TW202128216A - 免疫刺激組合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供了一種免疫刺激組合物，其包含皂苷和CpG寡聚去氧核苷酸或者其由包含皂苷的佐劑和CpG寡聚去氧核苷酸組成，其中，所述CpG寡聚去氧核苷酸序列中具有兩個或兩個以上拷貝的5’-TTCGTT-3’基序或5’-TCGTCGTCG-3’基序。本發明提供了所述免疫刺激組合物在製備用於治療疾病的藥物中的用途。

Description

免疫刺激組合物及其用途
本發明屬於生物製藥領域。具體地，本發明涉及一種免疫刺激組合物，所述免疫刺激組合物包含皂苷和CpG寡聚去氧核苷酸，或者所述免疫刺激組合物由包含皂苷的佐劑和CpG寡聚去氧核苷酸組成。其中，所述CpG寡聚去氧核苷酸序列具有兩個或兩個以上拷貝的5’-TTCGTT-3’基序或5’-TCGTCGTCG-3’基序。本發明還涉及所述免疫刺激組合物的製藥用途。
CpG寡聚去氧核苷酸是近年來發現的一類新型免疫刺激劑，其化學本質為含有胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸的去氧寡核苷酸，具有與天然CpG模式識別受體相似的免疫反應，能與細胞膜上的Toll樣受體結合，通過TLR9信號通路有效引發哺乳動物免疫反應。CpG引起的免疫反應以Th1型為主，可誘導Th2型免疫應答向Th1轉換，從而激發細胞免疫。通過啟動T細胞、B細胞、NK細胞等免疫活性細胞，大量地產生多種細胞因數，從而增強機體的特異性和非特異性免疫效應，是連接天然免疫和獲得性免疫的重要紐帶。
皂苷是苷元為三萜或螺旋甾烷類化合物的一類糖苷，屬植物來源佐劑。其中，皂樹皂苷（QS）是從皂樹中提取得到的皂苷，在QS系列中QS-21是目前報導最廣泛的一類佐劑，但QS-21可誘導細胞溶血，有一定系統毒副作用和局部的毒副作用。Alving等（ALVING CR, MATYAS G, BECK Z, et al. Revue Roumaine de Chimie, 2016, 61(8): 631-635.）研究發現，以ALF脂質體結合MPLA和QS-21作為佐劑對抗HIVgp140蛋白可有效增加血清中抗體滴度。Ng等（NG H, FERNANDO G J P, DEPELSENAIRE A C I, et al. Scientific Reports, 2016, 6(1): 228-230.）使用一種皮下傳遞技術-納米貼片，與QS-21構成佐劑複合物。結果表明，納米貼片與傳統肌內注射相比，可顯著減少抗原和QS-21的使用劑量以及誘導更高的IgG滴度（韓子怡，曾忠良，現代農業科技，2019(14): 220-221.）。
現有技術（WO2001051083A3）曾報導關於包含皂苷與CpG寡聚去氧核苷酸的免疫刺激組合物，其中CpG寡聚去氧核苷酸涉及CpG1826和CpG7909。然而，由於CpG寡聚去氧核苷酸具備結構多樣性，不同序列的CpG佐劑間的效果差異巨大。
因此，當前對免疫效果更強的佐劑以及藥物存在需求。
針對現有技術的不足，發明人在進行了大量研究之後，出乎意料的發現了免疫效果更強的免疫刺激組合物，在所述組合物中，皂苷和CpG寡聚去氧核苷酸之間表現出高效的協同作用，可以介導更強烈的免疫應答。將所述免疫刺激組合物應用於不同的抗原或抗原組合物中，均具有顯著性優勢。
因此，本發明的一個目的是提供一種免疫刺激組合物，所述組合物可用於製備多種藥物，以獲得高效的免疫刺激原性。
本發明的另一個目的是提供一種疫苗佐劑，所述疫苗佐劑能強烈地引發哺乳動物的免疫反應。
本發明的目的是通過以下技術方案實現的：
一方面，本發明提供了一種免疫刺激組合物，所述免疫刺激組合物包含皂苷和CpG寡聚去氧核苷酸，或者由包含皂苷的佐劑和CpG寡聚去氧核苷酸組成，其中所述CpG寡聚去氧核苷酸序列具有兩個或兩個以上拷貝的5’-TTCGTT-3’基序或5’-TCGTCGTCG-3’基序。
根據本發明所述的免疫刺激組合物，其中，所述CpG寡聚去氧核苷酸的序列選自以下中的任一種：CpG T1：TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT（SEQ ID NO: 6）、CpG T2：TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT CGT T（SEQ ID NO: 7）和CpG T3：TCG TCG TCG TCG TCG TCG TCG（SEQ ID NO: 8）。
優選地，所述CpG寡聚去氧核苷酸的序列為CpG T1：TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT（SEQ ID NO: 6）。
根據本發明所述的免疫刺激組合物，其中，所述皂苷選自皂樹皂苷、人參皂苷、桔梗皂苷、黃芪皂苷、三七皂苷、甘草皂苷、合歡皮皂苷、麥冬皂苷、柴胡皂苷或竹節參皂苷的一種或多種；優選地，所述皂苷為皂樹皂苷、人參皂苷、桔梗皂苷或黃芪甲苷；更優選地，所述皂樹皂苷為QS-7、QS-17、QS-18或QS-21；更優選地，所述皂樹皂苷為QS-21；所述人參皂苷可以為人參皂苷Rg1、人參皂苷Rg3、人參皂苷Rb1或人參皂苷Re；所述桔梗皂苷為桔梗皂苷D、桔梗皂苷D2或其兩者的混合物；所述黃芪皂苷可以為黃芪甲苷（黃芪皂苷IV）、黃芪皂苷I、黃芪皂苷II或其中兩種或兩種以上皂苷單體的混合物；所述三七皂苷可以為三七皂苷R1；所述麥冬皂苷可以為麥冬皂苷D；所述柴胡皂苷可以為柴胡皂苷a、柴胡皂苷d或其兩者的混合物；所述合歡皮皂苷可以為合歡皮總皂苷；所述甘草皂苷可以為甘草總皂苷；所述竹節參皂苷可以為竹節參總皂苷。
根據本發明所述的免疫刺激組合物，其中，所述包含皂苷的佐劑為免疫刺激複合物佐劑（Iscom佐劑）。
根據本發明所述的免疫刺激組合物，其中，所述CpG寡聚去氧核苷酸包含硫代磷酸酯連接。特別地，所述CpG寡聚去氧核苷酸為硫代寡聚去氧核苷酸，優選為全硫代寡聚去氧核苷酸。
根據本發明所述的免疫刺激組合物，其中，所述CpG寡聚去氧核苷酸與所述皂苷的重量比為1~40:0.1~2，優選為2~40:0.1~2，進一步優選為2:1。
另一方面，本發明還提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含所述免疫刺激組合物，以及抗原或抗原組合物。
根據本發明所述的藥物組合物，其中，所述抗原或抗原組合物選擇下述中任一種：人體免疫缺陷病毒，人皰疹病毒，水痘-帶狀皰疹病毒，人體細胞肥大病毒，甲、乙、丙或戊型肝炎病毒，呼吸合胞體病毒，人體乳頭狀瘤病毒，流感病毒，結核分枝桿菌，沙門氏菌，奈瑟菌如腦膜炎奈瑟菌或淋病奈瑟菌，疏螺旋體屬如回歸熱螺旋體或杜通氏螺旋體，衣原體屬如沙眼衣原體，博多特氏桿菌屬如百日咳博多特氏菌，瘧原蟲屬如惡性瘧原蟲（Plasmodium falciparum）、三日瘧原蟲（Plasmodium malariae）、卵形瘧原蟲（Plasmodium ovale）、間日瘧原蟲（Plasmodium vivax）或諾氏瘧原蟲（Plasmodium knowlesi）或弓形蟲屬如弓形蟲。
根據本發明所述的藥物組合物，其中，所述人皰疹病毒是HSV1或HSV2。
根據本發明所述的藥物組合物，其中，所述抗原為腫瘤抗原。
再一方面，本發明提供了一種疫苗，所述疫苗包含所述免疫刺激組合物。
根據本發明所述的疫苗，其中所述疫苗為用於預防病毒、細菌和/或寄生蟲感染的疫苗，或所述疫苗為以免疫療法治療病毒、細菌和/或寄生蟲感染的疫苗。
再一方面，本發明提供了所述免疫刺激組合物在製備用於引起細胞溶解的T細胞應答的藥物中的用途。
在一些具體實施方案中，本發明提供了所述免疫刺激組合物在製備用於在哺乳動物中誘發干擾素γ應答的藥物中的用途。
在一些具體實施方案中，本發明提供了所述免疫刺激組合物在製備用於預防病毒、細菌和/或寄生蟲感染的疫苗中的用途。
在一些具體實施方案中，本發明提供了所述免疫刺激組合物在製備用於以免疫療法治療病毒、細菌和/或寄生蟲感染的疫苗中的用途。
在一些具體實施方案中，本發明提供了所述免疫刺激組合物在製備用於以免疫療法治療腫瘤的疫苗中的用途。
本發明還提供了一種引起細胞溶解的T細胞應答的方法，所述方法包括給予有需要的受試者有效量的包含本發明所述的免疫刺激組合物的藥物組合物。
本發明還提供了一種在哺乳動物中誘發干擾素γ應答的方法，所述方法包括給予有需要的受試者有效量的包含本發明所述的免疫刺激組合物的藥物組合物。
本發明還提供了一種預防病毒、細菌和/或寄生蟲感染的方法，所述方法包括給予有需要的受試者預防有效量的包含本發明所述的免疫刺激組合物的疫苗。
本發明還提供了一種以免疫療法治療病毒、細菌和/或寄生蟲感染的方法，所述方法包括給予有需要的受試者有效量的包含本發明所述的免疫刺激組合物的疫苗。
本發明還提供了一種治療腫瘤的方法，所述方法包括給予有需要的受試者治療有效量的包含本發明所述的免疫刺激組合物的藥物組合物。
本發明提供的免疫刺激組合物達到了出乎意料的技術效果，可介導更強的免疫應答。單獨使用CpG T1~T3的免疫刺激作用弱於CpG1018、CpG7909和CpG1826等，但與QS-21聯合應用後，所述免疫刺激組合物表現出出人意料的協同作用，免疫效果顯著增強。
本發明研究發現，含有所述免疫刺激組合物的B型肝炎治療性疫苗可以突破轉基因小鼠的免疫耐受，產生高滴度的抗HBsAg抗體、抗HBcAg抗體、中和抗體。各項檢測結果均顯示，該疫苗通過多次免疫可以顯著清除轉基因小鼠體內的B型肝炎病毒，在免疫過程結束後，HBsAb水準接近飽和，可以保持穩定長效的免疫效果，HBsAg平均下降率維持在92%左右。同時含有所述免疫刺激組合物的B型肝炎疫苗可誘導產生較強的HBsAg和HBcAg特異性IFN-γ水準，免疫效果顯著優於單獨佐劑，也顯著優於現有的CPG佐劑和QS-21的組合。
含有該免疫刺激組合物的帶狀皰疹疫苗也證明該免疫刺激組合物具有優越的免疫刺激作用。細胞免疫實驗證明該疫苗可誘導產生較強的皰疹gE蛋白特異性IFN-γ水準，蛋白免疫效果顯著優於單一佐劑。體液免疫實驗也證明該疫苗可產生較高的皰疹gE蛋白特異性IgG/IgG1/IgG2a抗體水準，且效果優於單一佐劑，也顯著優於現有的CPG佐劑和QS-21的組合。
綜上，本發明提供的免疫刺激組合物具有優越的免疫刺激作用，相比單一佐劑、現有的CPG佐劑和QS21的組合，本發明的免疫刺激組合物中CpG T1~T3與QS-21表現出高效的協同作用，可以介導更強烈的免疫應答。應用於不同的抗原或抗原組合物，均有顯著性優勢。因此，本發明的免疫刺激組合物作為一種新型佐劑，具有很高的臨床應用價值和廣闊的市場前景。
定義
除非另有定義，本文使用的所有科技術語具有本領域普通技術人員所理解的相同含義。關於本領域的定義及術語，專業人員具體可參考Current Protocols in Molecular Biology（Ausubel）。胺基酸殘基的縮寫是本領域中所用的指代20個常用L-胺基酸之一的標準3字母和/或1字母代碼。
儘管本發明以廣義範圍顯示數位範圍和參數近似值，但是具體實施例中所示的數值盡可能準確的進行記載。然而，任何數值本來就必然含有一定的誤差，其是由它們各自的測量中存在的標準差所致。另外，本文公開的所有範圍應理解為涵蓋其中包含的任何和所有子範圍，例如記載的“2至40”的範圍應認為包含最小值2和最大值40之間（包含端點）的任何和所有子範圍，也就是說，所有以最小值2或更大起始的子範圍，例如2至6.1，以及以最大值40或更小終止的子範圍，例如5.5至40。另外，任何稱為“併入本文”的參考文獻應理解為以其整體併入。
另外應注意，如本說明書中所使用的，單數形式包括其所指物件的複數形式，除非清楚且明確的限於一個所指物件。術語“或”可與術語“和/或”互換使用，除非上下文另有清楚指明。
本文使用的術語“藥物組合物”、“組合藥物”和“藥物組合”可互換地使用，其表示組合在一起以實現某種特定目的的至少一種藥物以及任選的可藥用賦形劑或輔料的組合。在某些實施方案中，所述藥物組合物包括在時間和/或空間上分開的組合，只要其能夠共同作用以實現本發明的目的。例如，所述藥物組合物中所含的成分（例如gE蛋白、QS-21、CpG寡聚去氧核苷酸）可以以整體施用於物件，或者分開施用於物件。當所述藥物組合物中所含的成分分開地施用于物件時，所述成分可以同時或依次施用於物件。
本文使用的術語“CpG寡聚去氧核苷酸”或“CpG-ODN”是指短的單鏈合成DNA分子，其含有一個或更多個“CpG”單元，其中C表示胞嘧啶，G表示鳥嘌呤，p表示磷酸二酯鍵。特別地，所述CpG寡聚去氧核苷酸是非甲基化的。在一些實施方案中，所述CpG-ODN包含硫代磷酸酯連接或硫代磷酸酯骨架。也就是說，在一些實施方案中，所述CpG-ODN為硫代磷酸酯寡聚去氧核苷酸（即硫代寡聚去氧核苷酸）。優選地，所述CpG-ODN中所有核苷酸間連接均為硫代磷酸酯連接，即所述CpG-ODN為全硫代寡聚去氧核苷酸。在另一些實施方案中，所述CpG-ODN包含兩個或兩個以上拷貝的5’-TTCGTT-3’基序或5’-TCGTCGTCG-3’基序。特別地，所述CpG-ODN具有選自下列的序列：TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT（SEQ ID NO: 6）、TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT CGT T（SEQ ID NO: 7）或TCG TCG TCG TCG TCG TCG TCG（SEQ ID NO: 8），優選地為TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT（SEQ ID NO: 6）。
本文使用的“人參皂苷、桔梗皂苷、黃芪皂苷、三七皂苷、甘草皂苷、合歡皮皂苷、麥冬皂苷、柴胡皂苷或竹節參皂苷”是指是存在於對應植物中的活性成分，例如人參皂苷是一種固醇類化合物，主要存在於人參屬藥材中，是人參中的活性成分。在一些實施方案中，所述人參皂苷優選為人參皂苷Rg1、人參皂苷Rg3、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re等單體或其中兩個或兩個以上皂苷單體的混合物；桔梗皂苷優選為桔梗皂苷D、桔梗皂苷D2或其兩者的混合物；黃芪皂苷優選為黃芪甲苷（黃芪皂苷 IV）、黃芪皂苷I、黃芪皂苷II等單體或其中兩個或兩個以上皂苷單體的混合物；三七皂苷優選為三七皂苷R1等；麥冬皂苷優選為麥冬皂苷D等；柴胡皂苷優選為柴胡皂苷a、柴胡皂苷d或其兩者的混合物；合歡皮皂苷優選為合歡皮總皂苷等；甘草皂苷優選為甘草總皂苷等；竹節參皂苷優選為竹節參總皂苷等。
本文使用的“Iscom佐劑”為免疫刺激複合物佐劑，具體地為不包含抗原的Iscom基質（ISCOM MATRIX），是由磷脂、皂苷、膽固醇組成的籠狀結構的佐劑。
本文使用的“治療和/或預防有效量”或“有效量”是指足以顯示其對於所施用物件益處的劑量。施用的實際量，以及施用的速率和時間過程會取決於所治療者的自身情況和嚴重程度。治療的處方（例如對劑量的決定等）最終是全科醫生及其它醫生的責任並依賴其做決定，通常考慮所治療的疾病、患者個體的情況、遞送部位、施用方法以及對於醫生來說已知的其它因素。
本文所使用的術語“哺乳動物”是指人類，也可以是其它動物，如野生動物（如蒼鷺、鸛、鶴等），家畜（如鴨、鵝等）或實驗動物（如猩猩、猴子、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠、土撥鼠、地松鼠等）。
在另一些實施方案中，本發明組合物還可包含另外的添加劑，如可藥用載體或添加劑，尤其是當它以藥物製劑形式存在時。
優選的藥物載體尤其是水，緩衝水溶液，優選等滲鹽溶液如PBS（磷酸鹽緩衝液）、葡萄糖、甘露醇、右旋葡萄糖、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、纖維素、碳酸鎂、0.3%甘油、透明質酸、乙醇或聚亞烷基二醇如聚丙二醇、甘油三酯等。所用藥物載體的類型尤其依賴于根據本發明的組合物是否配製為用於口服、鼻、皮內、皮下、肌內或靜脈施用。根據本發明的組合物可包含潤濕劑、乳化劑或緩衝液物質作為添加劑。
根據本發明的藥物組合物、疫苗或者藥物製劑可通過任何適宜的途徑施用，例如可口服、鼻、皮內、皮下、肌內或靜脈內施用。
以下結合附圖通過具體實施方式的描述對本發明作進一步說明，但這並非是對本發明的限制，本領域技術人員根據本發明的基本思想，可以作出各種修改或改進，但是只要不脫離本發明的基本思想，均在本發明的範圍之內。
以下參照具體的實施例來說明本發明。本領域技術人員能夠理解，這些實施例僅用於說明本發明，其不以任何方式限制本發明的範圍。
下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的原料、試劑材料等，如無特殊說明，均為市售購買產品。
實施例1 製備本發明的免疫刺激組合物和B型肝炎疫苗
1、HBsAg原液：HBsAg蛋白的胺基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
HBsAg蛋白由HBsAg基因重組酵母細胞製備，酵母細胞種類包括漢遜酵母、釀酒酵母和畢赤酵母，優選為漢遜酵母。具體製備步驟參考中國專利申請CN108330145A，HBsAg基因重組漢遜酵母細胞經發酵培養，收穫菌體。經破菌處理和矽膠吸附、柱層析和TFF等步驟純化。
2、HBcAg原液：HBcAg蛋白的胺基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
HBcAg蛋白由HBcAg基因重組酵母細胞製備，酵母細胞種類包括漢遜酵母、釀酒酵母和畢赤酵母，優選漢遜酵母。具體製備步驟參考中國專利申請CN108047316A，HBcAg基因重組漢遜酵母細胞經發酵培養，收穫菌體。經破菌處理和硫酸銨、柱層析和TFF等步驟純化，製備HBcAg原液。
3、QS-21：購自BRENNTAG公司，CAS.NO.A010-023。
4、CPG寡聚去氧核苷酸原料的製備方法：
表1 CPG寡聚去氧核苷酸的具體序列
CPG寡聚去氧核苷酸的分型 CPG寡聚去氧核苷酸 序列
B型 CpG 1018 TGACTGTGAACGTTCGAGATGA（SEQ ID NO：3）
CpG 7909 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT（SEQ ID NO：4）
CpG 1826 TCCATGACGTTCCTGACGTT（SEQ ID NO：5）
CpG T1 TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT（SEQ ID NO：6）
CpG T2 TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT CGT T（SEQ ID NO：7）
CpG T3 TCG TCG TCG TCG TCG TCG TCG（SEQ ID NO：8）
CpG 684 TCGACGTTCGTCGTTCGTCGTTC（SEQ ID NO：9）
CpG 1668 TCC ATG ACG TTC CTG ATGCT（SEQ ID NO：10）
CpG D2 TGTCGTCGTCGTTTGTCGTTTGTCGTT（SEQ ID NO：11）
A型 CpG 2216 GGGGGACGATCGTCGGGGGG（SEQ ID NO：12）
ODN 2336 GGGGACGACGTCGTGGGGGGG（SEQ ID NO：13）
C型 ODN 2395 TCGTCGTTTCGCGCGCGCCG（SEQ ID NO：14）
ODN M362 TCGTCGTTCGTTCGTCGAACGACGTTTGAT（SEQ ID NO：15）
具體製備方法：使用常規固相亞磷醯胺三酯法化學合成方法製備，由3’端開始，1）脫保護基：先用三氯乙酸脫去連接在CpG上的核苷酸的保護基團DMT（二甲氧基三苯甲基），獲得游離的5’羥基，以供下一步縮合反應使用；2）活化：將亞磷醯胺保護的核苷酸單體與四氮唑活化劑混合並進入合成柱，形成亞磷醯胺四唑活性中間體，此中間體與CpG上已脫保護基的核苷酸發生縮合反應；3）連接：亞磷醯胺四唑活性中間體遇到CpG上已脫保護基的核苷酸時，將與其5’羥基發生親和反應，縮合並脫去四唑，此時寡核苷酸鏈向前延長一個堿基；4）氧化：縮合反應時核苷酸單體是通過亞磷酯鍵與連在CpG上的寡核苷酸連接，而亞磷酯鍵不穩定，易被酸或堿水解，此時使用硫代試劑將亞磷醯胺氧化為硫磷雙鍵的磷酸三酯，從而得到穩定的寡核苷酸；5）封閉：縮合反應後為了防止連在CpG上的未參與反應的5’羥基在隨後的循環反應中被延伸，常通過乙醯化來封閉此端羥基；經過以上五個步驟後，一個去氧核苷酸就連到CpG的核苷酸上；重複以上的脫保護基、活化、連接、氧化、封閉過程即可得到一個DNA片段粗品；最後對其進行切割、脫保護基、純化、定量等合成後處理即可。
5、使用PBS溶液（購自Hyclone公司）將HBsAg原液和HBcAg原液分別稀釋至200μg/ml和100μg/ml；使用PBS溶液將各CPG原料分別溶解並稀釋至100μg/ml，供下一步使用。
實施例2 CPG寡聚去氧核苷酸的篩選實驗
1、實驗動物：C57BL/6（N）小鼠，雄性，4週齡，135隻，上海靈暢實驗動物技術有限公司。
2、實驗分組：見表2，每次注射量為100μL/隻。其中A組為陰性對照，PBS溶液100 μL/隻。
表2 實驗動物分組
組別 數量(隻) 組分(μg/隻小鼠)
HBsAg HBcAg CpG T1 CpG T2 CpG T3 CpG 1018 CpG 7909 CpG 1826 CpG 684 CpG 1668 CPG D2 CpG 2216 ODN2336 ODN 2395 ODNM362
對照 9                              
抗原 9 20 10                          
T1 9 20 10 10                        
T2 9 20 10   10                      
T3 9 20 10     10                    
1018 9 20 10       10                  
7909 9 20 10         10                
1826 9 20 10           10              
684 9 20 10             10            
1668 9 20 10               10          
D2 9 20 10                 10        
2216 9 20 10                   10      
2336 9 20 10                     10    
2395 9 20 10                       10  
M362 9 20 10                         10
3、實驗步驟：小鼠免疫後第7天取脾，按常規方法製備脾淋巴細胞，具體如下：無菌操作取脾臟：用無菌鑷子及剪刀剪取脾臟，放於70μm細胞濾網中，置於含有2ml預冷處理的2% FBS（購自GIBCO公司）-PBS的平皿中；用研磨棒研磨脾臟，脾臟細胞通過篩目進入平皿中，得到細胞懸液，用巴氏吸管將懸液放入經40μm細胞濾網過濾（購自BD公司）的50ml無菌離心管；500×g，4℃離心5分鐘；棄去上清，加入2ml 1×破紅劑（購自BD公司）重懸細胞，4℃避光靜置5分鐘，以破碎紅細胞；加入10ml 2% FBS-PBS終止破紅反應；500×g，4℃離心5分鐘；棄去上清，加入5ml 2% FBS-PBS重懸細胞備用。分別使用刺激物HBsAg特異性肽庫PS4和HBcAg特異性肽庫PCP刺激脾細胞；按照試劑盒說明書，使用ELISPOT試劑盒（BD公司）檢測HBsAg和HBcAg抗原特異性IFN-γ分泌水準；使用ImmunoSPOT Series 3酶聯斑點分析儀讀取ELISPOT試劑盒測出的斑點數（具體操作步驟參考中國專利CN104043120B的實施例7）。
其中，HBsAg特異性肽庫序列參考中國專利CN104043120B的實施例7；HBcAg特異性肽庫序列見SEQ ID NO：16~30。
4、實驗結果：ELISPOT斑點結果見圖1和圖2，結果顯示，不同序列的B型CpG佐劑具有不同的免疫效果，其中，CpG T1~T3、CpG1018、CpG7909、CpG 1826和CpG 684整體優於A型CpG佐劑和C型CpG佐劑，而CpG1618和CPG D2的免疫效果較差，誘導產生HBsAg和HBcAg特異性IFN-γ水平均低於A型CpG佐劑和C型CpG佐劑。
實施例3 免疫刺激組合物的篩選實驗
1、實驗動物：C57BL/6（N）小鼠，雄性，4週齡，81隻，上海靈暢實驗動物技術有限公司，
2、實驗分組：見表3，每次注射量為100μL/隻。其中A組為陰性對照，PBS溶液100μL/隻。
表3 實驗動物分組
組別 數量(隻) 組分(μg/隻小鼠)
HBsAg HBcAg CpG T1 CpG T2 CpG T3 CpG 1018 CpG 7909 CpG 1826 CpG 684 QS21
對照 9                    
抗原 9 20 10                
T1 9 20 10 10             5
T2 9 20 10   10           5
T3 9 20 10     10         5
1018 9 20 10       10       5
7909 9 20 10         10     5
1826 9 20 10           10   5
684 9 20 10             10 5
3、實驗步驟：同實施例2。
4、實驗結果：ELISPOT斑點結果見圖3和圖4，結果顯示，CpG T1~T3與QS21聯合應用後產生了高效的協同作用，誘導產生HBsAg和HBcAg特異性IFN-γ水準顯著高於CpG1018、CpG7909等其他幾種CpG佐劑，具有出人意料的免疫效果。
實施例4 不同含量佐劑對藥物組合物免疫效果的影響
1、實驗動物：C57BL/6（N）小鼠，雄性，4週齡，60隻，上海靈暢實驗動物技術有限公司。
2、試劑材料：
1）HBsAg蛋白、HBcAg蛋白和CpG T1均由實施例1制得；
2）QS-21（CAS.NO.A010-023，購自BRENNTAG公司）
3）使用PBS溶液（購自Hyclone公司）將HBsAg原液、HBcAg原液分別稀釋至200μg/ml、100μg/ml，使用PBS溶液將QS21分別稀釋至5μg/ml、50μg/ml、100μg/ml，使用PBS溶液將CpG T1溶解並分別稀釋至50μg/ml、100μg/ml、2mg/ml，使用PBS溶液將CPG7909溶解並稀釋至100μg/ml，供下一步使用。
3、實驗分組：見表4，每次注射量為100μL/隻。其中A組為陰性對照，PBS溶液100μL/隻。
4、實驗步驟：同實施例2。
5、實驗結果：ELISPOT斑點結果見圖5和圖6，結果顯示，CpG T1與QS21的劑量變化對疫苗組合物的均有顯著性影響，高於劑量5的免疫刺激組合物，誘導產生HBsAg和HBcAg特異性IFN-γ水準顯著高於CPG7909組，但由於種屬差異性，佐劑劑量進一步增加誘導效果並無顯著性增加，推測原因為小鼠無法準確反映佐劑的免疫強度。
劑量1、2、4與CPG7909組的免疫刺激效果相當，但是使用的佐劑劑量低於同等CPG7909組，因此也具有一定優勢。
表4 實驗動物分組
組別 數量(隻) 組分(μg/隻小鼠)
HBsAg HBcAg CpG T1 QS21 CPG7909
對照 5          
抗原 5 20 10      
劑量1 5 20 10 5 0.5  
劑量2 5 20 10 5 5  
劑量3 5 20 10 5 10  
劑量4 5 20 10 10 0.5  
劑量5 5 20 10 10 5  
劑量6 5   20 10 10 10  
劑量7 5 20 10 200 0.5  
劑量8 5 20 10 200 5  
劑量9 5 20 10 200 10  
CPG7909 5 20 10   5 10  
實施例5 B型肝炎疫苗的實驗組設置及免疫流程
1、實驗動物及模型建立：
C57BL/6（N）小鼠，雄性，4週齡，81隻，上海靈暢實驗動物技術有限公司，rAAV8-HBV腺病毒，購自北京五加和分子醫學研究所有限公司。在C57BL/6（N）小鼠上尾靜脈注射rAAV8-HBV腺病毒，建立rAAV8-HBV持續感染C57BL/6（N）的小鼠模型。
2、試劑材料：
1）HBsAg蛋白：實施例1制得。
2）HBcAg蛋白：實施例1制得。
3）使用PBS溶液（購自Hyclone公司）將HBsAg原液、HBcAg原液和QS-21分別稀釋至200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml，使用PBS溶液將CpG 溶解並稀釋至100μg/ml，供下一步使用。
3、實驗分組：見表5，每隻小鼠每次注射量為100μL/隻，其中A組為陰性對照，注射PBS溶液100μL/隻。
表5 實驗動物分組及每組注射量
組別 數量(隻) 組分(μg/隻小鼠)
HBsAg HBcAg CpG T1 CpG 7909 QS-21
A 9          
B 9     10    
C 9         5
D 9     10   5
E 9 20 10      
F 9 20 10 10    
G 9 20 10     5
H 9 20 10 10   5
I 9 20 10   10 5
4、動物免疫：所有組別每2週進行1次肌肉注射，接種部位為右側後大腿，共給藥6次，分別於尾靜脈注射rAAV8-HBV病毒後第4週、第6週、第8週、第10週、第12週、第14週給藥。給藥開始後每2週採1次血，採血時間分別為第4週、第6週、第8週、第10週、第12週、第14週、第16週、第18週、第20週、第22週。第22週將所有小鼠處死。
實施例6 B型肝炎疫苗對血清中HBsAg水準的影響
1、血清HBsAg的檢測步驟：委託南京鼓樓醫院檢測。
使用兩步免疫測定法，首先檢測樣本和包被乙型肝炎表面抗體的順磁微粒子結合，經過洗滌，加入吖啶酯標記的乙型肝炎表面抗體結合物，再經過洗滌，加入預激發液和激發液到反應混合物中，測定檢測樣本的相對發光值（RLU），樣本中的HBsAg含量與RLU之間成正相關性，通過產生的ARCHTITECT HBsAg標準曲線測定小鼠血清樣本中HBsAg濃度，最終小鼠血清樣本中HBsAg濃度為測定值的50~200倍。
2、結果分析（圖7）：含有本發明所述免疫刺激物的H組疫苗，對應的HBsAg水準呈明顯下降趨勢，在免疫過程結束後（第14週起），保持穩定長效的免疫效果，相比單獨的CpG組（F組）和QS-21組（G組），具有顯著性優勢。H組HBsAg水準從起始＞6350 IU/ml降低到50 IU/ml左右，該組在第二次免疫（第6週）後HBsAg水準即下降30%以上，在第三次免疫（第8週）後HBsAg水準下降70%以上，且在第14週免疫結束後平均下降率維持在92%左右。具有優越的免疫效果。與雙佐劑對照（I組）相比，H在第14週免疫結束後依舊維持穩定的免疫效果，免疫水準顯著優於I組。
實施例7 B型肝炎疫苗的體液免疫效果評價
1、血清HBsAb的檢測步驟：委託南京鼓樓醫院檢測。
使用兩步免疫測定法，即首先檢測樣本和重組HBsAg（rHBsAg）包被順磁微粒子混合，經過洗滌，加入吖啶酯標記的rHBsAg結合物，再經過洗滌，加入預激發液和激發液到反應混合物中，測定檢測樣本的相對發光值（RLU），樣本中的HBsAb含量與RLU之間成正相關性，通過產生的ARCHTITECT HBsAb校準曲線測定小鼠血清樣本中HBsAb濃度，最終小鼠血清樣本中HBsAb濃度為測定值的50~200倍。
2、結果分析（圖8）：含有所述免疫刺激物的H組疫苗在第二次免疫（第6週）後開始產生HBsAb（＞10mIU/ml），且隨著免疫次數的增加，HBsAb水準呈現不斷增長的趨勢，且增長趨勢顯著優於單獨的CpG組（F組）和QS-21組（G組）。免疫結束後兩週（第十六週）之後HBsAb水準接近飽和，可達4.0個對數值即10000mIU/ml左右的HBsAb水準，與雙佐劑對照（I組）相比，產生的抗體水準也具有顯著性優勢。
實施例8 B型肝炎疫苗的細胞免疫效果評價
1、檢測步驟：同實施例2。
2、評價指標：若對照孔斑點數≤5 SCF，樣品孔斑點數≥10 SCF，判定為陽性；若5 SFC＜對照孔斑點數≤10 SCF，樣品孔斑點數/對照孔斑點數≥2，判定為陽性；若對照孔斑點數＞10 SFC，樣品孔斑點數/對照孔斑點數≥3，判定為陽性。
3、實驗結果：
表6 脾細胞分泌的HBsAg和HBcAg特異性IFN-γ的轉陽率
組別 數量(隻) 陽轉率（%）
HBsAg HBcAg
A 9 11.1 11.1
B 9 0 11.1
C 8 0 0
D 8 12.5 12.5
E 9 37.5 12.5
F 9 100 100
G 8 100 100
H 8 100 100
I 8 100 100
細胞免疫水準檢測結果：ELISPOT斑點結果見圖9和10，分析結果顯示，F組-I組的HBsAg特異性IFN-γ陽轉率均為100%，HBcAg特異性IFN-γ陽轉率均為100%。含有所述免疫刺激物的H組疫苗可誘導產生較高的HBsAg和HBcAg特異性IFN-γ水準，分別大於2350 SFC/106 脾細胞和大於1250 SFC/106 脾細胞，與單獨的CpG組（F組）和QS-21組（G組）相比，具有顯著性差異。H組與雙佐劑對照（I組）相比，後者誘導產生的HBsAg和HBcAg特異性IFN-γ水準約為1630 SFC/106 脾細胞和750 SFC/106 脾細胞左右，顯著低於H組。
實施例9 藥物組合物在血清中HBsAg和HBcAg特異性抗體檢測
1、檢測步驟：用純化的HBsAg和HBcAg包被96孔酶標板，形成固相抗原，經過封閉處理後，將待測血清以一定的起始稀釋度作倍比稀釋，設多個稀釋度，在96孔酶標板中加入倍比稀釋後的血清樣本，再與HRP標記的抗IgG/IgG1/IgG2a抗體結合，形成抗原-抗體（血清）-酶標抗體複合物，最後加入底物TMB顯色，並用酶標儀測定450nm波長下的吸光度（OD值），顯色顏色的深淺與檢測樣本中的HBsAg和HBcAg特異性抗體IgG/IgG1/IgG2a水準呈正相關，通過擬合“吸光度OD值-血清樣本稀釋倍數（Log）”的關係曲線，進行抗體滴度的判定。
2、結果分析：
1）血清中HBsAb IgG抗體及亞型檢測結果：
各組不同時間用ELISA方法檢測小鼠血清中HBsAb IgG抗體及亞型水準如圖11所示。含有所述免疫刺激物的H組疫苗產生較高滴度的抗HBsAg特異性IgG/IgG1/IgG2a抗體，且隨著免疫次數的增加，抗體水準不斷增長，在第六次免疫（第14週）時抗體水準接近飽和，特異性抗體滴度可達5.4個對數值以上；A組-D組未檢測到特異性抗體，E組-G組雖然產生一定的HBsAg特異性IgG/IgG1/IgG2a抗體水準，但抗體水準顯著低於H組，雙佐劑對照（I組）產生的抗HBsAg特異性IgG抗體和IgG2a抗體水準顯著低於H組。
2）血清中HBcAb IgG抗體及亞型檢測結果：
各組不同時間用ELISA方法檢測小鼠血清中HBcAb IgG抗體及亞型水準如圖12所示。含有所述免疫刺激物的H組疫苗產生較高滴度的抗HBcAg特異性IgG/IgG1/IgG2a抗體，且隨著免疫次數的增加，抗體水準不斷增長，在第六次免疫（第14週）時抗體水準接近飽和，特異性抗體滴度可達4.8個對數值以上；A組-D組未檢測到特異性抗體，E組-G組雖然產生一定的HBcAg特異性IgG/IgG1/IgG2a抗體水準，但抗體水準顯著低於H組。且H組更偏向於Th1通路，D圖可見特異性抗體IgG2a呈顯著上升趨勢，反映出H組疫苗可以促進抗HBcAg抗體亞型轉變，且轉變效率顯著高於雙佐劑對照（I組）。
實施例10 帶狀皰疹疫苗的實驗組設置
1、實驗動物及模型建立：
C57BL/6（N）小鼠，雌性，5週齡，48隻，購於上海斯萊克實驗動物有限責任公司。
2、試劑材料：
1）皰疹gE蛋白：胺基酸序列如SEQ ID NO：31所示。
製備步驟參考文獻Thomsson E , Persson L等在《Journal of Virological Methods》2011，第175卷，第1期，第53-59頁中的報導，具體步驟如下：根據目的蛋白序列對其核酸序列進行優化，使其密碼子符合哺乳動物表達系統，並對目的基因進行合成；將合成的目的基因通過酶切連接的方式與pcDNA3.1（+）質體連接，轉化Top 10感受態，挑取陽性單克隆，對陽性單克隆進行測序驗證；大量擴增單克隆菌體，用無內毒素質體抽提試劑盒進行大量抽提符合細胞轉染的質體；通過暫態轉染方式用質體轉染CHO懸浮細胞，CHO細胞活力低於70%或發酵時間大於7天時，在4℃下用5000rpm離心30min收集發酵液上清。將發酵液在4℃層析櫃中透析至含50mMTris-HCl、500mM NaCl、20mM咪唑的溶液中，透析比例1:100，每4h透析一次，共透析3次；通過鎳柱對收集樣品經行純化，對收集目的蛋白峰樣品進行SDS-PAGE檢測，合併較純的純化液，用含20mM磷酸鹽、150mM NaCl的溶液在4℃層析櫃中透析24h，透析比例1:100，每8h換液一次；將樣品過0.22um無菌濾膜，4℃冰箱中保存備用。
製備的皰疹gE蛋白原液要求其純度大於95%，蛋白含量不低於200μg/ml，內毒素水準不高於0.1Eu/ug。
2）使用PBS溶液（購自Hyclone公司）將皰疹gE原液分別稀釋至50μg/ml和10μg/ml，使用PBS溶液將QS-21分別稀釋至50μg/ml和10μg/ml，使用PBS溶液將CpG分別稀釋至100μg/ml和20μg/ml，使用PBS溶液將CpG7909分別稀釋至100μg/ml和20μg/ml。
3、實驗分組：見表7，每隻小鼠每次注射量為100μL/隻，其中A組為陰性對照，注射PBS溶液100μL/隻。
表7 實驗動物分組及每組注射量
組別 數量(隻) 組分μg/隻
皰疹gE蛋白 CpG T1 CpG7909 QS-21
A 6        
B 6 5      
C 6 5 10    
D 6 5     5
E 6 5 10   5
F 6 5   10 5  
G 6 1 2   1
H 6 1   2 1
4、動物免疫：所有組別每2週進行1次肌肉注射，接種部位為右側後大腿，連續給藥2次，即分別于第0週和第2週注射給藥，第4週將所有小鼠處死。
實施例11 帶狀皰疹疫苗的細胞免疫藥效驗證
1、檢測步驟和評價指標同實施例2；其中gE特異性肽庫序列見SEQ ID NO.32~46。
2、實驗結果：各組小鼠脾細胞分泌gE特異性IFN-γ的T淋巴細胞斑點數水準如圖13所示，gE特異性IFN-γ陽轉率結果如表8所示。結果表明：免疫高劑量的E、F組對應的脾細胞分泌gE特異性IFN-γ的T淋巴細胞斑點數水準（＞4000SFC/106 脾細胞）均顯著高於低劑量的G、H組；其中，E組、G組（CpGT1+QS-21）對應的脾細胞分泌gE特異性IFN-γ的T淋巴細胞斑點數水準高於同劑量的F組、H組（CpG7909+QS-21），E-H組IFN-γ的轉陽率均為100%。
表8 脾細胞分泌的SgE特異性IFN-γ的轉陽率
組別 A B C D E F G H
轉陽數量/隻 1/6 0/6 4/6 5/6 6/6 6/6 6/6 6/6
轉陽率/% 16.7 0 66.7 83.3 100 100 100 100
實施例12 帶狀皰疹疫苗的體液免疫藥效驗證
1、檢測步驟：免疫後第28天進行採血，分離血清（全血置於37℃恒溫培養箱放置40min，12000rpm、4℃離心10min；吸取上清，凍存於-20℃備用），按照試劑盒說明書，使用ELISA試劑盒（上海科華）檢測產生的皰疹gE蛋白特異性抗體陽轉率。檢測設空白對照、陰性對照和待測樣品，每種兩個平行孔，其中陰性對照為陰性小鼠血清；除空白對照外，各孔分別加入陰性對照或待測樣品，再加入酶結合物，混勻封板後37℃孵育30分鐘；使用洗滌液洗滌各孔，每孔加入顯色劑A液和顯色劑B液，混勻封板後37℃孵育15分鐘；每孔加入終止液混勻；使用酶標儀讀取450nm波長處的各孔OD值。
2、實驗結果：ELISA檢測小鼠血清中抗原特異性IgG抗體及亞型水準如圖14所示，結果表明：含有本發明所述免疫刺激物的E組免疫效果顯著優於單獨的CpG組（C組）和QS-21組（D組）和雙佐劑對照（F組），且對應的IgG和IgG2a抗體水準與兩組均存在顯著差異，即在QS-21中加入CpG可提高相應的體液免疫水準。
實施例13 不同皂苷對重組帶狀皰疹疫苗組合物的藥效影響
1、實驗動物及模型建立：
C57BL/6(N)小鼠，雌性，5週齡，48隻，購於上海斯萊克實驗動物有限責任公司。
2、 試劑材料：
1）皰疹gE蛋白由實施例10獲得、CpG T1、CpG 7909均由實施例1制得；
2）QS-21（CAS.NO.A010-023，購自BRENNTAG公司）；人參皂苷Rg1（CAS: 22427-39-0，購自南京春秋生物工程有限公司）、黃芪甲苷（CAS: 84687-43-4，購自南京春秋生物工程有限公司）、桔梗皂苷D（CAS: 58479-68-8，購自湖北雲鎂科技有限公司），Iscom佐劑（購自上海熹垣生物科技有限公司）
3）使用PBS溶液（購自Hyclone公司）將皰疹gE原液稀釋至50μg/mL，使用PBS溶液將各皂苷分別稀釋至50μg/mL，使用PBS溶液將CpG T1和CpG 7909分別溶解並稀釋至100μg/mL，供下一步使用。
3、實驗分組：
見表9，每次注射量為100μL/隻。其中對照組注射PBS溶液100μL/隻。
4、實驗步驟：同實施例2。
5、實驗結果：
ELISPOT斑點結果見圖15，結果顯示，CpG T1與各皂苷聯合應用後均產生了高效的協同作用，誘導產生gE特異性IFN-γ水準顯著高於其他CpG和皂苷的組合物，其中，QS21的效果最佳。
表9 實驗動物分組
組別 數量(隻) 組分(μg/隻小鼠)
gE CpG T1 QS-21 人參皂苷 Rg1 桔梗皂苷D 黃芪甲苷 IV Iscom佐劑 CpG 7909
對照 6                
抗原 6 5              
QS-21 6 5 10 5          
人參皂苷 Rg1 6 5 10   5        
桔梗皂苷D 6 5 10     5      
黃芪甲苷 6 5 10       5    
Iscom 6 5 10         5  
7909 6 5   5         10
綜上所述，本發明提供的免疫組合物具有優越的免疫刺激作用，相比單一佐劑、其他CPG佐劑和QS21的組合，CpG T1~T3與QS-21表現出高效的協同作用，可以介導更強烈的免疫應答。應用於不同的抗原或抗原組合物，均有顯著性優勢。因此，該免疫組合物作為一種新型佐劑，具有很高的臨床應用價值和廣闊的市場前景。
儘管以上已經對本發明作了詳細描述，但是本領域技術人員理解，在不偏離本發明的精神和範圍的前提下可以對本發明進行各種修改和改變。本發明的權利範圍並不限於上文所作的詳細描述，所述修改和改變應歸屬於申請專利範圍。雖然以上僅描述了本發明的具體實施方式的範例，但本領域的技術人員應當理解，以上這些僅為舉例說明，本發明的保護範圍是由所附申請專利範圍限定的。本領域的技術人員在不背離本發明的原理和實質的前提下，可以對這些實施方式做出多種變更或修改，但這些變更或修改均應落入本發明的保護範圍。
無
以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中： 圖1顯示了不同的CPG寡聚去氧核苷酸對HBsAg抗原特異性IFN-γ分泌水準的影響； 圖2顯示了不同的CPG寡聚去氧核苷酸對HBcAg抗原特異性IFN-γ分泌水準的影響； 圖3顯示了根據本發明的不同的免疫刺激組合物對HBsAg抗原特異性IFN-γ分泌水準的影響； 圖4顯示了根據本發明的不同的免疫刺激組合物對HBcAg抗原特異性IFN-γ分泌水準的影響； 圖5顯示了根據本發明的不同劑量的免疫刺激組合物對HBsAg抗原特異性IFN-γ分泌水準的影響； 圖6顯示了根據本發明的不同劑量的免疫刺激組合物對HBcAg抗原特異性IFN-γ分泌水準的影響； 圖7顯示了含有本發明所述的免疫刺激組合物的B型肝炎疫苗對血清中HBsAg水準的影響； 圖8顯示了含有本發明所述的免疫刺激組合物的B型肝炎疫苗對血清中HBsAb水準的影響； 圖9顯示了含有本發明所述的免疫刺激組合物的B型肝炎疫苗對HBsAg抗原特異性IFN-γ分泌水準的影響； 圖10顯示了含有本發明所述的免疫刺激組合物的B型肝炎疫苗對HBcAg抗原特異性IFN-γ分泌水準的影響； 圖11顯示了含有本發明所述的免疫刺激組合物的B型肝炎疫苗對小鼠血清中HBsAg抗原特異性IgG抗體及其亞型水準的影響； 其中，A 圖：各組小鼠血清的HBsAb IgG水準；B圖：各組小鼠血清的HBsAb IgG1水準；C圖：各組小鼠血清的HBsAb IgG2a水準；D圖：各組小鼠血清的HBsAb IgG2a與IgG1的比值； 圖12顯示了含有本發明所述的免疫刺激組合物的B型肝炎疫苗對小鼠血清中HBcAg抗原特異性IgG抗體及其亞型水準的影響； 其中，A圖：各組小鼠血清的HBcAb IgG水準；B圖：各組小鼠血清的HBcAb IgG1水準；C圖：各組小鼠血清的HBcAb IgG2a水準；D圖：各組小鼠血清的HBcAb IgG2a與IgG1的比值； 圖13顯示了含有本發明所述的免疫刺激組合物的帶狀皰疹疫苗對皰疹gE抗原特異性IFN-γ分泌水準的影響； 圖14顯示了含有本發明所述的免疫刺激組合物的帶狀皰疹疫苗對小鼠血清中抗原特異性IgG抗體及其亞型水準的影響 其中，A圖：各組小鼠血清的IgG水準；B圖：各組小鼠血清的IgG1水準；C圖：各組小鼠血清的IgG2a水準；D圖：各組小鼠血清的IgG2a與IgG1的比值。 圖15顯示了根據本發明的包含不同皂苷的免疫刺激組合物對皰疹gE抗原特異性IFN-γ分泌水準的影響。
無

Claims (18)

  1. 一種免疫刺激組合物，其包含皂苷和CpG寡聚去氧核苷酸，或者其由包含皂苷的佐劑和CpG寡聚去氧核苷酸組成，其中所述CpG寡聚去氧核苷酸序列具有兩個或兩個以上拷貝的5’-TTCGTT-3’基序或5’-TCGTCGTCG-3’基序。
  2. 如請求項1所述的免疫刺激組合物，其中，所述CpG寡聚去氧核苷酸的序列選自以下中的任一種：CpG T1：TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT（SEQ ID NO: 6）、CpG T2：TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT CGT T（SEQ ID NO: 7）和CpG T3：TCG TCG TCG TCG TCG TCG TCG（SEQ ID NO: 8）； 優選地，所述CpG寡聚去氧核苷酸的序列為CpG T1：TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT（SEQ ID NO: 6）。
  3. 如請求項1或2所述的免疫刺激組合物，其中，所述皂苷選自皂樹皂苷、人參皂苷、桔梗皂苷、黃芪皂苷、三七皂苷、甘草皂苷、合歡皮皂苷、麥冬皂苷、柴胡皂苷或竹節參皂苷中的一種或多種。
  4. 如請求項3所述的免疫刺激組合物，其中，所述皂樹皂苷為QS-7、QS-17、QS-18或QS-21，優選地，所述皂樹皂苷為QS-21；所述人參皂苷為人參皂苷Rg1、人參皂苷Rg3、人參皂苷Rb1或人參皂苷Re；所述桔梗皂苷為桔梗皂苷D、桔梗皂苷D2或其兩者的混合物；所述黃芪皂苷為黃芪甲苷、黃芪皂苷I、黃芪皂苷II或其中兩種或兩種以上皂苷單體的混合物；所述三七皂苷為三七皂苷R1；所述麥冬皂苷為麥冬皂苷D；所述柴胡皂苷為柴胡皂苷a、柴胡皂苷d或其兩者的混合物；所述合歡皮皂苷為合歡皮總皂苷；所述甘草皂苷為甘草總皂苷；所述竹節參皂苷為竹節參總皂苷。
  5. 如請求項1至4中任一項所述的免疫刺激組合物，其中所述包含皂苷的佐劑為Iscom佐劑。
  6. 如請求項1至5中任一項所述的免疫刺激組合物，其中所述CpG寡聚去氧核苷酸包含硫代磷酸酯連接。
  7. 如請求項5所述的免疫刺激組合物，其中所述CpG寡聚去氧核苷酸是全硫代寡聚去氧核苷酸。
  8. 如請求項1至7中任一項所述的免疫刺激組合物，所述CpG寡聚去氧核苷酸與皂苷的重量比為1~40: 0.1~2，優選為2~40:0.1~2；更優選地為2:1。
  9. 一種藥物組合物，其包含如請求項1至8中任一項所述的免疫刺激組合物，以及抗原或抗原組合物。
  10. 如請求項9所述的藥物組合物，其中，所述抗原或抗原組合物選自下述中的任一種：人體免疫缺陷病毒，人皰疹病毒，水痘-帶狀皰疹病毒，人體細胞肥大病毒，甲、乙、丙或戊型肝炎病毒，呼吸合胞體病毒，人體乳頭狀瘤病毒，流感病毒，結核分枝桿菌，沙門氏菌，奈瑟菌如腦膜炎奈瑟菌或淋病奈瑟菌，疏螺旋體屬如回歸熱螺旋體或杜通氏螺旋體，衣原體屬如沙眼衣原體，博多特氏桿菌屬如百日咳博多特氏菌，瘧原蟲屬如惡性瘧原蟲（Plasmodium falciparum）、三日瘧原蟲（Plasmodium malariae）、卵形瘧原蟲（Plasmodium ovale）、間日瘧原蟲（Plasmodium vivax）或諾氏瘧原蟲（Plasmodium knowlesi）或弓形蟲屬如弓形蟲。
  11. 如請求項10所述的藥物組合物，其中，所述人皰疹病毒是HSV1或HSV2。
  12. 如請求項9所述的藥物組合物，其中，所述抗原為腫瘤抗原。
  13. 一種疫苗，其包含如請求項1至8中任一項所述的免疫刺激組合物； 優選地，所述疫苗為用於預防病毒、細菌和/或寄生蟲感染的疫苗，或所述疫苗為以免疫療法治療病毒、細菌和/或寄生蟲感染的疫苗。
  14. 一種如請求項1至8中任一項所述的免疫刺激組合物在製備用於引起細胞溶解的T細胞應答的藥物中的用途。
  15. 一種如請求項1至8中任一項所述的免疫刺激組合物在製備用於在哺乳動物中誘發干擾素γ應答的藥物中的用途。
  16. 一種如請求項1至8中任一項所述的免疫刺激組合物在製備用於預防病毒、細菌和/或寄生蟲感染的疫苗中的用途。
  17. 一種如請求項1至8中任一項所述的免疫刺激組合物在製備用於以免疫療法治療病毒、細菌和/或寄生蟲感染的疫苗中的用途。
  18. 一種如請求項1至8中任一項所述的所述免疫刺激組合物在製備用於以免疫療法治療腫瘤的疫苗中的用途。
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