CN106893730B - 重组人乳头瘤蛋白表达 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种密码子优化的人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1编码基因，所述基因在被转入酵母细胞后可高效地表达重组人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1。本发明还公开了一种具有免疫原性的大分子，其主要由所述经密码子优化的人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1编码基因在酵母细胞中表达产生。本发明还公开了所述具有免疫原性的大分子的应用和组合物。

Description

重组人乳头瘤蛋白表达

技术领域

本领域涉及分子生物学领域，具体而言，本发明涉及经密码子优化而适于在毕赤酵母中表达的HPV31人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1的基因，以及含有该人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1基因的载体，菌株，表达该基因的方法，及其用途。

背景技术

人乳头状瘤病毒(human papilloma virus，HPV)是乳多空病毒科多瘤病毒亚科的一个无包膜的小型双链环状DNA病毒。HPV可通过人体间的密切接触传播，引起被感染者的皮肤出现寻常疣和肛门生殖器尖锐湿疣等病变，被列为性传播疾病。1995年，国际癌症研究中心公布的研究结果证实，HPV与宫颈癌有密切的因果关系。由此可见，HPV感染已成为严重危害人类健康的病原体。因此，研制高效、廉价的HPV疫苗，对于预防女性宫颈癌和HPV感染所引起的性传播疾病具有十分重要的意义。

目前已经确定的HPV型超过100种。采用灵敏的检测方法，可以从几乎100％的宫颈癌患者病变组织中检测到高危HPV‐DNA。根据HPV亚型与女性生殖道恶性肿瘤的关系，将HPV分为低危型和高危型。HPV6、11、34、40、42等型多见于良性宫颈病变如宫颈湿疣及宫颈上皮轻度不典型性增生病变中，属HPV低危型；而宫颈上皮重度不典型增生及宫颈癌中以HPV16、18、31、33、35、39、45，52，58型感染更为多见，这些亚型为高危型。不同人群中一系列的研究已证实生殖道的HPV 16、18型感染与宫颈癌的发生高度相关，较其他危险因素更密切。宫颈癌患者中，约50‐60％是由HPV16感染引起，HPV18约占14％，HPV45占约8％，HPV31占约5％，其余型占23％(Walboomers JM.et al.J Pathol 1999；189:12‐19)。

宫颈癌是仅次于乳腺癌的第二大妇科恶性肿瘤，全球每年有超过50万的妇女被诊断出患有宫颈癌，27万妇女死于此病，年龄标准化感染率达10.5％。早在80年代初，Haraldzur Hausen就发现人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)的感染与宫颈癌发病有关，后续的大量研究也已证明HPV与宫颈癌及其癌前病变有密切联系。到目前为止，已发现了百余种HPV基因型，其中约40种可以感染生殖道粘膜。一个正常妇女一生中宫颈至少感染一种HPV的终生累计概率约为40％。

HPV是无包膜二十面体对称病毒，其病毒基因组DNA为闭合环状，长度约7200‐8000bp，由早期编码区(early region)、晚期编码区(late region)和位于两者之间的长调控区(long control region)组成。其中晚期编码区含两个开放阅读框(ORF)，编码病毒衣壳蛋白L1和L2。L1蛋白分子量约55kDa，为主要衣壳蛋白，以72个五聚体的形式支撑整个病毒衣壳结构，在不同型别中氨基酸序列高度保守，能够刺激机体产生保护性抗体。L2蛋白分子量较小，多位于L1蛋白内部。

昆虫表达系统、酵母表达系统、原核表达系统和哺乳动物细胞等多种表达系统都可以通过单独表达主要衣壳蛋白L1或联合表达L1+L2的方式获得病毒样颗粒(VLP)。L1单独表达得到的VLP与天然病毒衣壳结构类似，可用于诱导与保护免受病毒侵袭有关的高效价病毒中和抗体应答。

因此，鉴于L1蛋白于不同基因型别内部高度保守，并且能够单独表达形成VLP，以L1蛋白作为HPV疫苗研发的目标蛋白具有较高的可行性。不过，以表达重组病毒蛋白得到的VLP作为HPV疫苗的商业化开发与生产需要解决许多技术问题，其中首先需要解决的技术问题就是如何提高重组病毒蛋白的表达水平。而L1蛋白在大肠杆菌、毕赤酵母、杆状病毒等表达系统中，往往受到这些生物体内氨基酸密码子使用频率的限制导致表达水平较低甚至无表达。如Merck公司的美国专利No.7,498,036中记载，野生型VLP蛋白在酿酒酵母中的表达量为35μg/mg(破菌上清液中的VLP/破菌上清液总蛋白)左右。

因此，本领域中需要一种高水平表达基因的方法，所述方法应该能够高水平地、操作简便和低成本地表达HPV基因。

发明内容

为了解决上述技术问题，根据本发明的第一方面，提供了一种能够在毕赤酵母中表达的HPV基因，所述基因具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

利用毕赤酵母作为表达重组蛋白的表达系统，具有表达量高、操作简便、成本低等特点，并且相较于更高等的昆虫细胞与哺乳动物细胞而言更利于大规模工业化生产。由于不同物种间氨基酸密码子使用频率不一，在利用毕赤酵母表达重组蛋白的时候，往往根据目的蛋白的氨基酸序列经过密码子优化调整后得到更利于翻译的DNA序列。因此，本发明的经过密码子优化后的HPV基因在毕赤酵母中可以获得较高的表达水平，且所获得的蛋白在纯化后纯度极高，更有利于针对HPV的预防性疫苗的研发与生产。如本申请实施例所示，本发明的密码子优化过的HPV31基因在毕赤酵母中表达后蛋白的纯度约为95％。

根据本发明的第二方面，提供了一种在毕赤酵母中表达HPV L1基因的方法，包括下述步骤：

(1)将本发明的HPV L1基因分别各自克隆入表达载体中；

(2)将步骤(1)所得的表达载体转化至毕赤酵母菌株中；

(3)使用抗生素对步骤(2)所得的转化菌株进行筛选，获得生长情况最好的一个或多个菌株；

(4)通过测试各HPV L1基因的表达量对步骤(3)所得的菌株进行进一步筛选，获得表达量最高的一个或多个菌株；

(5)使用步骤(4)所得的菌株进行表达，分别获得HPV L1蛋白。

根据本发明的一个具体实施方案，所述步骤(1)中所述的表达载体为pPICZαB载体，并且所述步骤(3)中使用的抗生素为Zeocin。。

根据本发明的一个具体实施方案，所述步骤(2)中使用的毕赤酵母菌株为毕赤酵母X‐33菌株。

根据本发明的一个具体实施方案，所述步骤(4)中测试HPV L1基因的表达量的操作是通过Western blot方法进行的。

根据本发明的一个具体实施方案，所述步骤(5)中的表达步骤为在发酵罐中进行的发酵步骤。

根据本发明的第三方面，提供了含有本发明的各HPV L1基因的表达载体。

根据本发明的一个具体实施方案，所述含有本发明的各HPV L1基因的表达载体来源于pPICZαB载体。

根据本发明的第四方面，提供了含有本发明的HPV L1基因或表达载体的毕赤酵母菌株，所述菌株能够高水平地表达生产各HPV L1蛋白，更利于针对HPV的预防性疫苗的研发与生产。

附图说明

图1显示了HPV31 L1基因双酶切后琼脂糖电泳图。1：DL 5000DNA Marker(Takara公司)；2：pPICZαB‐31 L1样品1；3：BstBI+KpnI双酶切pPICZαB‐31 L1样品2。

图2显示了HPV31 L1蛋白样品SDS‐PAGE电泳图。条带1：PageRuler PrestainedProtein Ladder；条带2：重组纯化蛋白样品。

图3显示了HPV31 L1纯化后病毒样颗粒透射电镜照片；

图4显示了蛋白免疫原性在小鼠上的实验测定结果。

序列说明

SEQ ID NO：1为野生型HPV31 L1氨基酸序列。

SEQ ID NO：2为本发明的HPV31 L1基因的核苷酸序列。

具体实施方式

通过以下实施例详细描述本发明，以便本领域普通技术人员能够更好地理解本发明。下述实施例仅仅出于示例性目的，并非意在限制本发明的范围。已经努力确保有关数字(如数量、温度等)的准确性，但应该考虑到会存在一些误差和偏差。除非另有说明，温度以℃为单位或者为环境温度，压力接近或等于大气压。除非另有说明，在下述各实施例中用到的限制性内切酶均购自New England Biolab公司。应当理解的是，除非另有说明，下述各实施例中所用到的仪器设备均为本领域的常规设备。除非另有说明，所使用的培养基均为市售可得的常规培养基，本领域技术人员均熟知其中的成分及含量。为了简便起见，在本文中有可能使用各种通用的缩写，本领域技术人员完全能够理解其含义。

实施例

实施例1：HPVL1密码子优化设计

遗传密码有64种，但是绝大多数生物倾向于利用这些密码子中的一部分。毕赤酵母和人的基因对密码子的利用有各自的偏爱。由于遗传密码是简并的，每个氨基酸都由一个以上的密码子编码，同一氨基酸的密码子在野生型的基因中的使用频率是不同的。毕赤酵母的密码子偏好可能导致重组蛋白低的翻译效率和表达水平，本发明人根据野生型的HPV31 L1氨基酸序列(AAA46956.1)进行基因序列改造：对其所有的氨基酸基因全部采用使用频率最高和较高的密码子。Pichia酵母密码子使用频率见表1(参见http://www.kazusa.or.jp/codon/)。然后在此基础上，为了使翻译出来的mRNA的GC含量保持在适当的水平，，又为了避免mRNA的二级结构影响翻译的效率和一些常用的酶切位点，本发明人对最高频率的密码子进行一定的修正，例如将一些天冬酰胺(Asn)最高频率密码子AAC修正为AAT，赖氨酸(Lys)最高频率密码子AAG修正为AAA，天冬氨酸(Asp)最高频率密码子GAT修正为GAC，苯丙氨酸(Phe)最高频率密码子TTT修正为TTC，酪氨酸(Tyr)最高频率密码子TAC修正为TAT，甘氨酸(Gly)最高频率密码子GGT修正为GGA。改造后的HPVL1基因序列不含有以下内含子识别序列及转录因子结合位点：ATGACTCAT和TGACTA(转录因子GCN4结合位点)；ATATAA(GAL4的结合位点)；TATTTAA(TBP结合位点)；TTAGTAA和TTACTAA(YAP1结合位点)；ATGACTAAT；ACTAATTAGG。

由此，本发明人优化设计出若干种适于毕赤酵母表达的HPV L1基因的核苷酸序列，按照所述的序列全合成了HPV L1基因，将其克隆到现有毕赤酵母表达载体中，通过同源重组及高浓度抗生素的筛选构建重组毕赤酵母表达菌株；利用重组毕赤酵母进行发酵培养和甲醇诱导胞内表达HPV L1蛋白。从中分别筛选出全新的HPV L1基因的核苷酸序列，可分别在毕赤酵母中高表达HPV L1蛋白，并在胞内同时形成病毒样颗粒(VLPs)，破菌上清经过层析方法纯化后，纯化的病毒样颗粒纯度大于95％，吸附铝佐剂后，具有极高的免疫原性，可作为人用预防宫颈癌的疫苗。这些优化设计的HPV L1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

表1 Pichia酵母密码子表

实施例2：HPV31L1重组表达载体构建

合成所得的HPV31L1基因序列通过下列方法克隆入pPICZalphaB载体(Invitrogen)。以PCR的方式扩增得到两端分别带有BstBI和KpnI的HPV L1 DNA片段，PCR引物。HPV31L1,正向引物：5’‐CGATGGAACTTCGAAACGATGTGGAGACC‐3’(BstBI)(SEQ ID NO：3)；反向引物：5’‐GACCTGGGTACCCTATTATCTCTTGGTTTTAG‐3’(KpnI)(SEQ ID NO：4)。PCR程序：94℃ 5分钟，94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 1分50秒循环30次，72℃10分钟，10℃10分钟，运行结束。PCR产物以琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收1500bp处条带(Qiagen gel extractionkit)。回收片段与pPICZalphaB以BstBI和KpnI(New England Biolab)联合酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定并分别回收约1500bp和3600bp片段。回收后HPVL1与pPICZalphaB以摩尔比为5:1的比例用T4连接酶(Takara)16℃过夜连接，第二天连接产物转化入E.coli DH5α，涂布于低盐LB平板(含25ug/mL Zeocin)，37℃过夜培养。挑取部分转化后克隆抽提质粒，双酶切(BstBI+KpnI)鉴定，琼脂糖电泳检测(图1)，其中条带1为Marker，自上而下分别对应10000bp、7000bp、4000bp、2000bp、1000bp、500bp以及250bp,条带2为质粒，条带3位联合酶切后的质粒，条带3靠下图的片段为L1 DNA片段。鉴定所得阳性重组克隆经DNA测序验证正确后保存，重组载体命名为Ppicz31L1。

实施例3：HPV L1重组表达菌株构建与表达

以SacI线性化pPICZ31L1，酶切反应结束后酚：氯仿去除蛋白，再加入2.5倍体积无水乙醇，1/10体积3M NaAc(pH5.2)沉淀DNA，所得沉淀经75％乙醇洗涤、烘干后以少量无菌ddH2O溶解沉淀，电转毕赤酵母宿主菌(Invitrogen)，涂布于YPDS平板(含180μg/mLZeocin)，30℃培养3天，得数百克隆。从中挑取数十克隆接种于YPD平板(含1500μg/mLZeocin)，筛选质粒高拷贝菌株，30℃培养2天。部分克隆生长较快，挑取生长情况最好的数个克隆接种于5mL YPD液体培养基，24小时后更换BMMY培养基，0.5％甲醇诱导48小时后收集菌体。菌体经玻璃珠破碎后，离心所得上清液以Western‐blot鉴定，所用一抗为自制兔多抗。取表达量最高的菌株冻存于‐80℃，作为发酵罐培养工作种子。

实施例4：HPV L1重组蛋白的发酵罐培养

从实施例3所得的表达HPV31 L1的基因工程菌工作种子库中，取1支甘油冻存管，融化后吸取100μL接入5mL YPG培养基，250‐300转/分钟(rpm)，30℃培养16‐24小时，直到OD₆₀₀达到2‐6，镜检无杂菌污染。将检验合格的活化菌液按0.2％接种量接入YPG培养基，250‐300rpm，30℃培养16‐24小时。直到OD₆₀₀达到2‐6。镜检无杂菌污染。将上述活化后菌种液接种于发酵罐内，接种量5‐10％。发酵温度30.0±0.5℃，初始pH5.00±0.1，起始转速300rpm，通气量0.5‐1.0vvm，初始溶氧(DO)校准至100％。发酵用基础盐培养基BSM，配制后高压湿热灭菌，灭菌条件为121℃，30分钟，灭菌结束后冷却至30℃。按4ml/LBSM的比例添加PTM1痕量盐类。初始增殖阶段在18‐24小时，发酵过程中维持溶氧值不低于20％，当碳源消耗完毕时，溶氧值迅速地上升,菌体湿重达到90‐150g/L。此后进入甘油补料阶段，甘油补料液浓度为50％，每升补料液添加12mlPTM1，甘油补料速度为8‐18ml/h/升初始发酵体积，菌体湿重达到180‐220g/L时，停止补料。此阶段发酵液中甘油最大浓度不应超过4％。甘油补料结束后维持一定时间，待培养基中甘油消耗完全后开始进行甲醇诱导，每升甲醇加入12mlPTM1，同时将pH值控制调为6.00±0.1。最初甲醇补加速度控制在1.5‐2.5ml/h/升初始发酵体积,之后缓慢增加甲醇补加速度，甲醇诱导4小时后将补料速度提升至2.5‐7.5ml/h/升初始发酵体积。维持溶氧(DO)不低于20％，温度维持在30±0.5℃，pH值控制为6.00±0.1。诱导结束时放出发酵液，菌体湿重达200‐400g/L。4℃，4800rpm离心20分钟收集菌体，‐20℃保存。

发酵基础盐培养基(BSM)配方(1L)：

PTM1痕量盐配方(1L)：

成分	含量
		5水硫酸铜	6.0g
碘化钠	0.08g
		1水硫酸锰	3.0g
2水钼酸钠	0.2g
		硼酸	0.02g
氯化钴	0.5g
		氯化锌	20.0g
7水硫酸亚铁	65.0g
		生物素	0.2g
硫酸	5.0ml
		纯化水	加至1L

实施例5：HPV L1蛋白纯化

收集HPV 31L1发酵菌体经破菌(破菌缓冲液：200mM MOPS，pH7.0，0.7NaCl，0.05％Tween‐80)离心后，离心上清液经过层析方法纯化，得到L1蛋白自组装形成的病毒样颗粒。具体步骤如下：将表达HPV31L1 VLP的毕赤酵母细胞，按1：5(m/v)比例加入破菌缓冲液，充分混匀后，以机械高压破碎均匀上述细胞悬液，并重复操作，使90％的细胞破碎。将高压破碎的破菌液于4℃冰箱静置过夜，于9000rpm，30min，10℃离心分离，收集离心后上清液。破菌上清液通过阳离子交换层析柱(POROS 50HSApplied Biosystems公司层析柱)进行初步纯化，洗脱方式为：100％缓冲液A(0.5M NaCl，50mM MOPS，pH7.0，0.05％Tween‐80)至100％的缓冲液B(1.5M NaCl，50mM MOPS，pH7.0，0.05％Tween‐80)的线性梯度洗脱，收集洗脱组分，并采用SDS‐PAGE，Western‐blot检测目标蛋白。

将含有HPV 31 VLP蛋白的洗脱组分合并后，经羟基磷灰石层析柱(CHTBIO‐RADTypeII)进一步纯化，洗脱方式为：100％缓冲液A(5mM PB,0.6M NaCl,50mM MOPS，pH6.5,0.05％Tween‐80)至100％的缓冲液B(200mM PB，0.6M NaCl,pH6.5，0.05％Tween‐80)的线性梯度洗脱。收集洗脱组分，并采用SDS‐PAGE和Western‐blot检测目标蛋白，将含有HPV31VLP的组分合并，即为最后的纯化样品，如图2所示(含量约为95％)。此外，通过CE(毛细管电泳)检测可知，纯化后样品主峰面积大于97％。经过电镜(复旦大学化学3系电镜室)观察纯化样品中呈现病毒样颗粒(图3)，结果显示颗粒直径在30‐60nm之间。

实施例6：本发明的HPV 31L1重组蛋白的表达量测定

本实施例根据Bradford法测得的发酵后菌体破菌上清液中总蛋白含量和Elisa夹心法测得的HPV31L1 VLP的表达量，计算得到HPV31L1 VLP在破菌后总蛋白中的含量。具体步骤如下：

取0.1g发酵菌体，加入1ml破菌缓冲液，经玻璃珠破菌后，离心，取上清，用Elisa夹心法测定重组菌株发酵后菌体破菌上清液中HPV31L1 VLP的含量，具体如下：

使用纯化的HPV31L1 VLP做标准蛋白浓度曲线，诱导前的菌体作为阴性对照。

用包被液(1.6g Na2CO3，2.95g NaHCO3)将兔抗HPV31L1 VLP多抗稀释2000倍，然后向酶标板的各凹孔中各加入0.1ml稀释后的兔多抗，4℃过夜。移去包被液，用0.3ml PBST(PBS，pH7.0，0.05％Tween‐20)洗涤凹孔，再用0.3ml封闭液(5％脱脂奶粉+PBST)于37℃保温2小时。

用稀释液(PBS，pH7.0)以连续二倍稀释的方式，将实施例5中获得的纯化HPV31L1VLP从浓度2μg/ml梯度稀释到0.0625μg/ml，以此作为标准样品。同时将实施例4中获得的发酵菌体的破菌上清液稀释200倍，然后分别向凹孔中加入0.1ml梯度稀释后的不同浓度的HPVL1 VLP溶液或稀释后的破菌上清液，于37℃保温1小时后，移去抗原液，并用0.3ml PBST洗涤凹孔。然后用抗体稀释缓冲液(PBS，pH7.0，2％脱脂奶粉)将MAB885鼠抗HPV31L1 VLP单抗(购自CHEMICON公司)1000倍稀释后加入到凹孔中，每孔加0.1ml，37℃保温1小时。移去单抗溶液，用0.3ml PBST洗涤凹孔。再向各凹孔中加入用抗体稀释缓冲液稀释5000倍的HRP标记的羊抗鼠IgG 0.1ml，37℃保温1小时。移去抗体溶液，并用0.3ml PBST洗涤凹孔，向凹孔中各加入0.1ml DAB显色液(购自Amresco公司)，室温作用10分钟。向每个凹孔中加入0.05ml 2M H₂SO₄终止液以终止反应，并用酶标比色仪测定OD₄₅₀吸光值。

利用梯度稀释的HPV31L1 VLP的OD₄₅₀的检测结果，制作标准蛋白浓度曲线，再通过标准蛋白浓度曲线换算得HPV31L1蛋白的发酵表达量。

本实施例的结果示于表2。

表2：本发明的HPV31L1基因的表达量

由表2可以看出，本发明的HPV31L1基因的表达量最高可达到673μg/g(破菌上清液中的HPV31L1 VLP/湿菌。

实施例7：HPV L1疫苗制备

参考《中华人民共和国药典》(2005年版)中的方法，将实施例5中纯化获得的HPVL1蛋白，吸附磷酸铝佐剂，制备获得具有免疫原性的HPV疫苗。

实施例8：HPV31L1基因表达产物免疫原性的测定

HPV31L1基因表达产物免疫原性的测定

选取6～8周龄的SPF级BALB/c小鼠(上海西普尔必凯实验动物有限公司)，分为3组，每组10只小鼠。第1～2组分别注射0.25μg和0.05μg吸附500μg铝佐剂的HPV31L1 VLP(即实施例7中所制备得到的产物)，注射体积为0.5mL(作为检测组)，第3组小鼠用0.5mL铝佐剂进行免疫(作为阴性对照组)。于0天和14天分别腹腔注射免疫一次，每次免疫后第14天采血。将采集得到的血液于37℃放置1小时后，5000rpm离心10min，吸取上清，即得到小鼠免疫血清，56℃灭活30分钟后于‐20℃存放，并检测小鼠血清中针对HPV31L1的中和抗体滴度，具体方法如下：将293FT细胞按1.5×10⁴/孔的密度预铺于96孔细胞培养板中，每孔加细胞液100μl，于37℃，5％CO₂培养箱中培养至细胞贴壁(约24h)。同时，将血清样品用DMEM完全培养基稀释到合适的起始稀释度后，再进行连续2倍稀释7个梯度。根据HPV31假病毒原液的TCID₅₀/0.1ml计算稀释倍数，用DMEM完全培养基将假病毒液稀释至‐log(TCID₅₀/0.1ml)＝3.2，混匀，同时设置不同稀释度质控血清对照组。在70μl血清稀释液中加入70μl假病毒稀释液，振荡混匀1分钟后置于25℃恒温培养箱中孵育60分钟。准确吸取血清‐假病毒混合液100μl，缓慢小心加入预铺的96孔细胞板中。于37℃，5％CO₂培养箱中培养72小时后用荧光显微镜观察结果。同时进行假病毒回滴以保证实验的有效。若待检血清孔荧光数不高于假病毒阳性对照孔荧光数一半时所在的最大稀释倍数即为该血清标本的中和抗体滴度，具体结果如图4所示。

综上所述，本发明提供的人乳头状瘤病毒31主要衣壳蛋白L1基因是一种优化过的L1基因，具有以下优点：经过优化的基因适合在酵母宿主中高效率表达目标蛋白，而且能够满足工业化生产的要求；同时，本发明提供的人乳头状瘤病毒疫苗，能够自组装形成VLPs结构，纯化的VLPs吸附佐剂后，通过中和反应的测定，说明该疫苗能在小鼠体内产生较强的免疫原性，而且由于采用毕赤酵母表达系统，因此该方法具有以下优点：成本低，产量高，产品性质更加均一稳定。

Claims (6)

1.一种分离的基因，其编码人乳头瘤主要衣壳蛋白L1，其特征在于，所述的基因具有酵母偏爱的密码子，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示。

2.一种表达载体，所述的表达载体中含有权利要求1所述的基因。

3.一种基因工程化的宿主细胞，所述的细胞含有权利要求2所述的表达载体，或基因组中整合有权利要求1所述的基因。

4.根据权利要求3所述的宿主细胞，其特征在于，所述的细胞是毕赤酵母。

5.一种制备具有免疫原性的大分子的方法，其特征在于，所述的方法包括：步骤（1)：培养权利要求3所述的宿主细胞，从而在宿主细胞内表达人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1，并组装形成具有免疫原性的大分子；步骤(2)：分离所述的具有免疫原性的大分子。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中包括：(a)破碎步骤(1)获得的宿主细胞，获得含有具有免疫原性的大分子的上清液；和(b)将步骤(a)获得的上清液采用阳离子交换柱层析和羟基磷灰石柱层析进行纯化，从而获得所述的具有免疫原性的大分子。

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