CN114891072B

CN114891072B - 预防和/或治疗疱疹病毒的截短的疫苗抗原肽及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN114891072B
Application number: CN202210239558.XA
Authority: CN
Inventors: 夏慧; 傅文彬; 蔡威特; 沈琼
Original assignee: Shanghai Bowei Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Bowei Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-03-11
Filing date: 2022-03-11
Publication date: 2023-07-04
Anticipated expiration: 2042-03-11
Also published as: CN114891072A

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种针对带状疱疹的疫苗。本发明采用水痘‑带状疱疹病毒的gE蛋白免疫原，尤其是氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示蛋白质的分段多肽或其组合用于制备疫苗制剂，所述分段gE蛋白为氨基酸序列选自SEQ ID NO.9和/或SEQ ID NO.10所示的蛋白或其保守性变异蛋白。本发明还公开了一种疫苗制品。本发明的构建方法能够解决大规模疱疹病毒疫苗生产中蛋白不易释放出细胞导致获得蛋白滴度低、免疫原性差、副作用大等缺陷，所述gE蛋白作为抗原肽具有较好的免疫原性，大大提高疫苗对人体的安全性，减少不良反应，为预防水痘‑带状疱疹病毒引起的疾病提供了新的方案。

Description

预防和/或治疗疱疹病毒的截短的疫苗抗原肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域，特别涉及一种用于预防和/或治疗疱疹病毒的截短的疫苗抗原肽及其制备方法和应用。

背景技术

水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus，VZV)又称3型人疱疹病毒(humanherpesvirus 3，HHV-3)，它与1型和2型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type 1 and2，HSV-1 and HSV-2)同属于人α-疱疹病毒。VZV主要由四层结构组成，由内至外依次为：双链病毒DNA 所组成的圆杆状病毒核心；由162个壳粒构成的直径约为100nm二十面体对称结构，即核衣壳；覆盖在核衣壳外侧，由蛋白质及酶类组成的一层无定型物质，亦称作皮层(tugement)；最外层为囊膜，呈典型脂质双分子层结构，上有大量突起，完整病毒颗粒呈圆形亦或多角形，直径为120～300nm。

在机体内，不同组织感染VZV会造成不同结果，同时引起不同的临床表型。VZV的初发感染多从上呼吸道粘膜上皮细胞开始，其子代病毒可传播至扁桃体和上呼吸道局部淋巴结，同时感染T细胞，并随循环系统传播至身体不同位点，引起全身弥散性的皮疹——水痘(varicella)。带状疱疹易复发且还会诱发其他的并发症，包括脑膜脑炎、脊髓炎、颅神经麻痹、血管病变、角膜炎、视网膜病、溃疡、肝炎、胰腺炎等(Gershon et al.,2015)。抗病毒疗法可有效针对于带状疱疹，能够限制病毒复制，并减少疼痛、病症持续时间、并发症风险，不过无法根治带状疱疹及减缓带状疱疹后遗神经痛(Amlie-Lefond and Gilden,2016)。

因此疫苗接种是控制老年人带状疱疹发病和其并发症的有效手段。现有上市或处于临床研究的重组带状疱疹疫苗，都是利用哺乳动物细胞制备的水痘-带状疱疹病毒的糖蛋白gE，而利用哺乳动物细胞制备疫苗，存在诸多问题，如培养工艺繁琐，成本高，培养后获得的细胞成分复杂，纯化步骤多，不利于大规模生产等。由于gE为糖蛋白，现有技术研究中未能明确糖基化对蛋白功能的影响，以及该蛋白作为抗原激发人体免疫响应时糖基化程度的贡献，致使研究者优先选择糖基化能力更好的哺乳动物细胞生产该蛋白，但目前积累的研究结果表明带状疱疹发病的主要因素是机体针对VZV的细胞免疫响应的减弱，因此有效的抗原成分主要以T细胞表位多肽为主。因此，哺乳动物细胞并不是构建高表达具有较高免疫原性的gE 蛋白的最优表达系统。因此，亟需开发新的表达系统，能够高表达具有较高免疫原性的gE 蛋白抗原。

发明内容

为克服现有技术中存在的诸多缺陷(如表达产量低，纯化困难、成本高等)，本发明提供了一种成本低廉、稳定、高效的可在真菌(如酵母)中直接可溶性表达水痘-带状疱疹病毒 gE蛋白的方法。gE蛋白虽然是糖蛋白，但糖基化修饰结构对带状疱疹疫苗的抗原表位影响有限，原因在于带状疱疹发病的主要因素是机体针对VZV的细胞免疫响应的减弱，因此有效的抗原成分主要以T细胞表位多肽为主，在不考虑糖基化修饰的前提下，本发明通过优化编码基因，筛选适宜的宿主细胞和培养条件等，通过酵母表达系统可以高效表达gE蛋白，用于VZV疫苗开发。现有技术中还未有关于gE蛋白的立体结构的解析，本发明通过对该gE 蛋白的分段截短表达和对应截短蛋白免疫原性的解析，阐述gE蛋白作为带状疱疹疫苗抗原的关键区域，有助于进一步理解gE蛋白的结构和功能。

本发明提供了一种用于预防和/或治疗疱疹病毒的疫苗。

本发明一方面提供了一组疱疹病毒免疫原，所述疱疹病毒免疫原为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示蛋白的截短多肽或其保守性变异多肽，即，所述疱疹病毒免疫原通过改造水痘- 带状疱疹病毒中如SEQ ID NO.1所示的gE蛋白获得，具体为gE蛋白被截短为不同长度的包含N端或C端的多肽。

进一步地，所述疱疹病毒免疫原选自以下任一：包含截短或未截短的gE_1-188、gE_31-188、 gE_1-208、gE_31-208、gE_189-546、gE_169-546、gE_31-168、gE_31-336及gE_337-538或其保守性变异蛋白，所述 gE_1-188、gE_31-188、gE_1-208、gE_31-208、gE_189-546、gE_169-546、gE_31-168、gE_31-336及gE_337-538的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、 SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9及SEQ ID NO.10所示。

优选地，所述疱疹病毒免疫原包含截短或未截短的gE31-336或其保守性变异蛋白以及截短或未截短的gE337-538或其保守性变异蛋白，或截短或未截短的gE31-336或其保守性变异蛋白，或截短或未截短的gE337-538或其保守性变异蛋白；即所述疱疹病毒免疫原既包含截短或未截短的gE31-336或其保守性变异蛋白，也包含截短或未截短的gE337-538或其保守性变异蛋白，或所述疱疹病毒免疫原仅包含截短或未截短的gE31-336或其保守性变异蛋白，或所述疱疹病毒免疫原仅包含截短或未截短的gE337-538或其保守性变异蛋白。

本发明另一方面提供了一种用于编码所述疱疹病毒免疫原的多核苷酸。

本发明另一方面提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体中含有如上所述的多核苷酸。

本发明另一方面提供了一种重组工程菌，所述重组工程菌中含有或者整合有如上所述的重组表达载体。

所述重组工程菌为重组细菌或重组真菌；

其中，所述细菌选自大肠杆菌、卵形拟杆菌、空肠弯曲菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、多形拟杆菌、普通拟杆菌、单形拟杆菌、干酪乳杆菌、脆弱拟杆菌、鲁氏不动杆菌、具核梭杆菌、乔氏拟杆菌、拟南芥拟杆菌、鼠李糖乳杆菌、马赛拟杆菌、粪副拟杆菌、梭杆菌、finegoldii拟杆菌和短双歧杆菌中的一种或几种；

其中，真菌选自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、多形汉逊酵母(Ogataeaangusta)、毕赤酵母(巴斯德毕赤酵母(Komagataella pastoris))、脆壁克鲁维氏酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)，以及栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、白假丝酵母、杜氏假丝酵母、光滑假丝酵母、季也蒙假丝酵母、乳酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、葡萄牙假丝酵母、梅林假丝酵母、嗜油假丝酵母、近平滑假丝酵母、热带假丝酵母和产朊假丝酵母、烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、棒曲霉、灰绿曲霉群、构巢曲霉、米曲霉、土曲霉、焦曲霉和杂色曲霉中的一种或几种。

优选地，所述细菌为大肠杆菌；所述真菌为巴斯德毕赤酵母X33。

本发明另一方面提供了一种表达系统，包括如上所述的重组工程菌，所述重组工程菌中含有或者整合有如上所述的重组表达载体。

本发明另一方面提供了一种制备疱疹病毒免疫原的方法，包括如下步骤：构建整合有或者含有如上所述的多核苷酸的重组工程菌，培养，收集菌体，纯化，获得所述疱疹病毒免疫原。

本发明另一方面提供了如上所述的疱疹病毒免疫原、多核苷酸、重组表达载体、重组工程菌和/或表达系统在制备预防和/或治疗由水痘-带状疱疹病毒感染引起的疾病的药物中的应用。

本发明另一方面提供了如上所述的疱疹病毒免疫原、多核苷酸、重组表达载体、重组工程菌和/或表达系统在制备针对水痘-带状疱疹病毒的抗体中的应用。

本发明另一方面提供了如上所述的疱疹病毒免疫原、多核苷酸、重组表达载体、重组工程菌和/或表达系统在制备水痘-带状疱疹病毒疫苗和/或诊断试剂中的应用。

在一具体实施方式中，本发明疫苗制品可包含一种或多种(如1、2、3、4或更多种)疱疹病毒免疫原。可制备单价疫苗，也可制备2-价、3-价、4-价疫苗。

本发明另一方面提供了一种疫苗佐剂组合物，所述疫苗佐剂组合物包括脂质体和皂苷，所述皂苷和脂质体的体积比为3-6：40-60。

本发明另一方面提供了如上所述的疫苗佐剂组合物在制备水痘-带状疱疹病毒疫苗中的应用。

本发明另一方面提供了一种水痘-带状疱疹病毒疫苗，包含如上所述的疱疹病毒免疫原、多核苷酸、重组表达载体、重组工程菌和/或表达系统中的一种或几种。

本发明应用或疫苗制品中，所述疱疹病毒为水痘-带状疱疹病毒VZV、1型单纯疱疹病毒 HSV-1、2型单纯疱疹病毒HSV-2中的一种或几种；优选为水痘-带状疱疹病毒VZV。

如上所述，本发明具有以下有益效果：

本发明对编码疱疹病毒免疫原的基因序列进行密码子优化，使其更符合酵母表达系统的密码子偏爱性；此外，本发明还采用了新的分子构建方案，疱疹病毒免疫原在不同分子设计下截短表达后，相较全长gE蛋白表达量大幅提高，并且截短后的蛋白免疫原性不低于全长蛋白，非常有利于大规模生产，和大幅降低生产成本。本发明获得了含pPICZαB-gE_31-336、 pPICZαB-gE_337-538、pPICZαB-gE_31-336-538的表达载体的重组生物工程菌株，能够高效表达带状疱疹疫苗重组抗原(如发酵液中目的蛋白表达水平高)，并且易于培养，蛋白表达水平大幅提高，生产成本低廉，生产工艺简便，原料成本、时间成本、生产成本低和质量控制成本都具有非常明显的优势。本发明制备的重组gE蛋白抗原(疱疹病毒免疫原)构建方法简单，重组蛋白抗原得率高，纯度好，免疫原性优良。本发明提供的制备方法简单高效，利于后期工艺放大，解决大规模疫苗生产中水痘-带状疱疹病毒不易释放出细胞导致获得的病毒毒力滴度低、纯度低、免疫原性差等缺陷，有助于开发成本更低的带状疱疹疫苗。本发明的重组蛋白作为疫苗抗原具有安全可控，不会产生较强的毒副反应，不良反应少等优点，是新一代带状疱疹疫苗的有力候选。本发明的重组蛋白能够有助于解析gE的结构，是探索VZV病毒结构的重要基石。

附图说明

图1显示为质粒结构示意图；其中，图1A：pPICZαB-gE_1-188，图1B： pPICZαB-gE_31-188，图1C：pPICZαB-gE_1-208，图1D：pPICZαB-gE_31-208，图1E： pPICZαB-gE_31-168，图1F：pPICZαB-gE_31-336，图1G：pPICZαB-gE_189-546，图1H： pPICZαB-gE_169-546，图1I：pPICZαB-gE_337-538，图1J：pPICZαB-gE_31-188-546，图1K： pPICZαB-gE_31-168-546，图1L：pPICZαB-gE_31-336-538。

图2显示为重组gE蛋白分段重组工程菌株的表达结果。

图2A为gE蛋白分段重组工程菌株的表达结果(SDS-PAGE检测)，图2B为gE蛋白分段重组工程菌株的表达结果(Western-blot检测)；图2A和图2B中1-9号泳道分别为重组工程菌株pPICZαB-gE_1-188-X33、pPICZαB-gE_31-188-X33、pPICZαB-gE_1-208-X33、 pPICZαB-gE_31-208-X33、pPICZαB-gE_31-168-X33、pPICZαB-gE_31-336-X33、 pPICZαB-gE_189-546-X33、pPICZαB-gE_169-546-X33和pPICZαB-gE_337-538-X33，10号泳道为阴性对照株X33。

图2C为多gE蛋白表达盒重组工程菌株的表达结果(SDS-PAGE检测)，图2D为多gE蛋白表达盒重组工程菌株的表达结果(Western-blot检测)；图2C和图2D中1-3号泳道为重组工程菌株pPICZαB-gE_31-188-546-X33、pPICZαB-gE_31-168-546-X33和 pPICZαB-gE_31-336-538-X33，4号泳道为阴性对照株X33。

图3显示为重组工程菌株的发酵结果。

图3A为重组工程菌株pPICZαB-gE31-336-X33发酵上清检测，其中1-4号泳道分别是重组工程菌株发酵10h至40h(10h、20h、30h、40h)的上清；

图3B为重组工程菌株pPICZαB-gE337-538-X33发酵上清检测，其中1-7号泳道分别是重组工程菌株发酵0h至60h(0h、10h、20h、30h、40h、50h、60h)的上清；

图3C为重组工程菌株pPICZαB-gE31-336-538-X33发酵上清检测，其中，1-9号泳道分别是重组工程菌株发酵0h至80h(0h、10h、20h、30h、40h、50h、60h、70h、80h)的上清。

图4显示为重组抗原蛋白gE31-336、gE337-538的纯化和共纯化检测结果。1-3号(4号泳道是无关样品)泳道分别是重组蛋白gE_31-336、gE_337-538的纯化和共纯化样品。其中，1号泳道是单独表达重组蛋白gE_31-336菌株发酵液的纯化结果，2号泳道是单独表达重组蛋白gE_31-336菌株发酵液的纯化结果，3号泳道是同时表达重组蛋白gE_31-336和重组蛋白gE_31-336的pPICZαB-gE_31-336-538-X33菌株(该菌株中含有重组蛋白gE_31-336和重组蛋白gE_31-336各自的表达盒)发酵液的纯化结果，即同时纯化得到两个蛋白。

图5为不同疫苗组别免疫小鼠后的血清抗体滴度水平。

图6为不同疫苗组别免疫小鼠后激发的细胞响应。其中，图6A对应IL-2；图6B对应IL-4；图6C对应IL-5；图6D对应IL-10；图6E对应INF-γ；图6F对应TNF-α。

具体实施方式

本发明根据酵母密码子偏爱性合成编码gE蛋白的核苷酸序列，合成所得的基因连接到毕赤酵母表达载体上，得到表达gE蛋白的表达质粒，重组毕赤酵母质粒属于分泌表达型质粒。重组质粒通过基因工程方法整合到毕赤酵母基因组中，经筛选得到表达菌株，以此重组表达菌株为种子，表达得到gE蛋白。通过柱层析等纯化方法获得高纯度的gE蛋白，纯化后的gE蛋白吸附适当的佐剂(AS01或类似物)成为重组疫苗制剂。

为了能够在真菌(如毕赤酵母)中高效表达gE蛋白，本发明根据日本疫苗株Oka如SEQ ID NO.1所示的gE蛋白序列，对gE基因进行分析，通过优化gE基因编码的密码子、转录因子结合区、重复序列和RNA高级结构等，对gE蛋白编码基因序列进行优化，获得的优化后的符合真菌(如毕赤酵母)密码子偏爱的gE蛋白编码序列，如SEQ ID NO.11所示，其编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示蛋白或其保守性变异蛋白。

本发明提供了一种疱疹病毒免疫原，其通过改造水痘-带状疱疹病毒中gE蛋白获得，具体为gE蛋白的N端和C端被截短不同长度获得的免疫原，选自以下任意一种或几种：包含截短或未截短的gE1-188、gE31-188、gE1-208、gE31-208、gE189-546、gE169-546、 gE31-168、gE31-336及gE337-538或其保守性变异蛋白；其中，所述gE_1-188、gE_31-188、 gE_1-208、gE_31-208、gE_189-546、gE_169-546、gE_31-168、gE_31-336及gE_337-538的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.9及SEQ ID NO.10所示。

优选地，所述疱疹病毒免疫原选自以下其一：

a.所述疱疹病毒免疫原包含第一gE蛋白片段与第二gE蛋白片段，所述第一gE蛋白片段包含截短或未截短的gE31-336或其保守性变异多肽，所述第二gE蛋白片段包含截短或未截短的gE337-538或其保守性变异多肽；

b.包含第一gE蛋白片段，所述第一gE蛋白片段包含截短或未截短的gE31-336或其保守性变异多肽；

c.包含第二gE蛋白片段，所述第二gE蛋白片段包含gE337-538或其保守性变异多肽；

其中，所述gE31-336的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述gE337-538的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。

进一步优选地，所述第一gE蛋白片段的氨基酸残基数为222-348个，即 gE31-gE252～gE31-gE378(N端为gE31，C端为gE252～378)；所述第二gE蛋白片段的氨基酸残基数为160-286个，即gE253-gE538～gE379-gE538(N端为gE253～379，C端为gE538)。

所述第一gE蛋白片段包含截短或未截短的gE31-336。

所述第一gE蛋白片段包含截短或未截短的gE31-336是指：第一gE蛋白片段包含截取自gE蛋白的多肽序列，该截取自gE蛋白的多肽序列可以是gE31-336，或者根据gE蛋白序列，C端相对gE336延伸或缩进若干个氨基酸残基。例如，截取自gE蛋白的多肽序列N端可以起始于gE蛋白的gE31；C端可以终止于gE蛋白的gE252、gE253、gE254、gE255、gE256、gE257、gE258、gE259、gE260、gE261、gE262、gE263、gE264、gE265、gE266、gE267、 gE268、gE269、gE270、gE271、gE272、gE273、gE274、gE275、gE276、gE277、gE278、 gE279、gE280、gE281、gE282、gE283、gE284、gE285、gE286、gE287、gE288、gE289、 gE290、gE291、gE292、gE293、gE294、gE295、gE296、gE297、gE298、gE299、gE300、 gE301、gE302、gE303、gE304、gE305、gE306、gE307、gE308、gE309、gE310、gE311、 gE312、gE313、gE314、gE315、gE316、gE317、gE318、gE319、gE320、gE321、gE322、 gE323、gE324、gE325、gE326、gE327、gE328、gE329、gE330、gE331、gE332、gE333、 gE334、gE335、gE336、gE337、gE338、gE339、gE340、gE341、gE342、gE343、gE344、 gE345、gE346、gE347、gE348、gE349、gE350、gE351、gE352、gE353、gE354、gE355、 gE356、gE357、gE358、gE359、gE360、gE361、gE362、gE363、gE364、gE365、gE366、 gE367、gE368、gE369、gE370、gE371、gE372、gE373、gE374、gE375、gE376、gE377、gE378中的任意一个。在一具体实施方式中，截取自gE蛋白的多肽序列选自以下：gE31-gE295、 gE31-gE296、gE31-gE297、gE31-gE298、gE31-gE299、gE31-gE300、gE31-gE301、gE31-gE302、 gE31-gE303、gE31-gE304、gE31-gE305、gE31-gE306、gE31-gE307、gE31-gE308、gE31-gE309、 gE31-gE310、gE31-gE311、gE31-gE312、gE31-gE313、gE31-gE314、gE31-gE315、gE31-gE316、 gE31-gE317、gE31-gE318、gE31-gE319、gE31-gE320、gE31-gE321、gE31-gE322、gE31-gE323、 gE31-gE324、gE31-gE325、gE31-gE326、gE31-gE327、gE31-gE328、gE31-gE329、gE31-gE330、 gE31-gE331、gE31-gE332、gE31-gE333、gE31-gE334、gE31-gE335、gE31-gE336。

在一具体实施方式中，对gE31-336在C端进行截短，获得的缩短后的gE31-251和gE31-294的表达明显下降，即缩短42个及以上氨基酸残基后，重组gE多肽表达显著下降。

所述第二gE蛋白片段包含截短或未截短的gE337-538。

所述第二gE蛋白片段包含截短或未截短的gE337-538是指：第二gE蛋白片段包含截取自gE蛋白的多肽序列，该截取自gE蛋白的多肽序列可以是gE337-538，或者根据gE蛋白序列，N端相对gE337延伸或缩进若干个氨基酸残基，C端可以终止于gE蛋白的gE538。例如，截取自gE蛋白的多肽序列N端可以起始于gE蛋白的gE379、gE378、gE377、gE376、gE375、gE374、gE373、gE372、gE371、gE370、gE369、gE368、gE367、gE366、gE365、gE364、 gE363、gE362、gE361、gE360、gE359、gE358、gE357、gE356、gE355、gE354、gE353、 gE352、gE351、gE350、gE349、gE348、gE347、gE346、gE345、gE344、gE343、gE342、 gE341、gE340、gE339、gE338、gE337、gE336、gE335、gE334、gE333、gE332、gE331、 gE330、gE329、gE328、gE327、gE326、gE325、gE324、gE323、gE322、gE321、gE320、gE319、gE318、gE317、gE316、gE315、gE314、gE313、gE312、gE311、gE310、gE309、 gE308、gE307、gE306、gE305、gE304、gE303、gE302、gE301、gE300、gE299、gE298、 gE297、gE296、gE295、gE294、gE293、gE292、gE291、gE290、gE289、gE288、gE287、 gE286、gE285、gE284、gE283、gE282、gE281、gE280、gE279、gE278、gE277、gE276、 gE275、gE274、gE273、gE272、gE271、gE270、gE269、gE268、gE267、gE266、gE265、 gE264、gE263、gE262、gE261、gE260、gE259、gE258、gE257、gE256、gE255、gE254、 gE253中的任意一个；C端可以终止于gE蛋白的gE538。在一些具体实施方式中，截取自gE 蛋白的多肽序列选自以下：gE379-gE538、gE378-gE538、gE377-gE538、gE376-gE538、gE375-gE538、gE374-gE538、gE373-gE538、gE372-gE538、gE371-gE538、gE370-gE538、gE369-gE538、gE368-gE538、gE367-gE538、gE366-gE538、gE365-gE538、gE364-gE538、gE363-gE538、gE362-gE538、gE361-gE538、gE360-gE538、gE359-gE538、gE358-gE538、gE357-gE538、gE356-gE538、gE355-gE538、gE354-gE538、gE353-gE538、gE352-gE538、gE351-gE538、gE350-gE538、gE349-gE538、gE348-gE538、gE347-gE538、gE346-gE538、gE345-gE538、gE344-gE538、gE343-gE538、gE342-gE538、gE341-gE538、gE340-gE538、gE339-gE538、gE338-gE538、gE337-gE538、gE336-gE538、gE335-gE538、gE334-gE538、gE333-gE538、gE332-gE538、gE331-gE538、gE330-gE538、gE329-gE538、gE328-gE538、gE327-gE538、gE326-gE538、gE325-gE538、gE324-gE538、gE323-gE538、gE322-gE538、gE321-gE538、gE320-gE538、gE319-gE538、gE318-gE538、gE317-gE538、gE316-gE538、gE315-gE538、gE314-gE538、gE313-gE538、gE312-gE538、gE311-gE538、gE310-gE538、gE309-gE538、gE308-gE538、gE307-gE538、gE306-gE538、gE305-gE538、gE304-gE538、gE303-gE538、gE302-gE538、gE301-gE538、gE300-gE538、gE299-gE538、gE298-gE538、gE297-gE538、gE296-gE538、gE295-gE538、gE294-gE538、gE293-gE538、gE292-gE538、gE291-gE538、gE290-gE538、gE289-gE538、gE288-gE538、gE287-gE538、gE286-gE538、gE285-gE538、gE284-gE538、gE283-gE538、gE282-gE538、gE281-gE538、gE280-gE538、gE279-gE538、gE278-gE538、gE277-gE538、gE276-gE538、gE275-gE538、gE274-gE538、gE273-gE538、gE272-gE538、gE271-gE538、gE270-gE538、gE269-gE538、gE268-gE538、gE267-gE538、gE266-gE538、gE265-gE538、gE264-gE538、gE263-gE538、gE262-gE538、gE261-gE538、gE260-gE538、gE259-gE538、gE258-gE538、gE257-gE538、gE256-gE538、gE255-gE538、gE254-gE538、gE253-gE538。

在一具体实施方式中，对gE337-538在C端进行截短，获得的缩短后的gE337-510的表达几乎不受影响，即缩短28个氨基酸残基后，重组gE多肽表达未明显变化。

更进一步优选地，所述疱疹病毒免疫原包含SEQ ID NO.9所示的gE31-336和/或如SEQ ID NO.10所示的gE337-538，或所述疱疹病毒免疫原包含SEQ ID NO.9所示的gE31-336，或所述疱疹病毒免疫原包含如SEQ ID NO.10所示的gE337-538。

本发明中，所述保守性变异蛋白是在疱疹病毒免疫原的基础上，经过取代、缺失或者添加一个或多个氨基酸得到的且功能未改变的蛋白/肽。

本领域技术人员已知，本发明所述的肽可以在氨基酸序列之间的一个或多个位置进行翻译后修饰。

本发明还提供上述蛋白/抗原肽的类似物。这些类似物与天然的蛋白/肽差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白/肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白/抗原肽并不限于上述例举的代表性的肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的蛋白/肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白/肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白/肽。这种修饰可以通过将蛋白/肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白/肽。

本发明还提供了一种符合真菌密码子偏爱的编码疱疹病毒免疫原的分离的多核苷酸序列，所述多核苷酸编码如上所述的抗原肽，如在真菌中表达上述疱疹病毒免疫原。

所述核酸分子可以主要由编码本发明所述疱疹病毒免疫原的核酸序列组成，或可以仅编码本发明所述的gE蛋白。此类核酸分子可以用本领域已知的方法合成。由于遗传密码的简并性，本领域技术人员应理解，不同核酸序列的核酸分子可以编码相同的氨基酸序列。

在一具体实施方式中，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示。在一具体实施方式中，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示。在一具体实施方式中，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示。在一具体实施方式中，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示。在一具体实施方式中，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示。在一具体实施方式中，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示。在一具体实施方式中，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示。在一具体实施方式中，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示。在一具体实施方式中，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示。在一优选实施方式中，所述多核苷酸序列如SEQID NO.30和/或31所示。

进一步地，与SEQ ID No.11、23～31任一序列具有90％以上(如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上)序列同一性且具有所述多核苷酸的功能的多核苷酸也在本发明的保护范围内容，具体地，其他具有同一性的多核苷酸包括如SEQ IDNo.11、23～31任一序列所示的核苷酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是 1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)核苷酸而得到的，或者在N-末端和/或C-末端添加一个或多个(具体可以是1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、 1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)核苷酸而得到的，且具有如SEQ ID No.11、23～31任一序列所示的多核苷酸的功能的多核苷酸。

进一步地，与SEQ ID No.2～10任一序列具有90％以上(如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上)序列同一性且具有所述氨基酸的功能的氨基酸也在本发明的保护范围内容，具体地，其他具有同一性的氨基酸包括如SEQ ID No.2～10任一序列所示的氨基酸序列分别经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)氨基酸而得到的，或者在N-末端和/或C-末端添加一个或多个(具体可以是1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、 1-3个、1个、2个、或3个)氨基酸而得到的，且具有如SEQ ID No.2～10任一序列所示的氨基酸的功能的氨基酸。

本发明还提供了一种疱疹病毒免疫原重组表达载体(重组质粒)，所述重组表达载体通过质粒改造获得，所述重组表达载体中含有如上所述的多核苷酸或其组合，或所述重组表达载体分别含有如上所述的多核苷酸。

进一步地，所述重组表达载体由如上所述的符合真菌密码子偏爱的gE蛋白编码序列和载体连接所得。

进一步地，所述细菌包括但不限于大肠杆菌、卵形拟杆菌、空肠弯曲菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、多形拟杆菌、普通拟杆菌、单形拟杆菌、干酪乳杆菌、脆弱拟杆菌、鲁氏不动杆菌、具核梭杆菌、乔氏拟杆菌、拟南芥拟杆菌、鼠李糖乳杆菌、马赛拟杆菌、粪副拟杆菌、梭杆菌、finegoldii拟杆菌和短双歧杆菌中的一种或几种；所述真菌包括但不限于：真菌选自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、多形汉逊酵母(Ogataea angusta)、毕赤酵母(巴斯德毕赤酵母(Komagataella pastoris)、脆壁克鲁维氏酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)，以及栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、白假丝酵母、杜氏假丝酵母、光滑假丝酵母、季也蒙假丝酵母、乳酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、葡萄牙假丝酵母、梅林假丝酵母、嗜油假丝酵母、近平滑假丝酵母、热带假丝酵母和产朊假丝酵母、烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、棒曲霉、灰绿曲霉群、构巢曲霉、米曲霉、土曲霉、焦曲霉和杂色曲霉中的一种或几种。

优选地，所述细菌为大肠杆菌，所述真菌为酵母。

所述大肠杆菌选自BL21、BW25113、JM109、MG1655、DH5a、TOP10、HB101、 BLR、C43(DE3)、C41(DE3)或TB1中的一种或几种，所述BL21选自BL21(DE2)、 BL21(DE3)、BL21 star(DE3)或BL21(DE3)PlysS；优选地，所述大肠杆菌为BL21(DE3)。

优选地，所述酵母为巴斯德毕赤酵母GS115、X33、SMD1168、SMD1168H、KM71；进一步优选地，所述酵母为巴斯德毕赤酵母X33。

进一步地，合适的载体可以是载体构建领域已知的，包括启动子的选择和其他调控元件，比如增强子元件。作为优选地，本发明所述载体例如可以选自pPICZA，pPICZB，pPICZC，pPICZαA，pPICZαB，pPICZαC，pPIC9K，pGAPZA，pGAPZB，pGAPZC， pGAPZαA，pGAPZαB，pGAPZαC，pPIC6αA，pPIC6αB，pPIC6αC，pYes2/CTα-factor等酵母工程质粒；进一步优选地，所述载体为pPICZαB。本发明所述的载体包括适合引入细胞的序列。比如，所述载体可以是表达载体，在该载体中，所述蛋白的编码序列受到它自身顺式作用调控元件的控制，载体的设计便于宿主细胞的基因整合或基因替换等。

进一步地，所述表达载体通过质粒改造获得。

在一具体实施方式中，本发明提供的疱疹病毒免疫原的重组表达载体由符合毕赤酵母密码子偏爱的gE蛋白编码序列和载体pPICZαB连接所得，所述的gE蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2～10中的一种或几种所示。在一具体实施方式中，所述gE蛋白的编码序列如SEQ ID NO.23所示。在一具体实施方式中，所述gE蛋白的编码序列如SEQ ID NO.24所示。在一具体实施方式中，所述gE蛋白的编码序列如SEQ ID NO.25所示。在一具体实施方式中，所述 gE蛋白的编码序列如SEQ ID NO.26所示。在一具体实施方式中，所述gE蛋白的编码序列如 SEQ ID NO.27所示。在一具体实施方式中，所述gE蛋白的编码序列如SEQ ID NO.28所示。在一具体实施方式中，所述gE蛋白的编码序列如SEQ ID NO.29所示。在一具体实施方式中，所述gE蛋白的编码序列如SEQ ID NO.30所示。在一具体实施方式中，所述gE蛋白的编码序列如SEQ ID NO.31所示。在一优选实施方式中，所述gE蛋白的编码序列如SEQ ID NO.30和/或31所示。

进一步地，所述重组表达载体还含有启动子和终止子。

进一步地，所述启动子选自AOX1，GAP，DAS，MOX，FMD，FLAD1，PEX8， YPT1，TPS1，ADH1，ADH2，PGK1，ENO，YPK1，GAL-10，CUP1，PHO5等酵母启动子，所述终止子选自AOX1(TT)，GAP(TT)，DAS(TT)，MOX(TT)，FMD(TT)， FLAD1(TT)，PEX8(TT)，YPT1(TT)，TPS1(TT)，ADH1(TT)，ADH2(TT)，PGK1(TT)，ENO(TT)，YPK1(TT)，GAL-10(TT)，CUP1(TT)，PHO5(TT) 等酵母终止子。

在一具体实施方式中，进一步地，所述表达载体为在质粒pPICZαB的XhoI与NotI位点之间插入上述核苷酸。

进一步地，所述重组表达载体中还含有选择标志物基因。

优选地，本发明所述的选择标志物基因优选不包含在目的蛋白的表达片段的核酸表达盒中。因此，在一具体实施方式中，本发明所述重组表达载体还包含一个或多个包含选择标志物基因的核酸表达盒。选择标志物基因的表达可以指示宿主细胞的核酸表达盒已经转化，因此，允许选择经转化的宿主细胞。选择标志物基因盒通常还包括启动子和转录终止子序列，其可操作地连接到所述重组表达载体中。

合适的选择标志物基因可以选自赋予抗生素抗性、视觉标志物或互补宿主细胞营养缺陷的标志物。例如，选择标志物基因可以赋予对抗生素如潮霉素B(如hph基因)、zeocin/腐草霉素(如ble基因)、卡那霉素或G418(如nptII或aphVIII基因)、壮观霉素(如aadA 基因)、新霉素(如aphVIII基因)、杀稻瘟素(如bsd基因)、诺尔丝菌素(如natR基因)、嘌呤霉素(如pac基因)和巴龙霉素(如aphVIII基因)或者其他目前常用的抗生素的抗性。也可以使用视觉标志物并包括例如β-葡糖醛酸酶(GUS)、萤光素酶和荧光蛋白，如绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白的任意一种或几种等。也可以使用互补宿主细胞营养缺陷的标志物，营养缺陷的两个突出实例是氨基酸亮氨酸缺陷(例如 LEU2基因)或尿嘧啶缺陷(例如URA3基因)。乳清苷-5'-磷酸脱羧酶阴性(ura3-)的细胞不能在缺乏尿嘧啶的培养基上生长。因此，功能性URA3基因可以在具有尿嘧啶缺陷的宿主细胞上用作选择标志物，并且可以在缺乏尿嘧啶的培养基上选择成功的转化体。仅用功能性 URA3基因转化的细胞能够合成尿嘧啶并在此类培养基上生长。如果野生型菌株不具有尿嘧啶缺陷，则必须制备具有缺陷的营养缺陷型突变体，以便使用URA3作为菌株的选择标志物。实现这点的方法是本领域公知的。

在一优选实施方式中，所述重组表达载体为pPICZαB-gE_1-188，pPICZαB-gE_31-188，pPICZαB-gE_1-208，pPICZαB-gE_31-208，pPICZαB-gE_31-168，pPICZαB-gE_31-336， pPICZαB-gE_189-546，pPICZαB-gE_169-546，pPICZαB-gE_337-538，pPICZαB-gE_31-188-546， pPICZαB-gE_31-168-546，pPICZαB-gE_31-336-538中的一种或几种。在一更优选实施方式中，所述重组表达载体为pPICZαB-gE_31-336，pPICZαB-gE_337-538，pPICZαB-gE_31-336-538中的一种或几种。

本发明还提供了一种重组工程菌，该重组工程菌是由上述的gE蛋白重组表达载体转化菌株细胞所得。所述重组工程菌含有或者整合有如上所述的重组表达载体。

本发明中，所述重组工程菌为细菌或真菌。其中所述细菌包括但不限于大肠杆菌、卵形拟杆菌、空肠弯曲菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、多形拟杆菌、普通拟杆菌、单形拟杆菌、干酪乳杆菌、脆弱拟杆菌、鲁氏不动杆菌、具核梭杆菌、乔氏拟杆菌、拟南芥拟杆菌、鼠李糖乳杆菌、马赛拟杆菌、粪副拟杆菌、梭杆菌、finegoldii拟杆菌和短双歧杆菌中的一种或几种。其中，所述真菌包括但不限于：白假丝酵母、杜氏假丝酵母、光滑假丝酵母、季也蒙假丝酵母、乳酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、葡萄牙假丝酵母、梅林假丝酵母、嗜油假丝酵母、近平滑假丝酵母、热带假丝酵母和产朊假丝酵母、烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、棒曲霉、灰绿曲霉群、构巢曲霉、米曲霉、土曲霉、焦曲霉和杂色曲霉中的一种或几种。

优选地，所述细菌为大肠杆菌，所述真菌为酵母。进一步优选地，所述重组工程菌为重组酵母，所述酵母选自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、多形汉逊酵母(Ogataeaangusta)、毕赤酵母(巴斯德毕赤酵母(Komagataella pastoris))、脆壁克鲁维氏酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)，以及栗酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)中的一种或几种；更进一步优选地，所述酵母为巴斯德毕赤酵母X33。

在一具体实施方式中，本发明提供的重组工程菌为重组毕赤酵母，该重组毕赤酵母是由上述的gE蛋白重组表达载体转化毕赤酵母X33所得。本文用于转化重组工程菌的方法是技术人员所公知的。例如，可以使用如本领域已知的电穿孔和/或化学(例如基于氯化钙或乙酸锂的)转化方法或根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的转化方法。

本发明的另一方面提供了一种用于表达疱疹病毒免疫原的表达系统，所述表达系统包括所述重组工程菌，所述重组工程菌中含有或者整合有上述重组表达载体。

进一步地，所述生物工程菌选自细菌或真菌。

其中，所述细菌包括但不限于大肠杆菌、卵形拟杆菌、空肠弯曲菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、多形拟杆菌、普通拟杆菌、单形拟杆菌、干酪乳杆菌、脆弱拟杆菌、鲁氏不动杆菌、具核梭杆菌、乔氏拟杆菌、拟南芥拟杆菌、鼠李糖乳杆菌、马赛拟杆菌、粪副拟杆菌、梭杆菌、finegoldii拟杆菌和短双歧杆菌中的一种或几种。所述真菌包括但不限于：白假丝酵母、杜氏假丝酵母、光滑假丝酵母、季也蒙假丝酵母、乳酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、葡萄牙假丝酵母、梅林假丝酵母、嗜油假丝酵母、近平滑假丝酵母、热带假丝酵母和产朊假丝酵母、烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、棒曲霉、灰绿曲霉群、构巢曲霉、米曲霉、土曲霉、焦曲霉和杂色曲霉中的一种或几种。

优选地，所述细菌为大肠杆菌，所述真菌为酵母。进一步优选地，所述重组工程菌为重组酵母。更进一步地，所述酵母选自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、多形汉逊酵母 (Ogataea angusta)、巴斯德毕赤酵母(Komagataella pastoris)、脆壁克鲁维氏酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)，以及栗酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)中的任一种。

本发明所述的疱疹病毒免疫原可以通过任何公知的方法获得，例如，采用如下方法其一进行：

a)采用化学合成的方法合成；

b)将如上所述的重组表达载体转化至重组工程菌中，利用重组工程菌表达gE蛋白；

c)利用如上所述的重组工程菌表达疱疹病毒免疫原获得。

作为优选地，本发明提供的疱疹病毒免疫原的制备方法，使用如SEQ ID NO.11、23-31 中任意的一种或几种序列所示的多核苷酸序列编码gE蛋白，即构建整合有或者含有如SEQ ID NO：11、23-31中任意的一种或几种序列所示的多核苷酸的重组工程菌，培养，收集菌体，破碎菌体获得裂解液，分离纯化裂解液，即可获得疱疹病毒免疫原。

作为优选地，本发明提供的疱疹病毒免疫原的制备方法，使用编码如SEQ ID NO.2～10 中任意的一种或几种序列所示的gE蛋白的核苷酸序列，即构建整合有或者含有编码如SEQ ID NO.2～10中任意的一种或几种序列所示的疱疹病毒免疫原的核苷酸序列的重组工程菌，培养，收集菌体，破碎菌体获得裂解液，分离纯化裂解液，即可获得gE蛋白。具体地，所述方法包括以下步骤：

1)构建上述疱疹病毒免疫原重组表达载体；

2)将上述重组表达载体转化至真菌中构建重组工程菌；

3)验证重组工程菌，获得正确构建的目的重组工程菌；

4)在特定条件下培养目的重组工程菌，收集培养菌体并进行疱疹病毒免疫原的纯化。

步骤1)中，设计引物分别扩增目的gE蛋白区域(1-188aa、31-188aa、1-208aa、31-208aa、189-546aa、169-546aa、31-168aa、31-336aa及337-538aa)的编码序列，并引入 XhoI和NotI酶切位点。利用XhoI和NotI酶切所扩增的产物与pPICZαB质粒(购自ThermoFishier)，酶切后的片段由T4 DNA连接酶连接，得到含有编码gE蛋白的多核苷酸序列的重组质粒。

其中，所述引物序列为SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ IDNO.15、 SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQID NO.21、SEQ ID NO.22。其中，SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.13和SEQ IDNO. 14、SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.20、SEQ IDNO.21和SEQ ID NO.22分别扩增目的gE蛋白区域(1-188aa、31-188aa、1-208aa、 31-208aa、189-546aa、169-546aa、31-168aa、31-336aa及337-538aa)的编码序列。

进一步地，合适的载体可以是载体构建领域已知的，包括启动子的选择和其他调控元件，比如增强子元件。作为优选地，本发明所述载体例如可以选自pPICZA，pPICZB，pPICZC，pPICZαA，pPICZαB，pPICZαC，pPIC9K，pGAPZA，pGAPZB，pGAPZC， pGAPZαA，pGAPZαB，pGAPZαC，pPIC6αA，pPIC6αB，pPIC6αC，pYes2/CTα-factor等酵母工程质粒；进一步优选地，所述载体为pPICZαB。

步骤1)中，所述表达载体内含有如SEQ ID NO.11、23～31任意的一种或几种所示的核苷酸序列。优选地，所述所述表达载体内含有如SEQ ID NO.30和/或31所示的核苷酸序列。

步骤1)中，所述重组表达载体中还含有报告蛋白基因编码序列。

步骤2)中，所述真菌包括但不限于：真菌选自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、多形汉逊酵母(Ogataea angusta)、毕赤酵母(巴斯德毕赤酵母(Komagataella pastoris))、脆壁克鲁维氏酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)，以及栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、白假丝酵母、杜氏假丝酵母、光滑假丝酵母、季也蒙假丝酵母、乳酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、葡萄牙假丝酵母、梅林假丝酵母、嗜油假丝酵母、近平滑假丝酵母、热带假丝酵母和产朊假丝酵母、烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、棒曲霉、灰绿曲霉群、构巢曲霉、米曲霉、土曲霉、焦曲霉和杂色曲霉中的一种或几种。

优选地，所述真菌为酵母；进一步优选地，所述酵母为巴斯德毕赤酵母X33。

步骤2)中，当真菌为巴斯德毕赤酵母X33时，将步骤1)中所述重组表达载体转化至毕赤酵母细胞中，得到的是重组毕赤酵母菌株。

步骤3)中，可通过本领域公知的常规方法验证获得的重组工程菌；例如通过培养、筛选等方法验证步骤2)中获得的重组毕赤酵母菌株，得到正确构建且高度表达的菌株。

步骤4)中，发酵培养步骤3)中所述高度表达的菌株，纯化后得到重组可溶性表达gE 蛋白。

步骤4)中，所述特定条件包括种子液培养和发酵培养。

其中，所述种子液培养是指，将重组工程菌株(如pPICZαB-gE_31-336-X33、 pPICZαB-gE_337-538-X33和pPICZαB-gE_31-336-538-X33)按1:1000比例(v/v)接种于YPG培养基中，摇瓶培养16-24小时，获得种子液。

其中，发酵培养基的组成为：硫酸铵0.5％，硫酸镁0.574％，二水硫酸钙0.0587％，磷酸二氢钾1.9％，甘油5％，ptm1 4mL/L，消泡剂1～2mL/L。除ptm1、消泡剂外，其他成分的用量为质量百分比。

其中，发酵培养的条件为：前期生长期培养温度28～32℃，pH 4.6～5.4，转速≤950rpm，罐压≤0.12mpa，溶氧≥10％，诱导阶段温度23～27℃，pH6.3～6.7，其他参数同生长期，甲醇诱导。其中，先向甲醇中加入ptm1配制成甲醇溶液，甲醇溶液中ptm1的浓度为12mL/L，诱导开始时向培养基中加入2‰(质量百分比)的该甲醇溶液(该甲醇溶液中加入了ptm1，浓度为12mL/L)，待甲醇用完溶氧反弹到80％后流加甲醇，甲醇总诱导40～80小时。

其中，甲醇总诱导的时间是40～80小时，可以是40～50、40～60、40～70、40～80、50～60、50～70、50～80、60～70、60～80、70～80小时，具体可以是40、45、50、55、60、 65、70、75、80小时。

其中，所述分离纯化的方法包括柱层析等，具体包括：1)发酵上清中加入HAc调pH至 3.8；2)POROS 50HS层析柱(26mm，50ml，20ml/min)预平衡至(20mM NaAc-HAc，pH3.8)；3)上样后用(20mM NaAc-HAc，pH3.8)淋洗2CV；4)(0.3M NaCl，20mM NaAc-HAc，pH3.8) 洗杂2CV：5)(1M NaCl，20mM NaAc-HAc，pH3.8)洗脱收集。或上述分离纯化的方法具体包括：1)发酵上清中加入NaCl至终浓度1M，并加入Tris调pH8.5；2)SF phenyl层析柱 (26mm，50ml，20ml/min)预平衡至(1M NaCl，20mM Tris，pH8.5)；3)上样后用(1M NaCl，20mM Tris，pH8.5)淋洗2CV；4)(20mM Tris，pH8.5)洗脱收集。或上述分离纯化的方法具体包括：1)发酵上清中加入HAc调pH至3.8；2)POROS 50HS层析柱(26mm，50ml， 20ml/min)预平衡至(20mMNaAc-HAc，pH3.8)；3)上样后用(20mM NaAc-HAc，pH3.8) 淋洗2CV；4)(0.3-0.4M NaCl，20mMNaAc-HAc，pH3.8)洗杂2CV；5)(0.7M NaCl， 20mM NaAc-HAc，pH3.8)洗脱收集。

本发明还提供了一种疱疹病毒免疫原，采用前述的产生疱疹病毒免疫原的方法获得；在一具体实施方式中，所述疱疹病毒免疫原选自以下任意一种或几种：gE1-188、gE31-188、 gE1-208、gE31-208、gE189-546、gE169-546、gE31-168、gE31-336及gE337-538或其保守性变异蛋白。所述重组gE蛋白/抗原肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9及SEQ IDNO.10所示。对应的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25、 SEQID NO.26、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30及SEQ ID NO.31。

更优选地，所述疱疹病毒免疫原的氨基酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

本发明还提供了所述重组gE蛋白、编码疱疹病毒免疫原的多核苷酸序列、所述重组表达载体、重组工程菌、表达系统、重组gE蛋白的制备方法在制备用于预防和/或治疗由疱疹病毒感染引起的疾病的药物中的应用。所述疾病包括水痘和带状疱疹、疱疹后神经痛、水痘肺炎，以及由水痘-带状疱疹病毒引起的急性小脑共济失调和脑炎等。所述疱疹病毒为水痘-带状疱疹病毒VZV、1型单纯疱疹病毒HSV-1、2型单纯疱疹病毒HSV-2中的一种或几种；优选为水痘-带状疱疹病毒VZV。

本发明还提供了疱疹病毒免疫原、编码疱疹病毒免疫原的多核苷酸序列、所述重组表达载体、重组工程菌、表达系统、重组gE蛋白的制备方法在制备针对疱疹病毒的抗体中的应用。所述疱疹病毒为水痘-带状疱疹病毒VZV、1型单纯疱疹病毒HSV-1、2型单纯疱疹病毒 HSV-2中的一种或几种；优选为水痘-带状疱疹病毒VZV。

本发明还提供了一种所述疱疹病毒免疫原、编码疱疹病毒免疫原的多核苷酸序列、重组表达载体、重组工程菌、表达系统、重组gE蛋白的制备方法在制备疱疹病毒疫苗和/或诊断试剂中的应用。该疱疹病毒免疫原可以作为重组疱疹病毒疫苗的主要抗原成分，也可以作为联合疫苗、单(多)价疫苗的主要抗原成分，还可以作为疱疹病毒相关研究中抗原、抗体定性、定量检测使用。所述疱疹病毒为水痘-带状疱疹病毒VZV、1型单纯疱疹病毒HSV-1、2 型单纯疱疹病毒HSV-2中的一种或几种；优选为水痘-带状疱疹病毒VZV。

本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物中含有如上所述编码疱疹病毒免疫原的多核苷酸序列、疱疹病毒免疫原、重组表达载体或者重组表达系统，以及任选的一种或多种药学上可接受的载体、介质。所述可接受的载体、介质例如无菌水或生理盐水、稳定剂、赋形剂、抗氧化剂(抗坏血酸等)、缓冲剂(磷酸、枸橼酸、其它的有机酸等)、防腐剂、表面活性剂(PEG、Tween等)、螯合剂(EDTA等)、粘合剂等。而且，也可含有其它低分子量的多肽；血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白等蛋白质；甘氨酸、谷酰胺、天冬酰胺、精氨酸和赖氨酸等氨基酸；多糖和单糖等糖类或碳水化物；甘露糖醇或山梨糖醇等糖醇。当制备用于注射的水溶液时，例如生理盐水、含有葡萄糖或其它的辅助药物的等渗溶液，如 D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇、氯化钠，可并用适当的增溶剂例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇，PEG等)、非离子表面活性剂(吐温80，HCO-50)等。

本发明还提供了一种疱疹病毒疫苗的制备方法，包括以下步骤：利用前述的产生疱疹病毒免疫原的方法，制备疱疹病毒免疫原，加入药学上可用的疫苗佐剂。

本发明还提供了一种疫苗制剂，采用前述的疱疹病毒疫苗的制备方法获得。所述疫苗制剂中含有如上所述疱疹病毒免疫原(抗原肽)和佐剂。

较佳地，所述佐剂可以含有氢氧化铝、磷酸铝、明矾、CpG DNA、poly I:C、脂质体、真菌脂多糖、真菌鞭毛蛋白、真菌类毒素、皂树皂苷、角鲨烯、生育酚等成分，或是这些佐剂成分的提取物、类似物、衍生物及其组合。

更佳地，所述佐剂含有脂质体、MPL、QS-21的组合物。

在一优选实施方式中，所述佐剂组合物包括脂质体和皂苷，所述皂苷和脂质体的体积比为3-6：40-60；优选地，为1：9。

其中，所述脂质体是指由DOPC、胆固醇组成的脂质单层囊泡，所述脂质体中DOPC浓度为2mg/mL、胆固醇浓度为500mg/mL。

其中，所述皂苷是指QS21，浓度为100μg/mL。

进一步地，与上述佐剂组合物混合获得疫苗制品，所述疫苗制品包括疱疹病毒免疫原、脂质体和皂苷物；所述疱疹病毒免疫原、脂质体和皂苷的用量关系为10-20μg的gE蛋白、 30-60μL皂苷和400-600μL脂质体。

在一具体实施方式中，所述疫苗制品包括疱疹病毒免疫原(10μg)，50μL皂苷和450μL 脂质体。

在一具体实施方式中，所述疫苗制品包括共纯化gE_31-336、gE_337-538(20μg)，50μL皂苷和450μL脂质体。

在一具体实施方式中，所述疫苗制品包括gE_31-336(10μg)，50μL皂苷和450μL脂质体。

在一具体实施方式中，所述疫苗制品包括gE_337-538(10μg)，50μL皂苷和450μL脂质体。

在一具体实施方式中，所述疫苗制品包括gE_31-336+gE_337-538(各10μg)，50μL皂苷和450μL脂质体。

本发明还提供了一种疫苗佐剂组合物，所述疫苗佐剂组合物包括脂质体和皂苷，所述皂苷和脂质体的体积比为3-6：40-60；优选地，为1:9。

本发明还提供了所述疫苗佐剂组合物在制备疱疹病毒疫苗中的应用。所述疫苗佐剂组合物应用于疫苗中，具有明显优异的免疫强化效果。所述疱疹病毒为水痘-带状疱疹病毒 VZV、1型单纯疱疹病毒HSV-1、2型单纯疱疹病毒HSV-2中的一种或几种；优选为水痘-带状疱疹病毒VZV。

本发明中，所述组合物或疫苗可以通过药学领域已知的任何方法制备，例如在无菌条件下，通过将活性成分与载体或赋形剂混合。所述药物组合物或疫苗适用于任何适当的给药途径，如注射(包括皮下，肌肉，腹腔或静脉注射)、吸入或口服、或经鼻、或经肛门等途径。所述药物组合物或疫苗的剂型选自：注射剂、注射用无菌粉末、片剂、丸剂、胶囊、锭剂、醑剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、酊剂、气雾剂、粉雾剂、或栓剂。本领域技术人员可根据给药方式，选择合适的制剂形式，例如，适合于口服给药的制剂形式可以是包括但不限于丸剂、片剂、咀嚼剂、胶囊剂、颗粒剂、溶液剂、滴剂、糖浆、气雾剂或粉雾剂等，再例如，适合于胃肠外给药的制剂形式可以是包括但不限于溶液、悬浮液、可复水的干制剂或喷雾剂等，再例如，适合于直肠给药的通常可以是栓剂，再例如，适合注射给药的可以是注射剂、注射用无菌粉末等。

本发明中，所述药物组合物或疫苗还可以与其他药物或疫苗联用。所述其他药物或疫苗可以是水痘-带状疱疹病毒相关药物或疫苗，也可以是其他病原体相关药物或疫苗。

本发明还提供了一种预防和/或治疗由疱疹病毒感染引起的疾病的方法，所述方法包括施用本发明所述的疱疹病毒免疫原、编码疱疹病毒免疫原的多核苷酸序列、所述重组表达载体、重组工程菌、表达系统、药物组合物、疫苗中的一种或几种。

根据用于治疗的疾病或病症、患者的个体年龄和状况等，本发明药物组合物或疫苗等制剂的给药剂量可以在较宽的范围内变化。恰当的给药剂量将由医师最终决定。

上文中，所述疱疹病毒为水痘-带状疱疹病毒VZV、1型单纯疱疹病毒HSV-1、2型单纯疱疹病毒HSV-2中的一种或几种；优选为水痘-带状疱疹病毒VZV。所述由疱疹病毒感染引起的疾病包括水痘和带状疱疹、疱疹后神经痛、水痘肺炎，以及由水痘-带状疱疹病毒引起的急性小脑共济失调和脑炎等。

应当理解，本发明所述gE蛋白质可以或可以不被翻译后修饰，例如糖基化。因此，当提及gE蛋白时，本发明也包括翻译后修饰的蛋白质，例如糖蛋白。

术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用，并且通常是指基本上由核苷酸，例如脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸组成的任何长度的聚合物。核酸可包含嘌呤和/或嘧啶碱基，和/或其他天然的、化学或生物化学修饰的(例如甲基化的)、非天然的或衍生化的核苷酸碱基。核酸的主链可以包含糖和磷酸基团，如通常可以在RNA或DNA中发现的，和/或一种或多种修饰的或取代的(例如，2'-O-烷基化，例如，2'-O-甲基化或2'-O-乙基化；或2'-O,4'-C-炔基化，例如2'-O,4'-C-乙基化)糖或一个或多个修饰或取代的磷酸基团。

术语“核酸表达盒”指包含一种或多种转录控制元件(例如但不限于启动子、增强子、多腺苷酸化序列和内含子)的核酸分子，所述转录控制元件指导与它们可操作地连接的(转) 基因表达。

术语“可操作地连接”是指各种核酸分子元件相对于每一种的排列，使得元件功能性连接并且能够在基因表达的背景下彼此相互作用。此类元件可以包括但不限于启动子、增强子、多腺苷酸化序列、一个或多个内含子、以及待表达的感兴趣基因的编码序列(例如目的基因)。当适当取向或可操作地连接时，核酸序列元件一起起作用以确保或调节编码序列的表达。调节是指增加、降低或维持特定元件的活性水平。每个元件相对于其他元件的位置可以以每个元件的5'末端和3'末端而言表示，并且任何特定元件之间的距离可以通过元件之间的居间核苷酸或碱基对的数目来表示。

术语“目的基因”或“编码目的蛋白的基因”是指要在导入有核酸序列的宿主细胞中表达的编码多肽或多肽的一部分的特定核酸序列。如何将核酸序列导入宿主细胞中不是必需的，例如它可以通过整合到基因组中或作为附加型质粒。

术语“启动子”是指能够结合RNA聚合酶并且启动与其可操作连接的一个或多个核酸编码序列(例如目的基因)的转录的核酸序列。启动子通常位于同一链上的基因的转录起始位点附近和核苷酸编码序列的上游(有义链中的5')。启动子可以单独发挥功能以调节转录或可以通过一个或多个调节序列(例如增强子或沉默子)进一步调节。

术语“选择标志物基因”包括赋予表达它的宿主细胞表型以促进鉴定和/或选择用转基因转染或转化的宿主细胞的任何基因。

术语“载体”是指可以接受多核苷酸插入或克隆的多核苷酸分子，优选源自例如质粒、噬菌体或植物病毒的DNA分子。载体优选含有一个或多个独特的限制性内切酶位点，并且可以能够在确定的宿主细胞中自主复制，或者可以整合在确定的宿主的基因组内，使得克隆的序列是可复制的。载体的选择通常取决于载体与要导入载体的宿主细胞的相容性。

术语“重组工程菌”是指用于转化的那些细胞，即用于表达目的基因的细胞。重组工程菌可以是分离的细胞或培养物中培养的细胞系，或者是存在于活组织或生物体中的细胞。在本发明的上下文中，宿主细胞优选是能够在培养物中生长的细胞。

术语“转化”是指将外源核酸导入生物体中，使得核酸可作为染色体外元件或通过染色体整合而复制。

同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

实施例1重组gE蛋白工程菌株构建

1.gE蛋白编码基因的选择与密码子的优化设计

编码gE蛋白的氨基酸序列参照日本疫苗株Oka的gE蛋白序列，如SEQ ID NO.1所示。

对SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的对应核苷酸编码序列进行改造，密码子尽可能采用酵母表达系统中使用频率较高的密码子，同时避免了可能影响表达的转录因子结合区、重复序列和RNA高级结构。密码子优化后得到的gE蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO.11所示。

2.gE蛋白重组表达载体的构建

设计gE蛋白编码基因并进行全基因合成，获得SEQ ID NO.11所示序列的核苷酸片段。

设计引物分别扩增目的gE蛋白区域(1-188aa、31-188aa、1-208aa、31-208aa、189-546aa、 169-546aa、31-168aa、31-336aa及337-538aa)的编码序列，并引入XhoI和NotI酶切位点。利用XhoI和NotI酶切所扩增的产物与pPICZαB质粒(购自Thermo Fishier)，酶切后的片段由T4 DNA连接酶连接，获得的重组质粒转化大肠杆菌DH5α菌株，37℃过夜倒置培养。次日挑取部分克隆进行PCR鉴定及测序，构建成功的重组质粒命名为pPICZαB-gE_1-188、 pPICZαB-gE_31-188、pPICZαB-gE_1-208、pPICZαB-gE_31-208、pPICZαB-gE_189-546、pPICZαB-gE_169-546、 pPICZαB-gE_31-168、pPICZαB-gE_31-336及pPICZαB-gE_337-538，结构示意图分别见图1A～1I所示。

所述引物序列为SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQID NO.22。

3.多gE蛋白表达盒重组表达载体的构建

设计gE表达序列并进行全基因合成，获得SEQ ID NO.11所示序列的核苷酸片段。

设计引物分别扩增目的gE蛋白区域(31-188aa、189-546aa、31-168aa、169-546aa、31-336aa 及337-538aa)的编码序列，并引入XhoI和NotI酶切位点。利用XhoI和NotI酶切所扩增的产物与pPICZαB质粒(购自Thermo Fishier)，酶切后的片段由T4 DNA连接酶连接，获得的重组质粒转化大肠杆菌DH5α菌株，37℃过夜倒置培养。次日挑取部分克隆进行PCR鉴定及测序，构建成功的重组质粒命名为pPICZαB-gE_31-188、、pPICZαB-gE_189-546、pPICZαB-gE_31-168、 pPICZαB-gE_169-546、pPICZαB-gE_31-336及pPICZαB-gE_337-538。

设计引物分别扩增pPICZαB-gE_189-546、pPICZαB-gE_169-546和pPICZαB-gE_337-538质粒上P_AOX启动子序列、gE蛋白区域(189-546aa、169-546aa和337-538aa)的编码序列及转录终止子的序列，并引入点突变以及BglII和BamHI酶切位点，使P_AOX启动子序列中的SacI位点突变。利用BglII和BamHI酶切所扩增的产物，利用BamHI酶切pPICZαB-gE_31-188、pPICZαB-gE_31-168及pPICZαB-gE_31-336质粒并对线性化的质粒进行去磷酸化处理，酶切后的片段由T4DNA连接酶连接，获得的重组质粒转化大肠杆菌DH5α菌株，37℃过夜倒置培养。次日挑取部分克隆进行PCR鉴定及测序，构建成功的重组质粒命名为pPICZαB-gE_31-188-546、pPICZαB-gE_31-168-546和pPICZαB-gE_31-336-538，结构示意图分别见图1J～1L所示。

4.gE蛋白重组表达菌株构建

毕赤酵母X33菌株购自Thermo Fishier。

将重组构建的pPICZαB-gE_1-188、pPICZαB-gE_31-188、pPICZαB-gE_1-208、pPICZαB-gE_31-208、 pPICZαB-gE_189-546、pPICZαB-gE_169-546、pPICZαB-gE_31-168、pPICZαB-gE_31-336、pPICZαB-gE_337-538、 pPICZαB-gE_31-188-546、pPICZαB-gE_31-168-546和pPICZαB-gE_31-336-538质粒分别由SacI酶线性化，电转毕赤酵母，电转条件为1500V，120Ω，50μF。电转后菌液涂布YPDS平板(200μg/ml Zeocin)，30℃倒置培养2-3天。挑取部分克隆进行表达验证，分别使用SDS-PAGE和WB验证培养基上清中重组蛋白的表达情况。构建得到的工程菌株分别命名为pPICZαB-gE_1-188-X33、 pPICZαB-gE_31-188-X33、pPICZαB-gE_1-208-X33、pPICZαB-gE_31-208-X33、pPICZαB-gE_31-168-X33、 pPICZαB-gE_31-336-X33、pPICZαB-gE_189-546-X33、pPICZαB-gE_169-546-X33、pPICZαB-gE_337-538-X33、 pPICZαB-gE_31-188-546-X33、pPICZαB-gE_31-168-546-X33和pPICZαB-gE_31-336-538-X33。

上述重组工程菌株的表达结果(图2)显示，其中，图2A和图2B中1-9号泳道分别为重组工程菌株pPICZαB-gE1-188-X33、pPICZαB-gE31-188-X33、pPICZαB-gE1-208-X33、pPICZαB-gE31-208-X33、pPICZαB-gE31-168-X33、pPICZαB-gE31-336-X33、 pPICZαB-gE189-546-X33、pPICZαB-gE169-546-X33和pPICZαB-gE337-538-X33，10号泳道为阴性对照株X33)，图2C和图2D中1-3号泳道为重组工程菌株pPICZαB-gE31-188-546-X33、 pPICZαB-gE31-168-546-X33和pPICZαB-gE31-336-538-X33，4号泳道为阴性对照株X33；图 2中部分酵母培养上清中存在明确的异源蛋白表达条带。不同重组工程菌株中gE分段蛋白 (1-188aa、31-188aa、1-208aa、31-208aa、31-168aa、31-336aa、189-546aa、169-546aa及 337-538aa)的理论分子量分别为21.2kDa、18.2kDa、23.6kDa、20.62kDa、15.9kDa、34.99kDa、40.1kDa、42.4kDa及22.59kDa。这些蛋白的实际表达产物的分子量高于理论分子量，说明这些表达产物存在不同程度的糖基化。此外，不同区段的重组蛋白表达情况也有显著的差异，相对而言，pPICZαB-gE_31-336-X33、pPICZαB-gE_337-538-X33和pPICZαB-gE_31-336-538-X33中的重组蛋白表达水平较高。

实施例2重组gE蛋白的制备工艺

1.重组gE蛋白工程菌株的发酵罐培养

将甘油管保存的pPICZαB-gE_31-336-X33、pPICZαB-gE_337-538-X33和 pPICZαB-gE_31-336-538-X33表达菌株，按1:1000比例(v/v)接种于YPG培养基中，摇瓶培养16-24小时。按1:20的比例(v/v)接种至发酵培养基(Basic salts)，通过调节转速、罐压和通气量维持溶氧值，并补加甘油使酵母菌体增长。待甘油消耗结束后，补加甲醇诱导，通过调节转速、罐压和通气量维持溶氧值，总诱导80小时后，终止发酵。离心后取发酵上清液，用于后续纯化。

其中，发酵培养的条件为：前期生长期培养温度28～32℃，pH 4.6～5.4，转速≤950rpm，罐压≤0.12mpa，溶氧≥10％，诱导阶段温度23～27℃，pH6.3～6.7，其他参数同生长期，甲醇诱导。其中，先向甲醇中加入ptm1配制成甲醇溶液，甲醇溶液中ptm1的浓度为12mL/L，诱导开始时向培养基中加入2‰(质量百分比)的该甲醇溶液(该甲醇溶液中加入了ptm1，浓度为12mL/L)，待甲醇用完溶氧反弹到80％后流加甲醇，总诱导80小时。

取不同时间的发酵培养基离心，获得的上清液进行SDS-PAGE鉴定(图3)，图3A的1-4 号泳道分别是重组工程菌株pPICZαB-gE31-336-X33发酵10h至40h(10h、20h、30h、40h)的上清，图3B的1-7号泳道分别是重组工程菌株pPICZαB-gE337-538-X33发酵0h至60h(0h、10h、20h、30h、40h、50h、60h)的上清，图3C的1-9号泳道分别是重组工程菌株 pPICZαB-gE31-336-538-X33发酵0h至80h(0h、10h、20h、30h、40h、50h、60h、70h、80h) 的上清。结果显示重组gE_31-336和gE_337-538蛋白的分泌表达情况随诱导时间延长而不断增加，表达量符合大规模生产需求。

2.重组gE蛋白的纯化

将上述pPICZαB-gE_31-336-X33、pPICZαB-gE_337-538-X33和pPICZαB-gE_31-336-538-X33的发酵终止后的培养基离心，获得上清液，将上清分别调整至pH为3.8、8.5和3.8，利用POROS50HS层析柱或SF phenyl层析柱分离纯化，收集得到的目的蛋白即纯化的抗原，冻存于 -80℃。并对纯化产物进行SDS-PAGE纯度鉴定(图4)。图4显示为重组抗原蛋白的纯化结果。1-3号泳道分别是重组蛋白gE_31-336、gE_337-538的纯化和共纯化样品(共纯化样品是指同时表达重组蛋白gE_31-336、gE_337-538的菌株发酵后的上清利用相关层析柱纯化得到两个蛋白)。结果表明，gE_31-336、gE_337-538、以及gE_31-336和gE_337-538共纯化样品的电泳纯度>85％。

实施例3重组gE蛋白的免疫原性检测

1.疫苗制备

将纯化获得的gE_31-336、gE_337-538、共纯化的gE_31-336、gE_337-538以及对照gE蛋白(CHO细胞表达(蛋白序列为SEQ ID NO.32))分别混合佐剂组合物或铝佐剂制备获得VZV疫苗成品。配制比例见表1和表2。

表1佐剂组合物配制比例

注：根据实际需要配制佐剂组合物的量

2.重组gE蛋白在小鼠体内的免疫原性

取6-8周龄Balb/c雌鼠48只，随机分成6组(A-F组)，每组8只小鼠。疫苗制剂分组和免疫程序见表2。

表2小鼠免疫方案

(2.1)抗体滴度检测

在免疫后第49天取血，进行抗体滴度检测。具体如下：

以gE(全长蛋白，CHO细胞表达)包被96孔板，4℃放置过夜，PBST洗板5次。每孔加入封闭液(含5％奶粉的PBST)，置37℃2小时。PBST洗板5次。血清样品按2倍梯度进行稀释(检测最后得到的数据是能正常显色的最高稀释倍数，称之为抗体滴度。测定抗体滴度时，具体的稀释方案可根据不同实验室、不同检测需求而定)，100μl/孔加入酶标板，室温孵育1小时。PBST洗板5次。每孔加入100μl 1:5000稀释的羊抗鼠IgG-HRP(北京鼎国)，室温孵育1小时。PBST洗板5次。每孔加入100μl新鲜配制的显色液(TMB显色)，37℃显色10分钟。每孔加入50μl 2M硫酸终止显色，振荡混匀后使用酶标仪读数，测定波长为 450nm，参比波长为620nm。

图5显示重组gE蛋白抗原在小鼠体内的免疫原性，具体为不同疫苗组别免疫小鼠后的血清抗体滴度水平，结果显示，含有gE_31-336蛋白以及佐剂组合物的疫苗制剂可诱导小鼠产生高水平的gE特异性抗体反应，表明gE蛋白中抗原表位主要集中于N端。

(2.2)细胞免疫水平检测

在免疫49天后处死上述各免疫组中的小鼠，无菌分离A-F每组小鼠的脾脏淋巴细胞(每组8只小鼠的脾脏合并后研磨分离得淋巴细胞)，将每组小鼠的淋巴细胞浓度调整为1×10⁷/mL。随后分别取100μL细胞悬液，加入预包被好对应细胞因子(IFN-γ，IL-2，IL-4，IL-5，IL-10，TNF-α)抗体的96孔板，每组细胞样品检测8孔，其中4个孔加入gE(全长蛋白，序列为SEQ ID NO.32)，3个孔加入阳性刺激物刀豆素A(ConA)，1个孔加入培养基作为阴性对照。随后将96孔板放置于37℃，5％的CO₂培养箱中培养24小时。次日根据Elispot 试剂盒(Cellular Technology Limited，CTL)说明书进行斑点显色并拍照计数。

图6显示重组gE蛋白抗原在小鼠体内的免疫原性，具体为不同疫苗组别免疫小鼠后激发的细胞响应的计数结果，结果表明免疫含有gE_31-336蛋白和佐剂组合物的疫苗制剂的小鼠的特异性细胞免疫水平更高，表明本发明该疫苗制剂具有良好的VZV疫苗潜力。

其中，gE(全长蛋白)的作用为：gE蛋白为细胞因子检测所用的刺激抗原，不是对照组的意思。

其中，阳性刺激物的作用为能够刺激淋巴细胞分泌上述细胞因子，作为实验系统阳性的指标，不是检测实验结果的阳性对照。

图6中的柱状图显示的是6组小鼠免疫的结果，纵坐标具体数值是指10⁶个淋巴细胞中经全长gE蛋白特异性刺激后分泌相应细胞因子的细胞数。例如图6A是指6组小鼠在免疫不同抗原的疫苗后，提取脾脏中的淋巴细胞后，让10⁶个淋巴细胞在全长gE蛋白的刺激下，其中能够响应此特异性抗原进而分泌IL-2细胞因子的细胞数。

SEQ ID NO.1

SEQ ID NO.2

SEQ ID NO.3

SEQ ID NO.4

SEQ ID NO.5

SEQ ID NO.6

SEQ ID NO.7

SEQ ID NO.8

SEQ ID NO.9

SEQ ID NO.10

SEQ ID NO.11

/>

SEQ ID NO.12

SEQ ID NO.13

SEQ ID NO.14

SEQ ID NO.15

SEQ ID NO.16

SEQ ID NO.17

SEQ ID NO.18

SEQ ID NO.19

SEQ ID NO.20

SEQ ID NO.21

SEQ ID NO.22

SEQ ID NO.23

SEQ ID NO.24

SEQ ID NO.25

SEQ ID NO.26

/>

SEQ ID NO.27

SEQ ID NO.28

SEQ ID NO.29

SEQ ID NO.30

SEQ ID NO.31

SEQ ID NO.32

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围。

序列表

<110> 上海博唯生物科技有限公司

<120> 预防和/或治疗疱疹病毒的截短的疫苗抗原肽及其制备方法和应用

<160> 32

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 623

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Gly Thr Val Asn Lys Pro Val Val Gly Val Leu Met Gly Phe Gly

1 5 10 15

Ile Ile Thr Gly Thr Leu Arg Ile Thr Asn Pro Val Arg Ala Ser Val

20 25 30

Leu Arg Tyr Asp Asp Phe His Ile Asp Glu Asp Lys Leu Asp Thr Asn

35 40 45

Ser Val Tyr Glu Pro Tyr Tyr His Ser Asp His Ala Glu Ser Ser Trp

50 55 60

Val Asn Arg Gly Glu Ser Ser Arg Lys Ala Tyr Asp His Asn Ser Pro

65 70 75 80

Tyr Ile Trp Pro Arg Asn Asp Tyr Asp Gly Phe Leu Glu Asn Ala His

85 90 95

Glu His His Gly Val Tyr Asn Gln Gly Arg Gly Ile Asp Ser Gly Glu

100 105 110

Arg Leu Met Gln Pro Thr Gln Met Ser Ala Gln Glu Asp Leu Gly Asp

115 120 125

Asp Thr Gly Ile His Val Ile Pro Thr Leu Asn Gly Asp Asp Arg His

130 135 140

Lys Ile Val Asn Val Asp Gln Arg Gln Tyr Gly Asp Val Phe Lys Gly

145 150 155 160

Asp Leu Asn Pro Lys Pro Gln Gly Gln Arg Leu Ile Glu Val Ser Val

165 170 175

Glu Glu Asn His Pro Phe Thr Leu Arg Ala Pro Ile Gln Arg Ile Tyr

180 185 190

Gly Val Arg Tyr Thr Glu Thr Trp Ser Phe Leu Pro Ser Leu Thr Cys

195 200 205

Thr Gly Asp Ala Ala Pro Ala Ile Gln His Ile Cys Leu Lys His Thr

210 215 220

Thr Cys Phe Gln Asp Val Val Val Asp Val Asp Cys Ala Glu Asn Thr

225 230 235 240

Lys Glu Asp Gln Leu Ala Glu Ile Ser Tyr Arg Phe Gln Gly Lys Lys

245 250 255

Glu Ala Asp Gln Pro Trp Ile Val Val Asn Thr Ser Thr Leu Phe Asp

260 265 270

Glu Leu Glu Leu Asp Pro Pro Glu Ile Glu Pro Gly Val Leu Lys Val

275 280 285

Leu Arg Thr Glu Lys Gln Tyr Leu Gly Val Tyr Ile Trp Asn Met Arg

290 295 300

Gly Ser Asp Gly Thr Ser Thr Tyr Ala Thr Phe Leu Val Thr Trp Lys

305 310 315 320

Gly Asp Glu Lys Thr Arg Asn Pro Thr Pro Ala Val Thr Pro Gln Pro

325 330 335

Arg Gly Ala Glu Phe His Met Trp Asn Tyr His Ser His Val Phe Ser

340 345 350

Val Gly Asp Thr Phe Ser Leu Ala Met His Leu Gln Tyr Lys Ile His

355 360 365

Glu Ala Pro Phe Asp Leu Leu Leu Glu Trp Leu Tyr Val Pro Ile Asp

370 375 380

Pro Thr Cys Gln Pro Met Arg Leu Tyr Ser Thr Cys Leu Tyr His Pro

385 390 395 400

Asn Ala Pro Gln Cys Leu Ser His Met Asn Ser Gly Cys Thr Phe Thr

405 410 415

Ser Pro His Leu Ala Gln Arg Val Ala Ser Thr Val Tyr Gln Asn Cys

420 425 430

Glu His Ala Asp Asn Tyr Thr Ala Tyr Cys Leu Gly Ile Ser His Met

435 440 445

Glu Pro Ser Phe Gly Leu Ile Leu His Asp Gly Gly Thr Thr Leu Lys

450 455 460

Phe Val Asp Thr Pro Glu Ser Leu Ser Gly Leu Tyr Val Phe Val Val

465 470 475 480

Tyr Phe Asn Gly His Val Glu Ala Val Ala Tyr Thr Val Val Ser Thr

485 490 495

Val Asp His Phe Val Asn Ala Ile Glu Glu Arg Gly Phe Pro Pro Thr

500 505 510

Ala Gly Gln Pro Pro Ala Thr Thr Lys Pro Lys Glu Ile Thr Pro Val

515 520 525

Asn Pro Gly Thr Ser Pro Leu Leu Arg Tyr Ala Ala Trp Thr Gly Gly

530 535 540

Leu Ala Ala Val Val Leu Leu Cys Leu Val Ile Phe Leu Ile Cys Thr

545 550 555 560

Ala Lys Arg Met Arg Val Lys Ala Tyr Arg Val Asp Lys Ser Pro Tyr

565 570 575

Asn Gln Ser Met Tyr Tyr Ala Gly Leu Pro Val Asp Asp Phe Glu Asp

580 585 590

Ser Glu Ser Thr Asp Thr Glu Glu Glu Phe Gly Asn Ala Ile Gly Gly

595 600 605

Ser His Gly Gly Ser Ser Tyr Thr Val Tyr Ile Asp Lys Thr Arg

610 615 620

<210> 2

<211> 188

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Gly Thr Val Asn Lys Pro Val Val Gly Val Leu Met Gly Phe Gly

1 5 10 15

Ile Ile Thr Gly Thr Leu Arg Ile Thr Asn Pro Val Arg Ala Ser Val

20 25 30

Leu Arg Tyr Asp Asp Phe His Ile Asp Glu Asp Lys Leu Asp Thr Asn

35 40 45

Ser Val Tyr Glu Pro Tyr Tyr His Ser Asp His Ala Glu Ser Ser Trp

50 55 60

Val Asn Arg Gly Glu Ser Ser Arg Lys Ala Tyr Asp His Asn Ser Pro

65 70 75 80

Tyr Ile Trp Pro Arg Asn Asp Tyr Asp Gly Phe Leu Glu Asn Ala His

85 90 95

Glu His His Gly Val Tyr Asn Gln Gly Arg Gly Ile Asp Ser Gly Glu

100 105 110

Arg Leu Met Gln Pro Thr Gln Met Ser Ala Gln Glu Asp Leu Gly Asp

115 120 125

Asp Thr Gly Ile His Val Ile Pro Thr Leu Asn Gly Asp Asp Arg His

130 135 140

Lys Ile Val Asn Val Asp Gln Arg Gln Tyr Gly Asp Val Phe Lys Gly

145 150 155 160

Asp Leu Asn Pro Lys Pro Gln Gly Gln Arg Leu Ile Glu Val Ser Val

165 170 175

Glu Glu Asn His Pro Phe Thr Leu Arg Ala Pro Ile

180 185

<210> 3

<211> 158

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ser Val Leu Arg Tyr Asp Asp Phe His Ile Asp Glu Asp Lys Leu Asp

1 5 10 15

Thr Asn Ser Val Tyr Glu Pro Tyr Tyr His Ser Asp His Ala Glu Ser

20 25 30

Ser Trp Val Asn Arg Gly Glu Ser Ser Arg Lys Ala Tyr Asp His Asn

35 40 45

Ser Pro Tyr Ile Trp Pro Arg Asn Asp Tyr Asp Gly Phe Leu Glu Asn

50 55 60

Ala His Glu His His Gly Val Tyr Asn Gln Gly Arg Gly Ile Asp Ser

65 70 75 80

Gly Glu Arg Leu Met Gln Pro Thr Gln Met Ser Ala Gln Glu Asp Leu

85 90 95

Gly Asp Asp Thr Gly Ile His Val Ile Pro Thr Leu Asn Gly Asp Asp

100 105 110

Arg His Lys Ile Val Asn Val Asp Gln Arg Gln Tyr Gly Asp Val Phe

115 120 125

Lys Gly Asp Leu Asn Pro Lys Pro Gln Gly Gln Arg Leu Ile Glu Val

130 135 140

Ser Val Glu Glu Asn His Pro Phe Thr Leu Arg Ala Pro Ile

145 150 155

<210> 4

<211> 208

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Gly Thr Val Asn Lys Pro Val Val Gly Val Leu Met Gly Phe Gly

1 5 10 15

Ile Ile Thr Gly Thr Leu Arg Ile Thr Asn Pro Val Arg Ala Ser Val

20 25 30

Leu Arg Tyr Asp Asp Phe His Ile Asp Glu Asp Lys Leu Asp Thr Asn

35 40 45

Ser Val Tyr Glu Pro Tyr Tyr His Ser Asp His Ala Glu Ser Ser Trp

50 55 60

Val Asn Arg Gly Glu Ser Ser Arg Lys Ala Tyr Asp His Asn Ser Pro

65 70 75 80

Tyr Ile Trp Pro Arg Asn Asp Tyr Asp Gly Phe Leu Glu Asn Ala His

85 90 95

Glu His His Gly Val Tyr Asn Gln Gly Arg Gly Ile Asp Ser Gly Glu

100 105 110

Arg Leu Met Gln Pro Thr Gln Met Ser Ala Gln Glu Asp Leu Gly Asp

115 120 125

Asp Thr Gly Ile His Val Ile Pro Thr Leu Asn Gly Asp Asp Arg His

130 135 140

Lys Ile Val Asn Val Asp Gln Arg Gln Tyr Gly Asp Val Phe Lys Gly

145 150 155 160

Asp Leu Asn Pro Lys Pro Gln Gly Gln Arg Leu Ile Glu Val Ser Val

165 170 175

Glu Glu Asn His Pro Phe Thr Leu Arg Ala Pro Ile Gln Arg Ile Tyr

180 185 190

Gly Val Arg Tyr Thr Glu Thr Trp Ser Phe Leu Pro Ser Leu Thr Cys

195 200 205

<210> 5

<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Ser Val Leu Arg Tyr Asp Asp Phe His Ile Asp Glu Asp Lys Leu Asp

1 5 10 15

Thr Asn Ser Val Tyr Glu Pro Tyr Tyr His Ser Asp His Ala Glu Ser

20 25 30

Ser Trp Val Asn Arg Gly Glu Ser Ser Arg Lys Ala Tyr Asp His Asn

35 40 45

Ser Pro Tyr Ile Trp Pro Arg Asn Asp Tyr Asp Gly Phe Leu Glu Asn

50 55 60

Ala His Glu His His Gly Val Tyr Asn Gln Gly Arg Gly Ile Asp Ser

65 70 75 80

Gly Glu Arg Leu Met Gln Pro Thr Gln Met Ser Ala Gln Glu Asp Leu

85 90 95

Gly Asp Asp Thr Gly Ile His Val Ile Pro Thr Leu Asn Gly Asp Asp

100 105 110

Arg His Lys Ile Val Asn Val Asp Gln Arg Gln Tyr Gly Asp Val Phe

115 120 125

Lys Gly Asp Leu Asn Pro Lys Pro Gln Gly Gln Arg Leu Ile Glu Val

130 135 140

Ser Val Glu Glu Asn His Pro Phe Thr Leu Arg Ala Pro Ile Gln Arg

145 150 155 160

Ile Tyr Gly Val Arg Tyr Thr Glu Thr Trp Ser Phe Leu Pro Ser Leu

165 170 175

Thr Cys

<210> 6

<211> 358

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gln Arg Ile Tyr Gly Val Arg Tyr Thr Glu Thr Trp Ser Phe Leu Pro

1 5 10 15

Ser Leu Thr Cys Thr Gly Asp Ala Ala Pro Ala Ile Gln His Ile Cys

20 25 30

Leu Lys His Thr Thr Cys Phe Gln Asp Val Val Val Asp Val Asp Cys

35 40 45

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50 55 60

Gln Gly Lys Lys Glu Ala Asp Gln Pro Trp Ile Val Val Asn Thr Ser

65 70 75 80

Thr Leu Phe Asp Glu Leu Glu Leu Asp Pro Pro Glu Ile Glu Pro Gly

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Val Leu Lys Val Leu Arg Thr Glu Lys Gln Tyr Leu Gly Val Tyr Ile

100 105 110

Trp Asn Met Arg Gly Ser Asp Gly Thr Ser Thr Tyr Ala Thr Phe Leu

115 120 125

Val Thr Trp Lys Gly Asp Glu Lys Thr Arg Asn Pro Thr Pro Ala Val

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145 150 155 160

His Val Phe Ser Val Gly Asp Thr Phe Ser Leu Ala Met His Leu Gln

165 170 175

Tyr Lys Ile His Glu Ala Pro Phe Asp Leu Leu Leu Glu Trp Leu Tyr

180 185 190

Val Pro Ile Asp Pro Thr Cys Gln Pro Met Arg Leu Tyr Ser Thr Cys

195 200 205

Leu Tyr His Pro Asn Ala Pro Gln Cys Leu Ser His Met Asn Ser Gly

210 215 220

Cys Thr Phe Thr Ser Pro His Leu Ala Gln Arg Val Ala Ser Thr Val

225 230 235 240

Tyr Gln Asn Cys Glu His Ala Asp Asn Tyr Thr Ala Tyr Cys Leu Gly

245 250 255

Ile Ser His Met Glu Pro Ser Phe Gly Leu Ile Leu His Asp Gly Gly

260 265 270

Thr Thr Leu Lys Phe Val Asp Thr Pro Glu Ser Leu Ser Gly Leu Tyr

275 280 285

Val Phe Val Val Tyr Phe Asn Gly His Val Glu Ala Val Ala Tyr Thr

290 295 300

Val Val Ser Thr Val Asp His Phe Val Asn Ala Ile Glu Glu Arg Gly

305 310 315 320

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325 330 335

Ile Thr Pro Val Asn Pro Gly Thr Ser Pro Leu Leu Arg Tyr Ala Ala

340 345 350

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355

<210> 7

<211> 378

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gln Arg Leu Ile Glu Val Ser Val Glu Glu Asn His Pro Phe Thr Leu

1 5 10 15

Arg Ala Pro Ile Gln Arg Ile Tyr Gly Val Arg Tyr Thr Glu Thr Trp

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Ser Phe Leu Pro Ser Leu Thr Cys Thr Gly Asp Ala Ala Pro Ala Ile

35 40 45

Gln His Ile Cys Leu Lys His Thr Thr Cys Phe Gln Asp Val Val Val

50 55 60

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65 70 75 80

Ser Tyr Arg Phe Gln Gly Lys Lys Glu Ala Asp Gln Pro Trp Ile Val

85 90 95

Val Asn Thr Ser Thr Leu Phe Asp Glu Leu Glu Leu Asp Pro Pro Glu

100 105 110

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115 120 125

Gly Val Tyr Ile Trp Asn Met Arg Gly Ser Asp Gly Thr Ser Thr Tyr

130 135 140

Ala Thr Phe Leu Val Thr Trp Lys Gly Asp Glu Lys Thr Arg Asn Pro

145 150 155 160

Thr Pro Ala Val Thr Pro Gln Pro Arg Gly Ala Glu Phe His Met Trp

165 170 175

Asn Tyr His Ser His Val Phe Ser Val Gly Asp Thr Phe Ser Leu Ala

180 185 190

Met His Leu Gln Tyr Lys Ile His Glu Ala Pro Phe Asp Leu Leu Leu

195 200 205

Glu Trp Leu Tyr Val Pro Ile Asp Pro Thr Cys Gln Pro Met Arg Leu

210 215 220

Tyr Ser Thr Cys Leu Tyr His Pro Asn Ala Pro Gln Cys Leu Ser His

225 230 235 240

Met Asn Ser Gly Cys Thr Phe Thr Ser Pro His Leu Ala Gln Arg Val

245 250 255

Ala Ser Thr Val Tyr Gln Asn Cys Glu His Ala Asp Asn Tyr Thr Ala

260 265 270

Tyr Cys Leu Gly Ile Ser His Met Glu Pro Ser Phe Gly Leu Ile Leu

275 280 285

His Asp Gly Gly Thr Thr Leu Lys Phe Val Asp Thr Pro Glu Ser Leu

290 295 300

Ser Gly Leu Tyr Val Phe Val Val Tyr Phe Asn Gly His Val Glu Ala

305 310 315 320

Val Ala Tyr Thr Val Val Ser Thr Val Asp His Phe Val Asn Ala Ile

325 330 335

Glu Glu Arg Gly Phe Pro Pro Thr Ala Gly Gln Pro Pro Ala Thr Thr

340 345 350

Lys Pro Lys Glu Ile Thr Pro Val Asn Pro Gly Thr Ser Pro Leu Leu

355 360 365

Arg Tyr Ala Ala Trp Thr Gly Gly Leu Ala

370 375

<210> 8

<211> 138

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Ser Val Leu Arg Tyr Asp Asp Phe His Ile Asp Glu Asp Lys Leu Asp

1 5 10 15

Thr Asn Ser Val Tyr Glu Pro Tyr Tyr His Ser Asp His Ala Glu Ser

20 25 30

Ser Trp Val Asn Arg Gly Glu Ser Ser Arg Lys Ala Tyr Asp His Asn

35 40 45

Ser Pro Tyr Ile Trp Pro Arg Asn Asp Tyr Asp Gly Phe Leu Glu Asn

50 55 60

Ala His Glu His His Gly Val Tyr Asn Gln Gly Arg Gly Ile Asp Ser

65 70 75 80

Gly Glu Arg Leu Met Gln Pro Thr Gln Met Ser Ala Gln Glu Asp Leu

85 90 95

Gly Asp Asp Thr Gly Ile His Val Ile Pro Thr Leu Asn Gly Asp Asp

100 105 110

Arg His Lys Ile Val Asn Val Asp Gln Arg Gln Tyr Gly Asp Val Phe

115 120 125

Lys Gly Asp Leu Asn Pro Lys Pro Gln Gly

130 135

<210> 9

<211> 306

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Ser Val Leu Arg Tyr Asp Asp Phe His Ile Asp Glu Asp Lys Leu Asp

1 5 10 15

Thr Asn Ser Val Tyr Glu Pro Tyr Tyr His Ser Asp His Ala Glu Ser

20 25 30

Ser Trp Val Asn Arg Gly Glu Ser Ser Arg Lys Ala Tyr Asp His Asn

35 40 45

Ser Pro Tyr Ile Trp Pro Arg Asn Asp Tyr Asp Gly Phe Leu Glu Asn

50 55 60

Ala His Glu His His Gly Val Tyr Asn Gln Gly Arg Gly Ile Asp Ser

65 70 75 80

Gly Glu Arg Leu Met Gln Pro Thr Gln Met Ser Ala Gln Glu Asp Leu

85 90 95

Gly Asp Asp Thr Gly Ile His Val Ile Pro Thr Leu Asn Gly Asp Asp

100 105 110

Arg His Lys Ile Val Asn Val Asp Gln Arg Gln Tyr Gly Asp Val Phe

115 120 125

Lys Gly Asp Leu Asn Pro Lys Pro Gln Gly Gln Arg Leu Ile Glu Val

130 135 140

Ser Val Glu Glu Asn His Pro Phe Thr Leu Arg Ala Pro Ile Gln Arg

145 150 155 160

Ile Tyr Gly Val Arg Tyr Thr Glu Thr Trp Ser Phe Leu Pro Ser Leu

165 170 175

Thr Cys Thr Gly Asp Ala Ala Pro Ala Ile Gln His Ile Cys Leu Lys

180 185 190

His Thr Thr Cys Phe Gln Asp Val Val Val Asp Val Asp Cys Ala Glu

195 200 205

Asn Thr Lys Glu Asp Gln Leu Ala Glu Ile Ser Tyr Arg Phe Gln Gly

210 215 220

Lys Lys Glu Ala Asp Gln Pro Trp Ile Val Val Asn Thr Ser Thr Leu

225 230 235 240

Phe Asp Glu Leu Glu Leu Asp Pro Pro Glu Ile Glu Pro Gly Val Leu

245 250 255

Lys Val Leu Arg Thr Glu Lys Gln Tyr Leu Gly Val Tyr Ile Trp Asn

260 265 270

Met Arg Gly Ser Asp Gly Thr Ser Thr Tyr Ala Thr Phe Leu Val Thr

275 280 285

Trp Lys Gly Asp Glu Lys Thr Arg Asn Pro Thr Pro Ala Val Thr Pro

290 295 300

Gln Pro

305

<210> 10

<211> 202

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Arg Gly Ala Glu Phe His Met Trp Asn Tyr His Ser His Val Phe Ser

1 5 10 15

Val Gly Asp Thr Phe Ser Leu Ala Met His Leu Gln Tyr Lys Ile His

20 25 30

Glu Ala Pro Phe Asp Leu Leu Leu Glu Trp Leu Tyr Val Pro Ile Asp

35 40 45

Pro Thr Cys Gln Pro Met Arg Leu Tyr Ser Thr Cys Leu Tyr His Pro

50 55 60

Asn Ala Pro Gln Cys Leu Ser His Met Asn Ser Gly Cys Thr Phe Thr

65 70 75 80

Ser Pro His Leu Ala Gln Arg Val Ala Ser Thr Val Tyr Gln Asn Cys

85 90 95

Glu His Ala Asp Asn Tyr Thr Ala Tyr Cys Leu Gly Ile Ser His Met

100 105 110

Glu Pro Ser Phe Gly Leu Ile Leu His Asp Gly Gly Thr Thr Leu Lys

115 120 125

Phe Val Asp Thr Pro Glu Ser Leu Ser Gly Leu Tyr Val Phe Val Val

130 135 140

Tyr Phe Asn Gly His Val Glu Ala Val Ala Tyr Thr Val Val Ser Thr

145 150 155 160

Val Asp His Phe Val Asn Ala Ile Glu Glu Arg Gly Phe Pro Pro Thr

165 170 175

Ala Gly Gln Pro Pro Ala Thr Thr Lys Pro Lys Glu Ile Thr Pro Val

180 185 190

Asn Pro Gly Thr Ser Pro Leu Leu Arg Tyr

195 200

<210> 11

<211> 1641

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atgggcaccg ttaacaagcc tgtcgttggt gtgctgatgg gcttcggcat cattaccggt 60

acgctcagaa tcacgaatcc agttagagcc tccgtgctca gatacgacga tttccacatt 120

gacgaggata agctcgacac caactccgtc tacgagccat actatcactc ggatcacgca 180

gagtcttcgt gggtgaacag aggcgagtcg tctagaaagg catacgacca caactcgcct 240

tacatctggc ctagaaacga ctacgatggc tttctggaga acgcgcacga gcatcacggc 300

gtctacaacc agggtagagg catcgactct ggcgaaagac tcatgcagcc cacccagatg 360

tccgctcaag aggacctcgg cgatgacacc ggtattcacg ttatcccaac gctgaacggt 420

gacgatagac acaagatcgt gaacgtcgac cagaggcagt acggagacgt gtttaagggt 480

gacctcaacc ctaagcctca aggtcagaga cttatcgagg tttcggtcga agagaaccat 540

ccattcacgc tcagagcacc tatccagaga atctatggcg tcagatacac ggagacctgg 600

tcgttccttc catccttgac ctgtactgga gacgccgcgc ctgccatcca gcacatctgc 660

ctgaagcaca cgacctgctt ccaggacgtg gttgtcgatg tcgactgcgc cgagaacacc 720

aaagaggacc aactggctga gatttcctac agattccaag gcaagaagga ggccgaccag 780

ccttggatcg tcgtgaacac ctccacgctg ttcgacgagc tagaactgga cccacctgag 840

attgaaccag gagttctgaa ggttctgaga accgagaagc agtacctggg tgtctacatc 900

tggaacatga gaggctcgga tggcacttcc acctacgcta cgttcctggt cacctggaag 960

ggcgacgaga agaccagaaa ccctacgcca gccgtgactc ctcaacctag aggagcggag 1020

tttcacatgt ggaactacca ctcgcacgtc ttctctgttg gtgacacctt ctctctggcc 1080

atgcacctgc agtataagat tcacgaagct ccattcgacc tgttgcttga gtggctgtac 1140

gtgcctattg atcctacctg tcaaccaatg agactgtact ccacctgcct gtaccaccct 1200

aacgcacctc agtgcctgtc tcacatgaac tctggatgta cgttcacttc gccacacctg 1260

gctcagagag tcgcctccac cgtctatcag aactgcgagc acgcagacaa ctacaccgct 1320

tactgccttg gtatctcgca catggagcct tccttcggac tcattctgca cgacggaggc 1380

accactctga agtttgttga cacccctgag tccctctctg gactgtacgt ctttgtcgtt 1440

tacttcaacg gccacgttga ggcagttgct tacaccgtgg tctccaccgt tgaccacttc 1500

gttaacgcca tcgaagagag aggcttccca cctaccgccg gacagccacc tgccacgacc 1560

aagcctaagg agatcactcc tgttaaccca ggcacctctc ctcttctgag atacgcagcc 1620

tggaccggcg gactggcctg a 1641

<210> 12

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atccgctcga gaaaagagag gctgaagctg gcaccgttaa caagcctgtc g 51

<210> 13

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ataagaatgc ggccgctcag ataggtgctc tgagcgtgaa tg 42

<210> 14

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ccgctcgaga aaagagaggc tgaagcttcc gtgctcagat acg 43

<210> 15

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

aaggaaaagc ggccgctgat caacaggtca aggatggaag gaacga 46

<210> 16

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ccgctcgaga aaagagaggc tgaagctcag agaatctatg gcgtcag 47

<210> 17

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

aggaaaagcg gccgctcagg ccagtccgcc ggt 33

<210> 18

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

atccgctcga gaaaagagag gctgaagctc agagacttat cgaggtttc 49

<210> 19

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ataagaatgc ggccgctcaa ccttgaggct tagggttg 38

<210> 20

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ataagaatgc ggccgctcaa ggttgaggag tcacggct 38

<210> 21

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ccgctcgaga aaagagaggc tgaagctaga ggagcggagt ttcac 45

<210> 22

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ataagaatgc ggccgctcag tatctcagaa gaggagaggt 40

<210> 23

<211> 564

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ggcaccgtta acaagcctgt cgttggtgtg ctgatgggct tcggcatcat taccggtacg 60

ctcagaatca cgaatccagt tagagcctcc gtgctcagat acgacgattt ccacattgac 120

gaggataagc tcgacaccaa ctccgtctac gagccatact atcactcgga tcacgcagag 180

tcttcgtggg tgaacagagg cgagtcgtct agaaaggcat acgaccacaa ctcgccttac 240

atctggccta gaaacgacta cgatggcttt ctggagaacg cgcacgagca tcacggcgtc 300

tacaaccagg gtagaggcat cgactctggc gaaagactca tgcagcccac ccagatgtcc 360

gctcaagagg acctcggcga tgacaccggt attcacgtta tcccaacgct gaacggtgac 420

gatagacaca agatcgtgaa cgtcgaccag aggcagtacg gagacgtgtt taagggtgac 480

ctcaacccta agcctcaagg tcagagactt atcgaggttt cggtcgaaga gaaccatcca 540

ttcacgctca gagcacctat ctga 564

<210> 24

<211> 477

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tccgtgctca gatacgacga tttccacatt gacgaggata agctcgacac caactccgtc 60

tacgagccat actatcactc ggatcacgca gagtcttcgt gggtgaacag aggcgagtcg 120

tctagaaagg catacgacca caactcgcct tacatctggc ctagaaacga ctacgatggc 180

tttctggaga acgcgcacga gcatcacggc gtctacaacc agggtagagg catcgactct 240

ggcgaaagac tcatgcagcc cacccagatg tccgctcaag aggacctcgg cgatgacacc 300

ggtattcacg ttatcccaac gctgaacggt gacgatagac acaagatcgt gaacgtcgac 360

cagaggcagt acggagacgt gtttaagggt gacctcaacc ctaagcctca aggtcagaga 420

cttatcgagg tttcggtcga agagaaccat ccattcacgc tcagagcacc tatctga 477

<210> 25

<211> 624

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ggcaccgtta acaagcctgt cgttggtgtg ctgatgggct tcggcatcat taccggtacg 60

ctcagaatca cgaatccagt tagagcctcc gtgctcagat acgacgattt ccacattgac 120

gaggataagc tcgacaccaa ctccgtctac gagccatact atcactcgga tcacgcagag 180

tcttcgtggg tgaacagagg cgagtcgtct agaaaggcat acgaccacaa ctcgccttac 240

atctggccta gaaacgacta cgatggcttt ctggagaacg cgcacgagca tcacggcgtc 300

tacaaccagg gtagaggcat cgactctggc gaaagactca tgcagcccac ccagatgtcc 360

gctcaagagg acctcggcga tgacaccggt attcacgtta tcccaacgct gaacggtgac 420

gatagacaca agatcgtgaa cgtcgaccag aggcagtacg gagacgtgtt taagggtgac 480

ctcaacccta agcctcaagg tcagagactt atcgaggttt cggtcgaaga gaaccatcca 540

ttcacgctca gagcacctat ccagagaatc tatggcgtca gatacacgga gacctggtcg 600

ttccttccat ccttgacctg ttga 624

<210> 26

<211> 537

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

tccgtgctca gatacgacga tttccacatt gacgaggata agctcgacac caactccgtc 60

tacgagccat actatcactc ggatcacgca gagtcttcgt gggtgaacag aggcgagtcg 120

tctagaaagg catacgacca caactcgcct tacatctggc ctagaaacga ctacgatggc 180

tttctggaga acgcgcacga gcatcacggc gtctacaacc agggtagagg catcgactct 240

ggcgaaagac tcatgcagcc cacccagatg tccgctcaag aggacctcgg cgatgacacc 300

ggtattcacg ttatcccaac gctgaacggt gacgatagac acaagatcgt gaacgtcgac 360

cagaggcagt acggagacgt gtttaagggt gacctcaacc ctaagcctca aggtcagaga 420

cttatcgagg tttcggtcga agagaaccat ccattcacgc tcagagcacc tatccagaga 480

atctatggcg tcagatacac ggagacctgg tcgttccttc catccttgac ctgttga 537

<210> 27

<211> 1077

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

cagagaatct atggcgtcag atacacggag acctggtcgt tccttccatc cttgacctgt 60

actggagacg ccgcgcctgc catccagcac atctgcctga agcacacgac ctgcttccag 120

gacgtggttg tcgatgtcga ctgcgccgag aacaccaaag aggaccaact ggctgagatt 180

tcctacagat tccaaggcaa gaaggaggcc gaccagcctt ggatcgtcgt gaacacctcc 240

acgctgttcg acgagctaga actggaccca cctgagattg aaccaggagt tctgaaggtt 300

ctgagaaccg agaagcagta cctgggtgtc tacatctgga acatgagagg ctcggatggc 360

acttccacct acgctacgtt cctggtcacc tggaagggcg acgagaagac cagaaaccct 420

acgccagccg tgactcctca acctagagga gcggagtttc acatgtggaa ctaccactcg 480

cacgtcttct ctgttggtga caccttctct ctggccatgc acctgcagta taagattcac 540

gaagctccat tcgacctgtt gcttgagtgg ctgtacgtgc ctattgatcc tacctgtcaa 600

ccaatgagac tgtactccac ctgcctgtac caccctaacg cacctcagtg cctgtctcac 660

atgaactctg gatgtacgtt cacttcgcca cacctggctc agagagtcgc ctccaccgtc 720

tatcagaact gcgagcacgc agacaactac accgcttact gccttggtat ctcgcacatg 780

gagccttcct tcggactcat tctgcacgac ggaggcacca ctctgaagtt tgttgacacc 840

cctgagtccc tctctggact gtacgtcttt gtcgtttact tcaacggcca cgttgaggca 900

gttgcttaca ccgtggtctc caccgttgac cacttcgtta acgccatcga agagagaggc 960

ttcccaccta ccgccggaca gccacctgcc acgaccaagc ctaaggagat cactcctgtt 1020

aacccaggca cctctcctct tctgagatac gcagcctgga ccggcggact ggcctga 1077

<210> 28

<211> 1137

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

cagagactta tcgaggtttc ggtcgaagag aaccatccat tcacgctcag agcacctatc 60

cagagaatct atggcgtcag atacacggag acctggtcgt tccttccatc cttgacctgt 120

actggagacg ccgcgcctgc catccagcac atctgcctga agcacacgac ctgcttccag 180

gacgtggttg tcgatgtcga ctgcgccgag aacaccaaag aggaccaact ggctgagatt 240

tcctacagat tccaaggcaa gaaggaggcc gaccagcctt ggatcgtcgt gaacacctcc 300

acgctgttcg acgagctaga actggaccca cctgagattg aaccaggagt tctgaaggtt 360

ctgagaaccg agaagcagta cctgggtgtc tacatctgga acatgagagg ctcggatggc 420

acttccacct acgctacgtt cctggtcacc tggaagggcg acgagaagac cagaaaccct 480

acgccagccg tgactcctca acctagagga gcggagtttc acatgtggaa ctaccactcg 540

cacgtcttct ctgttggtga caccttctct ctggccatgc acctgcagta taagattcac 600

gaagctccat tcgacctgtt gcttgagtgg ctgtacgtgc ctattgatcc tacctgtcaa 660

ccaatgagac tgtactccac ctgcctgtac caccctaacg cacctcagtg cctgtctcac 720

atgaactctg gatgtacgtt cacttcgcca cacctggctc agagagtcgc ctccaccgtc 780

tatcagaact gcgagcacgc agacaactac accgcttact gccttggtat ctcgcacatg 840

gagccttcct tcggactcat tctgcacgac ggaggcacca ctctgaagtt tgttgacacc 900

cctgagtccc tctctggact gtacgtcttt gtcgtttact tcaacggcca cgttgaggca 960

gttgcttaca ccgtggtctc caccgttgac cacttcgtta acgccatcga agagagaggc 1020

ttcccaccta ccgccggaca gccacctgcc acgaccaagc ctaaggagat cactcctgtt 1080

aacccaggca cctctcctct tctgagatac gcagcctgga ccggcggact ggcctga 1137

<210> 29

<211> 417

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

tccgtgctca gatacgacga tttccacatt gacgaggata agctcgacac caactccgtc 60

tacgagccat actatcactc ggatcacgca gagtcttcgt gggtgaacag aggcgagtcg 120

tctagaaagg catacgacca caactcgcct tacatctggc ctagaaacga ctacgatggc 180

tttctggaga acgcgcacga gcatcacggc gtctacaacc agggtagagg catcgactct 240

ggcgaaagac tcatgcagcc cacccagatg tccgctcaag aggacctcgg cgatgacacc 300

ggtattcacg ttatcccaac gctgaacggt gacgatagac acaagatcgt gaacgtcgac 360

cagaggcagt acggagacgt gtttaagggt gacctcaacc ctaagcctca aggttga 417

<210> 30

<211> 921

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

tccgtgctca gatacgacga tttccacatt gacgaggata agctcgacac caactccgtc 60

tacgagccat actatcactc ggatcacgca gagtcttcgt gggtgaacag aggcgagtcg 120

tctagaaagg catacgacca caactcgcct tacatctggc ctagaaacga ctacgatggc 180

tttctggaga acgcgcacga gcatcacggc gtctacaacc agggtagagg catcgactct 240

ggcgaaagac tcatgcagcc cacccagatg tccgctcaag aggacctcgg cgatgacacc 300

ggtattcacg ttatcccaac gctgaacggt gacgatagac acaagatcgt gaacgtcgac 360

cagaggcagt acggagacgt gtttaagggt gacctcaacc ctaagcctca aggtcagaga 420

cttatcgagg tttcggtcga agagaaccat ccattcacgc tcagagcacc tatccagaga 480

atctatggcg tcagatacac ggagacctgg tcgttccttc catccttgac ctgtactgga 540

gacgccgcgc ctgccatcca gcacatctgc ctgaagcaca cgacctgctt ccaggacgtg 600

gttgtcgatg tcgactgcgc cgagaacacc aaagaggacc aactggctga gatttcctac 660

agattccaag gcaagaagga ggccgaccag ccttggatcg tcgtgaacac ctccacgctg 720

ttcgacgagc tagaactgga cccacctgag attgaaccag gagttctgaa ggttctgaga 780

accgagaagc agtacctggg tgtctacatc tggaacatga gaggctcgga tggcacttcc 840

acctacgcta cgttcctggt cacctggaag ggcgacgaga agaccagaaa ccctacgcca 900

gccgtgactc ctcaaccttg a 921

<210> 31

<211> 609

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

agaggagcgg agtttcacat gtggaactac cactcgcacg tcttctctgt tggtgacacc 60

ttctctctgg ccatgcacct gcagtataag attcacgaag ctccattcga cctgttgctt 120

gagtggctgt acgtgcctat tgatcctacc tgtcaaccaa tgagactgta ctccacctgc 180

ctgtaccacc ctaacgcacc tcagtgcctg tctcacatga actctggatg tacgttcact 240

tcgccacacc tggctcagag agtcgcctcc accgtctatc agaactgcga gcacgcagac 300

aactacaccg cttactgcct tggtatctcg cacatggagc cttccttcgg actcattctg 360

cacgacggag gcaccactct gaagtttgtt gacacccctg agtccctctc tggactgtac 420

gtctttgtcg tttacttcaa cggccacgtt gaggcagttg cttacaccgt ggtctccacc 480

gttgaccact tcgttaacgc catcgaagag agaggcttcc cacctaccgc cggacagcca 540

cctgccacga ccaagcctaa ggagatcact cctgttaacc caggcacctc tcctcttctg 600

agatactga 609

<210> 32

<211> 546

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

Met Gly Thr Val Asn Lys Pro Val Val Gly Val Leu Met Gly Phe Gly

1 5 10 15

Ile Ile Thr Gly Thr Leu Arg Ile Thr Asn Pro Val Arg Ala Ser Val

20 25 30

Leu Arg Tyr Asp Asp Phe His Ile Asp Glu Asp Lys Leu Asp Thr Asn

35 40 45

Ser Val Tyr Glu Pro Tyr Tyr His Ser Asp His Ala Glu Ser Ser Trp

50 55 60

Val Asn Arg Gly Glu Ser Ser Arg Lys Ala Tyr Asp His Asn Ser Pro

65 70 75 80

Tyr Ile Trp Pro Arg Asn Asp Tyr Asp Gly Phe Leu Glu Asn Ala His

85 90 95

Glu His His Gly Val Tyr Asn Gln Gly Arg Gly Ile Asp Ser Gly Glu

100 105 110

Arg Leu Met Gln Pro Thr Gln Met Ser Ala Gln Glu Asp Leu Gly Asp

115 120 125

Asp Thr Gly Ile His Val Ile Pro Thr Leu Asn Gly Asp Asp Arg His

130 135 140

Lys Ile Val Asn Val Asp Gln Arg Gln Tyr Gly Asp Val Phe Lys Gly

145 150 155 160

Asp Leu Asn Pro Lys Pro Gln Gly Gln Arg Leu Ile Glu Val Ser Val

165 170 175

Glu Glu Asn His Pro Phe Thr Leu Arg Ala Pro Ile Gln Arg Ile Tyr

180 185 190

Gly Val Arg Tyr Thr Glu Thr Trp Ser Phe Leu Pro Ser Leu Thr Cys

195 200 205

Thr Gly Asp Ala Ala Pro Ala Ile Gln His Ile Cys Leu Lys His Thr

210 215 220

Thr Cys Phe Gln Asp Val Val Val Asp Val Asp Cys Ala Glu Asn Thr

225 230 235 240

Lys Glu Asp Gln Leu Ala Glu Ile Ser Tyr Arg Phe Gln Gly Lys Lys

245 250 255

Glu Ala Asp Gln Pro Trp Ile Val Val Asn Thr Ser Thr Leu Phe Asp

260 265 270

Glu Leu Glu Leu Asp Pro Pro Glu Ile Glu Pro Gly Val Leu Lys Val

275 280 285

Leu Arg Thr Glu Lys Gln Tyr Leu Gly Val Tyr Ile Trp Asn Met Arg

290 295 300

Gly Ser Asp Gly Thr Ser Thr Tyr Ala Thr Phe Leu Val Thr Trp Lys

305 310 315 320

Gly Asp Glu Lys Thr Arg Asn Pro Thr Pro Ala Val Thr Pro Gln Pro

325 330 335

Arg Gly Ala Glu Phe His Met Trp Asn Tyr His Ser His Val Phe Ser

340 345 350

Val Gly Asp Thr Phe Ser Leu Ala Met His Leu Gln Tyr Lys Ile His

355 360 365

Glu Ala Pro Phe Asp Leu Leu Leu Glu Trp Leu Tyr Val Pro Ile Asp

370 375 380

Pro Thr Cys Gln Pro Met Arg Leu Tyr Ser Thr Cys Leu Tyr His Pro

385 390 395 400

Asn Ala Pro Gln Cys Leu Ser His Met Asn Ser Gly Cys Thr Phe Thr

405 410 415

Ser Pro His Leu Ala Gln Arg Val Ala Ser Thr Val Tyr Gln Asn Cys

420 425 430

Glu His Ala Asp Asn Tyr Thr Ala Tyr Cys Leu Gly Ile Ser His Met

435 440 445

Glu Pro Ser Phe Gly Leu Ile Leu His Asp Gly Gly Thr Thr Leu Lys

450 455 460

Phe Val Asp Thr Pro Glu Ser Leu Ser Gly Leu Tyr Val Phe Val Val

465 470 475 480

Tyr Phe Asn Gly His Val Glu Ala Val Ala Tyr Thr Val Val Ser Thr

485 490 495

Val Asp His Phe Val Asn Ala Ile Glu Glu Arg Gly Phe Pro Pro Thr

500 505 510

Ala Gly Gln Pro Pro Ala Thr Thr Lys Pro Lys Glu Ile Thr Pro Val

515 520 525

Asn Pro Gly Thr Ser Pro Leu Ile Arg Tyr Ala Ala Trp Thr Gly Gly

530 535 540

Leu Ala

545

Claims

1.一种疱疹病毒免疫原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

使用编码如SEQ ID NO.9所示的gE31-336蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列如SEQ IDNO.30所示，即构建疱疹病毒免疫原重组表达载体，并将所述重组表达载体转化至毕赤酵母X33中得到重组工程菌，培养，收集菌体，破碎菌体获得裂解液，分离纯化裂解液，即可获得gE31-336蛋白；

所述重组表达载体由pPICZαB构建获得：设计引物扩增目的gE31-336蛋白区域的编码序列，并引入 XhoI和NotI酶切位点，利用XhoI和NotI酶切所扩增的产物与pPICZαB质粒，酶切后的片段由T4 DNA连接酶连接，得到含有编码gE31-336蛋白的多核苷酸序列的重组质粒；

培养过程采用甲醇诱导。