射した。マウスには、第０および１４日に注射した。示した結果は、追加免疫の２週間後にエンドポイントＥＬＩＳＡにより測定したＨＢｓＡｇに特異的な全ＩｇＧ力価である（図１１Ａ）。
Ｃ５７ｂｌ／６マウスに、ＯＶＡ（２０μｇ）を、１０μｇのＣＰＧ ＯＤＮ２４５５、ＣＰＧ１０１０３または非ＣｐＧ対照ＯＤＮ２１３７と併用してまたは併用せずに筋肉内注射した。マウスには、第０、７および２１日に注射した。示した結果は、追加免疫の１週間後のＯＶＡに特異的な全ＩｇＧ力価である（図１１Ｂ）。
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、インフルエンザＡ型ＨＡ、Ｔｅｘａｓ１／７７、Ｈ３Ｎ２由来（１μｇ）±ミョウバン（２５μｇのＡｌ３＋）を、１０μｇのＣＰＧ ＯＤＮ２４５５、ＣＰＧ１０１０３または非ＣｐＧ対照ＯＤＮ２１３７と併用してまたは併用せずに筋肉内注射した。示した結果は、免疫化後の種々の時間にエンドポイントＥＬＩＳＡにより測定したＨＡに特異的な全ＩｇＧの動態である（図１１Ｃ）。
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＴ細胞応答
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＨＢｓＡｇ（１μｇ）を、１０μｇのＣＰＧ ＯＤＮ２４５５、ＣＰＧ１０１０３または非ＣｐＧ対照ＯＤＮ２１３７と併用してまたは併用せずに筋肉内注射した。マウスには、第０および１４日に注射した。示した結果は、追加免疫の２週間後に５１Ｃｒの放出により測定したＨＢｓＡｇに特異的なＣＴＬである（図１２Ａ）。
Ｃ５７ｂｌ／６マウスに、ＯＶＡ（２０μｇ）を、１０μｇのＣＰＧ ＯＤＮ２４５５、ＣＰＧ１０１０３または非ＣｐＧ対照ＯＤＮ２１３７と併用してまたは併用せずに筋肉内注射した。マウスには、第０、７および２１日に注射した。示した結果は、追加免疫の１週間後に５１Ｃｒの放出により測定したＯＶＡに特異的なＣＴＬである（図１２Ｂ）。
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＨＢｓＡｇ（１μｇ）を、１０μｇのＣＰＧ ＯＤＮ２４５５、ＣＰＧ１０１０３または非ＣｐＧ対照ＯＤＮ２１３７と併用してまたは併用せずに筋肉内注射した。マウスには、第０および１４日に注射した。最後の追加免疫の２週間後に得られた脾細胞を、それぞれの抗原と共に７２時間インキュベートし、培養物上清を、ＩＦＮ−γについてＥＬＩＳＡにより試験した（図１３Ａ）。
Ｃ５７ｂｌ／６マウスに、ＯＶＡ（２０μｇ）を、１０μｇのＣＰＧ ＯＤＮ２４５５、ＣＰＧ１０１０３または非ＣｐＧ対照ＯＤＮ２１３７と併用してまたは併用せずに筋肉内注射した。マウスには、第０、７および２１日に注射した。最後の追加免疫の１週間後に得られた脾細胞を、それぞれの抗原と共に７２時間インキュベートし、培養物上清を、ＩＦＮ−γについてＥＬＩＳＡにより試験した（図１３Ｂ）。
結果および考察
ＣＰＧ１０１０３中に存在する最も３’側のＣＧジヌクレオチドが、ＣＰＧ２４５５５中ではＧＣに反転し、その結果、ＣＰＧ２４５５５中ではＣｐＧモチーフが排除されていること以外は、ＣＰＧ１０１０３とＣＰＧ２４５５５とは、同一のヌクレオチド配列を有する。以前の報告に基づくと、隣接配列、モチーフの場所および間隔が同じであれば、ＣＰＧモチーフの数が増加すると、免疫賦活の増強がもたらされるべきである。以前の知識に基づいて、ＣＰＧ２４５５５は、ＣＰＧ１０１０３よりも、免疫賦活性が低く、ワクチンのアジュバントとしての有効性が低いであろうことが予想された。しかし、上記の結果から、ＣＰＧ２４５５５は、ＣＰＧ１０１０３と比較して、類似のまたはより高い免疫賦活性およびアジュバント活性を有する可能性があることが実証されている。
（実施例３）
ＢＡＬＢ／Ｃマウスにおける、インフルエンザ赤血球凝集素抗原（ＨＡ）に対するワクチンのアジュバントとしてのＣＰＧ１０１０３、ＣＰＧ２４５５５およびＣＰＧ７９０９の比較
方法および材料
雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（１０／ｇｐ）を、インフルエンザＡ型赤血球凝集素抗原（ＨＡ）、Ｔｅｘａｓ１／７７、Ｈ３Ｎ２由来（１μｇ）±ＣｐＧまたは対照ＯＤＮ（１０ｍｇ）±ミョウバン（２５ｍｇのＡｌ３＋）を、全量５０μｌとして左脛骨前側（ＴＡ）筋肉中への筋肉内（ＩＭ）注射により免疫化した。マウスを、免疫化後の異なる時期に出血させて、ＨＡに特異的な抗体応答を評価した。各群の半数の動物を、免疫化の６週間後に安楽死させて、細胞媒介型の免疫応答を評価した（ＣＴＬ、ＨＡ特異的ＩＦＮ−ｇ分泌、およびＴ細胞サイトカイン分泌のフローサイトメトリーによる解析）。
結果および考察
免疫化の６週間後の抗ＨＡ
免疫化の６週間後に、抗ＨＡの量を測定した。ＣＰＧ２４５５５は、ＣＰＧ１０１０３およびＣＰＧ７９０９より、ＨＡに特異的なＩｇＧを増大させる点では優れていた（図１４）。
免疫化の４週間後の赤血球凝集阻害（ＨＩＡ）力価
抗体の機能を、赤血球凝集阻害アッセイ（ＨＩＡ）を使用して評価した。ＣＰＧ２４５５５は、アジュバントとして単独で使用した場合、ＨＩＡ力価を増大させる点では、ＣＰＧ１０１０３より優れ（ｐ＝０．００９）、ＣＰＧ７９０９とは同等であった（ｐ＝０．１）（図１５）。試験した３つのＣｐＧ ＯＤＮは全て、ミョウバンと組み合わせて使用した場合、ＨＩＡ力価を増大させる点では同等であった。
ＨＡに特異的なＩＦＮγの分泌
ＩＦＮγの分泌濃度を測定した。ＣＰＧ２４５５５は、アジュバントとして単独で使用した場合、ＨＡに特異的なＩＦＮ−γの分泌（細胞媒介型免疫のマーカー）を増大させる点では、ＣＰＧ１０１０３より優れていた（図１６）。ＣＰＧ２４５５５は、ミョウバンと組み合わせて使用した場合、ＨＡ−特異的ＩＦＮ−γ分泌を増大させる点では、ＣＰＧ１０１０３およびＣＰＧ７９０９より優れていた（図１６）。
（実施例４）
カニクイザルにおける、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に対するワクチンのアジュバントとしてのＣＰＧ２４５５５とＣＰＧ７９０９との比較
材料および方法
カニクイザル（３〜５歳齢；２．５〜５．５ｋｇ；ｎ＝５／ｇｐ；ただし、ＨＢｓＡｇ＋ＩＭＸ群ではｎ＝４）を、
１）Ｅｎｇｅｒｉｘ−Ｂ（小児用量；１０ｍｇのＨＢｓＡｇ）
２）Ｅｎｇｅｒｉｘ−Ｂ＋ＣＰＧ７９０９（０．５ｍｇ）
３）Ｅｎｇｅｒｉｘ−Ｂ＋ＣＰＧ２４５５５（０．５ｍｇ）
を用いて筋肉内免疫化した（０．６ｍｌの右四頭筋内へのＩＭ注射）。
動物に、免疫処置を、３回、すなわち、第０週（予備刺激）、第４週（追加免疫１）および第８週（追加免疫２）に施した。これらの動物を、予備刺激前、予備刺激の４週間後（第４週）、追加免疫１の２週間後（第６週）、追加免疫１の４週間後（第８週）、および追加免疫２の２週間後（第１０週）に出血させた。
ＨＢｓＡｇ特異的免疫アッセイを、以下に従って実施した。
１）抗体力価およびアビディティー
２）細胞内サイトカイン分泌（ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α）
３）多機能性Ｔ細胞
４）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ：ＩＬ２、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、パーフォリン
結果および考察
液性応答
この研究では、動物が以前にＢ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ）に曝露された可能性があることが、ワクチン接種前に検出された高いレベルのＨＢｓＡｇ特異的抗体力価により明らかであった。さらに、１匹の動物は、輸送中に、血清学検査によりＨＢＶ陽性を示し、このことから、ＨＢＶに曝露された可能性が示唆された。しかし、この研究に使用した動物は全て、ＰＣＲ試験により、ＨＢＶ陰性であった。抗ＨＢｓＡｇ力価が、各追加免疫に伴って増加した。Ｅｎｇｅｒｉｘ−ＢにＣｐＧを追加すると、Ｅｎｇｅｒｉｘ−Ｂを単独で使用した場合と比較して、ＨＢｓＡｇに特異的な抗体力価が増強された（図１７）。さらに、ＣｐＧの追加は、Ｅｎｇｅｒｉｘ−Ｂを単独で使用した場合と比較して、抗体のアビディティーも増強した（図１８）。ＣＰＧ２４５５５は、抗体力価およびアビディティーの両方を増強させる点では、ＣＰＧ７９０９と同等であった。
Ｔ細胞応答：ＣＤ４Ｔ細胞による細胞内サイトカインの分泌
Ｅｎｇｅｒｉｘ−ＢにＣｐＧを追加すると、ＣＤ４Ｔ細胞が、ＩＬ−２ではなく、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの分泌を媒介する頻度が増加する傾向が示された（図１９Ａ、ＢおよびＣ）。全体的には、ＣＰＧ２４５５５は、ＣＤ４媒介型サイトカインの誘発については、ＣＰＧ７９０９と同等またはそれよりも良好であった。
Ｔ細胞応答：多機能性ＣＤ４Ｔ細胞；定量分析
１つ、２つまたは３つのサイトカインを分泌する細胞数を、第１０週（追加免疫２の２週間後）に測定した。ＣＰＧ２４５５５は、１つのサイトカインを分泌するＥｎｇｅｒｉｘ−Ｂ特異的ＣＤ４Ｔ細胞を誘発する点では、ＣＰＧ７９０９と同等であった。全体的には、比較的低いレベルの三重サイトカイン産生ＣＤ４Ｔ細胞が検出された。しかし、ＣＰＧ２４５５５は、ＣＰＧ７９０９または、Ｅｎｇｅｒｉｘ−Ｂ単独よりも、より高い三重サイトカイン産生ＣＤ４Ｔ細胞を誘発した（図２０Ａ）。さらに、Ｅｎｇｅｒｉｘ−Ｂ＋ＣＰＧ２４５５５を用いて免疫化した動物は、Ｅｎｇｅｒｉｘ−Ｂ単独またはＥｎｇｅｒｉｘ−Ｂ＋ＣＰＧ７９０９を用いて免疫化した動物と比較して、より高い比率の、三重サイトカイン産生Ｔ細胞を有した（図２０Ｂ）。
Ｔ細胞応答：多機能性ＣＤ４Ｔ細胞；定性分析
ＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦα、またはこれらのサイトカインの組合せを分泌する細胞数を測定した。ＣＰＧ２４５５５は、多機能性Ｔ細胞を誘発する点では、ＣＰＧ７９０９と同等またはそれよりも良好であった（図２１Ａおよび図２１Ｂ）。
Ｔ細胞応答：ＣＤ４Ｔ細胞の多機能性
三重サイトカイン産生ＣＤ４Ｔ細胞の比率を、追加免疫２の２週間後に測定した。ＣＰＧ２４５５５を用いた場合には、ＣＰＧ７９０９を用いた場合よりも高い比率の、三重サイトカイン産生ＣＤ４Ｔ細胞が観察された。
結論
これらのデータに基づくと、ＣＰＧ２４５５５中の３’ＣｐＧモチーフの排除は、抗原特異的免疫応答を増大させるその能力に対して、全く負の影響を及ぼさず、ＣＰＧ１０１０３およびＣＰＧ７９０９と比較して、同等またはより良好な適応免疫応答の増大を示した。また、マウスにおいて、複数の抗原に関して見られたＣＰＧ２４５５５のアジュバント活性は、形を変えて、非ヒト霊長類においても、カニクイザルのＢ型肝炎表面抗原に関するＣＰＧ２４５５５の、ＣＰＧ７９０９と同等（液性免疫）またはそれより優れた（Ａｇ特異的多機能性Ｔ細胞の）アジュバント活性となって現れた。
当業者であれば、日常的な実験を使用するだけで、本明細書に記載する本発明の特定の実施形態の多くの均等物を認識するか、または究明することができるであろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されるものとする。

Claims (25)

  1. ヌクレオチド配列
    ５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴ３’（配列番号１）
    を含む免疫賦活性オリゴヌクレオチド。
  2. １つまたは複数のホスホロチオエート連結を含む、請求項１に記載の免疫賦活性オリゴヌクレオチド。
  3. ピリミジン−プリンジヌクレオチドを含む、請求項１に記載の免疫賦活性オリゴヌクレオチド。
  4. 抗原と配列番号１のヌクレオチド配列を含む免疫賦活性オリゴヌクレオチドとを含み、薬学的に許容できる担体をさらに含むワクチン。
  5. 免疫賦活性オリゴヌクレオチドが、抗原特異的免疫応答を誘発するのに有効な量である、請求項４に記載のワクチン。
  6. 誘発される抗原特異的免疫応答が、Ｔｈ１免疫応答である、請求項５に記載のワクチン。
  7. 抗原が、微生物抗原、自己抗原または、コカインおよびニコチンから選ばれる習慣性物質である、請求項４に記載のワクチン。
  8. 微生物抗原が、細菌抗原、ウイルス抗原または寄生生物抗原である、請求項７に記載のワクチン。
  9. ａ）細菌抗原が、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、う歯を引き起こす細菌、または歯周疾患を引き起こす細菌と関連がある；
    ｂ）ウイルス抗原が、呼吸器多核体ウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）（ＲＳＶ）、単純ヘルペスウイルス１（Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ１）、単純ヘルペスウイルス２（Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ２）、ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ）−１（ＨＩＶ−１）もしくはＨＩＶ−２と関連がある、または
    ｃ）寄生生物抗原が、マラリアを引き起こす寄生生物と関連がある、
    請求項８に記載のワクチン。
  10. ａ）う歯を引き起こす細菌が、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）、ストレプトコッカス・サンギス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｓ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、またはアクチノミセス・ビスコーサス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓ）である；または
    ｂ）歯周疾患を引き起こす細菌が、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）またはアクチノバチルス・アクチノミセタムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）である、
    請求項９に記載のワクチン。
  11. 自己抗原が、腫瘍抗原、アルツハイマー病と関連がある抗原、ヒト抗体に対する抗原、ヒト内因性レトロウイルスエレメントから発現される抗原、または担体にコンジュゲートさせたニコチンハプテンである、請求項７に記載のワクチン。
  12. ａ）腫瘍抗原が、ＨＥＲ２、ＭＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ＰＳＡ、ＣＥＡ、またはＥＧＦＲの変異型である；
    ｂ）アルツハイマー病と関連がある抗原が、タウまたはβ−アミロイドである；
    ｃ）抗原がＩｇＥである；または
    ｄ）ニコチンハプテンをコンジュゲートさせた担体が、ジフテリア毒素（ＤＴ）である、
    請求項１１に記載のワクチン。
  13. 抗原が、ペプチド、組換えタンパク質、精製タンパク質、死滅させた全病原体、弱毒化生ウイルスもしくはウイルスベクター、弱毒化生細菌もしくは細菌ベクター、多糖、ハプテンである、またはプラスミドＤＮＡによってコードされている、請求項４に記載のワクチン。
  14. 抗原を、担体にコンジュゲートさせた、請求項４に記載のワクチン。
  15. 担体が、ジフテリア毒素（ＤＴ）またはウイルス様粒子であり、ウイルス様粒子が、ＲＮＡファージＱ−β、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、またはＢ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）である、請求項１４に記載のワクチン。
  16. １つまたは複数のアジュバントをさらに含む、請求項４に記載のワクチン。
  17. アジュバントが、ＴＬＲ９ではないＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）に対するアゴニストである、請求項１６に記載のワクチン。
  18. アゴニストが、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７またはＴＬＲ８に対するアゴニストである、請求項１７に記載のワクチン。
  19. ａ）ＴＬＲ３アゴニストが、安定化ポリＩ：Ｃである；
    ｂ）ＴＬＲ４アゴニストが、ＭＰＬおよびＧＬＡから選ばれるリポ多糖（ＬＰＳ）の誘導体である；
    ｃ）ＴＬＲ５アゴニストが、フラジェリンである；または
    ｄ）ＴＬＲ７アゴニストまたはＴＬＲ８アゴニストが、低分子のイミダゾキノリンファミリーである、
    請求項１８に記載のワクチン。
  20. アジュバントが、アルミニウム塩、免疫賦活複合体（ＩＳＣＯＭ）、水中油型もしくは油中水型の乳剤、リポソーム、または、ナノ粒子およびマイクロ粒子から選ばれる送達系である、請求項１６に記載のワクチン。
  21. アルミニウム塩が、水酸化アルミニウムである、
    請求項２０に記載のワクチン。
  22. ａ）免疫賦活性オリゴヌクレオチドが、１つまたは複数のホスホロチオエート連結を含む；または
    ｂ）免疫賦活性オリゴヌクレオチドが、ピリミジン−プリンジヌクレオチドを含む、
    請求項４に記載のワクチン。
  23. 投与のために製剤化される、請求項４に記載のワクチン。
  24. ａ）ワクチンが、非経口経路を介する投与のために製剤化され、前記非経口経路が、筋肉内、皮下、皮内、静脈内または腹腔内である；または
    ｂ）ワクチンが、外用経路を介する投与のために製剤化され、前記外用経路が、皮膚、経皮または粘膜表面である、
    請求項４に記載のワクチン。
  25. 粘膜経路が、経口、鼻腔内、膣内、直腸内、頬側内または眼内である、請求項２４に記載のワクチン。
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