KR20100102114A - 인간 파필로마 바이러스의 주요 캡시드 단백질 ｌ1을 암호화하는 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

인간 파필로마 바이러스의 주요 캡시드 단백질 ｌ1을 암호화하는 유전자 및 이의 용도

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Abstract

본 발명은 효모 세포 내로의 형질전환 후, 효율적으로 인간 파필로마 바이러스의 주요 캡시드 단백질 L1을 발현할 수 있는, 인간 파필로마 바이러스의 주요 캡시드 단백질 L1을 암호화하는 코돈-최적화 유전자를 기술한다. 본 발명은 또한 본질적으로 효모 세포에서 인간 파필로마 바이러스의 주요 캡시드 단백질 L1을 암호화하는 상기 코돈-최적화 유전자의 발현에 의해 생산되는 면역원성 거대분자를 기술한다. 본 발명은 나아가 상기 면역원성 거대분자의 용도 및 상기 면역원성 거대분자를 포함하는 조성물을 기술한다.

Description

인간 파필로마 바이러스의 주요 캡시드 단백질 Ｌ1을 암호화하는 유전자 및 이의 용도{GENES ENCODING MAJOR CAPSID PROTEIN L1 OF HUMAN PAPILLOMA VIRUS AND USE OF THE SAME}
본 발명은 생물공학 분야, 구체적으로 인간 파필로마 바이러스의 주요 캡시드 단백질, 이를 암호화하는 유전자, 및 이의 제조방법 및 용도에 관한 것이다.
인간 파필로마 바이러스(HPV)는 파포바(papova) 바이러스 과의 폴리오마바이러스(polyomavirus) 아과에 속하는 비-외피보유(non-enveloped) 소 이중-가닥 원형 DNA이다. HPV는 인간들 사이의 친밀한 접촉을 통해 전파되어, 감염된 사람의 피부 위에 보통 사마귀(verruca vulgaris) 및 항문과 생식기 주위에 첨형 콘딜로마(condylomata acuminate)와 같은 병소를 유발할 수 있는데, 이는 성행위로 전파되는 질환으로 분류된다. 1995년에 국제암연구기구(International Agency for Research on Cancer)에 의해 공개된 조사 결과는 HPV가 자궁경부암의 원인과 밀접하게 관련되어 있음을 나타내었다. 따라서 HPV는 인간 건강에 심각하게 해로운 병원체가 될 수 있음이 명백하다. 그러므로, HPV 감염에 의해 야기되는 여성의 자궁경부암 및 성행위로 전파되는 질환의 예방을 위한 매우 효율적이고 저렴한 HPV 백신을 개발하는 것이 매우 중요하다.
현재 100개 이상의 HPV 아형들이 동정되었다. 자궁경부암 환자의 거의 100%는 민감 검출 방법을 이용하여 병리학적 조직 내 고-위험 HPV DNA의 존재에 대해 양성으로 검출될 수 있다. 여성 환자의 생식관에서 HPV 아형들과 악성종양 사이의 관계에서, HPV는 저-위험군 및 고-위험군으로 분류될 수 있다. 전형적으로 자궁경부 콘딜로마와 자궁경부 상피의 경미한 비정형 과다형성과 같은 양성 자궁경부 병소에서 발견되는 HPV6, 11, 34, 40 및 42 등은 저-위험 HPV 아형이고; 대부분의 자궁경부암뿐만 아니라 자궁경부 상피의 심각한 비정형 과다형성에서 발견되는 HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45는 고-위험 HPV 아형이다. 상이한 인간 집단에 대한 일련의 연구는 생식관에서 HPV 16 및 18 감염이 다른 위험 요인들보다 자궁경부암의 발병과 매우 밀접하게 관련되어 있음을 입증하였다. 자궁경부암 환자들 중에, 약 50 내지 60%의 사례는 HPV 16 감염에 의해, 약 14%는 HPV 18 감염에 의해, 약 8%는 HPV 45 감염에 의해, 약 5%는 HPV 31 감염에 의해 야기되고, 나머지 23%의 사례는 다른 HPV 아형들에 의해 야기된다.
HPV는 72개 캡시드 입자로 이루어진 정20면체 대칭 편향 캡시드를 갖는, 약 45 내지 55 nm 직경의 비-외피보유 및 구형 모양의 바이러스이다. 비리온 캡시드는 본질적으로 주요 캡시드 단백질(L1) 및 부 캡시드 단백질(L2)로 구성된다. 세포 내에서 발현된 후, 주요 캡시드 단백질 L1은 바이러스-유사 입자(VLPs)로 불리는 캡시드 입자로 자가-조립될 수 있다.
정상 여성은 그녀의 평생 동안 적어도 1개의 HPV 아형에 의한 자궁경부 감염에 대해 약 40%의 생애 축적 가능성을 갖는다. 따라서, 여성에게서 자궁경부암의 이환률 및 사망률을 낮추기 위해 자궁경부암에 대한 적당한 가격의 유리하게 보호적인 백신, 특히 HPV 16 및 HPV 18에 대한 백신을 개발하는 것은 매우 중요하다.
선행 기술에서 일부 백신이 HPV에 대해 개발되었다고 하더라도, 이들 백신은 일반적으로 HPV 단백질의 낮은 발현 효율, 발현된 단백질의 낮은 활성, 바이러스-유사 입자로 조립될 수 없는 단백질의 무능력 또는 바람직하지 않은 조립된 입자의 면역학적 효과의 문제점이 있다. 따라서, 개선된 HPV 백신 제품이 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 인간 파필로마 바이러스의 주요 캡시드 단백질 L1의 유전자, 이의 제조방법 및 용도를 제공하는 것을 포함한다.
본 발명의 제1 태양에서, 피치아 효모에 의해 선호되는 코돈을 갖는, 인간 파필로마 바이러스의 주요 캡시드 단백질 L1을 암호화하는 단리된 유전자가 제공된다.
다른 바람직한 실시형태에서, 상기 유전자는 서열번호: 10 또는 서열번호: 10의 위치 62 내지 568(즉, 인간 파필로마 바이러스의 주요 캡시드 단백질 L1 아형 18)에 개시된 아미노산 서열을 갖는 인간 파필로마 바이러스의 주요 캡시드 단백질 L1을 암호화한다. 더욱 바람직하게는, 상기 유전자는 서열번호: 1, 서열번호: 2 및 서열번호: 3에 개시된 것들로부터 선택된 염기 서열을 갖고; 또는 서열번호: 4, 서열번호: 5 및 서열번호: 6에 개시된 것들로부터 선택된 염기 서열을 갖는다.
다른 바람직한 실시형태에서, 상기 유전자는 서열번호: 11(즉, 인간 파필로마 바이러스의 주요 캡시드 단백질 L1 아형 16)에 개시된 인간 파필로마 바이러스의 주요 캡시드 단백질 L1을 암호화한다. 더욱 바람직하게는, 상기 유전자는 서열번호: 7, 서열번호: 8 및 서열번호: 9 에 개시된 것들로부터 선택된 염기 서열을 갖는다.
본 발명의 제2 태양에서, 상기 유전자의 서열을 포함하는 발현 벡터가 제공된다.
다른 바람직한 실시형태에서, 상기 발현 벡터는 피치아 효모 발현 벡터이다.
본 발명의 제3 태양에서, 상기 발현 벡터를 포함하거나 그의 게놈 내로 통합된 상기 유전자를 갖는 유전적으로 조작된 숙주 세포가 제공된다.
다른 바람직한 실시형태에서, 상기 세포는 피치아 효모 세포이다. 더욱 바람직하게는, 상기 피치아 효모는 피치아 효모 X-33, GS115, KM71 및 SMD1168 균주로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 상기 피치아 효모는 피치아 효모 X-33 균주이다.
본 발명의 제4 태양에서, 면역원성 거대분자(즉, 바이러스-유사 입자)가 제공된다. 직경 50-80 nm의 상기 거대분자는 피치아 효모에 의해 발현되는, 인간 파필로마 바이러스의 주요 캡시드 단백질 L1로부터 자가-조립된다.
다른 바람직한 실시형태에서, 상기 면역원성 거대분자는 하기 방법에 의해 제조된다:
(1) 숙주 세포를 배양하여 상기 숙주 세포 내에서 상기 인간 파필로마 바이러스의 주요 캡시드 단백질 L1이 발현되고 상기 면역원성 거대분자로 자가-조립되게 하는 단계; 및
(2) 상기 면역원성 거대분자를 분리하는 단계.
본 발명의 제5 태양에서, 하기 단계를 포함하는, 상기 면역원성 거대분자의 제조방법이 제공된다:
(1) 숙주 세포를 배양하여 상기 숙주 세포 내에서 상기 인간 파필로마 바이러스의 주요 캡시드 단백질 L1이 발현되고 상기 면역원성 거대분자로 자가-조립되게 하는 단계; 및
(2) 상기 면역원성 거대분자를 분리하는 단계.
다른 바람직한 실시형태에서, 상기에 기재된 바와 같은 단계 (2)는 하기를 포함한다:
(a) 단계 (1)에서 수득된 숙주 세포를 파괴하여 상기 면역원성 거대분자를 포함하는 상청액을 수득하는 단계; 및
(b) 단계 (a)에서 수득된 상청액을 포로스(POROS) 50 HS 칼럼 크로마토그래피 및 CHT 칼럼 크로마토그래피를 사용해 연속적으로 정제하여 상기 면역원성 거대분자를 수득하는 단계.
다른 바람직한 실시형태에서, 상기에 기재된 바와 같은 단계 (b)에서,
포로스 50HS 칼럼 크로마토그래피를 사용하는 정제는 하기와 같이 수행된다: 단계 (a)에서 수득된 상청액을 세척되고 평형화된 포로스 50HS 칼럼 위에 로우딩하여 상기 면역원성 거대분자를 칼럼에 결합시킨다. 헹구고 평형화시킨 후, 칼럼을 100% 완충액 A 내지 100% 완충액 B의 선형 구배로 용출하고, 70-100 ms/cm에서 크로마토그래피 피크를 수집한다. 이때, 상기 완충액 A는 50±20 mM MOPS, 0.75±0.3 M NaCl 및 0.05±0.02% 트윈-80(pH 6.5±1)을 포함하고, 상기 완충액 B는 50±20 mM MOPS, 1.5M NaCl 및 0.05±0.02% 트윈-80(pH 6.5±1)을 포함하고; 또는
CHT 칼럼 크로마토그래피를 사용하는 정제는 하기와 같이 수행된다: 포로스 50 HS 칼럼 크로마토그래피로부터 정제된 생성물을 세척되고 평형화된 CHT 칼럼 위에 로우딩한다. 헹구고 평형화시킨 후, 칼럼을 완충액 C 내지 100% 완충액 D의 선형 구배로 용출하고, 크로마토그래피 피크를 50-70 ms/cm에서 수집한다. 이때, 상기 완충액 C는 50±20 mM MOPS, 0.5±0.2 M NaCl, 0.04±0.02 M PB 및 0.05±0.02% 트윈-80(pH 6.5±1)을 포함하고, 상기 완충액 D는 0.5±0.2 M NaCl, 200 mM PB, 및 0.05±0.02% 트윈-80(pH 6.5±1)을 포함한다.
본 발명의 제6 태양에서, 하기를 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다:
(i) 유효량의 상기 면역원성 거대분자; 및
(ii) 약학적으로 허용가능한 담체.
다른 바람직한 실시형태에서, 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 적어도 1개의 면역자극제 또는 항원보강제를 포함한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 상기 항원보강제는 알루미늄 항원보강제이다.
다른 바람직한 실시형태에서, 상기 조성물은 백신이다.
본 발명의 제7 태양에서, 인간 파필로마 바이러스 감염과 관련된 질환의 예방 또는 치료에 있어 상기 면역원성 거대분자의 용도가 제공된다.
본 발명의 제8 태양에서, 유효량의 상기 면역원성 거대분자 또는 상기 면역원성 조성물을 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 인간 파필로마 바이러스 감염과 관련된 질환을 예방하거나 치료하는 방법이 제공된다.
다른 바람직한 실시형태에서, 인간 파필로마 바이러스 감염과 관련된 상기 질환은 악성종양(예컨대, 자궁경부암, 질암, 항문 및/또는 항문주위 암, 입인두암, 상악동암, 폐암) 또는 자궁경부 상피내종양으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 태양은 본 명세서를 고려하여 당해 분야의 숙련자에게 자명할 것이다.
집중적인 연구를 통해, 본 발명자들은 이후에 바이러스-유사 입자로 자가-조립되는 인간 파필로마 바이러스의 주요 캡시드 단백질 L1을 산업적 생산의 요구조건을 충족하는 발현량으로 효율적으로 발현할 수 있는, 인간 파필로마 바이러스의 주요 캡시드 단백질 L1을 암호화하는 코돈-최적화 유전자를 최초로 발표하였다. 본 발명은 또한 효모 세포 내에서 본질적으로 인간 파필로마 바이러스의 주요 캡시드 단백질 L1을 암호화하는 상기 코돈-최적화 유전자의 발현에 의해 생산된 면역원성 거대분자를 최초로 개시하였다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 상기 인간 파필로마 바이러스의 주요 캡시드 단백질 L1은, 생략하여, HPV L1 단백질로 언급되고; 상기 인간 파필로마 바이러스의 주요 캡시드 단백질 L1 아형 18은, 생략하여, HPV18 L1 단백질로 언급되고; 상기 인간 파필로마 바이러스의 주요 캡시드 단백질 L1 아형 16은, 생략하여, HPV16 L1 단백질로 언급된다. HPV L1 단백질에는 HPV18 L1 단백질 및 HPV16 L1 단백질, 또는 이들의 절단된 형태가 포함된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "면역원성 거대분자"라는 용어는 인간 파필로마 바이러스의 다수개의 단량체성 주요 캡시드 단백질 L1을 포함하는, 바람직하게는 인간 파필로마 바이러스의 다수개의 주요 캡시드 단백질 L1로부터 중합되거나 조립된 중합체 거대분자를 지칭하고; 상기 인간 파필로마 바이러스의 주요 캡시드 단백질 L1은 인간 파필로마 바이러스의 주요 캡시드 단백질 L1을 암호화하는 코돈-최적화 유전자에 의해 암호화되고 효모 세포(바람직하게는, 피치아 효모 세포)에서 발현된다. 상기 면역원성 거대분자의 모양은 구형이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "함께 작동적으로 연결된" 또는 "작동적으로 연결된"은 선형 DNA 서열의 소정 부분이 동일한 선형 DNA 서열의 다른 부분의 활성에 영향을 미칠 수 있는 상태를 일컫는다. 예를 들어, 만약 프로모터가 암호화 서열의 전사를 제어한다면, 이는 암호화 서열에 작동적으로 연결된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "포함하는", "갖는" 또는 "함유하는"(또는 이들의 문법적 변형들)이라는 어구는 "포함하는", "실질적으로 구성된...", "본질적으로 구성된..." 및 "구성된..."을 포함한다. "실질적으로 구성된...", "본질적으로 구성된..." 및 "구성된..."이라는 개념은 "포함하는", "갖는" 또는 "함유하는"의 하위 개념이다.
인간 파필로마 바이러스의 주요 캡시드 단백질 L1 을 암호화하는 유전자
효모 세포를 이용해 HPV L1 단백질을 발현하는 목적에 기초하여, 본 발명자들은, 반복적인 조사 후에, 효모 세포, 특히 피치아 효모 세포에서 효율적으로 발현되기에 적합한 HPV L1 단백질을 암호화하는 최적화 유전자를 발견하였다. 상기 최적화 유전자는 전장 또는 절단된 HPV18 L1 단백질을 암호화한다. 대안적으로, 상기 최적화 유전자는 전장 HPV16 L1 단백질을 암호화한다.
64개 유전적 코돈이 존재하더라도, 대부분의 유기체는 이들 코돈의 일부를 이용하는 경향이 있음이 당해 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 효모 세포의 유전자는 인간 유전자와는 상이한 코돈 선호도를 갖는다. 유전적 코돈의 축퇴성으로 인해, 각 아미노산은 야생형 유전자에서 상이한 사용 빈도를 갖는 동일한 아미노산에 대한 코돈을 가지면서, 1개 이상의 코돈에 의해 암호화될 수 있다. 효모 세포의 코돈 선호도는 재조합 단백질의 낮은 번역 효율 및 발현 수준의 결과를 가져올 수 있다.
본 발명에 따른 코돈 최적화는 본질적으로 하기와 같이 달성된다. 먼저, 유전자의 대응하는 아미노산 모두에 대한 코돈을 최적화하고 효모 세포에서의 발현에 작합한 신규한 세트의 HPV DNA 서열을 찾기 위해 최적화 유전자 서열에 반복적으로 유전자 발현 실험을 수행함으로써 HPV L1을 암호화하는 자연 발생적인 유전자에 대한 변경이 이루어진다. 전장 HPV 18 L1을 암호화하는 유전자는 Genbank 등재번호 AAP20601에 개시되고; 절단된 HPV 18 L1을 암호화하는 유전자는 Genbank 등재번호 AAQ92369에 개시되고; 전장 HPV 16 L1을 암호화하는 유전자는 Genbank 등재번호 AAC09292에 개시된다.
또한, 전사된 mRNAs 내 높은 GC 비율의 존재, 번역 효율에 대한 mRNA 이차 구조의 영향, 및 통상적인 제한 자리의 발생을 예방하기 위해, 본 발명은 일부 바람직한 코돈에 대한 변경, 예컨대, 아스파라긴(Asn)에 대한 코돈을 AAC에서 AAT로 변경하고; 라이신(Lys)에 대한 코돈을 AAG에서 AAA로 변경하고; 아스파르트산(Asp)에 대한 코돈을 GAT에서 GAC로 변경하고; 페닐알라닌(Phe)에 대한 코돈을 TTT에서 TTC로 변경하고; 티로신(Tyr)에 대한 코돈을 TAC에서 TAT로 변경하고; 글리신(Gly)에 대한 코돈을 GGT에서 GGA로 변경하여, 변경된, 신규한 HPV DNA 서열을 수득하였다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 상기 유전자는 서열번호: 10 또는 서열번호: 10의 위치 62 내지 568에 개시된 아미노산 서열을 갖는 인간 파필로마 바이러스의 주요 캡시드 단백질 L1(즉, HPV18 L1)을 암호화한다. 더욱 바람직하게는, 상기 유전자는 서열번호: 1, 서열번호: 2 및 서열번호: 3에 개시된 것들로부터 선택되는 염기 서열을 갖고; 또는 서열번호: 4, 서열번호: 5 및 서열번호: 6에 개시된 것들로부터 선택되는 염기 서열을 갖는다. 훨씬 더욱 바람직하게는, 상기 유전자는 서열번호: 1 또는 서열번호: 4에 개시된 염기 서열을 갖는다. 가장 바람직하게는, 상기 유전자는 서열번호: 1에 개시된 염기 서열을 갖는데, 이는 N-말단에서 61개 아미노산의 결실을 갖는 절단된 HPV 18 L1 단백질에 대응하는 절단된 HPV 18 L1에 대한 유전자이다. 이러한 절단된 유전자는 단백질의 활성을 변화시키지 않으면서 재조합 벡터 내에서 더욱 유리하게 발현된다.
본 발명의 다른 바람직한 실시형태에서, 상기 유전자는 서열번호: 11에 개시된 아미노산 서열을 갖는 인간 파필로마 바이러스의 주요 캡시드 단백질 L1(즉, HPV16 L1)을 암호화한다. 더욱 바람직하게는, 상기 유전자는 서열번호: 7, 서열번호: 8 및 서열번호: 9에 개시된 것들로부터 선택되는 염기 서열을 갖는다. 가장 바람직하게는, 상기 유전자는 서열번호: 7에 개시된 염기 서열을 갖는다.
본 발명에 의해 제공되는 코돈-최적화 유전자는 하기의 이점을 갖는다: 1) 이 최적화 유전자는 효모 숙주에서 표적 단백질을 효율적으로 발현하는데 더욱 적합하고 산업적 생산의 요구조건을 충족하며; 2) 저 비용, 고 수율 및 생성물의 더욱 균일하고 안정한 품질이 피치아 효모 발현 시스템의 사용에 의해 달성될 수 있다.
본 발명은 또한 HPV L1을 암호화하는 상기 유전자를 포함하는 벡터를 제공한다. 상기 벡터는 상기 HPV L1 단백질의 발현을 용이하게 하기 위해 상기 암호화 유전자의 서열에 작동적으로 연결되는 발현용 조절 서열(들)을 추가로 포함할 수 있다. 임의의 적합한 벡터, 특히 효모 세포에서 클로닝 및 발현에 사용되는 것들이 사용될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 발현 벡터는 현재 통상적으로 사용되는 효모 발현 벡터들, 예컨대 pPICZ, pPIC6, pGAPZ 및 pAO815로부터 선택된다. 이러한 발현 벡터는 상업적으로 이용가능하다.
또한, HPV L1을 암호화하는 상기 유전자를 포함하는 재조합 세포가 또한 본 발명에 포함된다. 상기 재조합 세포는 효모 세포, 특히 피치아 효모 세포이다. 더욱 바람직하게는, 상기 피치아 효모 세포는 피치아 효모 X-33, GS115, KM71 및 SMD1168 균주로부터 선택된다. 이들 효모 세포 균주는 상업적으로 이용가능하다. 효모 세포 내에 외인성 유전자를 도입하는 방법, 예를 들어, 전기형질전환 또는 원형질체 형질전환이 당해 분야에 공지되어 있다.
HPV L1을 생산하는 방법이 또한 본 발명에 포함된다. 상기 방법은 상기 암호화 유전자를 포함하는 상기 재조합 세포를 배양하는 것을 포함한다. 상기 방법은 세포가 암호화된 HPV L1 단백질을 발현하게 하는 것을 포함할 수 있고, 발현된 단백질을 분리하고/하거나 정제하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기와 같이 수득된 HPV L1 단백질은 예를 들어, SDS-PAGE 전기영동에서 단일 결합을 나타내는, 본질적 동질성(essential)으로 정제될 수 있다.
본 발명에 따라 효모 세포에서 발현된 HPV L1 단백질은 생체 내에서 면역반응, 특히 체액성 면역반응을 유발할 수 있는 면역원성 거대분자를 제조하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 실시형태로서, 본 발명자들은 최적화를 통해, 피치아 효모에서 HPV L1 단백질을 발현하는데 적합한 수개의 유전자 서열을 고안하고, 이들을 전장 HPV L1 유전자 또는 그의 절단된 형태의 전체 합성에 사용하였다. 유전자 또는 그의 절단된 형태를 현존하는 피치아 효모 발현 벡터 내로 클로닝하고, 이어서 이를 동종 재조합 및 고농도의 항생제를 이용한 스크리닝을 통해 재조합 피치아 효모 발현 균주를 제작하는데 사용하였다. 재조합 피치아 효모를 발효적으로 배양한 후, 동시에 세포 내에서 바이러스-유사 입자(VLPs)로 자가-조립될 수 있는, HPV L1 단백질이 세포 내에서 고도로 발현하도록 메탄올로 유도하였다. 파괴된 세포로부터 수득된 상청액의 크로마토그래피에 의해 정제된 바이러스-유사 입자를 90% 초과의 순도를 갖고 알루미늄 항원보강제에 흡착되는 경우 고도로 면역원성을 띠어, 이를 자궁경부암에 대한 인간 백신으로 사용하는 것이 가능하다.
단백질 발현 및 정제
HPV L1 단백질은 HPV L1을 암호화하는 상기 유전자를 포함하는 상기 재조합 세포를 배양함으로써 효율적으로 발현될 수 있고, 발현된 단백질은 동시에 면역원성 거대분자로 자가-조립되는 것이 허용된다. 발현 및 정제 방법은 하기를 포함한다: (1) 상기 재조합 세포를 배양하여 상기 인간 파필로마 바이러스의 주요 캡시드 단백질 L1이 재조합 세포 내에서 발현되고 동시에 면역원성 분자로 자가-조립되게 하는 단계; (2) 단계 (1)에서 수득된 세포를 파괴하여 면역원성 분자를 포함하는 상청액을 수득하는 단계; 및 (3) 포로스(POROS) 50 HS 칼럼 크로마토그래피 및 CHT 칼럼 크로마토그래피를 사용해 단계 (2)로부터 수득된 상청액을 연속적으로 정제하여 상기 면역원성 거대분자를 수득하는 단계.
바람직하게는, 세포 배양 및 단백질 발현은 하기와 같이 수행된다. 본 발명에 따른 유전적으로 조작된 효모를 활성화 배지(YPD 또는 LB 또는 SOC)에 접종하고 25 내지 37℃에서 밤새 배양하였다. 이어서 활성화 유체를 종자 배양 배지(YPD 또는 LB 또는 SOC)에 접종하고 25 내지 37℃에서 밤새 배양하였다. 발효를 20 내지 37℃의 온도 및 3 내지 8의 초기 pH에서 미량의 염(PTM1, PTM2, PTM3)이 첨가된 기본 염 배지(BSM1 또는 BSM2 또는 BSM3)를 사용해 수행한다. 약 15 내지 30시간의 초기 증식기 후, 용존 산소 값을 교반 속도, 기류 및 탱크 압력을 조절하여 20 내지 80%로 유지한다. 탄소원이 완전히 소모되면, 효모의 습식 중량은 약 50 내지 150 g/L에 이를 것이다. 이와 동시에, 글리세롤 또는 글루코스 용액을 보충하고 용존 산소 값을 20 내지 80%로 유지한다. 보충 기간 후, 효모의 습식 중량은 약 50 내지 500 g/L에 이를 것이고, 이때 보충을 중단하고 pH 값을 pH 3 내지 8로 유지하면서 메탄올을 첨가하여 유도한다. 용존 산소 값은 20 내지 80%보다 높게 유지하고, 온도는 20 내지 37℃로 유지하고, pH 값은 pH 3 내지 8로 유지한다. 시료를 2 내지 10시간의 간격으로 취하고 웨스턴 블롯 검출에 적용한다. 발효를 5 내지 60시간의 유도 후 중단하고, 발효 배양액(broth)를 배출시킨다. 발효 배양액을 냉장 원심분리기를 사용해 원심분리한 후, 세포를 수집하고 -20℃에서 보관한다. 유도적으로 발현된 HPV L1 단백질은 피치아 효모 세포 내부에서 바이러스-유사 입자(HPV L1 VLPs)로 자가-조립될 수 있다.
상기 HPV L1 단백질은 피치아 효모 세포 내부에서 발현되므로, 세포 파괴 및 단백질 정제를 수행하여 더 순수한 단백질을 수득한 후 이어서 바이러스-유사 입자로의 자가-조립을 허용할 수 있다. 정제는 일반적으로 하기와 같이 수행된다. 세포를 세척하여 부착된 배지 성분들(염, 색소 등)을 제거함으로써 이후의 정제에 대한 이들의 영향을 감소시킨다. 세척된 세포를 소정 농도로 염 및 계면활성제 성분을 포함하는 적합한 세포 파괴 완충액 내에 혼합한다. 사용될 수 있는 염 성분은 예를 들어, 약 0.4 내지 0.8 mol/l 범위의 농도로 NaCl 및 KCl이다. 사용될 수 있는 계면활성제 성분은 예를 들어, 약 0.005 내지 0.05 %(w/v) 범위의 농도로 트윈-80, 트윈-20 및 트리톤-X 100이다. 사용될 수 있는 완충액 시스템은, 예를 들어 약 0.02 내지 0.2 mol/l 범위의 농도로 인산염 완충액, 트리스 완충액, MOPS 완충액, 및 HEPES 완충액이다. 혼합된 세포를, 예를 들어 2 내지 4 파괴 주기에서 90% 초과의 파괴율을 달성하는, 약 800 내지 2000 bars의 압력 범위로 작동하는 고압 균질기, 또는 1 내지 2 파괴 주기에서 80% 초과의 파괴율을 달성하는, 약 70 내지 90%의 양으로 로우딩된 0.2 내지 0.4 mm 범위의 직경을 갖는 비드 밀 균질기를 사용해 파괴할 수 있다. 파괴된 세포를 포함하는 용액을 상청액 및 침전물을 분리하기 위해 20 내지 60분간 6,000 내지 10,000 rpm(SORVALL, HITACHI 등)의 고속 원심분리, 또는 0.45 내지 0.65 ㎛ 막 모듈(MiL1ipore, PAL1 등)을 사용한 접선 유동 미세여과(tangential flow microfiltration)에 적용하여, 추가의 정제를 위한 상청액을 수득한다. 수득된 상청액은 추가의 정제를 수행하기 전에 DNA, RNA 및 불순물 단백질과 같은, 상청액 내 불순물의 일부를 제거하기 위해 예컨대 Q 세파로스 패스트 플로우(Q Sepharose Flast Flow, GE) 또는 DEAE 세파로스 패스트 플로우(GE)와 같은 음이온 교환 크로마토그래피에 적용될 수 있다. 대안적으로, 수득된 상청액은 추가의 정제를 수행하기 위해 직접적으로 사용될 수 있다. 추가의 정체를 위해, 상청액 시료를 SP 세파로스 FF, 헤파린 세파로스CL-6B(GE), 포로스 50HS(Merck) 및 프락토겔(Fractogel＠) EMD TMAE-650(Merck)와 같은 HPV L1 VLPs-흡착가능 크로마토그래피 매질 위에 로우딩하여 HPV L1 VLPs 단백질이 크로마토그래피 매질에 효율적으로 결합하게 한다. 이어서 매질을 염 농도 구배(예컨대, 0.5 내지 1.0 M NaCl 또는 KCl 완충액 용액)를 이용해 세척하여 HPV L1 VLPs 단백질로부터 불순물을 분리한다. 그 후에, 고 농도 염-함유 완충액 용액(예컨대, 1.0 내지 2.0 M NaCl 또는 KCl 완충액 용액)을 사용하여 결합된 HPV L1 VLPs 단백질을 용출하고, 용출된 예비적으로-정제된 HPV L1 VLPs 단백질을 수집한다. 이렇게 수득된 예비적으로-정제된 HPV L1 VLPs 단백질을 HPV L1 VLPs 단백질이 소정 범위의 염 농도(예컨대, 0.3 내지 1.5 M NaCl 또는 KCl 완충액 용액)의 조건 하에서 효율적으로 결합할 수 있는 CHT(BIO-RAD 타입 II)와 같은 미세 정제용 크로마토그래피 매질 위에 로우딩한다. 이어서 매질을 인산염 농도 구배(예컨대, 20 내지 400 mM 범위의 인산염 농도)를 이용해 용출하여 HPV L1 VLPs로부터 불순물을 분리한다. 대안적으로, 예비적으로-정제된 HPV L1 VLPs 단백질은 또한 예컨대 세파크릴(Sephacryl) S-1000(GE) 및 HW-75(TSK)와 같은 미세 정제용 크로마토그래피 매질 위에 로우딩하여 겔 크로마투그래피를 통해 HPV L1 VLPs 단백질로부터 불순물의 분리를 달성할 수 있다. 미세 정제 후 용출된 HPV L1 VLPs 단백질을 최종 정제된 시료로 수집한다.
본 발명에 따른 정제 방법은 대부분의 오염된 생체분자(DNAs, 지질 및 단백질 포함)를 제거할 수 있다. 환원 SDS-PAGE 전기영동 또는 모세관 전기영동(Beckman Coulter)을 사용한 검출은 포로스 50HS 크로마토그래피 매질을 사용한 정제에 의해 수득된 시료는 75% 내지 80%의 순도를 갖고, 하이드록시아파타이트 매질을 사용해 정제된 최종 HPV L1 VLPs 단백질 시료는 90% 내지 95%의 순도를 가짐을 나타내었다. 웨스턴 블롯(Bio-RAD) 검출은 표적 단백질 밴드와 HPV L1 VLPs에 대한 단일클론 또는 다중클론 항체 사이의 특이적 염색 반응을 나타내었다. 동적 광 산란 검출(Malvern Instruments Zetasizer　Nano　ZS)은 정제된 시료가 약 50 내지 80 nm 크기 범위의 입자를 가짐을 나타내고, 투과 전자 현미경(Philips) 관찰은 시료 내 바이러스-유사 입자(VLPs)가 약 50 내지 80 nm 범위의 입자 크기를 가짐을 나타내었다. 본 실험에서, 사용된 하이드록시아파타이트 매질은 가장 바람직하게는 20 내지 50 nm 범위의 입자 크기 및 약 800Å 기공 크기를 갖는 세라믹 하이드록시아파타이트 매질 충전제이다. 크로마토그래피에 사용된 완충액은 6 내지 9 범위의 pH를 갖고, 바람직한 완충 시스템은 50 mM MOPS이다.
선행 기술과 비교하여, 본 발명은 선택적으로 HPV 18 L1에 대한 유전자(전장 유전자, 또는 바람직하게는 N-말단에서 61개 아미노산의 절단을 갖는 HPV 18 L1 단백질에 대응하는 절단된 유전자)를 고안하고 다른 발현 시스템(예컨대, 포유동물 세포, 베큘로바이러스, 사카로마이세스 세레비지에)과 비교하여 HPV 18 L1 단백질의 현저하게 증가된 발현이 달성되도록 피치아 효모 내로 클로닝하였다. 발현 이후에, 정제를 통해 수득된 바이러스-유사 입자를 야생형 HPV 입자와 유사하게, 50 - 80 nm 크기인 것으로 전자 현미경에 의해 관찰되었다. 재조합 HPV 18 L1 단백질로부터 조립된 바이러스-유사 입자를 알루미늄 항원보강제에 흡착시키고 면역 마우스에 사용하여, 고 역가의 항-HPV 18 L1 항체를 생성하였다. 슈도타입 바이러스를 사용한 중화 실험은 항체가 매우 우수한 중화 활성을 가짐(즉, 세포 내로의 슈도타입 바이러스의 진입을 억제할 수 있음)을 나타내었다. 또한, 본 발명에 따라 HPV 16 L1에 대해 선택적으로 고안된 유전자는, 피치아 효모 내로 클로닝된 후, HPV 16 L1 단백질의 매우 높은 수준의 발현 결과를 가져온다.
면역원성 거대분자
본 발명은 또한 인간 파필로마 바이러스의 주요 캡시드 단백질 L1로부터 본질적으로 자가-조립된 다중-분자(poly-molecular) 중합체이고, 상기 인간 파필로마 바이러스의 주요 캡시드 단백질 L1이 피치아 효모에 의해 발현되는, 50 내지 80 nm의 직경을 갖는 면역원성 거대분자를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 면역원성 거대분자는 하기 방법에 의해 제조된다: (1) 상기 재조합 세포를 배양하여 상기 인간 파필로마 바이러스의 주요 캡시드 단백질 L1이 발현되고 동시에 재조합 세포 내에서 면역원성 분자로 자가-조립되게 하는 단계; (2) 단계 (1)로부터 수득된 세포를 파괴하여 면역원성 분자를 포함하는 상청액을 수득하는 단계; 및 (3) 포로스 50 HS 칼럼 크로마토그래피 및 CHT 칼럼 크로마토그래피를 사용해 단계 (2)로부터 수득된 상청액을 연속적으로 정제하여 상기 면역원성 거대분자를 수득하는 단계.
본 발명은 또한 인간 파필로마 바이러스(HPV) 감염과 관련된 질환의 예방 또는 치료를 위한 조성물의 제조에 있어 상기 면역원성 거대분자의 용도를 제공한다. 상기 질환은 악성종양(예컨대, 자궁경부암, 질암, 항문 또는 항문주위 암, 입인두암, 상악동암, 폐암) 및 자궁경부 상피내종양으로부터 선택되지만, 이로 한정되는 것은 아니다.
조성물
본 발명은 또한 본 발명에 따른 유효량의 상기 면역원성 거대분자 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 면역원성 조성물(예컨대, 예방적 또는 치료적 백신)을 제공한다.
본 발명은 또한 상기에 기술된 방법을 이용하여 재조합 인간 파필로마 바이러스 단백질 L1의 바이러스-유사 입자를 제조한 후, 약학적으로 허용가능한 백신 항원보강제를 첨가하는 것을 포함하는, 인간 파필로마 바이러스에 대한 백신을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 백신 항원보강제는 알루미늄 항원보강제 또는 다른 항원보강제일 수 있다. 정제된 인간 파필로마 바이러스 단백질(HPV L1)로부터 형성된 바이러스-유사 입자는, 항원보강제에 흡착되는 경우, 백신으로 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용가능한" 성분이라는 용어는 과도한 유해 부작용(예컨대, 독성)을 유발하지 않으면서, 합리적인 유익/유해 비율에 잘 맞는 인간 및/또는 포유동물 대상에 사용하기에 적합한 물질을 일컫는다. "약학적으로 허용가능한 담체"라는 용어는 다양한 부형제 및 희석제를 비롯한, 치료제의 투여를 위한 담체를 일컫는다. 이 용어는 그 자체가 본질적인 활성 성분은 아니고 투여 후 과도한 독성을 나타내지 않는 것과 같은 그러한 치료제용 담체를 일컫는다. 적합한 담체는 당해 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 약학적으로 허용가능한 담체의 상세한 설명은 문헌[Reminton's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub. Co., N.J. 1991)]에서 확인할 수 있다. 조성물용 약학적으로 허용가능한 담체는 액체, 예컨대 물, 식염수, 글리세롤 및 소르비톨을 포함할 수 있다. 또한, 이들 담체는 예를 들어 윤활제, 활택제, 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질 및 안정화제(예, 알부민) 등과 같은 보조제를 포함할 수 있다.
상기 조성물은 이로 한정되는 것은 아니지만, 주사, 캡슐, 정제, 유제, 및 좌약을 포함하는, 포유동물에 투여하기에 적합한 다양한 투약 형태로 제형화될 수 있다.
동물 실험은 본 발명에 따른 면역원성 거대분자를 사용하여 제조된 백신을 이용한 동물의 면역접종이 동물에서 강력한 면역반응을 유도함을 나타내었다.
사용이 의도되는 경우, 본 발명에 따른 면역원성 거대분자는 안전하고 유효한 양으로 포유동물 대상(예컨대, 인간 대상)에 투여되는데, 상기 안전하고 유효한 양은 전형적으로 적어도 약 1 ㎍/kg 체중이고 대부분의 사례에서 약 10 mg/kg 체중 이하, 바람직하게는 약 1 ㎍/kg 체중 내지 약 1 mg/kg 체중의 범위이다. 물론, 투여되는 특정 용량은, 진료 의사의 기술 내에 속하는, 투여 경로, 환자의 일반 건강 등과 같은 고려사항들에 좌우된다.
본 발명은 또한 인간 파필로마 바이러스(HPV) 감염과 관련된 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
도 1은 pPICZ-18L1 벡터 제작의 도식적인 묘사이다.
도 2는 HPV 18L1 유전자의 PCR 증폭 도해이다.
도 3은 pPICZ-18L1 벡터의 식별 도해로, 레인 1은 BstBI- 및 KpnI-분해된 pPICZαB를 나타내고; 레인 2는 BstBI- 및 KpnI-분해된 pPICZ-18L1을 나타낸다.
도 4는 HPV 18 L1 발현의 웨스턴 블롯 식별 도해로, 여기서 M은 레인보우 마커(퍼멘타스 코포레이션 엘티디(Fermentas Co., Ltd))를 나타내고; 1은 발현의 양성 대조군을 나타내고; 2는 발현의 음성 대조군을 나타내고; 3은 HPV18L1을 발현하는 균주를 나타낸다. 화살표는 발현된 HPV 18 L1을 나타낸다.
도 5는 절단된 HPV 18L1의 유전자의 PCR 증폭 도해이다.
도 6은 pPICZ-18L1'벡터의 식별 도해로, 여기서 레인 1은 BstBI- 및 KpnI-분해된 pPICZαB를 나타내고, 레인 2는 BstBI- 및 KpnI-분해된 pPICZ-18L1'을 나타낸다.
도 7은 절단된 HPV 18 L1 발현의 웨스턴 블롯 식별 도해로, 여기서 M은 레인보우 마커(퍼멘타스 코포레이션 엘티디)를 나타내고; 1은 발현의 양성 대조군을 나타내고; 2는 절단된 HPV18L1을 발현하는 균주를 나타내고; 3은 발현의 음성 대조군으로 나타낸다. 화살표는 발현된 절단된 HPV 18 L1을 나타낸다.
도 8은 HPV 18 L1의 크로마로그래피로 정제된 시료의 환원된 SDS-PAGE 전기영동도로, 여기서 1은 포로스 50HS의 수집된 피크 1을 나타내고; 2는 포로스 50HS의 수집된 피크 2를 나타내고; 3은 포로스 50HS의 수집된 피크 3을 나타내고; 4는 CHT의 수집된 피크 1을 나타내고; 5는 CHT 피크 1의 농축된 시료를 나타내고; 6은 양성 대조군을 나타낸다.
도 9는 HPV 18 L1의 정제된 생성물의 면역블롯팅을 나타내고, 여기서 일차 항체는 피츠제랄드 코포레이션(Fitzgerald Corp.)으로부터 입수가능한 1:5000 희석배수의 항-HPV-18 L1 항체이고; 이차 항체는 1:250 희석배수의 염소-마우스 항체이고; 1은 양성 대조군을 나타내고; 2 및 3 모두 정제된 HPV 18 L1 단백질을 나타낸다.
도 10은 HPV 18 L1 VLPs의 정제된 시료의 투과 전자 현미경(×105000) 사진이다.
도 11a는 HPV 18 슈도타입(pseudotype) 바이러스에 의한 293FT 세포의 감염을 나타내는 도해이다.
도 11b는 생쥐 혈청에 의한 HPV 18 슈도타입 바이러스의 중화를 나타내는 도해이다.
도 12는 pPICZ-16 L1 벡터 제작의 도식적인 묘사이다.
도 13은 HPV 16 L1 유전자의 PCR 증폭 도해이다.
도 14는 pPICZ-16 L1 벡터의 식별 도해로, 여기서 레인 1은 BstBI- 및 KpnI-분해된 pPICZαB를 나타내고; 레인 2는 BstBI- 및 KpnI-분해된 pPICZ-16L1을 나타낸다.
도 15는 HPV 16 L1 발현의 웨스턴 블롯 식별의 도해로, 여기서 M은 레인보우 마커(퍼멘타스 코포레이션 엘티디)를 나타내고; 1은 발현의 양성 대조군을 나타내고; 2는 HPV 16 L1을 발현하는 균주를 나타내고; 3은 발현의 음성 대조군으로 나타낸다. 화살표는 발현된 HPV 16 L1을 나타낸다.
도 16은 HPV 16 L1의 크로마토그래피로 정제된 시료의 환원 SDS-PAGE 전기영동도로, 여기서 1은 포로스 50HS의 수집된 피크 시료를 나타내고; 2는 CHT 플로우쓰루(flowthrough) 1을 나타내고; 3은 CHT 플로우쓰루 2를 나타내고; 4는 HPV 16 L1 양성 대조군을 나타내고; 5는 CHT 용출 피크 1을 나타내고; 6은 CHT 용출 피크 2를 나타내고; 7은 CHT 용출 피크 4를 나타내고; 8은 CHT 용출 피크 8을 나타내고; 9는 CHT 용출 피크 12를 나타낸다.
도 17은 모세관 전기영동에 의해 결정되는 바와 같은 HPV 16 L1의 순도를 나타낸다.
도 18은 HPV 16 L1 VLPs의 정제된 시료의 투과 전자 현미경 사진(×105000)이다.
도 19a는 HPV 16 L1 슈도타입 바이러스에 의한 293FT 세포의 감염을 나타내는 도해이다.
도 19b는 생쥐 혈청에 의한 HPV 16 L1 슈도타입 바이러스의 중화를 나타내는 도해이다.
본 발명은 본 발명의 범주를 제한하기보다는 본 발명의 예시로 이해되어야 하는 하기 특정 실시예와 관련하여 추가로 기술된다. 특정한 조건이 명시되지 않은 하기 실시예에서 실험 과정은 일반적으로 문헌[Sambrook et. al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]에 기술된 것과 같은 조건, 또는 제조사에 의해 추천된 조건을 따른다. 달리 지시되지 않는 한, 백분율 및 부는 중량 기준이다.
본 발명의 실시예에서, 스트라타젠 코포레이션 엘티디(Stratagene Co., Ltd)로부터 구매한 열 활성화 Pfu 효소를 DNA 신장 및 PCR 증폭에 사용하였다.
본 발명의 실시예에서, pUC18 플라스미드는 제너레이 바이오테크(Generay Biotech, 상하이) 코포레이션 엘티디(중국, 상하이)로부터 구매하였고, pPICZαB 플라스미드는 인비트로젠 코포레이션(인비트로젠 코포레이션)으로부터 구매하였다.
본 발명의 실시예에서, HPV18 L1 및 HPV16 L1 단백질에 대한 토끼 다중클론 항체를 상하이 프라임진 바이오테크, 엘티디(Shanghai PrimeGene Bio-tech, LTD, 중국 상하이)에 의뢰하여 제조하였고, MAB885 생쥐 단일클론 항체를 케미콘 코포레이션 엘티디(CHEMICON Co., Ltd)로부터 구매하였고, HRP 표지 양 항-마우스 IgG를 베잉 딩구오 창쉥 바이오테크놀러지 코포레이션 엘티드(Being Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd, 중국 베이징)로부터 구매하였다.
본 발명의 실시예에서, BALB/c 마우스는 상하이 에스엘에이씨 레보러토리 에니멀 코포레이션 엘티디(Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd., 중국 상하이)로부터 구매하였다.
본 발명의 실시예에서, 정제 단계에 사용된 세척 완충액은: 100 mM PB, 0.15 M NaCl, pH 7.0을 포함하고; 세포 파괴에 사용된 완충액은: 200 mM MOPS, 0.4 M NaCl, 0.05% 트윈-80, pH 7.0을 포함한다;
완충액 E: 50 mM MOPS, 0.5 M NaCl, 0.05% 트윈-80, pH 6.5;
완충액 F: 50 mM MOPS, 1.5 M NaCl, 0.05% 트윈-80, pH 6.5;
완충액 G: 50 mM MOPS, 0.6M NaCl, 0.05 M PB, 0.05% 트윈-80, pH 6.5;
완충액 H: 0.6M NaCl, 200 mM PB, 0.05% 트윈-80, pH 6.5.
실시예 1: HPV 18 L1 에 대한 코돈-최적화 유전자의 고안 및 합성
1.1. HPV 18 L1에 대한 코돈-최적화 유전자의 고안
본 발명은 피치아 효모에 의해 선호되는 코돈으로 코돈-최적화된, 인간 파필로마 바이러스의 주요 캡시드 단백질 L1 아형 18(HPV18)을 암호화하는 DNA 분자에 관한 것이다. 각각 서열번호: 4, 5 및 6에 개시된 3개 DNA 서열들을 하기에 기술된 바와 같은, 코돈의 최적화 및 최적화 코돈의 변경을 통해 수득하였다.
먼저, 반복적인 실험을 통해, 유전자의 모든 대응하는 아미노산에 대한 코돈을 최적화하여 HPV 18L1을 암호화하는 자연-발생적인 유전자에 변형을 가하여 신규한 HPV DNA 서열, 즉, 서열번호: 4를 고안하였다.
이어서, 전사된 mRNAs 내 높은 GC 비율의 존재, 번역 효율에 대한 mRNA 이차 구조의 영향, 및 통상적인 제한 자리의 발생을 방지하기 위해, 최적화된 코돈에 대해 변경을 가하여, 예컨대, 아스파라긴(Asn)에 대한 코돈을 AAC에서 AAT로 변경하고, 라이신(Lys)에 대한 코돈을 AAG에서 AAA로 변경하고, 아스파르트산(Asp)에 대한 코돈을 GAT에서 GAC로 변경하고, 페닐알라닌(Phe)에 대한 코돈을 TTT에서 TTC로 변경하고, 티로신(Tyr)에 대한 코돈을 TAC 내지 TAT로 변경하고, 글리신(Gly)에 대한 코돈을 GGT에서 GGA로 변경하여, 2개의 변경된, 신규한 HPV DNA 서열: 아스파라긴(Asn), 라이신(Lys) 및 아스파르트산(Asp)에 대한 코돈의 변경을 통해 서열번호: 4로부터 변경된 서열번호: 5; 및 페닐알라닌(Phe), 티로신(Tyr) 및 글리신(Gly)에 대한 코돈의 변경을 통해 서열번호: 4로부터 변경된 서열번호: 6을 수득하였다.
1.2. HPV 18 L1에 대한 코돈-최적화 유전자의 합성
서열번호: 4에 개시된 바와 같은 HPV 18 L1에 대한 코돈-최적화 유전자를 합성하여 하기 서열을 갖는 시발체 a1 및 a2를 사용하는 PCR 증폭을 수행하기 위한 주형으로 사용하였다:
a1: 5'-ATAGAATTCAAGATGTGTTTGTACACTAGAGTTT-3'(서열번호: 12);
a2: 5'-AATGGTACCCTATTACTTTCTAGCTCTAACT-3'(서열번호: 13).
수득된 PCR 생성물을 아가로스 겔 전기영동으로 분리하고 겔로부터 표적 서열을 회수하여, 약 1.7 kb 크기의 절편을 수득하였다. 이 절편의 서열을 분석하여 서열번호: 4에 나타난 바와 같은 서열분석 결과를 얻었고, 이 결과로부터 이 절편이 HPV 18L1에 대한 전장 코돈-최적화 유전자임을 입증하였다. 그렇게 수득된 HPV 18L1에 대한 유전자를, 그의 말단에 위치한 EcoRI 및 KpnI 제한 자리에 의해, pUC18 플라스미드(제너레이 바이오테크(상하이) 코포레이션 엘티디(중국 상하이)로부터 입수가능) 내로 연결하였다. 결과로서 생기는 구조물이 올바른지 서열분석으로 확인한 후, pUC-18L1로 명명하였다.
서열번호: 5 및 6에 나타난 바와 같은 HPV 18L1에 대한 코돈-최적화 유전자를 상기에 언급된 것과 유사한 과정으로 수득하였다.
최적화 서열의 실행 가능성을 입증하기 위해, 이 실시예 1에서 수득된 HPV 16L1에 대한 코돈-최적화 유전자의 하나(서열번호: 4)를 실시예 2에 기술된 바와 같이, 그의 발현을 평가하기 위해 발현 플라스미드를 제작하는데 예시적으로 사용하였다.
실시예 2: HPV 18 L1 유전자에 대한 발현 벡터의 제작
서열번호: 4의 최적화 서열을 도 1에 도시되고 하기 단계들에 기술된 바와 같이, 피치아 효모 발현 벡터 내로 클로닝하였다.
2.1. HPV 18L1 유전자를 증폭하는데 요구되는, 하기 서열을 갖는 정방향 및 역방향 시발체들을 합성하였다:
정방향 시발체: 5'-TCCCAATCTTCGAAACGATGTGTTTGTACACTAGAGTTT-3'(서열번호: 14);
역방향 시발체: 5'-AATGGTACCCTATTACTTTCTAGCTCTAACT-3'(서열번호: 13);
정방향 시발체는 BstBI 제한 자리를 포함하는 반면, 역방향 시발체는 종결 코돈 측면에 KpnI 제한 자리를 포함하며, 상기 제한 자리는 각각 상기 시발체 서열의 밑줄 친 부분에 나타나 있다.
2.2. PCR 증폭을 상기 시발체 및 주형으로 실시예 1에서 수득된 pUC-18L1을 사용해 수행하였다. 증폭된 생성물을 전기영동으로 검출하여, 그 결과를 도 2에 나타내었고, 이는 HPV 18L1에 대한 전장 코돈-최적화 유전자가 수득되었음을 입증하였다. PCR 증폭된 절편을 BstBI 및 KpnI(제한 엔도뉴클리아제)로 분해한 후 BstBI 및 KpnI로 분해된 pPICZαB(인비트로젠 코포레이션)에 연결하였다. 이어서, 연결된 구조물을 사용하여 E. coli Top10 균주(제너레이 바이오테크(상하이) 코포레이션 엘티디(중국 상하이)로부터 입수가능함)의 적격 세포를 형질전환시키고, 형질전환된 세포를 25 ㎍/ml의 제오신을 함유하는 LB 한천 위에 도말하였다.
형질전환된 세포는 제오신-내성 유전자를 수반하는 pPICZαB 벡터와 같이 제오신 함유 LB 배지에서 성장할 수 있었다. 형질전환된 세포의 단일 콜로니를 분리하여 플라스미드 DNA를 제조하였다. HPV 18L1 유전자 및 벡터 서열을 제한 지도화(restriction mapping)(도 3 참고) 및 염기 서열 분석을 통해 검출하여 pPICZ-18L1로 명명된, HPV 18L1 유전자를 포함하는 올바른 구조물을 확인하였다. 분비 신호(a-인자 신호)가 제작된 플라스미드로부터 절단되기 때문에, HPV 18L1 단백질은 세포 내에서 발현된 단백질이어야 한다.
실시예 3: HPV 18 L1 유전자-발현 균주의 제작 및 발현
3.1. HPV 18L1 유전자-발현 균주의 제작
pPICZ-18L1 플라스미드를 제한 엔도뉴클리아제 효소 SacI으로 선형화시키고, 빈 플라스미드 pPICZαB를 이와 유사하게 SacI로 분해하여 음성 대조군으로 제공하였다. 효소 분해 용액에 무수 에탄올을 첨가하여 DNA 침전물을 수득하였다. 선형화된 pPICZ-18L1 절편을 소량의 이중-증류수에 용해시키고 하기 조건 하에서 전기천공에 의해 피치아 효모 균주 X-33(인비트로젠 코포레이션)를 형질전환시켰다: DNA 절편, 5 ㎍; 전압, 1,500 볼트; 저항, 25 옴; 전기천공 시간, 5 밀리초. 전기천공된 세포를 200 ㎍/ml 제오신을 함유하는 YPDS 한천 위에 도말하였다. pPICZαB 벡터는 제오신-내성 유전자를 수반하기 때문에, 형질전환된 세포는 제오신 함유 YPDS 배지 위에서 성장할 수 있었다. 형질전환된 세포의 단일 콜로니를 분리하여, HPV 18L1 유전자-발현 피치아 효모 균주를 수득하였다.
3.2. HPV 18L1 유전자-발현 피치아 효모 균주의 발현
수득된 HPV 18L1 유전자-발현 피치아 효모 균주를 1,000 ㎍/ml 또는 1,500 ㎍/ml 제오신을 함유하는 내성 플레이트 위에 도말하였다. 고농도의 내성을 갖는 플레이트로부터 수득된 클론을 개별적으로 4 mL의 YPD 액체 배양 배지에서 24시간 동안 배양한 후 이어서 48시간 동안 BMMY 배양 배지에서 유전자 발현을 유도하였다. 이어서 세포를 원심분리에 의해 회수하고 세포의 일부를 파괴하여 웨스턴 블롯팅 동정을 수행하기 위한 상청액을 수득하였다. 동정 결과를 도 4에 나타내었고, 이는 상청액 내 HPV 18L1 단백질의 존재를 나타낸다.
서열번호: 4 서열이 본 발명의 실시예 2 및 3에서 클로닝 및 발현에 사용되었다고 하더라도, 서열번호: 5 및 6 서열들이 클로닝 및 발현에 사용된 경우에도 유사한 결과가 달성될 수 있고, 따라서 이들 2개 서열들 또한 본 발명의 범주 내에 속한다는 것은 당해 분야의 숙련자에게 자명할 것이다. 더욱이, 당해 분야의 숙련자는, 본 발명의 요지에 비추어, 유사한 서열 및 클론을 용이하게 제작하고 제작된 서열을 피치아 효모 내에서 발현시켜 유사하거나 더 나은 결과를 얻을 수 있고, 따라서 이들 서열은 또한 본 발명의 범주 내에 속하는 것으로 생각된다.
실시예 4: HPV 18 L1 단백질의 정제
실시예 3에서 제조된 세포를 파괴하고 원심분리한 후, 결과로서 생기는 상청액을 크로마토그래피로 정제하여 하기에 기술된 바와 같이, 바이러스-유사 입자로 자가-조립된 HPV 18L1 단백질을 수득하였다.
HPV 18L1 유전자-발현 피치아 효모 세포를 1:3의 비율로 세척 완충액과 혼합하여 잘 흔들어준 후, 혼합물을 5분간 8,000 rpm에서 원심분리하여 세포를 수집하였다. 상기 과정을 2회 반복하였다.
세척된 세포를 1:5의 비율로 세포 파괴 완충액과 혼합하여 잘 흔들어준 후, 결과로서 생기는 상청액 내 세포를 고압 하에서 파괴하였다. 상기 과정을 90%의 세포가 파괴되도록 반복하였다. 결과로서 생기는 파괴된 세포 용액을 30분간 10℃에서 9,000 rpm으로 원심분리하고 상청액을 수집하였다.
수득된 상청액을 100% 완충액 E 내지 100% 완충액 F의 선형 구배로 용출하고 용출 분획을 수집하여 포로스 50HS(어플라이드 바이오시스템즈 코포레이션 엘티드(Applied Biosystems Co., Ltd)) 크로마토그래피 칼럼 상에서 예비적으로 정제하였다. 시료를 정제된 용출 분획으로부터 취하여 환원시켜 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅에 의한 검출용 단량체성 단백질을 형성하였다.
HPV 18L1 단백질을 포함하는 용출 분획들을 조합하여 100% 완충액 G 내지 100% 완충액 H의 선형 구배로 용출된 CHT(BIO-RAD 타입 II) 크로마토그래피 칼럼 상에서의 미세 정제에 적용하였다. 용출 분획을 수집하고, 그로부터 시료를 취하여 환원시켜 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅에 의한 검출용 단량체성 단백질을 형성하였다. HPV 18L1 단백질을 포함하는 용출 분획들을 조합하여 90% 초과의 순도를 갖는 미세 정제된 시료를 수득하였다.
실시예 5: HPV 18 L1 백신의 제조
상기 실시예 4에서 수득된 정제된 HPV 18L1 단백질을 알루미늄 항원보강제에 흡착시켜 중국 약전(Chinese Pharmacopoeia, 2005판)에 기술된 방법에 따라 면역원성 HPV 18L1 백신을 제조하였다.
실시예 6. HPV 18 L1 유전자의 발현 생성물의 면역원성 결정
24마리의 6 내지 8주령 SPF BALB/c 마우스를 각 그룹당 6마리씩 4 그룹으로 나누었다. 첫 번째 그룹의 마우스(음성 대조군임)를 각각 0, 7 및 21일째에 3회 0.1 mL의 알루미늄 항원보강제-함유 완충액(0.32 M 염화나트륨, 0.35 mM 붕산나트륨, 0.01% 트윈-80, 0.01 M 히스티딘, pH 6.5)의 피하 주사로 면역시키고, 다른 3 그룹의 마우스(검사 그룹임)를 각각 5 ㎍/mL, 0.5 ㎍/mL 및 0.05 ㎍/mL의 농도로 0.1 mL의 알루미늄 항원보강제-흡착된 VLPs로 유사하게 면역시켰다. 혈액 시료를 세 번째 면역접종 후 2주간 수집하였다. 수집된 혈액 시료를 2시간 동안 37℃에 보관한 후 10분간 4,000 g로 원심분리하였다. 마우스 다중클론 항혈청으로 수득된, 상청액을 흡인기로 빨아내고 -20℃에 보관하였다. 부가적으로, 상청액을 하기에 기술된 바와 같이, 항체양전율(seroconversion rate) 및 역가에 대해 분석하였다.
6.1. 항체양전율의 검출
피치아 효모에 의해 발현된 정제된 HPV 18L1 단백질을 코팅 용액을 이용해 1 ㎍/mL로 희석하였다. 0.1 mL의 희석액 부분 표본(aliquot)을 ELISA 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 코팅 용액을 각 웰로부터 제거한 후, 이를 0.3 mL의 PBST로 세척하였다. 이어서, 각 웰을 37℃에서 2시간 동안 0.3 mL의 차단 용액(5% 탈지분유 분말 + PBST)과 인큐베이션하여 차단하였다. 각 웰에 1:400의 비율로 혈청을 희석 완충액(2% 탈지분유 분말 + PBST)으로 희석하여 수득된 0.1 mL의 검사 혈청(알루미늄 항원보강제-흡착된 HPV 18L1 단백질로 면역시킨 마우스로부터 수득된 혈청 및 알루미늄 항원보강제 단독으로 면역시킨 마우스로부터 수득된 혈청) 용액을 첨가하고, 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 이어서 검사 혈청 용액을 제거하고 각 웰을 0.3 mL의 세척 완충액으로 세척하였다. 그 후에, 각 웰에 1:5,000의 비율로 IgG를 희석 완충액으로 희석하여 수득된 0.1 mL의 HRP 표지된 염소 항-마우스 IgG를 첨가하고 0.5시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 이어서, ELISA 용액을 제거하고 각 웰을 0.3 mL의 세척 완충액으로 세척하였다. 이어서, 각 웰에 0.1 mL DAB 발색 용액을 첨가하고, 20분간 실온의 암실에서 상호작용이 일어나게 하였다. 그 후에, 0.05 mL의 2 M H2SO4 정지 용액을 각 웰에 첨가하여 반응을 중지시키고, OD450 값을 ELISA 판독기를 사용해 결정하고, 판독값을 하기 표 2에 나타내었다.
OD450 판독값
마우스 1 마우스 2 마우스 3 마우스 4 마우스 5 마우스 6
5 ㎍ 면역접종 그룹 1.231 1.208 1.229 1.208 1.106 1.666
0.5 ㎍ 면역접종 그룹 1.150 1.244 1.227 1.158 1.252 1.171
0.05 ㎍ 면역접종 그룹 1.424 0.357 1.182 1.101 1.164 2.448
알루미늄 항원보강제 그룹 0.087 0.204 0.155 0.113 0.143 0.100
컷오프(Cutoff) 값 0.263
컷오프 값은 음성 대조군으로 검사 혈청(알루미늄 항원보강제로의 면역접종으로부터 수득된 마우스 혈청)에 대한 항체의 OD450 값들의 평균에 더하여 3× 표준 편차의 합이다. 컷오프 값보다 큰 OD450 값을 갖는 마우스는 양성으로 간주하였고, 컷오프 값보다 작은 OD450 값을 갖는 마우스는 음성으로 간주하였다. 3개 검사 그룹에 대한 항체양전율의 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
항체양전율의 결과
5 ㎍/mL 면역접종
그룹		 0.5 ㎍/mL 면역접종 그룹 0.05 ㎍/mL 면역접종
그룹
항체양전율 100% 100% 100%
6.2. 혈청 역가의 결정
정제된 HPV 18L1 단백질을 코팅 용액으로 1 ㎍/mL로 희석하였다. 0.1 mL의 희석액 부분 표본을 ELISA 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 코팅 용액을 각 웰로부터 제거한 후, 이를 0.3 mL의 PBST로 세척하였다. 이어서, 각 웰을 37℃에서 2시간 동안 0.3 mL의 차단 용액(5% 탈지분유 분말 + PBST)과 함께 인큐베이션하여 차단하였다. 검사 혈청(HPV 18L1 단백질로 면역시킨 마우스로부터 수득된 혈청)은 희석 완충액(2% 탈지분유 분말 + PBST)을 이용해 1:500 희석 내지 1:32,000 희석으로 연속적으로 이중 희석한 반면, 음성 대조군 혈청(알루미늄 항원보강제로 면역시킨 마우스로부터 수득된 혈청)은 1:10,000의 비율로 희석하였다. 각 웰에 0.1 mL의 희석된 혈청(검사 혈청 또는 음성 대조군 혈청)의 부분 표본을 첨가하고 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 이어서 검사 혈청 용액을 제거하고 각 웰을 0.3 mL의 세척 완충액으로 세척하였다. 그 후에, 각 웰에 1:5,000의 비율로 IgG를 희석 완충액으로 희석하여 수득된 0.1 mL의 HRP 표지된 양 항-마우스 IgG를 첨가하고, 37℃에서 0.5시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 ELISA 용액을 제거하고 각 웰을 0.3 mL의 세척 완충액으로 세척하였다. 이어서, 각 웰에 0.1 mL DAB 발색 용액을 첨가하고, 20분간 실온에서 상호작용이 일어나게 하였다. 그 후, 0.05 mL의 2 M H2SO4 정지 용액을 각 웰에 첨가하여 반응을 중지시키고, OD450 값을 ELISA 판독기를 사용해 결정하였다.
혈청 역가를 종점 적정(end point titration) 방법에 의해 계산하였고, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
역가 결정 결과
마우스 1 마우스 2 마우스 3 마우스 4 마우스 5 마우스 6
5 ㎍ 면역접종 그룹 8383 1315490 896331 2029474 43088 23781
0.5 ㎍ 면역접종 그룹 1154285 342344 415340 149924 1003880 103784
0.05 ㎍ 면역접종 그룹 24237 1000 306880 341405 564089 27950
요약하면, 실시예 1-6에 나타난 바와 같이, 인간 파필로마 바이러스의 주요 캡시드 단백질 L1 아형 18에 대한 유전자는, 본 발명에 의해 제공된 바와 같은, 최적화 HPV 18L1 유전자이고, 이는 효모 숙주 내에서 표적 단백질을 효율적으로 발현하는데 더욱 적합하고 산업적 생산의 요구조건을 만족하는 이점을 갖는다. 더욱이, 항원보강제-흡착된 정제 VLPs(HPV 18L1 단백질로부터 자가-조립된 바이러스-유사 입자)로부터 제조된, 본 발명에 의해 제공된 바와 같은 HPV 18L1 백신은 항체양전율 및 혈청 역가에 의해 결정되는 바와 같이 마우스 내에서 강력히 면역성인 것으로 입증되었다. 또한, 상기 방법은 피치아 효모 발현 시스템의 사용으로 인해 저 비용, 고 효율 및 생성물의 더욱 균일하고 적합한 품질이라는 이점을 갖는다.
실시예 7: 절단된 HPV 18 L1 에 대한 코돈-최적화 유전자의 고안 및 합성
7.1. 절단된 HPV 18 L1에 대한 코돈-최적화 유전자의 고안
본 발명은 피치아 효모에 의해 선호되는 코돈으로 코돈-최적화된 절단된 인간 파필로마 바이러스의 주요 캡시드 단백질 L1 아형 18(HPV18)을 암호화하는 DNA 분자에 관한 것이다. 각각 서열번호: 1, 2 및 3에 개시된 바와 같은, 3개의 DNA 서열들을 하기에 기술된 바와 같이, 코돈의 최적화, 최적화된 코돈의 변경 및 N 말단으로부터 61개 아미노산의 절단을 통해 수득하였다.
먼저, 상기 실기예 1과 유사한 방식으로 HPV 18L1을 암호화하는 자연-발생적인 유전자에 대해 변형을 가하여 신규한 HPV DNA 서열을 고안하였다.
이어서, 전사된 mRNAs 내 높은 GC 비율 존재, 번역 효율에 대한 mRNA 이차 구조의 영향, 및 통상적인 제한 자리의 발생을 방지하기 위해, 최적화된 코돈에 대해 변경을 가하여, 예컨대, 아스파라긴(Asn)에 대한 코돈을 AAC에서 AAT로 변경하고, 라이신(Lys)에 대한 코돈을 AAG에서 AAA로 변경하고, 아스파르트산(Asp)에 대한 코돈을 GAT에서 GAC로 변경하고, 페닐알라닌(Phe)에 대한 코돈을 TTT에서 TTC로 변경하고, 티로신(Tyr)에 대한 코돈을 TAC에서 TAT로 변경하고, 또한 N 말단으로부터 61개 아미노산을 절단하여, 3개의 신규한 절단된 HPV DNA 서열들을 수득하였고, 여기서:
서열번호: 1은 코돈 변경이 없는 DNA 서열이고;
서열번호: 2는 아스파라긴(Asn), 라이신(Lys) 및 아스파르트산(Asp)에 대한 코돈을 변경하여 서열번호: 1로부터 수득된 DNA 서열이고;
서열번호: 3은 페닐알라닌(Phe), 티로신(Tyr) 및 글리신(Gly)에 대한 코돈을 변경하여 서열번호: 1로부터 수득된 DNA 서열이다.
7.2. 절단된 HPV 18 L1에 대한 코돈-최적화 유전자의 합성
서열번호: 1에 개시된 바와 같은, 절단된 HPV 18 L1에 대한 전장 코돈-최적화 유전자는 상기에 언급된 실시예 1에 기술된 바와 본질적으로 동일한 방법을 사용해 수득하였다. 그렇게 수득된 절단된 HPV 18L1에 대한 유전자를, 그의 말단에 위치한 EcoRI 및 KpnI 제한 자리에 의해, pUC18 플라스미드(제너레이 바이오테크(상하이) 코포레이션 엘티디(중국 상하이)로부터 입수가능함) 내로 연결하였다. 결과로서 생기는 구조물이 올바른지 서열분석에 의해 입증하였고, 이를 pUC-18L1'로 명명하였다.
서열번호: 2 및 3에 개시된 바와 같은, 절단된 HPV 18 L1에 대한 코돈-최적화 유전자를 유사한 방법으로 수득하였다.
최적화 서열의 실행 가능성을 입증하기 위해, 이 실시예 7에서 수득된 절단된 HPV 18L1에 대한 코돈-최적화 유전자 중 하나(서열번호: 1)를 실시예 8에서와 같이, 그의 발현을 평가하기 위해 발현 플라스미드를 제작하는데 예시적으로 사용하였다.
실시예 8: 절단된 HPV 18 L1 유전자의 발현 벡터의 제작
서열번호: 1의 최적화 서열을 하기 단계에 기술된 바와 같이, 피치아 효모 발현 벡터 내에 클로닝하였다.
8.1. HPV 18L1 유전자를 증폭하는데 요구되는, 하기 서열을 갖는 정방향 및 역방향 시발체를 합성하였다:
정방향 시발체: 5'-TCCCAATCTTCGAAACGATGGCTTTGTGGA-3'(서열번호: 15);
역방향 시발체: 5'-AATGGTACCCTATTACTTTCTAGCTCTAACT-3'(서열번호: 13).
정방향 시발체는 BstBI 제한 자리를 포함하는 반면, 역방향 시발체는 종결 코돈 측면에 KpnI 제한 자리를 포함하고, 상기 제한 자리는 각각 상기 시발체 서열의 밑줄 친 부분에 나타나 있다.
8.2. PCR 증폭을 상기 시발체 및 주형으로 실시예 7에서 수득된 pUC-18L1'을 사용해 수행하였다. 증폭된 생성물을 전기영동으로 검출하고, 그 결과를 도 5에 나타내었으며, 이는 절단된 HPV 18L1에 대한 전장 코돈-최적화 유전자가 수득되었음을 입증하였다. PCR 증폭된 절편을 BstBI 및 KpnI(제한 엔도뉴클리아제)로 분해한 후 또한 BstBI 및 KpnI으로 분해된 pPICZαB(인비트로젠 코포레이션)에 연결하였다. 이어서, 연결된 구조물을 사용하여 E. coli Top10 균주(제너레이 바이오테크(상하이) 코포레이션 엘티디(중국 상하이)로부터 입수가능함)의 적격 세포를 형질전환시키고, 형질전환된 세포를 25 ㎍/mL의 제오신을 포함하는 LB 한천 위에 도말하였다.
형질전환된 세포는 제오신-내성 유전자를 수반하는 pPICZαB 벡터로서 제오신을 포함하는 LB 배지 상에서 성장할 수 있었다. 형질전환된 세포의 단일 콜로니를 분리하여 플라스미드 DNA. HPV 18L1 유전자를 제조하고 벡터 서열을 제한 지도화(도 6 참고) 및 염기 서열 분석을 통해 검출하여 절단된 HPV 18L1 유전자를 포함하는 올바른 구조물을 동정하였고, 이를 pPICZ-18L1'로 명명하였다. 분비 신호(a-인자 신호)가 제작된 플라스미드로부터 절단되기 때문에, 따라서 HPV 18L1 단백질은 세포 내에서 발현된 단백질이어야 한다.
실시예 9: 절단된 HPV 18 L1 유전자-발현 균주의 제작 및 발현
9.1. 절단된 HPV 18L1 유전자-발현 균주의 제작
pPICZ-18L1' 플라스미드를 제한 엔도뉴클리아제 효소 SacI으로 선형화시키고, 빈 플라스미드 pPICZαB를 이와 유사하게 SacI로 분해하여 음성 대조군으로 제공하였다. 효소 분해 용액에 무수 에탄올을 첨가하여 DNA 침전물을 수득하였다. 선형화된 pPICZ-18L1' 절편을 소량의 이중-증류수에 용해시키고 하기 조건 하에서 전기천공에 의해 피치아 효모 균주 X-33(인비트로젠 코포레이션)를 형질전환시켰다: DNA 절편, 5 ㎍; 전압, 1,500 볼트; 저항, 25 옴; 전기천공 시간, 5 밀리초. 전기천공된 세포를 200 ㎍/ml 제오신(제오신 코포레이션으로부터 입수)을 함유하는 YPDS 한천 위에 도말하였다. pPICZαB 벡터는 제오신-내성 유전자를 수반하기 때문에, 형질전환된 세포는 제오신 함유 YPDS 배지 위에서 성장할 수 있었다. 형질전환된 세포의 단일 콜로니를 분리하여, HPV 18L1 유전자-발현 피치아 효모 균주를 수득하였다.
9.2. 절단된 HPV 18L1 유전자-발현 피치아 효모 균주의 발현
수득된 절단된 HPV 18L1 유전자-발현 피치아 효모 균주를 1,000 ㎍/ml 또는 1,500 ㎍/ml 제오신을 함유하는 내성 플레이트 위에 도말하였다. 고 농도의 내성을 갖는 플레이트로부터 수득된 클론을 개별적으로 4 mL의 YPD 액체 배양 배지에서 24시간 동안 배양한 후 이어서 48시간 동안 BMMY 배양 배지에서의 유전자 발현을 유도하였다. 이어서, 세포를 원심분리에 의해 수확하고 세포의 일부를 파괴하여 웨스턴 블롯팅 동정을 수행하기 위한 상청액을 수득하였다. 동정 결과를 도 7에 나타내었고, 이는 상청액 내 절단된 HPV 18L1 단백질의 존재를 나타내었다.
서열번호: 1 서열이 본 발명의 실시예 8 및 9에서 클로닝 및 발현에 사용되었다고 하더라도, 서열번호: 2 및 3 서열들이 클로닝 및 발현에 사용되는 경우에도 유사한 결과가 얻어질 수 있고, 따라서 이들 2개 서열 모두 본 발명의 범주 내에 속한다는 것은 당해 분야의 숙련자에게 자명할 것이다. 더욱이, 당해 분야의 숙련자는, 본 발명의 요지에 비추어, 유사한 서열 및 클론을 용이하게 제작하고 피치아 효모 내에서 제작된 서열을 발현시켜 유사하거나 더 나은 결과를 얻을 수 있고, 따라서, 이들 서열은 또한 본 발명의 범주 내에 속하는 것으로 생각된다.
실시예 10. 절단된 HPV 18 L1 단백질의 대규모 발현 및 검출
1. 재조합 절단된 HPV 18 L1 단백질의 대규모 발현
접종 용액의 제조: 재조합 효모 스톡(stock)의 1개의 글리세롤 동결 튜브를 작동 중인 세포 은행으로부터 꺼내었다. 세척 후, 100 ㎕의 스톡을 5 mL의 YPD 배지에 접종하고 30℃에서 20시간 동안 280 rpm으로 배양하였으며, 이때 OD600은 1 내지 2인 것으로 검출되었고 다른 미생물로부터의 오염은 현미경적으로 관찰되지 않았다. 1 mL의 활성화 유액(만족스러운 것으로 검사되었음)을 500 mL의 YPD 배지에 접종하고 30℃에서 20시간 동안 280 rpm으로 배양하였으며, 이때 OD600은 2 내지 6인 것으로 검출되었고 다른 미생물로부터의 오염은 현미경적으로 관찰되지 않았다.
발효 공정: 발효용 기본 염 배지를 이온수를 이용해 제조하였다: BSM1(K2SO4 273 g, MgSO4 109 g, CaSO4 .2H2O 17.6 g, H3PO4 400.5 mL, KOH 62 g, 글리세롤 600 g, PTM1 60 mL, 소포제 1 mL; 15 L의 부피가 되도록 이온수 첨가). 항생제를 포함하지 않는 제조된 배지를 30 L 발효 탱크(바이오엔지니어링 코포레이션 엘티디)로 옮긴 후 121℃에서 30분간 탱크 내에서 안정화시키고, 이어서 30℃로 냉각시켰다. 앞서 준비된 접종 용액을 사용하여 1:15의 비율로 안정화 배지에 접종하였다. 발효를 미량 염 PTM1(CuSO4 .5H2O 6.0 g, NaI 0.008 g, MnSO4 3.0 g, NaMoO4 0.2 g, H3BO3 0.02 g, ZnSO4 20.0 g, CoCl2 0.5 g, FeSO4.7H2O 65.0 g, 바이오틴 0.2 g, 및 H2SO4 5.0 mL; 1 L의 부피가 되도록 이온수 첨가)을 첨가하면서, 30.0±0.5℃의 온도, 5.00±0.05의 초기 pH, 300 rpm의 초기 교반 속도, 0.5 vvm의 폭기 부피 및 100%의 용존 산소(DO)로 개시하였다. 초기 증식기를 약 20시간 동안 지속하였고, 이 기간 동안 용존 산소를 30% 이하로 유지하였다. 탄소 공급원이 완전히 소비되었을 때, 용존 산소가 신속히 증가하였고, 이 시점에서 습식 세포 중량은 최대 약 100 g/L이었다. 초기 2시간 내에, 200 mL/h의 속도로 50%(v/v) 글리세롤 용액(리터당 12 mL의 PTM1이 첨가됨)을 발효액에 보충하였다. 이어서 이 보충을 약 8시간 동안 300 mL/h의 속도로 지속하였고, 이 기간 동안에 용존 산소를 교반 속도, 공기 유동 및 탱크 압력(<0.8 bar)을 조절하여 20%보다 높게 유지하였다. 습식 세포 중량이 약 350 g/L에 도달하였을 때, 보충을 중지하였고, 그에 따라 용존 산소는 증가하였다. 그 동안, pH 값을 6.00±0.05로 조절하였고, 메탄올(리터당 12 mL의 PTM1이 첨가됨)을 30 mL/h의 초기 첨가 속도로 첨가하여 유전자 발현을 유도하였다. 메탄올의 첨가 속도는 4시간 후 90 mL/h의 설정 속도까지 서서히 증가하였다. 유도 도중에, 용존 산소는 20%(v/v)보다 높게, 온도는 30℃로, pH는 6.00±0.05로 유지하였다. 시료를 매 8시간마다 취하였고 웨스턴 블롯팅 검출에 적용하였다. 유도하고 48시간 후, 발효를 종결하고 발효 배양액을 배출하였다.
세포의 수확: 발효 배양액을 동결-원심분리를 이용해 원심분리하여 세포를 수집한 후, 이의 무게를 측정하였다. 회수된 세포에 배치 번호, 날짜 및 무게를 기록하고, 세포를 정제하거나 -20℃에 보관하였다.
2. 검출
정제된(하기 실시예 11에 기술된 방법에 따름) 절단된 HPV 18L1 단백질을 사용하여 단백질 농도 표준 곡선을 작성하였다. 음성 대조군으로 유도 전 세포를 이용하여, 발효 도중의 피치아 효모 내 HPV 18L1 유전자의 발현량을 하기에 기술된 바와 같이, 샌드위치 ELISA 방법을 이용해 검출하였다.
HPV 18L1 단백질에 대한 토끼 다중클론 항체를 코팅 용액으로 2,000배 희석하였다. 0.1 mL의 희석된 토끼 다중클론 항체의 부분 표본을 ELISA 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이어서 코팅 용액을 각 웰로부터 제거한 후, 이를 0.3 mL의 PBST로 세척하였다. 이어서, 각 웰을 37℃에서 2시간 동안 0.3 mL의 차단 용액과 함께 인큐베이션하여 차단하였다.
정제된 HPV 18L1 단백질을 2 ㎍/mL 내지 0.0625 ㎍/mL의 농도로 희석 완충액을 이용해 구배적으로 희석하였다. 그동안, 파괴된 발효 배양액으로부터 수득된 상청액을 200배 희석하였다. 이어서, 연속 희석에 의해 수득된 상이한 농도의 HPV 18 L1 단백질 용액 각각 및 희석된 상청액에 대해, 0.1 mL의 부분 표본을 취하고 상기-처리된 ELISA 플레이트의 개별적인 웰에 첨가한 후, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 항원 용액의 부분 표본을 각 웰로부터 제거한 후, 이를 0.3 mL의 세척 완충액으로 세척하였다. 이어서, MAB885 마우스 단일클론 항체(케미콘 코포레이션 엘티디로부터 구매함)를 희석 완충액으로 1,000배 희석하고, 0.1 mL의 희석액 부분 표본을 각 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션에 이어서, 단일클론 항체 용액을 각 웰로부터 제거한 후, 이를 0.3 mL의 세척 완충액으로 세척하였다. 그 후에, 각 웰에 희석 완충액으로 IgG를 5,000-배 희석하여 수득된 0.1 mL의 HRP 표지된 염소 항-마우스 IgG를 첨가하고, 37℃에서 0.5시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 ELISA 용액을 제거하고 각 웰을 0.3 mL의 세척 완충액으로 세척하였다. 이어서, 각 웰에 0.1 mL DAB 발색 용액을 첨가하고, 실온에서 20분간 상호작용이 일어나게 하였다. 그 후에, 0.05 mL의 2 M H2SO4 정지 용액을 각 웰에 첨가하여 반응을 중지시키고, OD450 값을 ELISA 판독기를 사용해 결정하였다.
HPV 18L1 단백질의 구배적으로 희석된 용액에 대한 OD450 값을 사용하여 단백질 농도 표준 곡선을 작성하였다. 이 표준 곡선을 사용하여, 발효 도중에 절단된 HPV 18L1 단백질의 발현량을 하기 표 5에 나타난 바와 같이, 수득하였다.
구체적으로 말하면, 공지된 농도의 정제된 표적 단백질 스톡 용액을, 예컨대 2 ㎍/mL, 1 ㎍/mL, 0.5 ㎍/mL, 0.25 ㎍/mL 및 0.125 ㎍/mL의 농도 범위의 용액으로 연속적으로 희석하고, 이를 표준 농도로 사용하였다. ELISA 검출을 이들 용액에 대해 수행하여 대응하는 OD450 값을 수득하였다. 이어서 세로 좌표는 농도를 나타내고 가로 좌표는 OD450 값을 나타내는 표준 선형 회귀 방정식을 작성하였다.
파괴된 발효 배양액으로부터 수득된 상청액을 연속적으로 희석, 예컨대 50배, 100배, 200배 및 400배로 희석하였다. OD450 값을 이들 연속 희석액에 대해 검출하였고, 대응하는 농도(㎍/mL)를 표준 선형 회귀 방정식으로부터 확인하였다. 이어서 상청액 내 표적 단백질의 농도(㎍/mL)를 확인된 농도에 대응하는 희석 배율을 곱하여 계산하였다. 파괴된 배양액이 습식 세포 중량:세포 파괴 완충액 = 1:5로부터 제조되었기 때문에, 따라서 습식 세포 내 표적 단백질의 발현량(㎍/g 습식 세포)은 상청액 내 표적 단백질의 5 × 농도(㎍/mL)였다. 발효 배양액 내 표적 단백질의 농도(㎍/L 발효 배양액)는 습식 세포 내 표적 단백질의 상기에서 수득된 발현량에 발효 배양액 내 세포의 밀도(g 습식 세포/L 발효 배양액)를 곱하여 수득하였다.
파괴된 발효 배양액으로부터 수득된 상청액 내 표적 단백질의 농도(㎍/mL) = 희석 배율 × 표준 표적 단백질 농도의 농도(㎍/mL) × OD450(파괴된 발효 배양액으로부터 수득된 상청액) / OD450 (표준 표적 단백질 농도);
발효 배양액 내 발현된 표적 단백질의 농도(㎍/L 발효 배양액) = 파괴된 발효 배양액으로부터 수득된 상청액 내 표적 단백질의 5 × 농도(㎍/mL) × 발효 배양액 내 세포의 밀도(g 습식 세포/L 발효 배양액).
발효 도중에 피치아 효모 내 절단된 HPV 18 L1 유전자의 발현량의 검출
시료 희석 배율 OD450 스톡 용액의 농도
(㎍/mL)		 평균 농도
(㎍/mL)		 전환된 농도 발효 밀도 발효 도중의 발현량
파괴된 발효 배양액 200 0.455 161.4 176 880 ㎍/g 습식 세포 438 g/L 385 mg/L 발효 배양액
상청액 1 100 0.718 185.6
파괴된 발효 배양액 200 0.365 153.0 152 760 ㎍/g 습식 세포 413 g/L 314 mg/L 발효 배양액
상청액 2 100 0.612 160.5
음성 대조군 100 0.091
블랭크 대조군 - 0.083
표 5에 나타낸 결과로부터, 본 발명에 따른 HPV 18L1 단백질에 대한 유전자의 최적화 서열이 피치아 효모에서 HPV 18L1 단백질로 발현될 수 있을 뿐만 아니라, 산업적 생산의 요구조건을 충족하는, 높은 발현량을 가짐을 알 수 있다.
실시예 11: 절단된 HPV 18 L1 단백질의 정제
세정: -20℃에서 보관되었던, 절단된 HPV 18 L1 단백질을 발현하는 상기에서 수득된 피치아 효모 세포를 실온에서 해동시켰다. 이어서 해동된 세포를 1:3(g/mL)의 비율로 정제를 위해 세척 완충액(100 mM PB, pH 7.0, 0.15 M NaCl) 또는 물과 혼합하고, 균질기(FLUKO) 내에서 완충액 또는 물과 완전하게 균질화하였다. 그 후에, 균질액을 5분간 8000 rpm으로 고속 원심분리(SORVAL1RC6PLUS)에 적용하여 세포를 분리하고, 상청액을 옮겨 담았다. 상기 과정을 2회 반복하였고, 그로 인해 세포의 세정을 달성하였다.
파괴: 세정된 세포를 세포 파괴 완충액(100 mM MOPS, 0.75M NaCl, 0.05% 트윈-80, pH 7.0)에 1:5(g/mL)의 비율로 첨가하여 혼합한 후, 균질기(FLUKO) 내에서 완충액과 완전하게 균질화하였다. 균질액 내 부유된 세포를 1200 내지 1300 bars 범위의 압력에서 작동하는 고압 균질기(ATSAH110B)를 사용해 파괴하였다. 이 파괴를 4회 반복한 후, 파괴된 세포 용액을4 내지 8℃에서 배출하였고, 90%의 세포가 파괴되었다.
정화: 상기와 같이 고압 파괴에 위해 수득된 파괴된 세포 용액을 원심분리 컵 내로 붓고 고압에서 원심분리하여 세포 부스러기를 제거하여, 후속 칼럼 크로마토그래피 분리를 위한 상청액을 수득하였다. 사용된 원심분리기는 SORVAL1RC6PLUS, 로터(rotor) 모델: FIBERLITEF10-6x500y, 원심분리 설정: 9,000 rpm, 30분, 10℃이었다.
예비 정제: 크로마토그래피 매질 포로스 50HS(어플라이드 바이오시스템즈)를 크로마토그래피 칼럼(직경 26 mm, 높이 10, 부피 50 mL) 내에 로우딩하였다. 예비 정제를 하기 단계로 수행하였다: (1) 세척 및 소독: 칼럼을 2 칼럼 부피의 0.5 M NaOH로 세척하였다; (2) 재생 및 평형화: 칼럼을 2 칼럼 부피의 완충액 F로 세척한 후 완충액 E로 평형화하였다; (3) 로우딩 시료: 상기에 기술된 바와 같이 파괴된 세포 용액을 원심분리하여 수득된 상청액을 칼럼 위에 로우딩하였다; (4) 헹굼: 기준선이 안정화될 때까지 칼럼을 5 칼럼 부피의 완충액 E로 헹구었다; (5) 용출: 칼럼을 칼럼 부피의 총 용출 부피로 100% 완충액 E 내지 100% 완충액 F의 선형 구배로 용출하였다; (6) 수집: 70 내지 100 ms/cm 범위의 전도율을 갖는 크로마토그래피 피크를 수집하고 4℃에 보관하였다.
미세 정제: 크로마토그래피 매질 CHT(BIO-RAD, 타입 II, 40 ㎛)를 크로마토그래피 칼럼(직경 26 mm, 높이 10 cm, 부피 50 mL) 내에 로우딩하였다. 미세 정제를 하기 단계로 수행하였다: (1) 세척 및 소독: 칼럼을 2 칼럼 부피의 0.5 M NaOH로 세척하였다; (2) 재생 및 평형화: 칼럼을 2 칼럼 부피의 완충액 H로 세척한 후 완충액 G로 평형화하였다; (3) 로우딩 시료: 예비 정제 후 수집된 시료를 30 mM의 최종 농도로 PB에 첨가한 후 칼럼 위에 로우딩하였다; (4) 헹굼: 기저선이 안정화될 때까지 칼럼을 5 칼럼 부피의 완충액 G로 헹구었다; (5) 용출: 칼럼을 100% 완충액 G 내지 100% 완충액 H의 선형 구배로 용출하였다; (6) 수집: 용출 분획들을 수집하고 절단된 HPV 18L1 단백질을 포함하는 분획들을 조합하여 최종 정제된 시료를 수득하였다. 정제된 시료를 단량체성 단백질로 환원시킨 후 이를 환원 SDS-PAGE(Bio-RAD)에 적용하여, 90% 보다 높은 순도를 가짐을 확인하였다(도 8 참고).
웨스턴 블롯(Bio-RAD) 검출은 표적 전기영동 밴드와 HPV 18 L1 단백질에 대한 단일클론 또는 다중클론 항체 사이의 특이적 염색 반응을 나타내었다(도 9 참고). 동적 광 산란 검출(Malvern Instruments Zetasizer　Nano　ZS)은 정제된 시료가 약 50 내지 80 nm 크기 범위의 입자를 가짐을 나타내었고, 전자 현미경 관찰(Philips Tecnai-12Biotwin transmission electron microscope, Electron Microscope Laboratory, Science and Technology Center, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, China)은 약 50 내지 80 nm 범위의 입자 크기를 갖는, 정제된 시료 내 바이러스-유사 입자(VLPs)를 나타내었다(도 10 참고). 상기에 기술된 바와 같이 발현된 전장 HPV 18L1 단백질은 또한, 동일한 방식으로 정제될 때, 동적 광 산란 및 전자 현미경 검출에 의해 50 내지 80 nm 범위의, 절단된 HPV 18L1 단백질 입자와 동일한 입자 크기를 갖는 것으로 확인된 정제된 VLPs를 제공하였다.
실시예 12: 절단된 HPV 18 L1 백신의 제조
상기 실시예 11에서 수득된 정제된 HPV 18L1 단백질을 알루미늄 항원보강제에 흡착시켜 중국 약전(2005판)에 기술된 방법에 따라 면역원성 HPV 18L1 백신을 제조하였다.
실시예 13. 절단된 HPV 18 L1 유전자의 발현 생성물의 면역원성 결정
24마리의 6 내지 8주령 SPF BALB/c 마우스를 각 그룹당 6마리씩 4 그룹으로 나누었다. 첫 번째 그룹의 마우스(음성 대조군임)를 각각 0, 7 및 21일째에 3회 0.1 mL의 알루미늄 항원보강제-함유 완충액(0.32 M 염화나트륨, 0.35 mM 붕산나트륨, 0.01% 트윈-80, 0.01 M 히스티딘, pH 6.5)의 피하 주사로 면역시키고, 다른 3 그룹의 마우스(검사 그룹임)를 각각 5 ㎍/mL, 0.5 ㎍/mL 및 0.05 ㎍/mL의 농도로 0.1 mL의 알루미늄 항원보강제-흡착된 VLPs로 유사하게 면역시켰다. 혈액 시료를 세 번째 면역접종 후 2주간 수집하였다. 수집된 혈액 시료를 37℃에서 2시간 동안 보관한 후 10분간 4,000 g로 원심분리하였다. 마우스 다중클론 항혈청으로 수득된, 상청액을 흡인기로 빨아내고 -20℃에 보관하였다. 부가적으로, 상청액을 하기에 기술된 바와 같이, 항체양전율 및 역가에 대해 분석하였다.
13.1. 항체양전율의 검출
피치아 효모에 의해 발현된 정제된 절단된 HPV 18L1 단백질을 코팅 용액을 이용해 1 ㎍/mL로 희석하였다. 0.1 mL의 희석액 부분 표본을 ELISA 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 코팅 용액을 각 웰로부터 제거한 후, 이를 0.3 mL의 PBST로 세척하였다. 이어서, 각 웰을 37℃에서 2시간 동안 0.3 mL의 차단 용액(5% 탈지분유 분말 + PBST)과 함께 인큐베이션하여 차단하였다. 각 웰에 1:400의 비율로 혈청을 희석 완충액(2% 탈지분유 분말 + PBST)으로 희석하여 수득된 0.1 mL의 검사 혈청(알루미늄 항원보강제-흡착된 HPV 18L1 단백질로 면역시킨 마우스로부터 수득된 혈청 및 알루미늄 항원보강제 단독으로 면역시킨 마우스로부터 수득된 혈청) 용액을 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 검사 혈청 용액을 제거하고 각 웰을 0.3 mL의 세척 완충액으로 세척하였다. 그 후에, 각 웰에 1:5,000의 비율로 IgG를 희석 완충액으로 희석하여 수득된 0.1 mL의 HRP 표지된 염소 항-마우스 IgG를 첨가하고 37℃에서 0.5시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, ELISA 용액을 제거하고 각 웰을 0.3 mL의 세척 완충액으로 세척하였다. 이어서, 각 웰에 0.1 mL DAB 발색 용액을 첨가하고, 20분간 실온의 암실에서 상호작용이 일어나게 하였다. 반응 후, 0.05 mL의 2 M H2SO4 정지 용액을 각 웰에 첨가하여 반응을 중지시키고, OD450 값을 ELISA 판독기를 사용해 결정하고, 판독값을 하기 표 6에 나타내었다.
OD450 판독값
마우스 1 마우스 2 마우스 3 마우스 4 마우스 5 마우스 6
5 ㎍ 면역접종 그룹 0.964 0.990 0.901 0.820 1.040 1.193
0.5 ㎍ 면역접종 그룹 0.769 0.898 0.830 1.706 0.763 0.982
0.05 ㎍ 면역접종 그룹 0.933 0.953 1.422 1.502 0.572 1.489
알루미늄 항원보강제 그룹 0.097 0.146 0.114 0.176 0.110 0.158
컷오프 값 0.226
컷오프 값은 음성 대조군으로 검사 혈청(알루미늄 항원보강제로의 면역접종으로부터 수득된 마우스 혈청)에 대한 항체의 OD450 값들의 평균에 더하여 3× 표준 편차의 합이다. 컷오프 값보다 큰 OD450 값을 갖는 마우스는 양성으로 간주하였고, 컷오프 값보다 작은 OD450 값을 갖는 마우스는 음성으로 간주하였다. 3개 검사 그룹에 대한 항체양전율의 결과를 하기 표 7에 나타내었다.
항체양전율의 결과
5 ㎍/mL 면역접종 그룹 0.5 ㎍/mL 면역접종 그룹 0.05 ㎍/mL 면역접종 그룹
항체양전율 100% 100% 100%
13.2. 혈청 역가의 결정
정제된 절단된 HPV 18L1 단백질을 코팅 용액으로 1 ㎍/mL로 희석하였다. 0.1 mL의 희석액 부분 표본을 ELISA 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 코팅 용액을 각 웰로부터 제거한 후, 이를 0.3 mL의 PBST로 세척하였다. 이어서, 각 웰을 37℃에서 2시간 동안 0.3 mL의 차단 용액(5% 탈지분유 분말 + PBST)과 함께 인큐베이션하여 차단하였다. 검사 혈청(HPV 18L1 단백질로 면역시킨 마우스로부터 수득된 혈청)은 희석 완충액(2% 탈지분유 분말 + PBST)을 이용해 1:500 희석 내지 1:32,000 희석으로 연속적으로 이중 희석한 반면, 음성 대조군 혈청(알루미늄 항원보강제로 면역시킨 마우스로부터 수득된 혈청)은 1:10,000의 비율로 희석하였다. 각 웰에 0.1 mL의 희석된 혈청(검사 혈청 또는 음성 대조군 혈청)의 부분 표본을 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 검사 혈청 용액을 제거하고 각 웰을 0.3 mL의 세척 완충액으로 세척하였다. 그 후에, 각 웰에 1:5,000의 비율로 IgG를 희석 완충액으로 희석하여 수득된 0.1 mL의 HRP 표지된 양 항-마우스 IgG를 첨가하고, 37℃에서 0.5시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 ELISA 용액을 제거하고 각 웰을 0.3 mL의 세척 완충액으로 세척하였다. 이어서, 각 웰에 0.1 mL DAB 발색 용액을 첨가하고 20분간 실온에서 상호작용이 일어나게 하였다. 반응 후, 0.05 mL의 2 M H2SO4 정지 용액을 각 웰에 첨가하여 반응을 중지시키고, OD450 값을 ELISA 판독기를 사용해 결정하였다. 혈청 역가는 종점 역가 방법에 의해 계산하였고, 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.
역가 결정 결과
마우스 1 마우스 2 마우스 3 마우스 4 마우스 5 마우스 6
5 ㎍ 면역접종 그룹 418416 83602 252997 192334 470324 215223
0.5 ㎍ 면역접종 그룹 1073694 13854 189584 18371 226400 192297
0.05 ㎍ 면역접종 그룹 79083 68971 61310 11819 2000 14099
요약하면, 실시예 1-13에 나타난 바와 같이, 인간 파필로마 바이러스의 주요 캡시드 단백질 L1 아형 18에 대한 유전자 또는 절단된 인간 파필로마 바이러스의 주요 캡시드 단백질 L1 아형 18에 대한 유전자는, 본 발명에 의해 제공된 바와 같은, 최적화 L1 유전자이고, 이는 효모 숙주 내에서 표적 단백질을 효율적으로 발현하는데 더욱 적합하고 산업적 생산의 요구조건을 만족하는 이점을 갖는다. 더욱이, 본 발명에 의해 제공된 바와 같은 HPV 18L1 백신은 VLPs의 구조 내로 자가-조립될 수 있다. 백신은 항원보강제-흡착된 정제 VLPs를 이용해 항체양전율 및 혈청 역가에 의해 결정되는 바와 같이 마우스 내에서 강력히 면역성인 것으로 입증되었다. 또한, 상기 방법은 피치아 효모 발현 시스템의 사용으로 인해 저 비용, 고 효율 및 생성물의 더욱 균일하고 적합한 품질이라는 이점을 갖는다.
실시예 14. 절단된 HPV 18 L1 VLPs 의 중화 활성
마우스를 상기에 기술된 것과 동일한 과정으로 면역시키고 혈액을 면역접종 후 2주간 수집하였다. 수집된 혈액을 37℃에서 2시간 동안 보관한 후, 4,000 g에서 10분간 원심분리하였다. 마우스 다중클론 항혈청으로 수득된, 상청액을 흡인기로 빨아내고 -20℃에 보관하였다.
293FT 세포(인비트로젠)를 초기에 15 cm 세포 배양 접시(1.1×07 세포/접시) 위에 도말하였다. 24시간 후, 세포를 인산칼슘 형질감염 방법을 이용해 각각 20 ㎍, 10 ㎍ 및 10 ㎍의 양으로 플라스미드 p18L1h, p18L2h(Buck CB, Pastrana DV, Lowy DR et al. Efficient IntraceL1ular Assembly of Papillomaviral Vectors. J Virol, 2004, 78(2):751-757) 및 녹색 형광 유전자-운반 pIRES2-EGFP(BD 바이오사이언스 클론테크로부터 구매함)로 동시-형질감염시켰다. 24시간 후, 세포를 관찰하고, 수집하고 용해시켰다. 세포 용해 상청액을 즉시 정제하거나 -80℃에 보관하였다.
16℃에서 4시간 동안 100,000 g로 30% 옵티프렙(OptiPrep) 밀도 구배 원심분리(MLS-50 원심분리 로터, 베크만 초고속 원심분리)를 이용해 5 mL 원심분리 튜브(Beckman) 내에서 세포 용해 상청액을 원심분리하여 정제를 수행하였다. 각각의 분획이 약 500 ㎕인 원심분리 분획들을 수집하고, 웨스턴 블롯팅을 이용해 HPV 18 L1 단백질의 함량에 대해 분석하였다. 가장 높은 농도의 L1 단백질을 함유하는 분획들을 슈도타입 바이러스 용액으로 조합한 후, 이를 부분 표본으로 나누어 -80℃에 보관하였다.
293FT 세포를 24-웰 세포 배양 플레이트(1.5×105 세포/웰) 위에 도말하였다. 24시간 후, 중화 실험을 하기와 같이 수행하였다. 상이한 혈청 시료를 DMEM 배지로 연속적으로 100-배 희석하였다. 각 희석액의 50 ㎕ 부분 표본을 DMEM 배지로 희석된 50 ㎕의 슈도타입 바이러스 용액과 혼합하고, 각 혼합물을 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 각각 인큐베이션된 혼합물을 293FT 세포로 사전-도말된 24-웰 세포 배양 플레이트 내에 첨가하고 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 OLUMPUSCKX41F32FL 도립(inverted) 형광 현미경 하에서 녹색 형광 단백질의 발현에 대해 관찰하고, 도 11a 및 11b에 나타난 바와 같이, 형광 이미지를 수집하였다. 도 11a에 형광이 나타났는데, 이는 HPV 18 슈도타입 바이러스가 293FT 세포를 감염시켰음을 나타내었다. 도 11b에 소량의 형광이 남아있는데, 이는 마우스 혈청이 HPV 18 슈도타입 바이러스를 중화시켜, 293FT 세포의 바이러스 감염을 감소시켰음을 나타내었다. 따라서 재조합 HPV 18L1 VLPs 백신으로 면역시킨 마우스가 세포 내로 슈도타입 바이러스의 진입을 억제하는 중화 항체를 생산할 수 있음이 명백하다.
본 발명에서, 염기 서열 서열번호: 2 또는 3과 염기 서열 서열번호: 5 또는 6이 각각 상기 실시예에서 서열번호: 1 및 서열번호: 4를 대체하여 상기 실시예에 기술된 바와 같은 방법을 이용하여 본 발명의 HPV 18 L1 단백질 및 그의 절단된 형태를 제조할 수 있다. 또한, 상기 유전자들은 또한 적합한 클로닝 방식으로, 다른 현존하는 피치아 효모 발현 벡터, 예컨대 pPIC6, pGAPZ 또는 pAO815 내로 클로닝될 수 있다. 이어서 수득된 재조합 발현 벡터는 유전적으로 조작된 균주를 제작하기 위해 다른 피치아 효모 균주, 예컨대 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115, KM71 또는 SMD1168 균주를 형질전환시키는데 사용될 수 있다. 배양 및 발효, 분리 및 정제(본 명세서에 상술되지 않음)의 통상적인 방법을 이용하여, 본 발명의 HPV 18 L1 단백질(HPV 18 L1 VLPs) 또는 그의 절단된 형태는 유전적으로 조작된 균주로부터 수득될 수 있다. 그렇게 제조된 HPV 18 L1 단백질 또는 그의 절단된 형태는 상기 실시예에서 제조된 HPV 18 L1 단백질 또는 그의 절단된 형태의 것과 유사한 면역원성을 가질 것이다.
실시예 15: HPV 16 L1 에 대한 코돈-최적화 유전자의 고안 및 합성
15.1. HPV 16 L1에 대한 코돈-최적화 유전자의 고안
본 발명은 피치아 효모에 의해 선호되는 코돈으로 코돈-최적화된 인간 파필로마 바이러스의 주요 캡시드 단백질 L1 아형 16(HPV16)을 암호화하는 DNA 분자에 관한 것이다. 각각 서열번호: 7, 8 및 9에 개시된 바와 같은, 3개의 DNA 서열들을 하기에 기술된 바와 같이, 코돈의 최적화 및 최적화 코돈의 변경을 통해 수득하였다.
먼저, 반복된 실험을 통해, 유전자의 모든 대응하는 아미노산에 대한 코돈을 최적화하여 HPV 16L1을 암호화하는 자연-발생적인 유전자에 대해 변형을 가하여 신규한 HPV DNA 서열, 즉, 서열번호: 7을 고안하였다.
이어서, 전사된 mRNAs 내 높은 GC 비율의 존재, 번역 효율에 대한 mRNA 이차 구조의 영향, 및 통상적인 제한 자리의 발생을 방지하기 위해, 최적화된 코돈에 대해 변경을 가하여, 예컨대, 아스파라긴(Asn)에 대한 코돈을 AAC에서 AAT로 변경하고, 라이신(Lys)에 대한 코돈을 AAG에서 AAA로 변경하고, 아스파르트산(Asp)에 대한 코돈을 GAT에서 GAC로 변경하고, 페닐알라닌(Phe)에 대한 코돈을 TTT에서 TTC로 변경하고, 티로신(Tyr)에 대한 코돈을 TAC에서 TAT로 변경하고, 글리신(Gly)에 대한 코돈을 GGT에서 GGA로 변경하여, 2개의 신규한 HPV DNA 서열을 수득하였다:
서열번호: 8은 아스파라긴(Asn), 라이신(Lys) 및 아스파르트산(Asp)에 대한 코돈을 변경하여 서열번호: 7로부터 수득된 DNA 서열이고; 서열번호: 9는 페닐알라닌(Phe), 티로신(Tyr) 및 글리신(Gly)에 대한 코돈을 변경하여 서열번호: 7로부터 수득된 DNA 서열이다.
15.2. HPV 16 L1에 대한 코돈-최적화 유전자의 합성
서열번호: 7에 개시된 바와 같은 HPV 16 L1에 대한 코돈-최적화 유전자를 합성하여 하기 서열을 갖는 시발체 a1 및 a2를 사용하는 PCR 증폭을 수행하기 위한 주형으로 사용하였다:
a1: 5'-ATAGAATTCATGTCTTTGTGGTTGCCATC-3'(서열번호: 16);
a2: 5'-ATAGGTACCCTATTACAACTTTCTCTTCTTT-3'(서열번호: 17).
수득된 PCR 생성물을 아가로스 겔 전기영동으로 분리하고 표적 서열을 겔로부터 회수하여, 약 1.5 kb 크기의 절편을 수득하였다. 이 절편의 서열을 분석하여 서열번호: 7에 나타난 바와 같은 서열분석 결과를 얻었고, 이 결과로부터 이 절편이 HPV 16L1에 대한 전장 코돈-최적화 유전자임을 입증하였다. 그렇게 수득된 HPV 16L1에 대한 유전자를, 그의 말단에 위치한 EcoRI 및 KpnI 제한 자리에 의해, pUC18 플라스미드(제너레이 바이오테크(상하이) 코포레이션 엘티디(중국 상하이)로부터 입수가능) 내로 연결하였다. 결과로서 생기는 구조물이 올바른지 서열분석으로 확인한 후, pUC-16L1로 명명하였다.
서열번호: 8 및 9에 나타난 바와 같은 HPV 16L1에 대한 코돈-최적화 유전자를 상기에 언급된 것과 유사한 과정으로 수득하였다.
최적화 서열의 실행 가능성을 입증하기 위해, 이 실시예 15에서 수득된 HPV 16L1에 대한 코돈-최적화 유전자의 하나(서열번호: 7)를 하기와 같이 그의 발현을 평가하기 위해 발현 플라스미드를 제작하는데 예시적으로 사용하였다.
실시예 16: HPV 16 L1 유전자의 발현 벡터의 제작
서열번호: 7의 최적화 서열을 도 12에 나타내고 하기 단계들에 기술된 바와 같이 피치아 효모 발현 벡터 내로 클로닝하였다.
16.1. 16L1 유전자를 증폭하는데 요구되는, 하기 서열을 갖는 정방향 및 역방향 시발체를 합성하였다:
정방향 시발체: 5'-ACTAATTATTCGAAACGATGTCTTTGTGG-3'(서열번호: 18);
역방향 시발체: 5'-AGCGGTACCCTATTACAACTTTCTCTTCTTTC-3'(서열번호: 19).
정방향 시발체는 BstBI 제한 자리를 포함하는 반면, 역방향 시발체는 종결 코돈 측면에 KpnI 제한 자리를 포함하며, 상기 제한 자리는 각각 상기 시발체 서열의 밑줄 친 부분에 나타나 있다.
16.2. PCR 증폭을 상기 시발체와 주형으로 실시예 15에서 수득된 pUC-16L1을 사용하여 수행하였다. 증폭된 생성물을 전기영동으로 검출하여, 그 결과를 도 13에 나타내었고, 이는 HPV 16L1에 대한 전장 코돈-최적화 유전자가 수득되었음을 입증하였다. PCR 증폭된 절편을 BstBI 및 KpnI(제한 엔도뉴클리아제)로 분해한 후 BstBI 및 KpnI로 분해된 pPICZαB(인비트로젠 코포레이션)에 연결하였다. 이어서, 연결된 구조물을 사용하여 E. coli Top10 균주(제너레이 바이오테크(상하이) 코포레이션 엘티디(중국 상하이)로부터 입수가능함)의 적격 세포에 형질전환시키고, 형질전환된 세포를 25 ㎍/ml의 제오신을 함유하는 LB 한천 위에 도말하였다.
형질전환된 세포는 제오신-내성 유전자를 수반하는 pPICZαB 벡터와 같이 제오신 함유 LB 배지에서 성장할 수 있었다. 형질전환된 세포의 단일 콜로니를 분리하여 플라스미드 DNA를 제조하였다. HPV 16L1 유전자 및 벡터 서열을 제한 지도화(도 14 참고) 및 염기 서열 분석을 통해 검출하여 pPICZ-16L1로 명명된, HPV 16L1 유전자를 포함하는 올바른 구조물을 확인하였다. 분비 신호(a-인자 신호)가 제작된 플라스미드로부터 절단되기 때문에, HPV 16L1 단백질은 세포 내에서 발현된 단백질이어야 한다.
실시예 17: HPV 16 L1 유전자-발현 피치아 효모 균주의 제작 및 발현
17.1. HPV 16L1 유전자-발현 피치아 효모 균주의 제작
pPICZ-16L1 플라스미드를 제한 엔도뉴클리아제 효소 SacI으로 선형화시키고, 빈 플라스미드 pPICZαB를 이와 유사하게 SacI로 분해하여 음성 대조군으로 제공하였다. 효소 분해 용액에 무수 에탄올을 첨가하여 DNA 침전물을 수득하였다. 선형화된 pPICZ-16L1 절편을 소량의 이중-증류수에 용해시키고 하기 조건 하에서 전기천공에 의해 피치아 효모 균주 X-33(인비트로젠 코포레이션)를 형질전환시켰다: DNA 절편, 5 ㎍; 전압, 1,500 볼트; 저항, 25 옴; 전기천공 시간, 5 밀리초. 전기천공된 세포를 200 ㎍/ml 제오신(제오신으로부터 입수)을 함유하는 YPDS 한천 위에 도말하였다. pPICZαB 벡터는 제오신-내성 유전자를 수반하기 때문에, 형질전환된 세포는 제오신 함유 YPDS 배지 위에서 성장할 수 있었다. 형질전환된 세포의 단일 콜로니를 분리하여, HPV 16L1 유전자-발현 피치아 효모 균주를 수득하였다.
17.2. HPV 16L1 유전자-발현 피치아 효모 균주의 발현
수득된 HPV 16L1 유전자-발현 피치아 효모 균주를 1,000 ㎍/ml 또는 1,500 ㎍/ml 제오신을 함유하는 내성 플레이트 위에 도말하였다. 고농도의 내성을 갖는 플레이트로부터 수득된 클론을 개별적으로 4 mL의 YPD 액체 배양 배지에서 24시간 동안 배양한 후 이어서 48시간 동안 BMMY 배양 배지에서 유전자 발현을 유도하였다. 이어서 세포를 원심분리에 의해 회수하고 세포의 일부를 파괴하여 웨스턴 블롯팅 동정을 수행하기 위한 상청액을 수득하였다. 동정 결과를 도 15에 나타내었고, 이는 상청액 내 HPV 16L1 단백질의 존재를 나타낸다.
서열번호: 7 서열이 본 발명의 실시예 16 및 17에서 클로닝 및 발현에 사용되었다고 하더라도, 서열번호: 8 및 9 서열들이 클로닝 및 발현에 사용된 경우에도 유사한 결과가 달성될 수 있고, 따라서 이들 2개 서열들 또한 본 발명의 범주 내에 속한다는 것은 당해 분야의 숙련자에게 자명할 것이다. 더욱이, 당해 분야의 숙련자는, 본 발명의 요지에 비추어, 유사한 서열 및 클론을 용이하게 제작하고 제작된 서열을 피치아 효모 내에서 발현시켜 유사하거나 더 나은 결과를 얻을 수 있고, 따라서 이들 서열은 또한 본 발명의 범주 내에 속하는 것으로 생각된다.
실시예 18. HPV 16 L1 단백질의 대규모 발현 및 검출
㎕1. 재조합 HPV 16 L1 단백질의 대규모 발현
접종 용액의 제조: 재조합 효모 스톡(stock)의 1개의 글리세롤 동결 튜브를 작동 중인 세포 은행으로부터 꺼내었다. 세척 후, 100 ㎕의 스톡을 5 mL의 YPD 배지에 접종하고 30℃에서 20시간 동안 280 rpm으로 배양하였으며, 이때 OD600은 1 내지 2인 것으로 검출되었고 다른 미생물로부터의 오염은 현미경적으로 관찰되지 않았다. 1 mL의 활성화 유액(만족스러운 것으로 점검되었음)을 500 mL의 YPD 배지에 접종하고 30℃에서 20시간 동안 280 rpm으로 배양하였으며, 이때 OD600은 2 내지 6인 것으로 검출되었고 다른 미생물로부터의 오염은 현미경적으로 관찰되지 않았다.
발효 공정: 발효용 기본 염 배지를 이온수를 이용해 제조하였다: BSM1(K2SO4 273 g, MgSO4 109 g, CaSO4 .2H2O 17.6 g, H3PO4 400.5 mL, KOH 62 g, 글리세롤 600 g, PTM1 60 mL, 소포제 1 mL; 15 L의 부피가 되도록 이온수 첨가). 항생제를 포함하지 않는 제조된 배지를 30 L 발효 탱크(바이오엔지니어링 코포레이션 엘티디)로 옮긴 후 121℃에서 30분간 탱크 내에서 안정화시키고, 이어서 30℃로 냉각시켰다. 앞서 준비된 접종 용액을 사용하여 1:15의 비율로 안정화 배지에 접종하였다. 발효를 미량 염 PTM1(CuSO4 .5H2O 6.0 g, NaI 0.008 g, MnSO4 3.0 g, NaMoO4 0.2 g, H3BO3 0.02 g, ZnSO4 20.0 g, CoCl2 0.5 g, FeSO4.7H2O 65.0 g, 바이오틴 0.2 g, 및 H2SO4 5.0 mL; 1 L의 부피가 되도록 이온수 첨가)을 첨가하면서, 30.0±0.5℃의 온도, 5.00±0.05의 초기 pH, 300 rpm의 초기 교반 속도, 0.5 vvm의 폭기 부피 및 100%의 용존 산소(DO)로 개시하였다. 초기 증식기를 약 20시간 동안 지속하였고, 이 기간 동안 용존 산소를 30% 이하로 유지하였다. 탄소 공급원이 완전히 소비되었을 때, 용존 산소가 신속히 증가하였고, 이 시점에서 습식 세포 중량은 최대 약 100 g/L이었다. 다음의 2시간 내에, 200 mL/h의 속도로 50%(v/v) 글리세롤 용액(리터당 12 mL의 PTM1이 첨가됨)을 발효액에 보충하였다. 이어서 이 보충을 약 8시간 동안 300 mL/h의 속도로 지속하였고, 이 기간 동안에 용존 산소를 교반 속도, 공기 유동 및 탱크 압력(<0.8 bar)을 조절하여 20%보다 높게 유지하였다. 습식 세포 중량이 약 350 g/L에 도달하였을 때, 보충을 중지하였고, 그에 따라 용존 산소는 증가하였다. 그 동안, pH 값을 6.00±0.05로 조절하였고, 메탄올(리터당 12 mL의 PTM1이 첨가됨)을 30 mL/h의 초기 첨가 속도로 첨가하여 유전자 발현을 유도하였다. 메탄올의 첨가 속도는 4시간 후 90 mL/h의 설정 속도까지 서서히 증가하였다. 유도 도중에, 용존 산소는 20%(v/v)보다 높게, 온도는 30℃로, pH는 6.00±0.05로 유지하였다. 시료를 매 8시간마다 취하였고 웨스턴 블롯팅 검출에 적용하였다. 유도하고 48시간 후, 발효를 종결하고 발효 배양액을 배출하였다.
세포의 수확: 발효 배양액을 냉장된 원심분리기를 이용해 원심분리하여 세포를 수집한 후, 이의 무게를 측정하였다. 회수된 세포에 배치 번호, 날짜 및 무게를 기록하고, 세포를 정제하거나 -20℃에 보관하였다.
2. 검출
정제된(하기 실시예 19에 기술된 방법에 따름) HPV 16L1 단백질을 사용하여 단백질 농도 표준 곡선을 작성하였다. 음성 대조군으로서 유도 전의 세포를 이용하여, 발효 도중에 피치아 효모 내 HPV 16L1 유전자의 발현을 하기에 기술된 바와 같은, 샌드위치 ELISA 방법을 이용하여 검출하였다.
HPV 16L1 단백질에 대한 토끼 다중클론 항체를 코팅 용액으로 2,000배 희석하였다. 0.1 mL의 희석된 토끼 다중클론 항체의 부분 표본을 ELISA 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 코팅 용액을 각 웰로부터 제거한 후, 이를 0.3 mL의 PBST로 세척하였다. 이어서, 각 웰을 37℃에서 2시간 동안 0.3 mL의 차단 용액과 함께 인큐베이션하여 차단하였다.
정제된 HPV 16L1 단백질을 2 ㎍/mL 내지 0.0625 ㎍/mL의 농도로 희석 완충액을 이용해 구배적으로 희석하였다. 그동안, 파괴된 발효 배양액으로부터 수득된 상청액을 200배 희석하였다. 이어서, 연속 희석에 의해 수득된 상이한 농도의 HPV 16 L1 단백질 용액 각각 및 희석된 상청액에 대해, 0.1 mL의 부분 표본을 취하고 상기-처리된 ELISA 플레이트의 개별적인 웰에 첨가한 후, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 항원 용액의 부분 표본을 각 웰로부터 제거한 후, 이를 0.3 mL의 세척 완충액으로 세척하였다. 이어서, MAB885 마우스 단일클론 항체(케미콘 코포레이션 엘티디로부터 구매함)를 희석 완충액으로 1,000배 희석하고, 0.1 mL의 희석액 부분 표본을 각 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션에 이어서, 단일클론 항체 용액을 각 웰로부터 제거한 후, 이를 0.3 mL의 세척 완충액으로 세척하였다. 그 후에, 각 웰에 희석 완충액으로 IgG를 5,000-배 희석하여 수득된 0.1 mL의 HRP 표지된 염소 항-마우스 IgG를 첨가하고, 37℃에서 0.5시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 ELISA 용액을 제거하고 각 웰을 0.3 mL의 세척 완충액으로 세척하였다. 이어서, 각 웰에 0.1 mL DAB 발색 용액을 첨가하고, 실온에서 20분간 상호작용이 일어나게 하였다. 그 후에, 0.05 mL의 2 M H2SO4 정지 용액을 각 웰에 첨가하여 반응을 중지시키고, OD450 값을 ELISA 판독기를 사용해 결정하였다.
HPV 16L1 단백질의 구배적으로 희석된 용액에 대한 OD450 값을 사용하여 단백질 농도 표준 곡선을 작성하였다. 이 표준 곡선을 사용하여, 발효 도중에 절단된 HPV 16L1 단백질의 발현량을 하기 표 9에 나타난 바와 같이, 수득하였다. 구체적으로 말하면, 공지된 농도의 정제된 표적 단백질 스톡 용액을, 예컨대 2 ㎍/mL, 1 ㎍/mL, 0.5 ㎍/mL, 0.25 ㎍/mL 및 0.125 ㎍/mL의 농도 범위의 용액으로 연속적으로 희석하고, 이를 표준 농도로 사용하였다. ELISA 검출을 이들 용액에 대해 수행하여 대응하는 OD450 값을 수득하였다. 이어서 세로 좌표는 농도를 나타내고 가로 좌표는 OD450 값을 나타내는 표준 선형 회귀 방정식을 작성하였다.
파괴된 발효 배양액으로부터 수득된 상청액을 연속적으로 희석, 예컨대 50배, 100배, 200배 및 400배로 희석하였다. OD450 값을 이들 연속 희석액에 대해 검출하였고, 대응하는 농도(㎍/mL)를 표준 선형 회귀 방정식으로부터 확인하였다. 이어서 상청액 내 표적 단백질의 농도(㎍/mL)를 확인된 농도에 대응하는 희석 배율을 곱하여 계산하였다. 파괴된 배양액이 습식 세포 중량:세포 파괴 완충액 = 1:5로부터 제조되었기 때문에, 따라서 습식 세포 내 표적 단백질의 발현량(㎍/g 습식 세포)은 상청액 내 표적 단백질의 5 × 농도(㎍/mL)였다. 발효 배양액 내 표적 단백질의 농도(㎍/L 발효 배양액)는 습식 세포 내 표적 단백질의 상기에서 수득된 발현량에 발효 배양액 내 세포의 밀도(g 습식 세포/L 발효 배양액)를 곱하여 수득하였다.
파괴된 발효 배양액으로부터 수득된 상청액 내 표적 단백질의 농도(㎍/mL) = 희석 배율 × 표준 표적 단백질 농도의 농도(㎍/mL) × OD450(파괴된 발효 배양액으로부터 수득된 상청액) / OD450 (표준 표적 단백질 농도);
발효 배양액 내 발현된 표적 단백질의 농도(㎍/L 발효 배양액) = 파괴된 발효 배양액으로부터 수득된 상청액 내 표적 단백질의 5 × 농도(㎍/mL) × 발효 배양액 내 세포의 밀도(g 습식 세포/L 발효 배양액).
발효 도중에 HPV 16L1 단백질 발현의 검출
시료 희석 배율 OD450 스톡 용액의 농도
(㎍/mL)		 평균 농도
(㎍/mL)		 전환된 농도 발효 밀도 발효 도중 발현량
파괴된 발효 배양액 200 0.601 382 381 1904㎍/g 습식 세포 472g/L 899mg/L 발효 배양액
상청액 1 100 1.034 379.5
파괴된 발효 배양액 200 0.826 578.1 542 2708㎍/g 습식 세포 347g/L 940mg/L 발효 배양액
상청액 2 100 1.323 505.1
음성 대조군 100 0.085
블랭크 대조군 - 0.077
표 9에 나타낸 결과로부터, 본 발명에 따른 HPV 16L1 단백질에 대한 유전자의 최적화 서열이 피치아 효모에서 HPV 16L1 단백질로 발현될 수 있을 뿐만 아니라, 산업적 생산의 요구조건을 충족하는, 높은 발현량을 가짐을 알 수 있다.
실시예 19: HPV 16 L1 단백질의 정제
세정: -20℃에서 보관되었던, HPV 16 L1 단백질을 발현하는 상기에서 수득된 피치아 효모 세포를 실온에서 해동시켰다. 이어서 해동된 세포를 1:3(g/mL)의 비율로 정제를 위해 세척 완충액(100 mM PB, pH 7.0, 0.15 M NaCl) 또는 물과 혼합하고, 균질기(FLUKO) 내에서 완충액 또는 물과 완전하게 균질화하였다. 그 후에, 균질액을 5분간 8000 rpm으로 고속 원심분리(SORVAL1RC6PLUS)에 적용하여 세포를 분리하고, 상청액을 옮겨 담았다. 상기 과정을 2회 반복하였고, 그로 인해 세포의 세정을 달성하였다.
파괴: 세정된 세포를 세포 파괴 완충액(200 mM MOPS, pH 7.0, 0.4 M NaCl, 0.05% 트윈-80)에 1:5(g/mL)의 비율로 첨가하여 혼합한 후, 균질기(FLUKO) 내에서 완충액과 완전하게 균질화하였다. 균질액 내 부유된 세포를 1200 내지 1300 bars 범위의 압력에서 작동하는 고압 균질기(ATSAH110B)를 사용해 파괴하였다. 이 파괴를 4회 반복한 후, 파괴된 세포 용액을 4 내지 8℃에서 배출하였고, 90%의 세포가 파괴되었다.
정화: 상기와 같이 고압 파괴에 위해 수득된 파괴된 세포 용액을 원심분리 컵 내로 붓고 고압에서 원심분리하여 세포 부스러기를 제거하여, 후속 칼럼 크로마토그래피 분리를 위한 상청액을 수득하였다. 사용된 원심분리기는 SORVAL1RC6PLUS, 로터(rotor) 모델: FIBERLITEF10-6x500y, 원심분리 설정: 9,000 rpm, 30분, 10℃이었다.
예비 정제: 크로마토그래피 매질 포로스 50HS(어플라이드 바이오시스템즈)를 크로마토그래피 칼럼(직경 26 mm, 높이 10, 부피 50 mL) 내에 로우딩하였다. 예비 정제를 하기 단계로 수행하였다: (1) 세척 및 소독: 칼럼을 2 칼럼 부피의 0.5 M NaOH로 세척하였다; (2) 재생 및 평형화: 칼럼을 2 칼럼 부피의 완충액 F로 세척한 후 완충액 E로 평형화하였다; (3) 로우딩 시료: 상기와 같이 파괴된 세포 용액을 원심분리하여 수득된 상청액을 칼럼 위에 로우딩하였다; (4) 헹굼: 기준선이 안정화될 때까지 칼럼을 5 칼럼 부피의 완충액 E로 헹구었다; (5) 용출: 칼럼을 100% 완충액 E 내지 100% 완충액 F의 선형 구배로 용출하였다; (6) 수집: 용출 분획들을 수집하고, HPV 16 L1 단백질을 포함하는 분획들(SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅에 의해 검출됨)을 조합하여 미세 정제에 사용하였다.
미세 정제: 크로마토그래피 매질 CHT(BIO-RAD, 타입 II, 40 ㎛)를 크로마토그래피 칼럼(직경 26 mm, 높이 10 cm, 부피 50 mL) 내에 로우딩하였다. 미세 정제를 하기 단계로 수행하였다: (1) 세척 및 소독: 칼럼을 2 칼럼 부피의 0.5 M NaOH로 세척하였다; (2) 재생 및 평형화: 칼럼을 2 칼럼 부피의 완충액 H로 세척한 후 완충액 G로 평형화하였다; (3) 로우딩 시료: 예비 정제 후 수집된 시료를 20 mM의 최종 농도로 PB에 첨가한 후 칼럼 위에 로우딩하였다; (4) 헹굼: 기저선이 안정화될 때까지 칼럼을 5 칼럼 부피의 완충액 G로 헹구었다; (5) 용출: 칼럼을 100% 완충액 G 내지 100% 완충액 H의 선형 구배로 용출하였다; (6) 수집: 용출 분획들을 수집하고 HPV 16L1 단백질을 포함하는 분획들을 조합하여 최종 정제된 시료를 수득하였다. 정제된 시료를 단량체성 단백질로 환원시킨 후 이를 환원 SDS-PAGE(Bio-RAD)(도 16 참고) 및 모세관 전기영동(도 17 참고)에 적용하여, 90% 보다 높은 순도를 가짐을 확인하였다. HPV 16L1에 대한 모세관 전기영동의 매개변수는 다음과 같다:
Figure pct00001
웨스턴 블롯(Bio-RAD) 검출은 표적 전기영동 밴드와 HPV 16 L1 단백질에 대한 단일클론 또는 다중클론 항체 사이의 특이적 염색 반응을 나타내었다. 동적 광 산란 검출(Malvern Instruments Zetasizer　Nano　ZS)은 정제된 시료가 약 50 내지 80 nm 크기 범위의 입자를 가짐을 나타내었고, 전자 현미경 관찰(Philips Tecnai-12Biotwin transmission electron microscope, Electron Microscope Laboratory, Science and Technology Center, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, China)은 약 50 내지 80 nm 범위의 입자 크기를 갖는, 정제된 시료 내 바이러스-유사 입자(VLPs)의 구조를 나타내었다(도 18 참고).
실시예 20: HPV 16 L1 백신의 제조
상기 실시예 19에서 수득된 정제된 HPV 16L1 단백질을 알루미늄 항원보강제에 흡착시켜 중국 약전(Chinese Pharmacopoeia, 2005판)에 기술된 방법에 따라 면역원성 HPV 16L1 백신을 제조하였다.
실시예 21. HPV 16 L1 유전자의 발현 생성물의 면역원성 결정
24마리의 6 내지 8주령 SPF BALB/c 마우스를 각 그룹당 6마리씩 4 그룹으로 나누었다. 첫 번째 그룹의 마우스(음성 대조군임)를 각각 0, 7 및 21일째에 3회 0.1 mL의 알루미늄 항원보강제-함유 완충액(0.32 M 염화나트륨, 0.35 mM 붕산나트륨, 0.01% 트윈-80, 0.01 M 히스티딘, pH 6.5)의 피하 주사로 면역시키고, 다른 3 그룹의 마우스(검사 그룹임)를 각각 5 ㎍/mL, 0.5 ㎍/mL 및 0.05 ㎍/mL의 농도로 0.1 mL의 알루미늄 항원보강제-흡착된 VLPs로 유사하게 면역시켰다. 혈액 시료를 세 번째 면역접종 후 2주간 수집하였다. 수집된 혈액 시료를 2시간 동안 37℃에 보관한 후 10분간 4,000 g로 원심분리하였다. 마우스 다중클론 항혈청으로 수득된, 상청액을 흡인기로 빨아내고 -20℃에 보관하였다. 부가적으로, 상청액을 하기에 기술된 바와 같이, 항체양전율 및 역가에 대해 분석하였다.
21.1. 항체양전율의 검출
피치아 효모에 의해 발현된 정제된 HPV 16L1 단백질을 코팅 용액을 이용해 1 ㎍/mL로 희석하였다. 0.1 mL의 희석액 부분 표본을 ELISA 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 코팅 용액을 각 웰로부터 제거한 후, 이를 0.3 mL의 PBST로 세척하였다. 이어서, 각 웰을 37℃에서 2시간 동안 0.3 mL의 차단 용액(5% 탈지분유 분말 + PBST)과 인큐베이션하여 차단하였다. 각 웰에 1:400의 비율로 혈청을 희석 완충액(2% 탈지분유 분말 + PBST)으로 희석하여 수득된 0.1 mL의 검사 혈청(알루미늄 항원보강제-흡착된 HPV 16L1 단백질로 면역시킨 마우스로부터 수득된 혈청 및 알루미늄 항원보강제 단독으로 면역시킨 마우스로부터 수득된 혈청) 용액을 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 검사 혈청 용액을 제거하고 각 웰을 0.3 mL의 세척 완충액으로 세척하였다. 그 후에, 각 웰에 1:5,000의 비율로 IgG를 희석 완충액으로 희석하여 수득된 0.1 mL의 HRP 표지된 염소 항-마우스 IgG를 첨가하고 37℃에서 0.5시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, ELISA 용액을 제거하고 각 웰을 0.3 mL의 세척 완충액으로 세척하였다. 이어서, 각 웰에 0.1 mL DAB 발색 용액을 첨가하고, 20분간 실온의 암실에서 상호작용이 일어나게 하였다. 그 후에, 0.05 mL의 2 M H2SO4 정지 용액을 각 웰에 첨가하여 반응을 중지시키고, OD450 값을 ELISA 판독기를 사용해 결정하고, 판독값을 하기 표 10에 나타내었다.
OD450 판독값
마우스 1 마우스 2 마우스 3 마우스 4 마우스 5 마우스 6
5 ㎍ 면역접종 그룹 1.306 1.961 1.840 1.280 0.992 0.889
0.5 ㎍ 면역접종 그룹 0.194 1.526 0.795 0.220 0.263 1.056
0.05 ㎍ 면역접종 그룹 0.786 1.481 0.648 0.377 0.287 0.161
알루미늄 항원보강제 그룹 0.100 0.137 0.092 0.119 0.099 0.128
컷오프 값 0.167
컷오프 값은 음성 대조군으로 검사 혈청(알루미늄 항원보강제로의 면역접종으로부터 수득된 마우스 혈청)에 대한 항체의 OD450 값들의 평균에 더하여 3× 표준 편차의 합이다. 컷오프 값보다 큰 OD450 값을 갖는 마우스는 양성으로 간주하였고, 컷오프 값보다 작은 OD450 값을 갖는 마우스는 음성으로 간주하였다. 3개 검사 그룹에 대한 항체양전율의 결과를 하기 표 11에 나타내었다.
항체양전율의 결과
5 ㎍/mL 면역접종 그룹 0.5 ㎍/mL 면역접종 그룹 0.05 ㎍/mL 면역접종 그룹
항체양전율 100% 100% 83%
21.2. 혈청 역가의 결정
정제된 HPV 16L1 단백질을 코팅 용액으로 1 ㎍/mL로 희석하였다. 0.1 mL의 희석액 부분 표본을 ELISA 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 코팅 용액을 각 웰로부터 제거한 후, 이를 0.3 mL의 PBST로 세척하였다. 이어서, 각 웰을 37℃에서 2시간 동안 0.3 mL의 차단 용액(5% 탈지분유 분말 + PBST)과 함께 인큐베이션하여 차단하였다. 검사 혈청(HPV 16L1 단백질로 면역시킨 마우스로부터 수득된 혈청)은 희석 완충액(2% 탈지분유 분말 + PBST)을 이용해 1:500 희석 내지 1:32,000 희석으로 연속적으로 이중 희석한 반면, 음성 대조군 혈청(알루미늄 항원보강제로 면역시킨 마우스로부터 수득된 혈청)은 1:10,000의 비율로 희석하였다. 각 웰에 0.1 mL의 희석된 혈청(검사 혈청 또는 음성 대조군 혈청)의 부분 표본을 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 검사 혈청 용액을 제거하고 각 웰을 0.3 mL의 세척 완충액으로 세척하였다. 그 후에, 각 웰에 1:5,000의 비율로 IgG를 희석 완충액으로 희석하여 수득된 0.1 mL의 HRP 표지된 양 항-마우스 IgG를 첨가하고, 37℃에서 0.5시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 ELISA 용액을 제거하고 각 웰을 0.3 mL의 세척 완충액으로 세척하였다. 이어서, 각 웰에 0.1 mL DAB 발색 용액을 첨가하고, 20분간 실온에서 상호작용이 일어나게 하였다. 반응 후, 0.05 mL의 2 M H2SO4 정지 용액을 각 웰에 첨가하여 반응을 중지시키고, OD450 값을 ELISA 판독기를 사용해 결정하였다
혈청 역가를 종점 역가 방법에 의해 계산하였고, 그 결과를 하기 표 12에 나타내었다.
역가 결정 결과
마우스 1 마우스 2 마우스 3 마우스 4 마우스 5 마우스 6
5 ㎍ 면역접종 그룹 71727 48969 30700 64289 118279 4598178
0.5 ㎍ 면역접종 그룹 7309 52706 335668 4593 47049 85822
0.05 ㎍ 면역접종 그룹 24330 42552 8421 5751 7108 <400
요약하면, 실시예 15-21에 나타난 바와 같이, 인간 파필로마 바이러스의 주요 캡시드 단백질 L1 아형 16에 대한 유전자는, 본 발명에 의해 제공된 바와 같은, 최적화 HPV 16L1 유전자이고, 이는 효모 숙주 내에서 표적 단백질을 효율적으로 발현하는데 더욱 적합하고 산업적 생산의 요구조건을 만족하는 이점을 갖는다. 더욱이, 항원보강제-흡착된 정제 VLPs(HPV 18L1 단백질로부터 자가-조립된 바이러스-유사 입자)로부터 제조된, 본 발명에 의해 제공된 바와 같은 HPV 18L1 백신은 항체양전율 및 혈청 역가에 의해 결정되는 바와 같이 마우스 내에서 강력히 면역성인 것으로 입증되었다. 또한, 상기 방법은 피치아 효모 발현 시스템의 사용으로 인해 저 비용, 고 효율 및 생성물의 더욱 균일하고 적합한 품질이라는 이점을 갖는다.
실시예 22. HPV 16 L1 VLPs 의 중화 활성
마우스를 상기에 기술된 것과 동일한 과정으로 면역시키고 면역접종 후 2주간 혈액을 수집하였다. 수집된 혈액을 37℃에서 2시간 동안 보관한 후, 4,000 g에서 10분간 원심분리하였다. 마우스 다중클론 항혈청으로 수득된, 상청액을 흡인기로 빨아내고 -20℃에 보관하였다.
293FT 세포(인비트로젠)를 초기에 15 cm 세포 배양 접시(1.1×107 세포/접시) 위에 도말하였다. 24시간 후, 세포를 인산칼슘 형질감염 방법을 이용해 각각 20 ㎍, 10 ㎍ 및 10 ㎍의 양으로 플라스미드 p16L1h, p16L2h(Buck CB, Pastrana DV, Lowy DR et al. Efficient IntraceL1ular Assembly of Papillomaviral Vectors. J Virol, 2004, 78(2):751-757) 및 녹색 형광 유전자-운반 pIRES2-EGFP(BD 바이오사이언스 클론테크로부터 구매함)로 동시-형질감염시켰다. 24시간 후, 세포를 관찰하고, 수집하고 용해시켰다. 세포 용해 상청액을 즉시 정제하거나 -80℃에 보관하였다.
16℃에서 4시간 동안 100,000 g로 30% 옵티프렙 밀도 구배 원심분리(MLS-50 원심분리 로터, 베크만 초고속 원심분리)를 이용해 5 mL 원심분리 튜브(Beckman) 내에서 세포 용해 상청액을 원심분리하여 정제를 수행하였다. 각각의 분획이 약 500 ㎕인 원심분리 분획들을 수집하고, 웨스턴 블롯팅을 이용해 HPV 16 L1 단백질의 함량에 대해 분석하였다. 가장 높은 농도의 L1 단백질을 함유하는 분획들을 슈도타입 바이러스 용액으로 조합한 후, 이를 부분 표본으로 나누어 -80℃에 보관하였다.
293FT 세포를 24-웰 세포 배양 플레이트(1.5×105 세포/웰) 위에 도말하였다. 24시간 후, 중화 실험을 하기와 같이 수행하였다. 상이한 혈청 시료를 DMEM 배지로 연속적으로 100-배 희석하였다. 각 희석액의 50 ㎕ 부분 표본을 DMEM 배지로 희석된 50 ㎕의 슈도타입 바이러스 용액과 혼합하고, 각 혼합물을 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 각각 인큐베이션된 혼합물을 293FT 세포로 사전-도말된 24-웰 세포 배양 플레이트 내에 첨가하고 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 OLUMPUSCKX41F32FL 도립 형광 현미경 하에서 녹색 형광 단백질의 발현에 대해 관찰하고, 도 19에 나타난 바와 같이, 형광 이미지를 수집하였다. 도 19A에 형광이 나타났는데, 이는 HPV 16 슈도타입 바이러스가 293FT 세포를 감염시켰음을 나타내었다. 도 19B에 소량의 형광이 남아있는데, 이는 마우스 혈청이 HPV 16 슈도타입 바이러스를 중화시켜, 293FT 세포의 바이러스 감염을 감소시켰음을 나타내었다. 따라서 재조합 HPV 16L1 VLPs 백신으로 면역시킨 마우스가 세포 내로 슈도타입 바이러스의 진입을 억제하는 중화 항체를 생산할 수 있음이 명백하다.
본 발명에서, 염기 서열 서열번호: 8 또는 9가 각각 상기 실시예에서 서열번호: 7을 대체하여 상기 실시예에 기술된 바와 같은 방법을 이용하여 본 발명의 HPV 16 L1 단백질 및 그의 절단된 형태를 제조할 수 있다. 상기 유전자들은 또한 적합한 클로닝 방식으로, 다른 현존하는 피치아 효모 발현 벡터, 예컨대 pPIC6, pGAPZ 또는 pAO815 내로 클로닝될 수 있다. 이어서 수득된 재조합 발현 벡터는 유전적으로 조작된 균주를 제작하기 위해 다른 피치아 효모 균주, 예컨대 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115, KM71 또는 SMD1168 균주를 형질전환시키는데 사용될 수 있다. 배양 및 발효, 분리 및 정제(본 명세서에 기술되지 않음)의 통상적인 방법을 이용하여, 본 발명의 HPV 16 L1 단백질(HPV 16 L1 VLPs) 또는 그의 절단된 형태는 유전적으로 조작된 균주로부터 수득될 수 있다. 그렇게 제조된 HPV 16 L1 단백질 또는 그의 절단된 형태는 상기 실시예에서 제조된 HPV 16 L1 단백질 또는 그의 절단된 형태의 것과 유사한 면역원성을 가질 것이다.
본 명세서에 언급된 모든 참고문헌은 각각이 개별적으로 참고로서 본 명세서에 포함되는 것과 같이 본 명세서에 참고로서 포함된다. 또한, 당해 분야의 숙련자는, 본 명세서의 상기에 기술된 교시에 비추어, 본 발명의 요지로부터 벗어나지 않으면서 본 발명에 다양한 변화 및 변경을 가할 수 있는 것으로 이해되고, 이들 등가물은 첨부된 특허청구범위 정의된 바와 같은 본 발명의 범주 내에 속하는 것으로 생각된다.
Sequence Listing <110> Shanghai Zerun Biotechnology Co., Ltd <120> Genes encoding Major Capsid Protein L1 of Human Papilloma Virus and Use of the Same <130> 086995PCWO <160> 19 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1524 <212> DNA <213> Artificial sequence <221> misc_feature <223> Polynucleotide <400> 1 atggctttgt ggagaccttc tgacaacact gtttacttgc cacctccatc cgttgctaga 60 gttgttaaca ctgatgacta cgttactaga acttctattt tctaccacgc tggttcctct 120 agattgttga ctgttggtaa cccttacttt agagttccag ctggtggtgg taacaagcaa 180 gatattccta aggtttccgc ttaccaatac agagttttca gagttcaatt gccagaccct 240 aacaagtttg gtttgccaga tacttctatt tacaaccctg agactcaaag attggtttgg 300 gcttgtgctg gtgttgaaat tggtagaggt caaccattgg gtgttggttt gtccggtcat 360 cctttctaca acaagttgga cgatactgag tcttcccacg ctgctacttc taacgtttcc 420 gaagacgtta gagataacgt ttctgttgac tacaagcaaa ctcaattgtg tattttgggt 480 tgtgctccag ctattggtga gcattgggct aagggtactg cttgtaagtc cagacctttg 540 tctcaaggtg attgtccacc tttggaattg aagaacactg ttttggagga cggtgatatg 600 gttgacactg gttacggtgc tatggatttc tccactttgc aagacactaa gtgtgaagtt 660 ccattggata tttgtcaatc tatttgtaag taccctgact acttgcaaat gtccgctgat 720 ccatacggtg actctatgtt cttttgtttg agaagagagc aattgttcgc tagacacttt 780 tggaacagag ctggtactat gggtgatact gttcctcaat ccttgtacat taagggtact 840 ggtatgagag cttctccagg ttcctgtgtt tactctcctt ccccatctgg ttccattgtt 900 acttctgact cccaattgtt caacaagcct tactggttgc ataaggctca aggtcacaac 960 aacggtgttt gttggcataa ccaattgttt gttactgttg ttgatactac tagatccact 1020 aacttgacta tttgtgcttc cactcaatct ccagttcctg gtcaatacga cgctactaag 1080 ttcaagcaat actccagaca cgttgaagag tacgatttgc aattcatctt ccaattgtgt 1140 actattactt tgactgctga cgttatgtct tacattcatt ccatgaactc ttccattttg 1200 gaagattgga actttggtgt tccacctcca cctactactt ctttggttga cacttacaga 1260 ttcgttcaat ccgttgctat tacttgtcaa aaggatgctg ctccagctga gaacaaggac 1320 ccttacgata agttgaagtt ttggaacgtt gacttgaagg aaaagttctc tttggatttg 1380 gaccaatacc cattgggtag aaagtttttg gttcaagctg gtttgagaag aaagcctact 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aacccaggtg attgtccacc attggaattg attaacactg ttattcaaga tggtgatatg 600 gttgatactg gttttggtgc tatggatttt actactttgc aagctaacaa gtctgaagtt 660 ccattggata tttgtacttc tatttgtaag tacccagatt acattaagat ggtttctgaa 720 ccatacggtg attctttgtt tttttacttg agaagagaac aaatgtttgt tagacacttg 780 tttaacagag ctggtgctgt tggtgaaaac gttccagatg atttgtacat taagggttct 840 ggttctactg ctaacttggc ttcttctaac tactttccaa ctccatctgg ttctatggtt 900 acttctgatg ctcaaatttt taacaagcca tactggttgc aaagagccca aggtcataac 960 aacggtattt gttggggtaa ccaattgttt gttactgttg ttgatactac tagatctact 1020 aacatgtctt tgtgtgctgc tatttctact tctgaaacta cttacaagaa cactaacttt 1080 aaggaatact tgagacacgg tgaagaatac gatttgcaat ttatttttca attgtgtaag 1140 attactttga ctgctgatgt tatgacttac attcattcta tgaactctac tattttggaa 1200 gattggaact ttggtttgca accaccacca ggtggtactt tggaagatac ttacagattt 1260 gttacttctc aagctattgc ttgtcaaaag cacactccac cagctccaaa ggaagatcca 1320 ttgaagaagt acactttttg ggaagttaac ttgaaggaaa agttttctgc tgatttggat 1380 caatttccat tgggtagaaa gtttttgttg caagctggtt tgaaggctaa gccaaagttt 1440 actttgggta agagaaaggc tactccaact acttcttcta cttctactac tgctaagaga 1500 aagaagagaa agttgtaa 1518 <210> 8 <211> 1521 <212> DNA <213> Artificial sequence <221> misc_feature <223> Oligonucleotide <400> 8 atgtctttgt ggttgccatc tgaagctact gtttacttgc caccagttcc agtttctaaa 60 gttgtttcta ctgacgaata cgttgctaga actaatattt actaccatgc tggtacttct 120 agattgttgg ctgttggtca tccatacttt ccaattaaaa aaccaaataa taataaaatt 180 ttggttccaa aagtttctgg tttgcaatac agagttttta gaattcattt gccagaccca 240 aataaatttg gttttccaga cacttctttt tacaatccag acactcaaag attggtttgg 300 gcttgtgttg gtgttgaagt tggtagaggt caaccattgg gtgttggtat ttctggtcat 360 ccattgttga ataaattgga cgacactgaa aatgcttctg cttacgctgc taatgctggt 420 gttgacaata gagaatgtat ttctatggac tacaaacaaa ctcaattgtg tttgattggt 480 tgtaaaccac caattggtga acattggggt aaaggttctc catgtactaa tgttgctgtt 540 aatccaggtg actgtccacc attggaattg attaatactg ttattcaaga cggtgacatg 600 gttgacactg gttttggtgc tatggacttt actactttgc aagctaataa atctgaagtt 660 ccattggaca tttgtacttc tatttgtaaa tacccagact acattaaaat ggtttctgaa 720 ccatacggtg actctttgtt tttttacttg agaagagaac aaatgtttgt tagacatttg 780 tttaatagag ctggtgctgt tggtgaaaat gttccagacg acttgtacat taaaggttct 840 ggttctactg ctaatttggc ttcttctaat tactttccaa ctccatctgg ttctatggtt 900 acttctgacg ctcaaatttt taataaacca tactggttgc aaagagctca aggtcataat 960 aatggtattt gttggggtaa tcaattgttt gttactgttg ttgacactac tagatctact 1020 aatatgtctt tgtgtgctgc tatttctact tctgaaacta cttacaaaaa tactaatttt 1080 aaagaatact tgagacatgg tgaagaatac gacttgcaat ttatttttca attgtgtaaa 1140 attactttga ctgctgacgt tatgacttac attcattcta tgaattctac tattttggaa 1200 gactggaatt ttggtttgca accaccacca ggtggtactt tggaagacac ttacagattt 1260 gttacttctc aagctattgc ttgtcaaaaa catactccac cagctccaaa agaagaccca 1320 ttgaaaaaat acactttttg ggaagttaat ttgaaagaaa aattttctgc tgacttggac 1380 caatttccat tgggtagaaa atttttgttg caagctggtt tgaaagctaa accaaaattt 1440 actttgggta aaagaaaagc tactccaact acttcttcta cttctactac tgctaaaaga 1500 aaaaaaagaa aattgtaata g 1521 <210> 9 <211> 1521 <212> DNA <213> Artificial sequence <221> misc_feature <223> Oligonucleotide <400> 9 atgtctttgt ggttgccatc tgaagctact gtttatttgc caccagttcc agtttctaag 60 gttgtttcta ctgatgaata tgttgctaga actaacattt attatcatgc tggaacttct 120 agattgttgg ctgttggaca tccatatttc ccaattaaga agccaaacaa caacaagatt 180 ttggttccaa aggtttctgg attgcaatat agagttttca gaattcattt gccagatcca 240 aacaagttcg gattcccaga tacttctttc tataacccag atactcaaag attggtttgg 300 gcttgtgttg gagttgaagt tggaagagga caaccattgg gagttggaat ttctggacat 360 ccattgttga acaagttgga tgatactgaa aacgcttctg cttatgctgc taacgctgga 420 gttgataaca gagaatgtat ttctatggat tataagcaaa ctcaattgtg tttgattgga 480 tgtaagccac caattggaga acattgggga aagggatctc catgtactaa cgttgctgtt 540 aacccaggag attgtccacc attggaattg attaacactg ttattcaaga tggagatatg 600 gttgatactg gattcggagc tatggatttc actactttgc aagctaacaa gtctgaagtt 660 ccattggata tttgtacttc tatttgtaag tatccagatt atattaagat ggtttctgaa 720 ccatatggag attctttgtt cttctatttg agaagagaac aaatgttcgt tagacatttg 780 ttcaacagag ctggagctgt tggagaaaac gttccagatg atttgtatat taagggatct 840 ggatctactg ctaacttggc ttcttctaac tatttcccaa ctccatctgg atctatggtt 900 acttctgatg ctcaaatttt caacaagcca tattggttgc aaagagctca aggacataac 960 aacggaattt gttggggaaa ccaattgttc gttactgttg ttgatactac tagatctact 1020 aacatgtctt tgtgtgctgc tatttctact tctgaaacta cttataagaa cactaacttc 1080 aaggaatatt tgagacatgg agaagaatat gatttgcaat tcattttcca attgtgtaag 1140 attactttga ctgctgatgt tatgacttat attcattcta tgaactctac tattttggaa 1200 gattggaact tcggattgca accaccacca ggaggaactt tggaagatac ttatagattc 1260 gttacttctc aagctattgc ttgtcaaaag catactccac cagctccaaa ggaagatcca 1320 ttgaagaagt atactttctg ggaagttaac ttgaaggaaa agttctctgc tgatttggat 1380 caattcccat tgggaagaaa gttcttgttg caagctggat tgaaggctaa gccaaagttc 1440 actttgggaa agagaaaggc tactccaact acttcttcta cttctactac tgctaagaga 1500 aagaagagaa agttgtaata g 1521 <210> 10 <211> 568 <212> PRT <213> Human papilloma virus <400> 10 Met Cys Leu Tyr Thr Arg Val Leu Ile Leu His Tyr His Leu Leu Pro 1 5 10 15 Leu Tyr Gly Pro Leu Tyr His Pro Gln Pro Leu Pro Leu His Ser Ile 20 25 30 Leu Val Tyr Met Val His Ile Ile Ile Cys Gly His Tyr Ile Ile Leu 35 40 45 Phe Leu Arg Asn Val Asn Val Phe Pro Ile Phe Leu Gln Met Ala Leu 50 55 60 Trp Arg Pro Ser Asp Asn Thr Val Tyr Leu Pro Pro Pro Ser Val Ala 65 70 75 80 Arg Val Val Asn Thr Asp Asp Tyr Val Thr Arg Thr Ser Ile Phe Tyr 85 90 95 His Ala Gly Ser Ser Arg Leu Leu Thr Val Gly Asn Pro Tyr Phe Arg 100 105 110 Val Pro Ala Gly Gly Gly Asn Lys Gln Asp Ile Pro Lys Val Ser Ala 115 120 125 Tyr Gln Tyr Arg Val Phe Arg Val Gln Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe 130 135 140 Gly Leu Pro Asp Thr Ser Ile Tyr Asn Pro Glu Thr Gln Arg Leu Val 145 150 155 160 Trp Ala Cys Ala Gly Val Glu Ile Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val 165 170 175 Gly Leu Ser Gly His Pro Phe Tyr Asn Lys Leu Asp Asp Thr Glu Ser 180 185 190 Ser His Ala Ala Thr Ser Asn Val Ser Glu Asp Val Arg Asp Asn Val 195 200 205 Ser Val Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Ile Leu Gly Cys Ala Pro 210 215 220 Ala Ile Gly Glu His Trp Ala Lys Gly Thr Ala Cys Lys Ser Arg Pro 225 230 235 240 Leu Ser Gln Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Lys Asn Thr Val Leu 245 250 255 Glu Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Tyr Gly Ala Met Asp Phe Ser 260 265 270 Thr Leu Gln Asp Thr Lys Cys Glu Val Pro Leu Asp Ile Cys Gln Ser 275 280 285 Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Gln Met Ser Ala Asp Pro Tyr Gly 290 295 300 Asp Ser Met Phe Phe Cys Leu Arg Arg Glu Gln Leu Phe Ala Arg His 305 310 315 320 Phe Trp Asn Arg Ala Gly Thr Met Gly Asp Thr Val Pro Gln Ser Leu 325 330 335 Tyr Ile Lys Gly Thr Gly Met Arg Ala Ser Pro Gly Ser Cys Val Tyr 340 345 350 Ser Pro Ser Pro Ser Gly Ser Ile Val Thr Ser Asp Ser Gln Leu Phe 355 360 365 Asn Lys Pro Tyr Trp Leu His Lys Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Val 370 375 380 Cys Trp His Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser 385 390 395 400 Thr Asn Leu Thr Ile Cys Ala Ser Thr Gln Ser Pro Val Pro Gly Gln 405 410 415 Tyr Asp Ala Thr Lys Phe Lys Gln Tyr Ser Arg His Val Glu Glu Tyr 420 425 430 Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Thr Ile Thr Leu Thr Ala Asp 435 440 445 Val Met Ser Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Ser Ile Leu Glu Asp Trp 450 455 460 Asn Phe Gly Val Pro Pro Pro Pro Thr Thr Ser Leu Val Asp Thr Tyr 465 470 475 480 Arg Phe Val Gln Ser Val Ala Ile Thr Cys Gln Lys Asp Ala Ala Pro 485 490 495 Ala Glu Asn Lys Asp Pro Tyr Asp Lys Leu Lys Phe Trp Asn Val Asp 500 505 510 Leu Lys Glu Lys Phe Ser Leu Asp Leu Asp Gln Tyr Pro Leu Gly Arg 515 520 525 Lys Phe Leu Val Gln Ala Gly Leu Arg Arg Lys Pro Thr Ile Gly Pro 530 535 540 Arg Lys Arg Ser Ala Pro Ser Ala Thr Thr Ser Ser Lys Pro Ala Lys 545 550 555 560 Arg Val Arg Val Arg Ala Arg Lys 565 <210> 11 <211> 505 <212> PRT <213> Human papilloma virus <400> 11 Met Ser Leu Trp Leu Pro Ser Glu Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val 1 5 10 15 Pro Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Ala Arg Thr Asn 20 25 30 Ile Tyr Tyr His Ala Gly Thr Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro 35 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Arg His Leu Phe Asn Arg Ala Gly Ala Val Gly Glu Asn Val Pro 260 265 270 Asp Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gly Ser Thr Ala Asn Leu Ala Ser 275 280 285 Ser Asn Tyr Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Asp Ala 290 295 300 Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln Gly His Asn 305 310 315 320 Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr 325 330 335 Thr Arg Ser Thr Asn Met Ser Leu Cys Ala Ala Ile Ser Thr Ser Glu 340 345 350 Thr Thr Tyr Lys Asn Thr Asn Phe Lys Glu Tyr Leu Arg His Gly Glu 355 360 365 Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Lys Ile Thr Leu Thr 370 375 380 Ala Asp Val Met Thr Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Thr Ile Leu Glu 385 390 395 400 Asp Trp Asn Phe Gly Leu Gln Pro Pro Pro Gly Gly Thr Leu Glu Asp 405 410 415 Thr Tyr Arg Phe Val Thr Ser Gln Ala Ile Ala Cys Gln Lys His Thr 420 425 430 Pro Pro Ala Pro Lys Glu Asp Pro Leu Lys Lys Tyr Thr Phe Trp Glu 435 440 445 Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln Phe Pro Leu 450 455 460 Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ala Gly Leu Lys Ala Lys Pro Lys Phe 465 470 475 480 Thr Leu Gly Lys Arg Lys Ala Thr Pro Thr Thr Ser Ser Thr Ser Thr 485 490 495 Thr Ala Lys Arg Lys Lys Arg Lys Leu 500 505 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Primer <400> 12 atagaattca tgtgtttgta cactagagt 29 <210> 13 <211> 31 <212> DNA <213> Primer <400> 13 aatggtaccc tattactttc tagctctaac t 31 <210> 14 <211> 39 <212> DNA <213> Primer <400> 14 tcccaatctt cgaaacgatg tgtttgtaca ctagagttt 39 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Primer <400> 15 tcccaatctt cgaaacgatg gctttgtgga 30 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> Primer <400> 16 atagaattca tgtctttgtg gttgccatc 29 <210> 17 <211> 31 <212> DNA <213> Primer <400> 17 ataggtaccc tattacaact ttctcttctt t 31 <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213> Primer <400> 18 actaattatt cgaaacgatg tctttgtgg 29 <210> 19 <211> 32 <212> DNA <213> Primer <400> 19 agcggtaccc tattacaact ttctcttctt tc 32

Claims (17)

  1. 피치아 효모(Pichia yeast)에 의해 선호되는 코돈을 갖는, 인간 파필로마 바이러스의 주요 캡시드 단백질 L1을 암호화하는 단리된 유전자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 유전자가 서열번호: 10 또는 서열번호: 10의 위치 62 내지 568에 개시된 아미노산 서열을 갖는 인간 파필로마 바이러스의 주요 캡시드 단백질을 암호화하는 유전자.
  3. 제2항에 있어서, 상기 유전자가 서열번호: 1, 서열번호: 2 및 서열번호: 3에 개시된 것들로부터 선택되는 염기 서열을 갖는 유전자.
  4. 제2항에 있어서, 상기 유전자가 서열번호: 4, 서열번호: 5 및 서열번호: 6에 개시된 것들로부터 선택되는 염기 서열을 갖는 유전자.
  5. 제1항에 있어서, 상기 유전자가 서열번호: 11에 개시된 아미노산 서열을 갖는 인간 파필로마 바이러스의 주요 캡시드 단백질 L1을 암호화하는 유전자.
  6. 제5항에 있어서, 상기 유전자가 서열번호: 7, 서열번호: 8 및 서열번호: 9 에 개시된 것들로부터 선택되는 염기 서열을 갖는 유전자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 유전자의 서열을 포함하는 발현 벡터.
  8. 제7항에 따른 발현 벡터를 포함하거나, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 유전자를 갖는, 유전적으로 조작된 숙주 세포.
  9. 제8항에 있어서, 상기 세포가 피치아 효모 세포인 숙주 세포.
  10. 50 내지 80 nm의 직경을 갖고, 본질적으로 인간 파필로마 바이러스의 주요 캡시드 단백질 L1으로 자가-조립되고, 상기 인간 파필로마 바이러스의 주요 캡시드 단백질 L1이 피치아 효모에 의해 발현되는, 면역원성 거대분자.
  11. 제10항에 있어서, 상기 면역원성 거대분자가 하기 방법에 의해 제조되는 면역원성 거대분자:
    (1) 제9항에 따른 숙주 세포를 배양하여 상기 인간 파필로마 바이러스의 주요 캡시드 단백질 L1이 발현되고 상기 숙주 세포 내에서 상기 면역원성 거대분자로 자가-조립되게 하는 단계; 및
    (2) 상기 면역원성 거대분자를 분리하는 단계.
  12. 하기를 포함하는, 제10항에 따른 면역원성 거대분자를 제조하는 방법:
    (1) 제9항에 따른 숙주 세포를 배양하여 상기 인간 파필로마 바이러스의 주요 캡시드 단백질 L1이 발현되고 상기 숙주 세포 내에서 상기 면역원성 거대분자로 자가-조립되게 하는 단계; 및
    (2) 상기 면역원성 거대분자를 분리하는 단계.
  13. 제12항에 있어서, 상기 단계 (2)가:
    (a) 단계 (1)에서 수득된 숙주 세포를 파괴하여 상기 면역원성 거대분자를 포함하는 상청액을 수득하는 단계; 및
    (b) 단계 (a)에서 수득된 상청액을 포로스(포로스) 50 HS 칼럼 크로마토그래피 및 CHT 칼럼 크로마토그래피를 사용해 연속적으로 정제하여 상기 면역원성 거대분자를 수득하는 단계를 포함하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 단계 (b)에서,
    포로스 50 HS 칼럼 크로마토그래피를 사용하는 정제가 하기와 같이 수행되고: 단계 (a)에서 수득된 상청액을 세척되고 평형화된 포로스 50HS 칼럼 위에 로우딩하여 상기 면역원성 거대분자를 칼럼에 결합시키고, 이를 헹구고 평형화시킨 후, 칼럼을 100% 완충액 A 내지 100% 완충액 B의 선형 구배로 용출하고, 70-100 ms/cm에서의 크로마토그래피 피크를 수집하고, 여기서 상기 완충액 A는 50±20 mM MOPS, 0.75±0.3 M NaCl 및 0.05±0.02% 트윈-80, pH 6.5±1을 포함하고, 상기 완충액 B는 50±20 mM MOPS, 1.5M NaCl 및 0.05±0.02% 트윈-80, pH 6.5±1을 포함함; 또는
    CHT 칼럼 크로마토그래피를 사용하는 정제가 하기와 같이 수행되는 방법: 포로스 50 HS 칼럼 크로마토그래피로부터 정제된 생성물을 세척되고 평형화된 CHT 칼럼 위에 로우딩하고, 이를 헹구고 평형화시킨 후, 칼럼을 완충액 C 내지 100% 완충액 D의 선형 구배로 용출하고, 크로마토그래피 피크를 50-70 ms/cm에서 수집하고, 여기서 상기 완충액 C는 50±20 mM MOPS, 0.5±0.2 M NaCl, 0.04±0.02 M PB 및 0.05±0.02% 트윈-80, pH 6.5±1을 포함하고, 상기 완충액 D는 0.5±0.2 M NaCl, 200 mM PB, 및 0.05±0.02% 트윈-80, pH 6.5±1을 포함함.
  15. 하기를 포함하는 면역원성 조성물:
    (i) 유효량의 제10항에 따른 상기 면역원성 거대분자; 및
    (ii) 약학적으로 허용가능한 담체.
  16. 인간 파필로마 바이러스 감염과 관련된 질환의 예방 또는 치료에 있어 제10항에 따른 상기 면역원성 거대분자의 용도.
  17. 유효량의 제10항에 따른 상기 면역원성 거대분자 또는 제15항에 따른 상기 면역원성 조성물을 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 인간 파필로마 바이러스 감염과 관련된 질환을 예방하거나 치료하는 방법.
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