CN101835797A

CN101835797A - 人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白l1基因及其用途

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Publication number: CN101835797A
Application number: CN200880113582A
Authority: CN
Inventors: 张高峡; 沈琼; 雷建强; 袁靖宇; 张梦华; 张千里; 熊莹华; 魏健; 吴克
Original assignee: Shanghai Zerun Biotech Co Ltd
Current assignee: Shanghai Zerun Biotech Co Ltd
Priority date: 2007-11-23
Filing date: 2008-11-24
Publication date: 2010-09-15
Also published as: BRPI0818957A2; EP2223933A4; US20110256182A1; EP2479186A1; EP2223933B1; US20140328935A1; MY182347A; KR101588413B1; EP2223933A1; RU2010125695A; RU2494106C2; MX2010005699A; US9034340B2; WO2009076824A1; KR20100102114A; EP2479187A1; MX344751B; MY162658A; US8795676B2; BRPI0818957B1

Abstract

本发明公开了一类密码子优化的人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1编码基因，所述基因在被转入酵母细胞后可高效地表达人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1。本发明还公开了一种具有免疫原性的大分子，其主要由所述经密码子优化的人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1编码基因在酵母细胞中表达产生。本发明还公开了所述具有免疫原性的大分子的应用和组合物。

Description

人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白 L1基因及其用途

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体地说，涉及人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白，其编码基因，及其制备方法和用途。背景技术

人乳头状瘤病毒 (human papilloma virus, HPV)是乳多空病毒科多瘤病毒亚科的一个无包膜的小型双链环状 DNA病毒。 HPV可通过人体间的密切接触传播，引起被感染者的皮肤出现寻常疣和肛门生殖器尖锐湿疣等病变，被列为性传播疾病。 1995年，国际癌症研究中心公布的研究结果证实， HPV 与宫颈癌有密切的因果关系。由此可见， HPV感染已成为严重危害人类健康的病原体。因此，研制高效、廉价的 HPV疫苗，对于预防女性宫颈癌和 HPV感染所引起的性传播疾病具有十分重要的意义。

目前已经确定的 HPV型超过 100种。采用灵敏的检测方法，可以从几乎 100%的宫颈癌患者病变组织中检测到高危 HPV-DNA。根据 HPV亚型与女性生殖道恶性肿瘤的关系，将 HPV分为低危型和高危型。 HPV6、 11、 34、 40、 42等型多见于良性宫颈病变如宫颈湿疣及宫颈上皮轻度不典型性增生病变中，属 HPV低危型；而宫颈上皮重度不典型增生及宫颈癌中以 HPV 16、 18、 31、 33、 35、 39、 45型感染更为多见，这些亚型为高危型。不同人群中一系列的研究已证实生殖道的 HPV 16、 18 型感染与宫颈癌的发生高度相关，较其他危险因素更密切。宫颈癌患者中，约 50〜60%是由 HPV 16 感染引起， HPV 18约占 14%， HPV 45占约 8%， HPV 31占约 5%，其余型占 23%。

HPV直径约为 45〜55nm，呈球形，无包膜，衣壳为由 72个壳微粒组成对称偏斜的 20面体。其病毒颗粒衣壳由主要衣壳蛋白 (L1)和次要衣壳蛋白 (L2)组成。主要衣壳蛋白 L1在细胞中表达后能自动组装成衣壳颗粒，称为病毒样颗粒 (VLPs；)。

一个正常妇女一生中宫颈至少感染一种 HPV的终生累计概率约为 40%。因此，开发一种价格适宜、保护性良好的宫颈癌疫苗，特别是针对 HPV 16或 HPV 18的疫苗，对于降低妇女宫颈癌发病和死亡率有意义重大。

尽管现有技术中已经开发了一些针对 HPV的疫苗，然而普遍还存在 HPV蛋白表达效率低下，表达获得的蛋白活性低，无法组装成病毒样颗粒或组装获得的颗粒免疫效果不理想等问题。因此，本领域还有必要开发改进的 HPV疫苗产品。发明内容

本发明的目的在于提供人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白 L1基因及其制备方法和用途。

在本发明的第一方面，提供一种分离的基因，其编码人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白 Ll，所述的基因具有毕赤酵母偏爱的密码子。

在另一优选例中，所述的基因编码具有 SEQ ID NO: 10中第 62-568位或 SEQ ID NO: 10所示氨基酸序列的人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白 L1 (即 18型人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白 Ll)。更佳地，所述的基因具有选自 SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO: 2或 SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列；或具有选自 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 5或 SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的基因编码具有 SEQ ID NO: 11所示氨基酸序列的人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白 L1 (即 16型人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白 Ll)。更佳地，所述的基因具有选自 SEQ ID NO: 7、 SEQ ID NO: 8或 SEQ ID NO: 9所示的核苷酸序列。

在本发明的第二方面，提供一种表达载体，所述的表达载体中含有所述的基因的序列。

在另一优选例中，所述的表达载体是毕赤酵母表达载体。

在本发明的第三方面，提供一种基因工程化的宿主细胞，所述的细胞含有所述的表达载体，或其基因组中整合有所述的基因。

在另一优选例中，所述的细胞是毕赤酵母细胞。较佳地，所述的毕赤酵母菌株选自毕赤酵母 X-33、 GS115、 KM71或 SMD1168菌株。最佳的，所述的毕赤酵母菌株是毕赤酵母 X-33。

在本发明的第四方面，提供一种具有免疫原性的大分子 (即病毒样颗粒；)，该大分子的直径为 50-80nm，主要由人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白 L1 自我装配而成，所述的人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白 L1是毕赤酵母表达的。

在另一优选例中，所述的具有免疫原性的大分子通过以下方法制备获得：

(1) 培养所述的宿主细胞，从而在宿主细胞内表达所述的人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白 Ll，并组装形成具有免疫原性的大分子；

(2) 分离所述的具有免疫原性的大分子。

在本发明的第五方面，提供一种制备所述的具有免疫原性的大分子的方法，所述方法包括：

(2) 分离所述的具有免疫原性的大分子。

在另一优选例中，在步骤（2) 中，包括：

(a) 破碎步骤（1) 获得的宿主细胞，获得含有具有免疫原性的大分子的上清液；和

(b) 将步骤（a) 获得的上清液依次采用 POROS 50 HS柱层析和 CHT柱层析进行纯化，从而获得所述的具有免疫原性的大分子。

在另一优选例中，在步骤（b) 中，采用 POROS 50 HS柱层析的纯化方法为：将步骤（a) 获得的上清液上样到经清洗、平衡的 POROS 50HS柱，使得所述具有免疫原性的大分子结合到柱上，淋洗平衡后，通过 100%缓冲液 A至 100%缓冲液 B线性梯度洗脱，收集 70〜100ms/cm层析峰；其中所述缓冲液 A含有 50 ±20 mM MOPS , 0.75 ± 0.3M NaCl， 0.05 ± 0.02%Tween-80 (pH6.5 ± 1) ; 所述缓冲液 B含有 50 ± 20 mM MOPS , 1.5 M NaCl, 0.05 ± 0.02% Tween-80 (pH6.5 ± 1); 或者

采用 CHT柱层析的纯化方法为：将经过 POROS 50 HS柱层析纯化的产物上样到经清洗、平衡的 CHT柱，淋洗平衡后，通过缓冲液 C至 100%缓冲液 D线性梯度洗脱，收集 50〜70ms/cm层析峰；其中所述缓冲液 C含有 50 ±20 mM MOPS , 0.5 ± 0.2M NaCl, 0.04 ± 0.02M PB， 0.05 ± 0.02% Tween-80 (pH6.5 ± 1); 所述缓冲液 D含有 0.5 ± 0.2M NaCl, 200mM PB， 0.05 ± 0.02% Tween-80 (pH6.5 ± l)。

在本发明的第六方面，提供一种具有免疫原性的组合物，所述的组合物中含有：

(1) 有效量的所述的具有免疫原性的大分子；和

(11) 药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的药学上可接受的载体包括至少一种免疫刺激剂或佐剂。

在另一优选例中，所述的佐剂是铝佐剂。

在另一优选例中，所述的组合物是疫苗。

在本发明的第七方面，提供所述的具有免疫原性的大分子的用途，用于预防或治疗人乳头状瘤病毒感染相关疾病。

在本发明的第八方面，提供一种预防或治疗人乳头状瘤病毒感染相关疾病的方法，所述方法包括：给予需要预防或治疗的对象有效量的所述具有免疫原性的大分子，或所述的具有免疫原性的组合物。

在另一优选例中，所述的人乳头状瘤病毒感染相关疾病选自：肿瘤 (如宫颈癌、阴道癌、肛门或肛周的癌、口咽部的癌、上颌窦癌、肺癌)或宫颈上皮内瘤样病变。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明

图 1是 pPICZ-18Ll载体构建示意图。

图 2是 HPV 18L1基因 PCR扩增图。

图 3是 pPICZ-18Ll载体鉴定图，其中，泳道 1为经 BstBI+Kpnl双酶切的 pPICZ a B; 泳道 2为 BstBI+Kpnl双酶切的 pPICZ-18Ll。

图 4是 HPV 18 L1表达 Western-Blot鉴定结果图。 M，彩虹 Marker (Fermentas公司）； 1，表达的阳性对照； 2，表达的阴性对照； 3， HPV18L1表达菌株。箭头所指之处即为表达的 HPV 18 L1。

图 5是截短型 HPV 18L1基因 PCR扩增图。

图 6是 pPICZ-18Ll'载体鉴定图，其中，泳道 1为经 BstBI+Kpnl双酶切的 pPICZ a B; 泳道 2为 BstBI+Kpnl双酶切的 pPICZ-18Ll'。

图 7是截短型 HPV 18 L1表达 Western-Blot鉴定结果图。 M，彩虹 Marker (Fermentas公司）； 1，表达的阳性对照； 2，截短型 HPV 18 L1表达菌株； 3，表达的阴性对照。箭头所指之处即为表达的截短型 HPV 18 Li e

图 8是 HPV 18 L1层析纯化样品还原性 SDS-PAGE电泳图。1，POROS 50HS 收集峰 1 ; 2，POROS 50H 收集峰 2; 3 , POROS 50HS 收集峰 3 ; 4， CHT 收集峰 1 ; 5， CHT Peakl浓縮样品； 6，阳性对照。

图 9是纯化产物 HPV 18 L1 免疫印迹图。一抗： fitzgerald公司 18 L1抗体 1 : 5000稀释；二抗：山羊抗鼠 1 : 250。 1，阳性对照； 2、 3，纯化后的 HPV 18L1蛋白。

图 10是 HPV 18 LI VLPs纯化样品透射电镜图（X 105000)。

图 11A是 HPV 18假病毒感染 293FT细胞图。

图 11B是鼠血清中和 HPV 18假病毒图。

图 12是 pPICZ-16 Ll载体构建示意图。

图 13是 HPV 16 L1基因 PCR扩增图。

图 14是 pPICZ-16 L1载体鉴定图，其中，泳道 1为经 BstBI+Kpnl双酶切的 pPICZ α Β; 泳道 2 为 BstBI+Kpnl双酶切的 pPICZ-16Ll。

图 15是 HPV 16 L1表达 Western-Blot鉴定结果图。 M，彩虹 Marker (Fermentas公司）； 1，表达的阳性对照； 2， HPV 16 L1表达菌株； 3，表达的阴性对照。箭头所指之处即为表达的 HPV 16 L1。

图 16是 HPV 16 L1层析纯化样品还原性 SDS-PAGE电泳图。 1， POROS 50HS收集峰样品； 2， CHT流穿 1 ; 3 , CHT流穿 2; 4， HPV 16 L1阳性对照； 5， CHT洗脱峰 1 ; 6， CHT洗脱峰 2; 7， CHT洗脱峰 4; 8， CHT洗脱峰 8; 9， CHT洗脱峰 12。

图 17是 HPV 16 L1毛细管电泳纯度图。图 18是 HPV 16 LI VLPs纯化样品透射电镜图（X 105000)。

图 19A是 HPV 16 L1假病毒感染 293FT细胞图。

图 19B是鼠血清中和 HPV 16 L1假病毒图。具体实施方式

本发明人经过深入的研究，首次揭示一类经过密码子优化的人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白 L1编码基因，所述基因在被转入酵母细胞后可高效地表达人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白 Ll，并自组装形成病毒样颗粒，产量能达到工业生产需求。本发明还首次揭示了一种具有免疫原性的大分子，其主要由所述经密码子优化的人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白 L1编码基因在酵母细胞中表达产生。如本文所用所述的，所述的人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白 L1简称为 HPV L1蛋白；所述的 18型人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白 L1简称为 HPV18 L1蛋白；所述的 16型人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白 L1简称为 HPV16 L1蛋白。 HPV L1蛋白包括了 HPV18 L1蛋白和 HPV16 L1蛋白或它们的截短方式。

如本文所用，术语 "具有免疫原性的大分子"是一种含有多条单体人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白 Ll，优选地由多条人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白 L1聚合或组装而成聚合物大分子；所述的人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白 L1蛋白是由经过密码子优化的人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白 L1编码基因编码的，并且由酵母细胞 (优选毕赤酵母细胞)表达的。所述的具有免疫原性的大分子是颗粒状的。

如本文所用， "操作性相连"或 "可操作地连于"指这样一种状况，即线性 DNA序列的某些部分能够影响同一线性 DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制以编码序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。

如本文所用，所述的 "含有"， "具有"或 "包括"包括了 "包含"、 "主要由 ... ...构成"、 "基本上由 ... ...构成" 、和 "由 ... ...构成"； "主要由 ... ...构成" 、 "基本上由 ... ...构成"和 "由 ... ... 构成"属于 "含有" ， "具有"或 "包括" 的下位概念。人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白 L1的编码基因

基于利用酵母细胞表达 HPV L1蛋白这一目标，本发明人经过反复的研究，最终优化出一类适合于在酵母细胞、特别是毕赤酵母细胞中高效表达的 HPV L1蛋白的编码基因。所述优化的编码基因可编码全长或截短型的 HPV18 L1蛋白；或者，所述优化的编码基因可编码全长的 HPV16 L1蛋白。

本领域人员均了解，遗传密码有 64种，但是绝大多数生物倾向于利用这些密码子中的一部分，酵母细胞和人的基因对密码子的利用有各自的偏爱。由于遗传密码是简并的，每个氨基酸都由一个以上的密码子编码，同一氨基酸的密码子在野生型的基因中的使用频率是不同的。酵母细胞的密码子偏好可能导致重组蛋白低的翻译效率和表达水平。

本发明密码子优化主要是通过以下方法实现的：首先，基于天然的 HPV L1编码基因进行改造，对其所有对应的氨基酸全部进行密码子优化，优化的结果反复进行表达试验，从而找到一组全新的且适合于酵母表达的 HPV DNA序列。其中，全长 HPV 18 L1 编码基因可参见 Genbank 登录号 AAP20601 ; 截短型的 HPV 18 L1编码基因可参见 Genbank登录号 AAQ92369。全长 HPV 16 L1编码基因可参见 Genbank登录号 AAC09292。

更进一步地，为了避免翻译出来的 mRNA的 GC比例过高， mRNA的二级结构对翻译效率的影响，避开一些常用的酶切位点，本发明人对一些较优的密码子频率进行修正，例如将天冬酰胺 (Asn) 密码子 AAC修正为 AAT; 赖氨酸 (Lys)密码子 AAG修正为 AAA; 天冬氨酸 (Asp)密码子 GAT修正为 GAC; 苯丙氨酸 (Phe)密码子 TTT修正为 TTC; 酪氨酸 (Tyr)密码子 TAC修正为 TAT, 甘氨酸 (Gly) 密码子 GGT修正为 GGA, 设计出经过修正的全新的 HPV DNA序列。

作为本发明的优选方式，所述的基因编码具有 SEQ ID NO: 10或 SEQ ID NO: 10中第 62-568位所示氨基酸序列的人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白 L1 (即 HPV18 Ll)。更优选的，所述的基因具有选自 SEQ ID NO: l、 SEQ ID NO: 2或 SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列；或具有选自 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 5或 SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列。进一步优选的，所述的基因具有 SEQ ID NO: 1或 SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列。最优选的，所述的基因具有 SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列，其是截短型的 HPV 18 L1基因，对应于 N端缺失 61个氨基酸的截短型 HPV 18 L1蛋白，该截短型基因更有利于在重组载体中进行表达，并不改变其活性。

作为本发明的另一种优选方式，所述的基因编码具有 SEQ ID NO: 11所示氨基酸序列的人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白 L1 (即 HPV16 L1)。更优选的，所述的基因具有选自 SEQ ID NO: 7、 SEQ ID NO: 8或 SEQ ID NO: 9所示的核苷酸序列。最优选的，所述的基因具有 SEQ ID NO: 7所示的核苷酸序列。

本发明提供的经过密码子优化的基因具有以下优点：经过优化的基因更适合在酵母宿主中高效率表达目标蛋白，而且能够满足工业化生产的要求；由于可采用毕赤酵母表达系统，成本低，产量高，且产品性质更加均一稳定。本发明还提供了包含所述的 HPV L1编码基因的载体。所述的载体还可包含与所述编码基因的序列操作性相连的表达调控序列，以便于所述 HPV L 1蛋白的表达。任何合适的载体都可以使用，特别是一些用于酵母细胞的克隆和表达的载体。较佳地，所述的表达载体选自 pPICZ、 pPIC6、 pGAPZ和 pA0815等现有常用的酵母表达载体。所述的表达载体可以通过商购的方式获得。

此外，含有所述 HPV L1编码基因的重组细胞也包括在本发明中，所述的重组细胞是一种酵母细胞；更特别地是一种毕赤酵母细胞。较佳的，所述的毕赤酵母细胞选自毕赤酵母 X-33、 GS115、 KM71 和 SMD1168等。所述的酵母细胞可以通过商购的方式获得。将外源基因转入酵母细胞的方法是本领域已知的，例如可用电转化或原生质体转化。

生产 HPV L1的方法也已包括在本发明中。所述方法包括培养含有所述编码基因的重组细胞。所述方法可包括让细胞表达编码的 HPV L1蛋白，所述方法还可包括表达的蛋白的分离和 /或纯化。可将上述制备获得的 HPV L1蛋白纯化为基本均一的性质，例如在 SDS-PAGE电泳上呈单一条带。

本发明的酵母细胞表达的 HPV L1蛋白可用于制备具有免疫原性的大分子，所述的大分子可在体内引起免疫反应，特别是体液免疫。

作为本发明的一种实施方式，本发明人优化设计出若干种适于毕赤酵母表达的 HPV L1蛋白的基因序列，按照所述的序列全合成了全长及该基因的截短型 HPV L1基因，将其克隆到现有毕赤酵母表达载体中，通过同源重组及高浓度抗生素的筛选构建重组毕赤酵母表达菌株；利用重组毕赤酵母进行发酵培养和甲醇诱导胞内表达 HPV L1蛋白。高表达的 HPV L1蛋白能够在胞内同时形成病毒样颗粒 (VLPs；)，破菌上清经过层析方法纯化后，纯化的病毒样颗粒纯度大于 90%，吸附铝佐剂后，具有极高的免疫原性，可作为人用预防宫颈癌的疫苗。蛋白表达和纯化

通过培养所述含有 HPV L1编码基因的重组细胞，可高效地表达 HPV L1蛋白，并使之组装形成具有免疫原性的大分子。一种表达和纯化方法包括：（1) 培养所述的重组细胞，从而在重组细胞内表达所述的人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白 L1，并组装形成具有免疫原性的大分子；（2) 破碎步骤（1) 获得的细胞，获得含有免疫原性的大分子的上清液；和 (3) 将步骤（2) 获得的上清液依次采用 POROS 50 HS柱层析和 CHT柱层析进行纯化，从而获得所述的具有免疫原性的大分子。

较佳的细胞培养和蛋白表达方法如下:将本发明基因工程菌接入活化培养基 (YPD或 LB或 SOC)，

25〜37°C培养过夜。将活化液接入种子培养基 (YPD或 LB或 SOC)， 25〜37°C培养过夜。发酵用基础盐培养基 (BSM1或 BSM2或 BSM3), 发酵温度为 20〜37°C，初始 pH3〜8，添加痕量盐类 (PTM1、 PTM2、 PTM3)。初始增殖阶段大约 15〜30 小时，通过调节搅拌转速、空气流量、罐压等维持溶氧值 20〜80%。当碳源消耗完毕时，菌体湿重达到约 50〜150g/L。补加甘油或葡萄糖溶液。维持溶氧值 20〜80%。补加一定时间，菌体湿重约 50〜500g/L时，停止补料。同时将 pH值控制调为 3〜8，开始加入甲醇诱导。维持溶氧值高于 20〜80%，温度维持在 20〜37°C， pH值控制为 3〜8。每 2〜10 小时取一次样， Western Blot检测。诱导 5〜90小时发酵结束，放出发酵液。用冷冻离心机离心发酵液后收集菌体。收获的菌体在 -20Ό冻存。诱导表达的 HPV L1蛋白，可在在毕赤酵母体内自组装成病毒样颗粒 (HPV LI VLPs)o

所述的 HPV L1蛋白表达在毕赤酵母细胞内，因此可通过破菌纯化的方法获得较纯的蛋白，并且使之形成病毒样颗粒。纯化的方法通常包括：清洗菌体，去除其中的培养基成分 (盐、色素等)，减少对后期纯化的影响。经过清洗后的菌体，使用适当的含有一定盐浓度和表面活性剂成分的破菌缓冲液混合：可使用的盐成分有 NaCl、 KC1等，浓度范围在 0.4〜0.8mol/l左右；可使用的表面活性剂有 Tween-80、 Tween-20、 Triton-X 100等，浓度范围在 0.005〜0.05%(w/v)左右，可使用的缓冲系统有磷酸盐缓冲、 Tns缓冲液、 MOPS缓冲液、 HEPES缓冲液等，使用浓度范围在 0.02〜0.2mol/l左右。混合后的菌体可以通过高压均质机或珠磨匀浆机等设备进行破壁，高压均质机使用破菌的压力范围 800〜2000Bar左右，破碎循环 2〜4遍可至破菌率 >90%，珠磨匀浆机选用珠体直径 0.2〜0.4mm，珠体的装量控制在 70%〜90%左右，循环 1〜2遍可至破菌率 >80%以上。将破碎后的菌液通过高速离心或者切向流微滤的方法分离沉淀和上清，离心机的转速控制在 6000〜10000rpm(SORVALL、HITACHI 等)，离心时间 20〜60分钟，切向流微滤可使用 0.45〜0.65um的膜包 (Millipore, PALL等)收集上清用于后期纯化。经过澄清后的上清，可以先经过阴离子交换层析柱如： Q Sephrose Flast Flow(GE)或 DEAE SephroseFast Flow(GE)去除上清中部分杂质如： DNA、杂蛋白和 RNA等，然后再进行后期纯化过程；也可以用澄清细胞上清直接进行后期纯化。后期纯化先将上清样品上样于可吸附 HPV L1 VLPs的层析介质上如 SP Sepharose FF、 Heparin SepharoseCL-6B(GE)、 Poros 50HS(Merk) 及 Fractogel @EMD TMAE-650(Merck)等， HPV LI VLPs蛋白有效结合于上述层析介质上，并通过一定的盐浓度梯度 (如： 0.5〜1.0M NaCl或 KC1缓冲溶液)洗脱，将杂质与 HPV LI VLPs蛋白分离，用含高盐 (如： 1.0〜2.0mol/l NaCl或 KC1缓冲溶液)的缓冲溶液洗脱结合的 HPV LI VLPs蛋白，收集洗脱的初步纯化的 HPV LI VLPs 蛋白。将初纯的 HPV LI VLPs 蛋白上样于精细纯化的层析介质上如 CHT(BIO-RAD Typell )， HPV LI VLPs蛋白在一定盐浓度范围 (如： 0.3〜1.5mol/l NaCl或 KC1缓冲溶液)能有效结合于 CHT(BIO-RAD Typell)介质上，并通过一定的磷酸盐浓度梯度 (如：磷酸盐的浓度可使用 20〜400mM)洗脱，将杂质与 HPV LI VLPs蛋白分离。经过纯化的样品也可上样与精细纯化的介质如 Sephacryl S-1000(GE)和 HW-75(TSK), 通过凝胶分离将杂质与 HPV LI VLPs蛋白分离。通过精细纯化后收集洗脱的 HPV LI VLPs蛋白即为最后纯化的样品。

本纯化方法能除去很大部分污染生物分子 (包括 DNA、脂类和蛋白质)；还原性 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳 (Beckman Coulter)检测表明，通过 POROS 50HS介质层析纯化的样品纯度在 75%〜80%；通过羟磷灰石介质纯化的 HPV LI VLPs 蛋白最终样品纯度在 90%〜95%。 Western blot(Bio-RAD)检测显示目的蛋白条带可与 HPV LI VLPs的单抗或多抗呈特异性的显色反应；经过动态光散射 (Malvern Instruments Zetasizer Nano ZS)的检测，纯化样品颗粒范围在 50-80nm左右，经过透射电镜 (Philips)观察纯化样品中呈现病毒样颗粒 (VLPs；)，颗粒直径在 50〜80nm之间。本实验步骤中的羟磷灰石介质最好使用粒子大小约为 20〜50um且孔径约为 800A陶瓷羟磷灰石填料。在层析过程中，所使用的缓冲液 pH范围 6〜9，优选缓冲系统用 50mM MOPS。

相比于现有技术，本发明选用优化设计的 HPV 18 L1基因 (全长或更优选地为对应于 N端缺失 61 个氨基酸的蛋白的截短型基因；)，克隆至毕赤酵母中，使 HPV 18 L1蛋白表达量较其他表达系统 (如哺乳动物细胞、杆状病毒、酿酒酵母)有明显提高。表达所得病毒样颗粒经纯化后在电镜下观察为 50〜 80nm，与野生型 HPV病毒颗粒相似。重组的 HPV 18 L1蛋白病毒样颗粒吸附铝佐剂后，免疫小鼠，能产生高效价的抗 HPV 18 L1抗体；假病毒中和实验结果表明，该抗体具有较佳的中和活性 (即能够阻止假病毒进入细胞；)。本发明优化设计的 HPV 16 L1基因克隆至毕赤酵母中后蛋白表达量也很高。具有免疫原性的大分子

本发明还提供一种具有免疫原性的大分子，所述的大分子是一种多分子聚合物，该大分子的直径为 50-80nm，主要由人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白 L1 自我装配而成，所述的人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白 L1是毕赤酵母表达的。

较佳地，本发明的具有免疫原性的大分子是通过以下方法制备的：（1) 培养所述的重组细胞，从而在重组细胞内表达所述的人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白 Ll，并组装形成具有免疫原性的大分子； (2) 破碎步骤（1) 获得的重组细胞，获得含有免疫原性的大分子的上清液；和 (3) 将步骤（2) 获得的上清液依次采用 POROS 50 HS柱层析和 CHT柱层析进行纯化，从而获得所述的具有免疫原性的大分子。

本发明还提供所述的具有免疫原性的大分子的用途，用于制备预防或治疗人乳头状瘤病毒 (HPV) 感染相关疾病的组合物。所述的疾病选自 (但不限于；)：肿瘤 (如宫颈癌、阴道癌、肛门或肛周的癌、口咽部的癌、上颌窦癌、肺癌)、宫颈上皮内瘤样病变。组合物

本发明还提供一种具有免疫原性的组合物 (如预防性或治疗性疫苗），所述的组合物包含：有效量的本发明所述的具有免疫原性的大分子，和药学上可接受的载体。

本发明一种制备抗人乳头状瘤病毒疫苗的方法，包括采用上述方法制备重组人乳头状瘤病毒 L1 蛋白病毒样颗粒，然后加入药学上可用的疫苗佐剂。所述的该疫苗佐剂可以是铝佐剂或其它佐剂，纯化后的人乳头状瘤病毒蛋白 (HPV L1)形成病毒样颗粒，吸附于佐剂上，可作为疫苗使用。

如本文所用， "药学上可接受的" 的成分是适用于人和 /或哺乳动物而无过度不良副反应 (如毒性）的，即具有合理的效益 /风险比的物质。术语 "药学上可接受的载体"指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在 Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub. Co. , N.J. 1991) 中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和山梨醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、 pH缓冲物质和稳定剂，如白蛋白等。

可将所述的组合物制成各种适合于哺乳动物给药的剂型，所述剂型包括但不限于：注射剂、胶囊剂、片剂、乳剂、栓剂。

动物实验表明，利用本发明的具有免疫原性的大分子制成的疫苗免疫后，能在动物体内产生很强的免疫原性。

在使用时，是将安全有效量的本发明所述的具有免疫原性的大分子施用于哺乳动物 (如人），其中该安全有效量通常至少约 1微克 /千克体重，而且在大多数情况下不超过约 10毫克 /千克体重，较佳地该剂量是约 1微克 /千克体重-约 1毫克 /千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook等人，分子克隆：实验室指南（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。本发明实施例中 DNA延伸和 PCR扩增，均采用购自 Stratagene公司的热启动 Pfo酶。

本发明实施例中， pUC18质粒购自捷瑞公司， pPICZaB质粒购自 Invitrogen公司。

本发明实施例中， HPV18 L1 和 HPV16 L1 蛋白的兔多抗由上海普欣生物技术有限公司制备， MAB885鼠单抗购自 CHEMICON公司， HRP标记的羊抗小鼠 IgG购自北京鼎国公司。

本发明实施例中， BALB/c小鼠购自上海斯莱克实验动物责任有限公司。

本发明实施例中，纯化步骤中使用的清洗缓冲液配方为： lOOmM PB pH7.0， 0.15M NaCl; 破菌缓冲液 200mM MOPS , pH7.0， 0.4M NaCl, 0.05% Tween-80;

缓冲液 E : 50 mM MOPS , 0.5M NaCl, 0.05% Tween-80 , pH 6.5；

缓冲液 F : 50 mM MOPS , 1.5M NaCl , 0.05% Tween-80 , pH=6.5 ;

缓冲液 G_: 50 mM MOPS , 0.6M NaCl, 0.05M PB , 0.05% Tween-80 , pH6.5 ;

缓冲液 H: 0.6M NaCl, 200 mM PB， 0.05% Tween-80, pH6.5。实施例 1、 HPV 18的密码子优化的 LI基因的设计与合成

1.1、 HPV 18的密码子优化的 L1基因的设计

本发明涉及经过毕赤酵母偏爱密码子优化的编码 18 型人乳头状瘤病毒 (HPV18)主要衣壳蛋白

L1的 DNA分子，通过密码子最优化和对最优密码子频率进行一定修正获得三段 DNA序列，其序列分别如 SEQ ID NO: 4、 5和 6所示，具体如下：

首先，对天然的 HPV 18L1基因进行改造，经过反复研究试验，对其所有的氨基酸全部采用使用优选的密码子，设计出一个全新的 HPV DNA序列，即 SEQ ID NO: 4。

然后，为了避免翻译出来的 mRNA的 GC比例过高， mRNA的二级结构对翻译效率的影响，并避开一些常用的酶切位点，对优选的密码子进行一定的修正，例如将天冬酰胺 (Asn)密码子 AAC修正为 AAT, 赖氨酸 (Lys)密码子 AAG修正为 AAA, 天冬氨酸 (Asp)密码子 GAT修正为 GAC，苯丙氨酸 (Phe)密码子 TTT修正为 TTC, 酪氨酸 (Tyr)密码子 TAC修正为 TAT, 甘氨酸 (Gly)密码子 GGT修正为 GGA, 从而，设计出两个全新的 HPV DNA序列，其中： SEQ ID NO: 5是 SEQ ID NO: 4序列中修正天冬酰胺 (Asn)，赖氨酸 (Lys)，天冬氨酸 (Asp)这三个密码子所得的 DNA序列； SEQ ID NO: 6是 SEQ ID NO: 4序列中修正苯丙氨酸 (Phe)，酪氨酸 (Tyr)，甘氨酸 (Gly)这三个密码子所得的 DNA序列。

1.2、 HPV 18的密码子优化的 L1基因的合成

合成如序列 SEQ ID NO: 4所示的 HPV 18的密码子优化的 L1基因，以该合成的基因为模板，然后用引物 al和 a2作为引物，进行 PCR扩增，引物序列如下所示：

a 1： 5 ' - ATAGAATTCAAGATGTGTTTGTACACTAGAGTTT -3' (SEQ ID NO: 12)；

a2: 5'- AATGGTACCCTATTACTTTCTAGCTCTAACT-3' (SEQ ID NO: 13)。

将获得的 PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳进行分离，胶回收目标片段，获得大小约为 1.7kb的片段，并将该片段测序，该片段的序列测序结果如 SEQ ID NO: 4所示，根据测序结果显示该片段即是全长的密码子优化的 HPV 18L1基因。获得的 HPV 18L1基因两端以 EcoRI和 Kpnl酶切位点装入 pUC18质粒 (捷瑞公司）中，命名为 pUC-18Ll，并经测序验证为正确。

按照类似的方法获得 SEQ ID NO: 5和 6所示的 HPV 18的密码子优化的 L1基因。

为验证优化序列的可行性，下面以实施例 1制备获得的 HPV 16L1基因优化序列中的一个 (SEQ ID NO: 4)为例，构建表达质粒并验证其表达。实施例 2、 HPV 18L1基因的表达载体构建

将 SEQ ID NO: 4的优化序列克隆到毕赤酵母表达载体中，构建方法如图 1所示，具体步骤如下：

2.1、合成扩增 HPV 18L1所需的正向引物和反向引物，序列如下所示：

正向弓 I物： 5 ' - TCCCAATCTTCGAAACGATGTGTTTGTACACTAGAGTTT-3 ' (SEQ ID NO: 14)；反向弓 I物： 5 ' -AATGGTACCCTATTACTTTCTAGCTCTAACT-3 ' (SEQ ID NO: 13)。

其中，正向引物包括一个 BstBI 限制性内切酶位点；反向引物包括位于终止密码子侧翼的 Kpnl 限制性内切酶位点，所述酶切位点分别如引物序列中的下划线所示。

2.2、用上述引物对为引物，以实施例 1获得的 pUC-18Ll为模板，进行 PCR扩增，将扩增获得的产物进行电泳检测，结果如图 2所示，证明获得了全长密码子优化的 HPV 18L1基因；将扩增获得的 PCR片段，经限制性内切核酸酶 BstBI 和 Kpnl 双酶切消化，再与 BstBI/Kpnl 双酶切消化的 _PPICZaB(Invitrogen公司)连接。再用连接液转化大肠杆菌菌株 ToplO (捷瑞公司）的感受态细胞，铺板于含 25 g/ml零霉素的 LB琼脂上。

由于 pPICZaB载体上携带有零霉素抗性基因，因此转化细胞能够在含零霉素的 LB培养基上生长。分离已转化细胞的单菌落，制备质粒 DNA, 并经限制性图谱 (图 3)和核苷酸序列分析检测 HPV 18L1 基因和载体序列，鉴别出包含 HPV 18L1基因的正确构建体，命名为 pPICZ-18Ll，由于构建的质粒的分泌信号 (a-factor signal)已经被切去，因此， HPV 18L1蛋白应该是胞内表达蛋白。实施例 3、 HPV 18L1基因的表达菌株构建和表达

3.1、 HPV 18L1基因的表达菌株构建

用 Sacl限制性内切酶单酶切 pPICZ-18Ll质粒使其线性化，对空质粒 pPICZaB进行同样的酶切作为阴性对照。酶切反应液加入无水乙醇，获得 DNA沉淀，用少量双蒸水溶解线性化的 pPICZ-18Ll 片段，电击转化毕赤酵母菌 X-33(I_nvltr₀g_en公司)，电转化条件为： DNA片段 5微克，电压 1500伏，电阻 25欧姆，电击时间为 5毫秒。电转化产物铺板于含 200 μ g/ml零霉素 (Zeocm)的 YPDS琼脂上，由于 pPICZaB载体上携带有零霉素抗性基因，因此转化产物能够在含零霉素的 YPDS琼脂上生长。分离已转化细胞的单菌落，即为 HPV 18L1的毕赤酵母表达菌株。

3.2、 HPV 18L1毕赤酵母表达菌株的表达

将获得的 HPV 18L1毕赤酵母表达菌株接种至含 1000 μ g/ml、 1500 μ g/ml零霉素抗性平板上。高浓度抗性平板上获得的克隆，分别用 4ml YPD液体培养基培养， 24hr后换成 BMMY培养基诱导基因表达，表达 48hr后离心收获菌体。取一部分菌体破菌处理，破菌上清用 West-Blotting鉴定，结果如图 4所示，可见破菌上清中有 HPV 18L1蛋白表达。

虽然在本发明的实施例 2和 3中，使用的是 SEQ ID NO: 4序列进行克隆和表达，但对于本领域的技术人员来说，使用 SEQ ID NO: 5和 6序列进行克隆和表达，以获得相似的结果是显而易见的，因此，属于本发明的保护范围；而且，根据本发明的构思，对于本领域的技术人员来说，构建相似的序列并利用该构建的序列，使用毕赤酵母进行克隆和表达以获得相似甚至更优的结果，也是显而易见的，因此，也属于本发明的保护范围。实施例 4、 HPV 18L1蛋白纯化

将实施例 3中制备的菌体破菌离心后，取破菌上清经过层析方法纯化，得到自组装成病毒样颗粒的 L1蛋白，具体步骤如下：

将表达 HPV 18L1蛋白的毕赤酵母细胞，按 1 : 3加入清洗缓冲液混合，充分混匀，于 8000rpm，离心 5mm，收集细胞，重复以上操作二遍。

将清洗后的细胞按 1 : 5加入破菌缓冲液混合，充分混匀后，高压破碎以上细胞悬液，并重复操作，使 90%的细胞破碎。将高压破碎的破菌液，于 9000rpm， 30min, 10°C离心分离，收集离心上清。

将经过离心澄清的破菌上清通过 POROS 50HS(Applied Biosystems公司)层析柱进行初纯，洗脱方式为： 100%缓冲液 E至 100%的缓冲液 F的线性梯度洗脱，收集洗脱组分。将纯化样品还原为单体蛋白后采用 SDS-PAGE, Western-blot检测。

将含有 HPV 18L1蛋白的洗脱组分合并后，使用 CHT(BIO-RAD Typell)层析柱精纯，洗脱方式为： 100%缓冲液 G至 100%的缓冲液 H的线性梯度洗脱。收集洗脱组分。将纯化样品还原为单体蛋白后采用 SDS-PAGE, Westem-blot检测。将含有 HPV 18L1蛋白的组分合并，即为最后的纯化样品，其纯度 >90%。实施例 5、 HPV 18L1疫苗制备

参考《中华人民共和国药典》（2005年版)中的方法，将实施例 4中纯化获得的 HPV 18L1蛋白，吸附铝佐剂，制备获得具有免疫原性的 HPV 18L1 疫苗。实施例 6、 HPV 18L1基因表达产物免疫原性的测定

选取 6〜8 周龄的 SPF 级 BALB/c 小鼠，分为 4组，每组 6 只小鼠。第 1 组小鼠用 O. lmL含有铝佐剂的缓冲液 (0.32M氯化钠， 0.35mM硼酸钠， 0.01%吐温 -80， 0.01M组氨酸， pH6.5)进行免疫 (作为阴性对照组)，其它 3 组分别用 0.1 mL 浓度为 5 g/mL、 0.5 g/mL、 0.05 g/mL 的吸附铝佐剂的

VLP (作为检测组)，分别于第 0、 7、 21天皮下注射免疫，共免疫三次，第三次免疫后两周采血。将采集得到的血液于 37Ό放置 2h后， 4000g离心10 mm，吸取上清，即得到鼠多抗血清，于 - 20Ό存放，并检测鼠血清的转阳率和滴度，具体方法如下： 6.1、血清转阳率的检测：

用包被液稀释纯化的毕赤酵母表达的 HPV18 L1 至 l g/mL，向酶标板每个凹孔中各加 0.1 mL， 4°C过夜。移去包被液，用 0.3 mL PBST洗涤凹孔。用 0.3mL 封闭液 (5%脱脂奶粉 + PBST)于 37°C保温 2 小时。每凹孔加入用稀释缓冲液 (2%脱脂奶粉 +PBST)以 1 : 400稀释的被检血清 (免疫过 HPV18 L1 和铝佐剂的鼠血清和只免疫铝佐剂的鼠血清)各 0.1 mL，于 37Ό保温 1小时后移去血清液，用 0.3 mL 洗涤液洗涤凹孔。然后向每凹孔加入用稀释缓冲液以 1 : 5000稀释的 HRP 标记的羊抗小鼠 IgG 各 0.1 mL, 37°C保温 0.5 小时后移去酶标液，用 0.3 mL洗涤液洗涤凹孔；然后向凹孔中加入 0.1 mL DAB 显色液，室温避光作用 20 分钟后加 2 M H₂SO₄ 0.05 mL终止液终止反应，并用酶标比色仪测定OD₄₅。值， OD₄₅。值如表 2所示。

表 2、 OD₄₅。读数

Cutoff值为阴性对照被检血清 (免疫铝佐剂的鼠血清)抗体的 OD₄₅。值的平均值加上 3倍标准差， OD₄₅。值大于 Cutoff值的小鼠判定为阳性， OD₄₅。值小于 Cutoff值的小鼠判定为阴性。三个检测组的转阳率结果如表 3 所示。

表 3、转阳率结果

6.2、血清滴度的测定

用包被液稀释纯化的 HPV18 L1至 1 g/mL，取 0.1 mL加于酶标板的各凹孔中， 4°C过夜；移去包被液，用 0.3mL PBST洗涤上述凹孔，再用 0.3mL封闭液 (5%脱脂奶粉 +PBST)于 37°C，保温封闭 2小时。将被检血清 (免疫过 HPV18 L1的鼠血清)用稀释缓冲液 (2%脱脂奶粉 +PBST)采用对倍稀释方式，从 1： 500稀释度一直稀释到 1 : 32000，阴性对照被检血清 (免疫铝佐剂的鼠血清)以 1 : 10000稀释，每个凹孔分别加入 O.lmL稀释后血清 (被检血清或阴性对照血清)， 37Ό保温 1小时。移去血清液，用 0.3mL洗涤液洗涤凹孔。每个凹孔加入用稀释缓冲液以 1 : 5000稀释的 HRP标记的羊抗小鼠 IgGO. lmL, 37°C保温 0.5小时。移去酶标液后，用 0.3mL洗涤液洗涤凹孔，并向凹孔中加入 O. lmL DAB显色液，于室温作用 20分钟后，加入 2M H₂SO₄ 0.05mL终止液终止反应。用酶标比色仪测定 OD₄₅。值。

采用终点滴度法计算血清的滴度值，其结果如表 4所示。

表 4、滴度测定结果综上实施例 1-6，本发明提供的 18 型人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白 L1 基因是一种优化过的 L1 基因，具有以下优点：经过优化的基因更适合在酵母宿主中高效率表达目标蛋白，而且能够满足工业化生产的要求；同时，本发明提供的 18 型人乳头状瘤病毒疫苗，能够自组装形成 VLPs 结构，纯化的 VLPs 吸附佐剂后，通过血清转阳率和血清滴度的测定，说明该疫苗能在小鼠体内产生较强的免疫原性，而且由于采用毕赤酵母表达系统，因此该方法具有以下优点：成本低，产量高，产品性质更加均一稳定。实施例 7、截短型的 HPV 18的密码子优化的 L1基因的设计与合成

7.1、截短型的 HPV 18的密码子优化的 L1基因的设计

本发明涉及经过毕赤酵母偏爱密码子优化的编码截短型的 18 型人乳头状瘤病毒 (HPV18)主要衣壳蛋白 L1 的 DNA分子，通过密码子最优化和对最优密码子频率进行一定修正并截短 N端部分 61 个氨基酸，获得三段 DNA序列，其序列分别如 SEQ ID NO: 1、 2和 3所示，具体如下：

首先，对天然的 HPV 18L1基因进行改造，改造方法参照前述实施例 1，设计出一个全新的 HPV DNA序列。

然后，为了避免翻译出来的 mRNA的 GC比例过高， mRNA的二级结构对翻译效率的影响，并避开一些常用的酶切位点，对优选的密码子进行一定的修正，例如将天冬酰胺 (Asn)密码子 AAC修正为 AAT; 赖氨酸 (Lys)密码子 AAG修正为 AAA; 天冬氨酸 (Asp)密码子 GAT修正为 GAC; 苯丙氨酸 (Phe)密码子 TTT修正为 TTC; 酪氨酸 (Tyr)密码子 TAC修正为 TAT, 并截短 N端部分 61个氨基酸，从而，设计出三个全新的截短型的 HPV DNA序列，其中：

SEQ ID NO: 1为未进行密码子修正的 DNA序列；

8£() 10 ^«): 2是8£(5 10 ^«): 1序列中修正天冬酰胺( 3 ，赖氨酸 (Lys)，天冬氨酸 (Asp)这三个密码子所得的 DNA序列；

SEQ ID NO: 3是 SEQ ID NO: 1序列中修正苯丙氨酸 (Phe)，酪氨酸 (Tyr)，甘氨酸 (Gly)这三个密码子所得的 DNA序列。

7.2、截短型的 HPV 18的密码子优化的 L1基因的合成

采用如前述实施例 1基本上相同的方法，获得全长的密码子优化的截短型的 HPV 18L1基因 SEQ ID NO: 1。获得的截短型的 HPV 18L1基因两端以 EcoRI和 Kpnl酶切位点装入 pUC18质粒 (捷瑞公司）中，命名为 pUC-18Ll'，并经测序验证为正确。

按照类似的方法获得 SEQ ID NO: 2和 3所示的截短型的 HPV 18的密码子优化的 L1基因。为验证优化序列的可行性，下面以实施例 7制备获得的 HPV 18L1基因优化序列中的一个 (SEQ ID

NO: 1)为例，构建表达质粒并验证其表达。实施例 8、截短型的 HPV 18L1基因的表达载体构建

将 SEQ ID NO: 1的优化序列克隆到毕赤酵母表达载体中，具体步骤如下：

8.1、合成扩增 HPV 18L1所需的正向引物和反向引物，序列如下所示：

正向引物： 5⁷ -TCCCAATCTTCGAAACGATGGCTTTGTGGA-3⁷ (SEP ID NO: 15);

反向弓 I物： 5 ' -AATGGTACCCTATTACTTTCTAGCTCTAACT-3 ' (SEQ ID NO: 13)。

8.2、用上述引物对为引物，以实施例 7获得的 pUC-18Ll'为模板，进行 PCR扩增，将扩增获得的产物进行电泳检测，结果如图 5所示，证明获得了全长密码子优化的截短型 HPV 18L1基因；将扩增获得的 PCR片段，经限制性内切核酸酶 BstBI和 Kpnl双酶切消化，再与 BstBI/Kpnl双酶切消化的 pPICZaB(I_nvlt_r0g_en公司)连接。再用连接液转化大肠杆菌菌株 ToplO (捷瑞公司)的感受态细胞，铺板于含 25 g/ml零霉素的 LB琼脂上。

由于 pPICZaB载体上携带有零霉素抗性基因，因此转化细胞能够在含零霉素的 LB培养基上生长。分离已转化细胞的单菌落，制备质粒 DNA, 并经限制性图谱 (结果如图 6所示)和核苷酸序列分析检测 HPV 18L1 基因和载体序列，鉴别出包含截短型的 HPV 18L1 基因的正确构建体，命名为 pPICZ-18Ll % 由于构建的质粒的分泌信号 (a-factor signal)已经被切去，因此，表达的 HPV 18L1蛋白应该是胞内表达蛋白。实施例 9、截短型的 HPV 18L1基因的表达菌株构建和表达

9.1、截短型的 HPV 18L1基因的表达菌株构建

用 Sac I限制性内切酶单酶切 pPICZ-18Ll '质粒使其线性化，对空质粒 pPICZaB进行同样的酶切作为阴性对照。酶切反应液加入无水乙醇，获得 DNA沉淀，用少量双蒸水溶解线性化的 pPICZ-18Ll ' 片段，电击转化毕赤酵母菌 X-33(I_nvltr₀g_en公司)，电转化条件为： DNA片段 5微克，电压 1500伏，电阻 25欧姆，电击时间为 5毫秒。将电转化产物铺板于含 200 μ g/ml零霉素 (Zeocm公司）的 YPDS 琼脂上，由于 pPICZaB载体上携带有零霉素抗性基因，因此转化产物能够在含零霉素的 YPDS琼脂上生长。分离已转化细胞的单菌落，即为截短型的 HPV 18L1的毕赤酵母表达菌株。

9.2、截短型的 HPV 18L1毕赤酵母表达菌株的表达

将获得的截短型的 HPV 18L1毕赤酵母表达菌株接种至含 1000 μ g/ml、 1500 μ g/ml零霉素抗性平板上。高浓度抗性平板上获得的克隆，分别用 4ml YPD液体培养基培养， 24hr后换成 BMMY培养基诱导基因表达，表达 48hr后离心收获菌体。取一部分菌体破菌处理，破菌上清用 West-Blotting鉴定，结果如图 7所示，根据该图结果，破菌上清中有截短型的 HPV 18L1蛋白表达。

虽然在本发明的实施例 8和 9中，使用的是 SEQ ID NO: 1序列进行克隆和表达，但对于本领域的技术人员来说，使用 SEQ ID NO: 2和 3序列进行克隆和表达，以获得相似的结果是显而易见的，因此，属于本发明的保护范围；而且，根据本发明的构思，对于本领域的技术人员来说，构建相似的序列并利用该构建的序列，使用毕赤酵母进行克隆和表达以获得相似甚至更优的结果，也是显而易见的，因此也属于本发明的保护范围。实施例 10、截短型的 HPV18 L1蛋白的大规模表达和检测

1.重组截短型 HPV 18 L1蛋白的大规模表达

种液制备：从工作种子库取 1支重组酵母菌种甘油冻存管，融化后吸取 ΙΟΟμί接入 5ml YPD培养基， 280转 /分钟 (rpm)， 30Ό培养 20小时。 OD₆。。在 1〜2。镜检无杂菌污染。将检验合格的活化液 lml接入 500ml YPD培养基， 280rpm， 30°C培养 20小时。 OD₆。。在 2〜6。镜检无杂菌污染。

发酵工艺：发酵用基础盐培养基 BSM K2S04 273g， MgS0₄ 109g, CaS0₄2H₂0 17.6g, H₃P0₄ 400.5ml, KOH 62g, 甘油 600g， PTMj 60ml, 泡敌 lml，去离子水加至 15L)，用去离子水配制，其中不含有抗生素，配制后在 30L发酵罐 (Bioengmeermg公司）中进行实罐灭菌。灭菌条件为 121°C， 30分钟，之后冷至 30°C。按 1 : 15接种。发酵温度为 30.0±0.5°C，初始 pH5.00±0.05，起始转速 300rpm 培养，通气量 0.5wm， DO 100%,添加 PTMl(CuS0₄5H₂0 6.0g， Nal 0.008g， MnSO₄3.0g， NaMoO₄0.2g, H₃BO₃0.02g, ZnSO₄20.0g， CoCl₂0.5g， FeS0₄.7H₂0 65.0g， biotin 0.2g, H₂SO₄5.0ml，去离子水力口至 1L)痕量盐类。初始增殖阶段大约 20小时左右，维持溶氧值不低于 30%，当碳源消耗完毕时，溶氧值迅速地上升,菌体湿重达到约 100g/L。初始两小时以每小时 200ml/h的速率补加体积百分比 50%的甘油溶液 (每升添加 12ml PTM o 补料两小时后改为 300ml/h。通过调节搅拌转速、空气流量、罐压 (<0.8bar)使溶氧水平维持在 20%以上。补加约 8小时，菌体湿重约 350g/L时，停止补料，溶氧值上升。同时将 pH值控制调为 6.00±0.05，开始加入甲醇 (每升添加 12ml PTM0诱导。最初甲醇加入量控制在 30ml/h。缓慢增加甲醇的加入量，甲醇诱导 4小时后将补料速度设定为 90ml/h。维持溶氧值高于体积百分比 20%，温度维持在 30°C， pH值控制为 6.00±0.05。每 8小时取一次样， Western Blot检测。诱导 48小时发酵结束时放出发酵液。

菌体收获：用冷冻离心机离心发酵液后收集菌体，称重。标明批号、日期、重量，收获的菌体交付于纯化，或在 -20Ό冻存。

2.检测

以纯化 (纯化方法如实施例 11)的截短型的 HPV18 L1蛋白做标准蛋白浓度曲线，以诱导前菌体做阴性对照，采用 ELISA夹心法检测 HPV 18L1基因在毕赤酵母中发酵表达量，具体步骤如下：

用包被液 2000倍稀释 HPV18 L1蛋白的兔多抗，向酶标板的凹孔中各加入 O. lmL稀释后的兔多抗，于 4°C过夜后，移去包被液，并用 0.3mL PBST洗涤凹孔，然后用 0.3mL封闭液于 37°C保温 2 小时，进行封闭。

用稀释液以对倍稀释的方式，将纯化的 HPV18 L1蛋白从浓度 2 g/mL梯度稀释到 0.0625 g/mL，同时将获得的发酵菌体的破菌上清稀释 200 倍，然后分别向凹孔中加入 O. l mL 梯度稀释后不同浓度的 HPV 18 L1蛋白溶液或稀释后的破菌上清，于 37Ό保温 1小时后，移去抗原液，并用 0.3mL洗涤液洗涤凹孔；然后用稀释缓冲液将 MAB885 鼠单抗 (购自 CHEMICON公司） 1000倍稀释后加入到凹孔中，每孔各 O. lmL, 37°C保温 1小时后，移去单抗溶液后，用 0.3 mL洗涤液洗涤凹孔；再向凹孔中加入用稀释缓冲液 5000倍稀释的 HRP标记的羊抗小鼠 IgG各 0.1 mL,在 37°C保温 0.5小时后，移去酶标液，并用 0.3 mL洗涤液洗涤凹孔后，向凹孔中各加入 O. l mL DAB显色液，室温下作用 20 分钟后，向每个凹孔中加入 0.05 mL 2M H₂S0₄终止液以终止反应，并用酶标比色仪测定 OD₄₅。值。

利用梯度稀释的 HPV18 L1蛋白的 OD₄₅。的检测结果，制作标准蛋白浓度曲线，再通过标准蛋白浓度曲线换算获得截短型的 HPV 18 L1蛋白的发酵表达量，结果如表 5所示，其中：

用已测定浓度的纯化目的蛋白原液稀释一系列浓度，例如： 2 g/mL， l g/mL， 0.5 g/mL， 0.25 g/mL， 0.125 g/mL，作为标准浓度，通过 ELISA检测，用浓度做纵坐标，对应 OD₄₅。检测值做横坐标，建立标准线性回归方程。

发酵破菌液上清稀释一系列倍数，例如 50， 100， 200， 400倍。测出的 OD₄₅。值通过标准线性回归方程求得对应浓度 (单位为 g/mL)，再乘以稀释倍数即为发酵破菌液上清目的蛋白浓度 (单位为 g/mL)。由于破菌液是由菌泥湿重：破菌缓冲液 = 1 : 5配制的，所以发酵菌泥的目的蛋白表达量 (单位为 g/g菌泥)为 5 X发酵破菌液上清目的蛋白浓度 (单位为 g/mL)。再乘以发酵液菌体密度 (单位为 g菌泥 /L发酵液)，则为发酵目的蛋白表达量浓度 (单位为 g/L发酵液)。

发酵破菌液上清目的蛋 X OD₄₅。(发酵破菌液上清 )/OD₄₅。(标准目的蛋白浓度)；

发酵目的蛋白表达量浓度 ^g/L发酵液 )=5 X发酵破菌液上清目的蛋白浓度 g/mL) X发酵液菌体密度 (g菌泥 /L发酵液)。

表 5 截短型 HPV 18 L1基因的在毕赤酵母中发酵表达量的检测稀释液浓度平均浓度发酵密发酵表达样品 OD₄₅₀ 原

换算浓度

倍数 (^g /ml) ( g/ml) 度里破菌液 200 0.455 161.4 88(^g/g湿 385mg/L

176 438g/L

上清 1 100 0.718 185.6 菌体发酵液破菌液 200 0.365 153.0

76(^g/g湿 314mg/L

152 413g/L

上清 2 100 0.612 160.5 菌体发酵液阴性对照 100 0.091

空白对照 - 0.083

由表 5的结果可见，本发明的 HPV 18L1蛋白基因的 ffi化序列，不仅能够在毕赤酵母中表达 HPV

18L1蛋白，而且表达量高，能够满足工业化生产的要求。实施例 11、截短型的 HPV 18L1蛋白纯化

清洗：将 -20Ό冷冻保存的、上述制得的表达截短型 HPV 18 L1的毕赤酵母细胞，放于室温下解冻，加入清洗缓冲液 100mM PB pH7.0、 0.15M NaCl或者纯化用水，按比例 1 : 3(g/ml)混合，使用匀浆机 (FLUKO)将酵母细胞与清洗缓冲充分打匀，随后通过高速离心 (SORVALLRC6PLUS)8000rpm， 5mm分离细胞和清洗上清。重复以上操作二遍，即完成细胞的清洗。

破碎：将清洗后的细胞加入破菌缓冲液 (100 mM MOPS , 0.75M NaCl, 0.05% Tween-80, pH 7.0), 按 1 : 5(g/ml)的比例混合，用匀浆机 (FLUKO)将酵母细胞与破菌缓冲液充分混匀。使用高压均质机 (ATSAH110B)在压力 1200〜1300bar的操作压力下破碎以上经过匀浆的细胞悬液，重复 4遍， 4°C〜 8°C出口冷却，使 90%的细胞破碎。

澄清：将经过高压破碎的破菌液倒入离心杯中，通过高速离心去除细胞碎片，收集离心上清用于随后的柱层析分离。使用的离心机： SORVALLRC6PLUS , 转子型号： FIBERLITEF10-6x500y，离心设置： 9000rpm， 30min, 10°C。

初纯：使用层析介质 POROS 50HS(Applied Biosystems)装柱 (直径 26mm，高度 10，体积 50ml)。通过以下步骤进行纯化：清洗消毒： 0.5M NaOH清洗 2个柱体积；再生平衡：缓冲液 F清洗 2个柱体积，缓冲液 E平衡层析柱；上样：将经过离心澄清的破菌上清上样；淋洗：缓冲液 E淋洗 5个柱体积，至基线平稳。洗脱： 100%缓冲液 E至 100%的缓冲液 F的线性梯度洗脱。洗脱总体积为 6个柱体积。收集电导在 70〜100ms/cm的层析峰，放在 4°C保存收集。

精纯：使用层析介质 CHT(BIO-RAD， Typell, 40um)装柱 (直径 26mm，高度 10cm，体积 50ml)。通过以下步骤进行纯化：清洗消毒： 0.5M NaOH清洗 2个柱体积；再生平衡：缓冲液 H清洗 2个柱体积，缓冲液 G平衡层析柱。上样：将经过初纯后收集的样品加入 PB至终浓度为 30mM上样；淋洗：缓冲液 G淋洗 5个柱体积，至基线平稳。洗脱： 100%缓冲液 G至 100%的缓冲液 H的线性梯度洗脱。收集：分部收集洗脱组分，将含有截短型 HPV 18L1 蛋白的组分合并，即为最后的纯化样品。将纯化样品还原为单体蛋白后经过还原性 SDS-PAGE(Bio-RAD) (见图 8)，纯度 >90%。

Western blot(Bio-RAD)检测的电泳目的条带可与 HPV 18 L1 蛋白的单抗或多抗呈特异性的显色反应 (见图 9)。经过动态光散射 (Malvern Instruments Zetasizer Nano ZS)的检测纯化样品颗粒范围在 50〜80nm左右，经过电镜 (Philips Tecnai-12Biotwin透射电子显微镜，上海中医药大学科技中心电镜室)观察纯化样品呈现病毒样颗粒 (VLPs)结构，颗粒直径在 50〜80nm之间，见图 10。前述表达的全长 HPV 18L1蛋白经过相同方法纯化后也可获得 VLPs纯化样品，经过动态光散射和电镜检测，形成的颗粒大小与截短型 HPV 18L1蛋白颗粒相同，颗粒直径在 50〜80nm之间。实施例 12、截短型的 HPV 18L1 疫苗制备

参考《中华人民共和国药典》（2005年版)中的方法，将实施例 11中纯化获得的 HPV 18L1 VLPs, 吸附铝佐剂，制备获得具有免疫原性的 HPV 18L1 疫苗。实施例 13、截短型的 HPV 18L1基因表达产物免疫原性的测定

选取 6〜8 周龄的 SPF 级 BALB/c 小鼠，分为 4组，每组 6 只小鼠。第 1 组小鼠用 0.1 mL含有铝佐剂的缓冲液 (0.32M氯化钠 ,0.35mM硼酸钠， 0.01%吐温 -80， 0.01M组氨酸， pH6.5)进行免疫 (作为阴性对照组)，其它 3 组分别用 0.1 mL 浓度为 5 g/mL、 0.5 g/mL、 0.05 g/mL 的吸附铝佐剂的 VLPs (作为检测组)，分别于第 0、 7、 21天皮下注射免疫，共免疫三次，第三次免疫后两周采血。将采集得到的血液于 37Ό放置 2h后， 4000g离心10 mm，吸取上清，即得到鼠多抗血清，于 - 20Ό存放，并检测鼠血清的转阳率和滴度，具体方法如下：

13.1、血清转阳率的检测：

用包被液稀释纯化的毕赤酵母表达的截短型的 HPV18 L1 VLPs至 1 g/mL，向酶标板每个凹孔中各加 0.1 mL， 4°C过夜。移去包被液，用 0.3 mL PBST洗涤凹孔。用 0.3 mL 封闭液 (5%脱脂奶粉 + PBST)于 37Ό保温 2 小时。每凹孔加入用稀释缓冲液 (2%脱脂奶粉 +PBST)以 1 : 400稀释的被检血清 (免疫过 HPV18 L1和铝佐剂的鼠血清和只免疫铝佐剂的鼠血清)各 0.1 mL, 于 37Ό保温 1小时后移去血清液，用 0.3 mL洗涤液洗涤凹孔。然后向每凹孔加入用稀释缓冲液以 1 : 5000稀释的 HRP 标记的羊抗小鼠 IgG各 0.1 mL, 37°C保温 0.5 小时后移去酶标液，用 0.3 mL洗涤液洗涤凹孔；然后向凹孔中加入 0.1 mL DAB 显色液，室温避光作用 20 分钟后加 2 M H₂S0₄ 0.05 mL终止液终止反应，并用酶标比色仪测定 OD₄₅。值， OD₄₅。值如表 6所示。

表 6、 OD₄₅。读数

Cutoff值为阴性对照被检血清 (免疫铝佐剂的鼠血清)抗体的 OD₄₅。值的平均值加上 3倍标准差， OD₄₅。值大于 Cutoff值的小鼠判定为阳性， OD₄₅。值小于 Cutoff值的小鼠判定为阴性。三个检测组的转阳率结果如表 7所示。

表 7、转阳率结果

13.2、血清滴度的测定

用包被液稀释纯化的截短型的 HPV18 L1至 1 g/mL，取 0.1 mL加于酶标板的各凹孔中， 4°C过夜；移去包被液，用 0.3mL PBST洗涤上述凹孔，再用 0.3mL封闭液 (5%脱脂奶粉 +PBST)于 37°C，保温封闭 2小时。将被检血清 (免疫过 HPV18 L1的鼠血清)用稀释缓冲液 (2%脱脂奶粉 +PBST)采用对倍稀释方式，从 1 : 500稀释度一直稀释到 1 : 32000，阴性对照被检血清 (免疫铝佐剂的鼠血清)以 1 : 10000稀释，每个凹孔分别加入 O. lmL稀释后血清 (被检血清或阴性对照血清)， 37Ό保温 1小时。移去血清液，用 0.3mL洗涤液洗涤凹孔。每个凹孔加入用稀释缓冲液以 1 : 5000稀释的 HRP标记的羊抗小鼠 IgGO. lmL, 37°C保温 0.5小时。移去酶标液后，用 0.3mL洗涤液洗涤凹孔，并向凹孔中加入 O. lmL DAB显色液，于室温作用 20分钟后，加入 2M H₂S0₄ 0.05mL终止液终止反应。用酶标比色仪测定 OD₄₅。值。采用终点滴度法计算血清的滴度值，其结果如表 8所示。

表 8、滴度测定结果综上实施例 1-13，本发明提供的 18 型人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白 L1 基因或截短型 18 型人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白 L1 基因是一种优化过的 L1 基因，具有以下优点：经过优化的基因更适合在酵母宿主中高效率表达目标蛋白，而且能够满足工业化生产的要求；同时，本发明提供的 18 型人乳头状瘤病毒疫苗，能够自组装形成 VLPs 结构，纯化的 VLPs 吸附佐剂后，通过血清转阳率和血清滴度的测定，说明该疫苗能在小鼠体内产生较强的免疫原性，而且由于采用毕赤酵母表达系统，因此该方法具有以下优点：成本低，产量高，产品性质更加均一稳定。实施例 14、截短型 HPV 18 LI VLPs的中和活性

小鼠免疫程序同前，免疫后两周采血。将采集的血液置 37Ό放置 2h， 4000g离心 10mm，吸取上清，即得到鼠多抗血清，存放于 -20Ό。

将 293FT细胞 (Invitrogen)预先铺于 15cm细胞培养皿 (1.1 X 10⁷细胞 /dish) , 24h后将质粒 p l 8Llh， p 18L2h(Buck CB, Pastrana DV, Lowy DR et al. Efficient Intracellular Assembly of Papillomaviral Vectors.

J Virol, 2004, 78(2):751-757)和带绿色荧光基因的 pIRES2-EGFP (购自 BD Biosciences Clontech)用磷酸钙方法进行共转染，用量分别为 20μ_§、 10μ_§, 10μ_§。 48h后进行观察并收集和裂解细胞，将收集的细胞裂解上清立即用于纯化或置 -80Ό保存。

在 5ml离心管 (Beckman)中用 30% Opti Prep密度梯度离心纯化收集的细胞裂解液， 16°C下 100，

000g离心 4h(MLS-50转头， Beckman超速离心机)，分部收集离心组分，每份约 500μ1，以蛋白印迹实验方法检测各组分中的 HPV 18 L1蛋白含量，将 L1蛋白浓度最高的组分合并，作为假病毒液，分装后 -80Ό保存。

将 293FT细胞铺于 24孔细胞培养板中（1.5 X 10⁵细胞 /well)。 24h后进行中和实验，将不同的血清样本分别用 DMEM培养基从 100倍起进行连续倍比稀释，然后取 50μ1分别与 50μ1稀释于 DMEM培养基的假病毒液混合， 4Ό孵育 lh后分别加入预铺有 293FT细胞的 24孔细胞培养板中， 37Ό培养 48h后用 OLUMPUSCKX41F32FL倒置荧光显微镜观察表达绿色荧光蛋白的细胞并采集荧光图像，见图 1 1a和图 l lb。图 1 1a有荧光，表明 HPV 18假病毒感染了 293FT细胞。图 l ib只剩极少荧光，表明鼠血清中和了 HPV 18假病毒，降低了 293FT细胞的感染。由此可见小鼠免疫重组 HPV 18L1 VLPs 疫苗后能产生中和抗体，能够阻止假病毒进入细胞。

本发明也可以将核苷酸序列 SEQ ID NO: 2〜3替换上述实施例中的 SEQ ID NO: 1，将核苷酸序列 SEQ ID NO: 5〜6替换上述实施例中的 SEQ ID NO: 4；按照前述实施例方法制备本发明的 HPV 18 L1蛋白或其截短形式；也可以将上述基因克隆至现有其它毕赤酵母表达载体，如 pPIC6、 pGAPZ或 pA0815，并选择与之相应的克隆方式，然后将重组表达载体转化其它毕赤酵母细胞，如 Pichia pastoris GS115、 KM71或 SMD1168菌株，构建基因工程菌，按照常规技术培养发酵、分离纯化得到本发明的 HPV 18 L1蛋白 (HPV 18 LI VLPs)或其截短形式，这些技术在此不详述。制得的 HPV 18 L1蛋白或其截短形式也具有与上述实施例制得 HPV 18 L1蛋白或其截短形式相类似的免疫原性。实施例 15、 HPV 16的密码子优化的 L1基因的设计与合成

15.1、 HPV 16的密码子优化的 L1基因的设计

本实施例涉及经过毕赤酵母偏爱密码子优化的编码 16 型人乳头状瘤病毒 (HPV16)主要衣壳蛋白 L1的 DNA分子，通过密码子最优化和对最优密码子频率进行一定修正获得三段 DNA序列，其序列分别如 SEQ ID NO:7、 8和 9所示，具体如下：

首先，对天然的 HPV 16L1基因进行改造，经过反复研究比较，对其所有的氨基酸全部采用经过优化的密码子，设计出一个全新的 HPV DNA序列，即 SEQ ID NO:7。

然后，为了避免翻译出来的 mRNA的 GC比例过高， mRNA的二级结构对翻译效率的影响，并避开一些常用的酶切位点，对最优的密码子频率进行一定的修正，例如将天冬酰胺 (Asn)密码子 AAC 修正为 AAT, 赖氨酸 (Lys)密码子 AAG修正为 AAA, 天冬氨酸 (Asp)密码子 GAT修正为 GAC，苯丙氨酸 (Phe)密码子 TTT修正为 TTC, 酪氨酸 (Tyr)密码子 TAC修正为 TAT, 甘氨酸 (Gly)密码子 GGT 修正为 GGA, 从而，又设计出两个全新的 HPV DNA序列，其中：

SEQ ID NO:8 是 SEQ ID NO:7序列中修正天冬酰胺 (Asn)，赖氨酸 (Lys)，天冬氨酸 (Asp)这三个密码子所得的 DNA序列； SEQ ID NO: 9是 SEQ ID NO:7序列中修正苯丙氨酸 (Phe；)，酪氨酸 (Tyr)，甘氨酸 (Gly)这三个密码子所得的 DNA序列。

15.2、 HPV 16的密码子优化的 L1基因的合成

合成如序列 SEQ ID NO:7所示的 HPV 16的密码子优化的 L1基因，以该合成的基因作为模板，然后用引物 al和 a2作为引物，进行 PCR扩增，引物 al和 a2序列如下所示：

a 1： 5 ' -ATAGAATTCATGTCTTTGTGGTTGCCATC-3 '(SEQ ID NO: 16)；

a2: 5 ' -ATAGGTACCCTATTACAACTTTCTCTTCTTT-3 ' (SEQ ID NO： 17)。

将获得的 PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳进行分离，胶回收目标片段，获得大小约为 1.5kbp的片段，并将该片段测序，该片段的序列测序结果如 SEQ ID NO: 7所示，根据测序结果显示该片段即是全长的密码子优化的 HPV 16L1基因。获得的 HPV 16L1基因两端以 EcoRI和 Kpnl酶切位点装入 pUC18质粒 (捷瑞公司）中，命名为 pUC-16Ll，并经测序验证为正确。

按照类似的方法获得 SEQ ID NO: 8和 9所示的 HPV 16的密码子优化的 L1基因。

为验证优化序列的可行性，下面以实施例 15制备获得的 HPV 16L1基因优化序列中的一个 (SEQ

ID NO: 7)为例，构建表达质粒并验证其表达。实施例 16、 HPV 16L1基因的表达载体构建

将 SEQ ID NO: 7的优化序列克隆到毕赤酵母表达载体中，构建方法如图 12所示，具体步骤如下： 16.1、合成扩增 HPV 16L1所需的正向引物和反向引物，序列如下所示：

正向引物： 5 ' -ACTAATTATTCGAAACGATGTCTTTGTGG-3 ' (SEQ ID NO: 18)；

反向弓 I物： 5 ' -AGCGGTACCCTATTACAACTTTCTCTTCTTTC-3 ' (SEQ ID NO： 19)。

其中，正向引物包括一个 BstBI 限制性内切酶位点；反向引物包括位于终止密码子侧翼的 Kpnl 限制性内切酶位点，所述酶切位点分别如引物序列中的下划线所示。 16.2、用上述引物对为引物，以实施例 15获得的 pUC-16Ll为模板，进行 PCR扩增，将扩增获得的产物进行电泳检测，结果如图 13所示，证明获得了全长密码子优化的 HPV 16L1基因；将扩增获得的 PCR片段，经限制性内切核酸酶 BstBI和 Kpnl双酶切消化，再与 BstBI/Kpnl双酶切消化的 _PPICZaB(Invitrogen公司)连接。再用连接液转化大肠杆菌菌株 ToplO (捷瑞公司）的感受态细胞，铺板于含 25 g/ml零霉素的 LB琼脂上。

由于 pPICZaB载体上携带有零霉素抗性基因，因此转化细胞能够在含零霉素的 LB培养基上生长。分离已转化细胞的单菌落，制备质粒 DNA, 并经限制性图谱 (结果如图 14所示)和核苷酸序列分析检测 HPV 16L1基因和载体序列，鉴别出包含 HPV 16L1基因的正确构建体，命名为 pPICZ-16Ll，由于构建的质粒的分泌信号 (a-factor signal)已经被切去，因此， HPV 16L1蛋白应该是胞内表达蛋白。实施例 17、 HPV 16L1毕赤酵母表达菌株的构建和表达

17.1、 HPV 16L1毕赤酵母表达菌株的构建

用 Sac I限制性内切酶单酶切 pPICZ-16Ll质粒使其线性化，对空质粒 pPICZaB进行同样的酶切作为阴性对照。酶切反应液加入无水乙醇，获得 DNA沉淀，用少量双蒸水溶解线性化的 pPICZ-16Ll 片段，电击转化毕赤酵母菌 X-33(I_nvltr₀g_en公司)，电转化条件为： DNA片段 5微克，电压 1500伏，电阻 25欧姆，电击时间为 5毫秒。电转化产物铺板于含 200μ_§/ηι1零霉素 (Zeocm)的 YPDS琼脂上，由于 pPICZaB载体上携带有零霉素抗性基因，因此转化产物能够在含零霉素的 YPDS琼脂上生长。分离已转化细胞的单菌落，即为 HPV 16L1的毕赤酵母表达菌株。

17.2、 HPV 16L1毕赤酵母表达菌株的表达

将获得的 HPV 16L1毕赤酵母表达菌株接种至含 1000μ_§/ηι1、 1500μ₈/ηι1零霉素抗性平板上。高浓度抗性平板上获得的克隆，分别用 4ml YPD液体培养基培养， 24hr后换成 BMMY培养基诱导基因表达，表达 48hr后离心收获菌体。取一部分菌体破菌处理，破菌上清用 West-Blotting鉴定，结果如图 15所示，根据该图结果，破菌上清中有 HPV 16L1蛋白表达。

虽然在本发明的实施例 16和 17中，使用的是 SEQ ID NO: 7序列进行克隆和表达，但对于本领域的技术人员来说，使用 SEQ ID NO: 8和 9序列进行克隆和表达，以获得相似的结果是显而易见的，因此，属于本发明的保护范围；而且，根据本发明的构思，对于本领域的技术人员来说，构建相似的序列并利用该构建的序列，使用毕赤酵母进行克隆和表达以获得相似甚至更优的结果，也是显而易见的，因此，也属于本发明的保护范围。实 I^、 HPV 16L1蛋白的大规模表达和检测

1.重组 HPV 16 L1蛋白的大规模表达

种液制备：从工作种子库取 1支重组酵母菌种甘油冻存管，融化后吸取 ΙΟΟμΙ接入 5ml YPD培养基， 280转 /分钟 (rpm)， 30°C培养 20小时。 OD₆。。在 1〜2。镜检无杂菌污染。将检验合格的活化液 lml接入 500ml YPD培养基， 280rpm， 30°C培养 20小时。 OD₆。。在 2〜6。镜检无杂菌污染。

发酵工艺：发酵用基础盐培养基 BSM K2S04 273g， MgS0₄ 109g， CaS0₄2H₂0 17.6g， H₃P0₄

400.5ml, KOH 62g，甘油 600g， PTMj 60ml, 泡敌 lml，去离子水加至 15L)，用去离子水配制，其中不含有抗生素，配制后在 30L发酵罐 (Bioengmeermg公司）中进行实罐灭菌。灭菌条件为 121°C， 30分钟，之后冷至 30°C。按 1: 15接种。发酵温度为 30.0±0.5°C，初始 pH5.00±0.05，起始转速 300rpm 培养，通气量 0.5wm， DO 100%,添加 PTMl(CuS0₄5H₂0 6.0g， Nal 0.008g， MnSO₄3.0g， NaMoO₄0.2g, H₃BO₃0.02g, ZnSO₄20.0g， CoCl₂0.5g， FeS0₄.7H₂0 65.0g， biotin 0.2g, H₂SO₄5.0ml，去离子水力口至

1L)痕量盐类。初始增殖阶段大约 20小时左右，维持溶氧值不低于 30%，当碳源消耗完毕时，溶氧值迅速地上升，菌体湿重达到约 100g/L。初始两小时以每小时 200ml/h的速率补加体积百分比 50% 的甘油溶液 (每升添加 12ml PTM o 补料两小时后改为 300ml/h。通过调节搅拌转速、空气流量、罐压 (<0.8bar)使溶氧水平维持在 20%以上。补加约 8小时，菌体湿重约 350g/L时，停止补料，溶氧值上升。同时将 pH值控制调为 6.00±0.05，开始加入甲醇 (每升添加 12ml PTM0诱导。最初甲醇加入量控制在 30ml/h。缓慢增加甲醇的加入量，甲醇诱导 4小时后将补料速度设定为 90ml/h。维持溶氧值高于体积百分比 20%，温度维持在 30°C， pH值控制为 6.00±0.05。每 8小时取一次样， Western Blot 检测。诱导 24小时发酵结束时放出发酵液。

2.检测

以纯化 (纯化方法如实施例 19)的 HPV16 L1蛋白做标准蛋白浓度曲线，以诱导前菌体做阴性对照，采用 ELISA夹心法检测 HPV 16L1基因在毕赤酵母中发酵表达量，具体步骤如下：

用包被液 2000倍稀释 HPV16 L1蛋白的兔多抗，向酶标板的凹孔中各加入 O. lmL稀释后的兔多抗，于 4°C过夜后，移去包被液，并用 0.3mL PBST洗涤凹孔，然后用 0.3mL封闭液于 37°C保温 2 小时，进行封闭。

用稀释液以对倍稀释的方式，将纯化的 HPV 16 L1蛋白从浓度 2 g/mL梯度稀释到 0.0625 g/mL，同时将获得的发酵菌体的破菌上清稀释 200 倍，然后分别向凹孔中加入 O. l mL梯度稀释后的不同浓度的 HPV 16 L1蛋白溶液或稀释后的破菌上清，于 37Ό保温 1小时后，移去抗原液，并用 0.3 mL 洗涤液洗涤凹孔；然后用稀释缓冲液将 MAB885鼠单抗 (购自 CHEMICON公司） 1000 倍稀释后加入到凹孔中，每孔各 O. l mL, 37 °C保温 1小时后，移去单抗溶液后，用 0.3 mL洗涤液洗涤凹孔；再向凹孔中加入用稀释缓冲液 5000 倍稀释的 HRP标记的羊抗小鼠 IgG各 O. l mL,在 37 °C保温 0.5 小时后，移去酶标液，并用 0.3 mL洗涤液洗涤凹孔后，向凹孔中各加入 O. l mL DAB显色液，室温下作用 20 分钟后，向每个凹孔中加入 0.05 mL 2 M H₂S0₄终止液以终止反应，并用酶标比色仪测定 OD₄₅。值。

利用梯度稀释的 HPV 16 L1 蛋白的 OD ₄₅。的检测结果，制作标准蛋白浓度曲线，再通过标准蛋白浓度曲线换算获得 HPV 16 L1 蛋白的发酵表达量，结果如表 9所示，其中：用已测定浓度的纯化目的蛋白原液稀释一系列浓度，例如： 2 g/mL， 1 g/mL， 0.5 g/mL， 0.25 g/mL， 0.125 g/mL，作为标准浓度，通过 ELISA检测，用浓度做纵坐标，对应 OD₄₅。检测值做横坐标，建立标准线性回归方程。

表 9、 HPV 16L1蛋白的发酵表达结果

稀释平均浓度发酵密发酵表达样品 OD₄₅₀ 原液浓度

换算浓度

倍数 (^g /ml) ( g/ml) 度里破菌液 200 0.601 382 1904μ_§/_§ 899mg/L

381 472g/L

上清 1 100 1.034 379.5 湿菌体发酵液破菌液 200 0.826 578.1 2708μ_§/_§ 940mg/L

542 347g/L

上清 2 100 1.323 505.1 湿菌体发酵液阴性对照 100 0.085

空白对照 - 0.077

由表 9的结果可见，本发明的 HPV 16L1蛋白基因的 ffi化序列，不仅能够在毕赤酵母中表达 HPV

16L1蛋白，而且表达量较高，能够满足工业化生产的要求。实施例 19、 HPV 16L1蛋白纯化

清洗：将 -20Ό冷冻保存的、上述制得的表达 HPV 16 L1蛋白的 P_1Ch 酵母细胞，放于室温下解冻，加入清洗缓冲液 100mM PB pH7.0、 0.15M NaCl或者纯化用水，按比例 l:3(g/ml)混合，使用匀浆机 (FLUKO)将酵母细胞与清洗缓冲充分混匀，随后通过高速离心（S0RVALLRC6PLUS) 8000rpm， 5mm分离细胞和清洗上清。重复以上操作二遍，即完成细胞的清洗。

破碎：将清洗后的细胞加入破菌缓冲液 (200mM MOPS、 pH7.0、 0.4M NaCl、 0.05% Tween-80), 按 l:5(g/ml)的比例混合，使用匀浆机 (FLUKO)将酵母细胞与破菌缓冲液充分混匀。使用高压均质机 (ATSAH110B)在压力 1200〜1300bar的操作压力下破碎以上经过匀浆的细胞悬液，重复 4遍 4°C〜8 °C出口冷却，使 90%的细胞破碎。

澄清：将经过高压破碎的破菌液倒入离心杯中，通过高速离心去除细胞碎片，收集离心上清用于随后的柱层析分离。使用的离心机： SORVALLRC6PLUS, 转子型号： FIBERLITEF10-6x500y，离心设置： 9000rpm， 30min, 10°C。

初纯：使用层析介质 POROS 50HS(Applied Biosystems)装柱 (直径 26mm，高度 10cm，体积 50ml)。通过以下步骤进行纯化：清洗消毒： 0.5M NaOH清洗 2个柱体积；再生平衡：缓冲液 F清洗 2个柱体积，缓冲液 E平衡层析柱；上样：将经过离心澄清的破菌上清上样；淋洗：缓冲液 E淋洗 5个柱体积，至基线平稳。洗脱： 100%缓冲液 E至 100%的缓冲液 F的线性梯度洗脱。收集：分部收集洗脱组分，将含有 HPV 16 L1蛋白的组分 (SDS-PAGE, Western blot检测判断)合并，用于精纯。

精纯：使用层析介质 CHT(BIO-RAD， Typell, 40um)装柱 (直径 26mm，高度 10cm，体积 50ml)。通过以下步骤进行纯化：清洗消毒： 0.5M NaOH清洗 2个柱体积；再生平衡：缓冲液 H清洗 2个柱体积，缓冲液 G平衡层析柱。上样：将经过初纯后收集的样品加入 PB至终浓度为 20mM上样；淋洗：缓冲液 G淋洗 5个柱体积，至基线平稳。洗脱： 100%缓冲液 G至 100%的缓冲液 H的线性梯度洗脱收集：分部收集洗脱组分，将含有 HPV 16 L1 蛋白的组分合并，即为最后的纯化样品，将纯化样品还原为单体蛋白后经过还原性 SDS-PAGE(Bio-RAD) (见图 16)以及毛细管电泳 (Beckman Coulter)的检测 (见图 17)，纯度 >90%。 HPV 16 L1毛细管电泳其参数如下：

波长 220nm检测结果

峰保留时间峰高校准后峰面积校准后峰面积所占比例

1 18.417 1530 1175.79185520 6.30041539

2 19.583 14269 17486.34042553 93.69958461 合计 15799 18662.13228074 100.00000000

Western-blot(Bio-RAD)检测的电泳目的条带可与 HPV 16 L1蛋白的单抗或多抗呈特异性的显色反应。经过动态光散射 (Malvern Instruments Zetasizer Nano ZS)的检测纯化样品颗粒范围在 50〜80nm 左右，经过电镜 (Philips Tecnai-12Biotwm透射电子显微镜，上海中医药大学科技中心电镜室）观察纯化样品呈现病毒样颗粒 (VLPs)结构，颗粒直径在 50〜80nm之间，见图 18。实施例 20、 HPV 16L1 疫苗制备

参考《中华人民共和国药典》（2005年版)中的方法，将实施例 19中纯化获得的 HPV 16L1 VLPs, 吸附铝佐剂，制备获得具有免疫原性的 HPV 16L1 疫苗。实施例 21、 HPV 16L1基因表达产物免疫原性的测定

选取 6〜8 周龄的 SPF 级 BALB/c 小鼠，分为 4组，每组 6 只小鼠。第 1 组小鼠用 0.1 mL含有铝佐剂的缓冲液 (0.32M氯化钠 ,0.35mM硼酸钠， 0.01%吐温 -80， 0.01M组氨酸， pH6.5)进行免疫 (作为阴性对照组)，其它 3 组分别用 0.1 mL 浓度为 5 g/mL、 0.5 g/mL、 0.05 g/mL 的吸附铝佐剂的 VLPs (作为检测组)，分别于第 0、 7、 21天皮下注射免疫，共免疫三次，第三次免疫后两周采血。将采集得到的血液于 37Ό放置 2 h 后， 4000g 离心 10 mm, 吸取上清，即得到鼠多抗血清，于 - 20Ό 存放，并检测鼠血清的转阳率和滴度，具体方法如下：

21.1、血清转阳率的检测：

用包被液稀释纯化的毕赤酵母表达的 HPV16 L1 VLPs至 1 g/mL，向酶标板每个凹孔中各加 0.1 mL, 4°C过夜。移去包被液，用 0.3 mL PBST洗涤凹孔。用 0.3 mL封闭液 (5%脱脂奶粉 + PBST)于 37°C 保温 2 小时。每凹孔加入用稀释缓冲液 (2%脱脂奶粉 +PBST)以 1 : 400稀释的被检血清 (免疫过 HPV16 L1和铝佐剂的鼠血清和只免疫铝佐剂的鼠血清)各 0.1 mL,于 37Ό保温 1小时后移去血清液，用 0.3 mL 洗涤液洗涤凹孔。然后向每凹孔加入用稀释缓冲液以 1 : 5000稀释的 HRP 标记的羊抗小鼠 IgG 各 0.1 mL, 37°C保温 0.5 小时后移去酶标液，用 0.3 mL洗涤液洗涤凹孔；然后向凹孔中加入 0.1 mL DAB 显色液，室温避光作用 20 分钟后加 2 M H₂S0₄ 0.05 mL终止液终止反应，并用酶标比色仪测定 OD₄₅。值， OD₄₅。值如表 10所示。

表 10、 OD₄₅。读数

Cutoff值为阴性对照被检血清 (免疫铝佐剂的鼠血清)抗体的 OD₄₅。值的平均值加上 3倍标准差， OD₄₅。值大于 Cutoff值的小鼠判定为阳性， OD₄₅。值小于 Cutoff值的小鼠判定为阴性。三个检测组的转阳率结果如表 11所示。

表 11、转阳率结果

21.2、血清滴度的测定用包被液稀释纯化的 HPV16 L1至 ^g/mL, 取 O. lmL加于酶标板的各凹孔中， 4°C过夜；移去包被液，用 0.3mL PBST洗涤上述凹孔，再用 0.3mL封闭液 (5%脱脂奶粉 +PBST)于 37°C，保温封闭 2小时。将被检血清 (免疫过 HPV16 L1的鼠血清)用稀释缓冲液 (2%脱脂奶粉 +PBST)采用对倍稀释方式，从 1： 500稀释度一直稀释到 1 : 32000，阴性对照被检血清 (免疫铝佐剂的鼠血清)以 1 : 10000稀释，每个凹孔分别加入 O.lmL稀释后血清 (被检血清或阴性对照血清)， 37Ό保温 1小时。移去血清液，用 0.3mL洗涤液洗涤凹孔。每个凹孔加入用稀释缓冲液以 1 : 5000稀释的 HRP标记的羊抗小鼠 IgG O. lmL, 37°C保温 0.5小时。移去酶标液后，用 0.3mL洗涤液洗涤凹孔，并向凹孔中加入 O. lmL DAB显色液，于室温作用 20分钟后，加入 2M H₂SO₄ 0.05mL终止液终止反应。用酶标比色仪测定 OD₄₅。值。

采用终点滴度法计算血清的滴度值，其结果如表 12所示。

表 12、滴度测定结果

综上实施例 15-21所述，本发明提供的 16型人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白 L1 基因是一种优化过的 L1 基因，具有以下优点：经过优化的基因更适合在酵母宿主中高效率表达目标蛋白，而且能够满足工业化生产的要求；同时，本发明提供的 16 型人乳头状瘤病毒疫苗，能够自组装形成 VLPs结构，纯化的 VLPs吸附佐剂后，通过血清转阳率和血清滴度的测定，说明该疫苗能在小鼠体内产生较强的免疫原性，而且由于采用毕赤酵母表达系统，因此该方法具有以下优点：成本低，产量高，产品性质更加均一稳定。实施例 22、 HPV 16 LlVLPs的中和活性

将 293FT细胞 (Invitrogen)预先铺于 15cm细胞培养皿 (1.1 X 10⁷细胞 /dish), 24h后将质粒 pl6Llh， pl6L2h(Buck CB, Pastrana DV, Lowy DR et al. Efficient Intracellular Assembly of Papillomaviral Vectors. J Virol, 2004, 78(2):751-757)和带绿色荧光基因的 pIRES2-EGFP (购自 BD Biosciences Clontech)用磷酸钙方法进行共转染，用量分别为 20μ_§、 10μ_§, 10μ_§。 48h后进行观察并收集和裂解细胞，将收集的细胞裂解上清立即用于纯化或置 -80Ό保存。

在 5ml离心管 (Beckman)中用 30% Opti Prep密度梯度离心纯化收集的细胞裂解液， 16°C下 100， 000g 离心 4h(MLS-50转头， Beckman超速离心机)，分部收集离心组分，每份约 500μ1，以蛋白印迹实验方法检测各组分中的 HPV 16 L1蛋白含量，将 L1蛋白浓度最高的组分合并，作为假病毒液，分装后 -80Ό保存。

将 293FT细胞铺于 24孔细胞培养板中（1.5 X 10⁵细胞 /well)。 24h后进行中和实验，将不同的血清样本分别用 DMEM培养基从 100倍起进行连续倍比稀释，然后取 50μ1分别与 50μ1稀释于 DMEM培养基的假病毒液混合， 4Ό孵育 lh后分别加入预铺有 293FT细胞的 24孔细胞培养板中， 37Ό培养 48h后用 OLUMPUSCKX41F32FL倒置荧光显微镜观察表达绿色荧光蛋白的细胞并采集荧光图像，见图 19。图 19A有荧光，表明 HPV 16假病毒感染了 293FT细胞。图 19B只剩极少荧光，表明鼠血清中和了 HPV 16假病毒，降低了 293FT细胞的感染。由此可见小鼠免疫重组 HPV 16L1 VLPs疫苗后能产生中和抗体，能够阻止假病毒进入细胞。本发明也可以将核苷酸序列 SEQ ID NO: 8或 SEQ ID NO: 9替换上述中的 SEQ ID NO:7,按照上述制备过程制备本发明的 HPV 16 L1蛋白；也可以将上述基因克隆至现有其它毕赤酵母表达载体，如 pPIC6、 pGAPZ或 pA0815，并选择与之相应的克隆方式，然后将重组表达载体转化其它毕赤酵母细胞，如 ¾ 2 α_JpαWoπ·■y GS 115、 KM71或SMD1168菌株，构建基因工程菌，按照常规技术培养发酵、分离纯化得到本发明的 HPV 16 L1蛋白 (HPV 16 LI VLPs), 这些技术在此不详述。制得的 HPV 16 L1 蛋白也具有与上述制得 HPV 16 L1蛋白相类似的免疫原性。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

权利要求

I. 一种分离的基因，其编码人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白 Ll，其特征在于，所述的基因具有毕赤酵母偏爱的密码子。
2. 如权利要求 1所述的基因，其特征在于，所述的基因编码具有 SEQ ID NO: 10中第 62-568位或 SEQ ID NO: 10所示氨基酸序列的人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白 L1。
3. 如权利要求 2所述的基因，其特征在于，所述的基因具有选自 SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO: 2 或 SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列。
4. 如权利要求 2所述的基因，其特征在于，所述的基因具有选自 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 5 或 SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列。
5. 如权利要求 1所述的基因，其特征在于，所述的基因编码具有 SEQ ID NO: 11所示氨基酸序列的人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白 Ll。
6. 如权利要求 5所述的基因，其特征在于，所述的基因具有选自 SEQ ID NO: 7、 SEQ ID NO: 8 或 SEQ ID NO: 9所示的核苷酸序列。
7. —种表达载体，所述的表达载体中含有权利要求 1-6任一所述的基因的序列。
8. 一种基因工程化的宿主细胞，所述的细胞含有权利要求 7所述的表达载体，或其基因组中整合有权利要求 1-6任一所述的基因。
9. 如权利要求 8所述的宿主细胞，其特征在于，所述的细胞是毕赤酵母细胞。
10. 一种具有免疫原性的大分子，该大分子的直径为 50-80nm，主要由人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白 L1 自我装配而成，所述的人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白 L1是毕赤酵母表达的。

I I. 如权利要求 10所述的大分子，其特征在于，所述的具有免疫原性的大分子通过以下方法制备获得：

(1) 培养权利要求 9所述的宿主细胞，从而在宿主细胞内表达所述的人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白 Ll，并组装形成具有免疫原性的大分子；

(2) 分离所述的具有免疫原性的大分子。
12. 一种制备权利要求 10所述的具有免疫原性的大分子的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1) 培养权利要求 9所述的宿主细胞，从而在宿主细胞内表达所述的人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白 Ll，并组装形成具有免疫原性的大分子；

(2) 分离所述的具有免疫原性的大分子。
13. 如权利要求 12所述的方法，其特征在于，在步骤（2) 中，包括：

(a) 破碎步骤（1) 获得的宿主细胞，获得含有具有免疫原性的大分子的上清液；和

(b) 将步骤（a) 获得的上清液依次采用 POROS 50 HS柱层析和 CHT柱层析进行纯化，从而获得所述的具有免疫原性的大分子。
14. 如权利要求 13所述的方法，其特征在于，在步骤（b) 中，

采用 POROS 50 HS 柱层析的纯化方法为：将步骤（a) 获得的上清液上样到经清洗、平衡的 POROS50HS柱，使得所述具有免疫原性的大分子结合到柱上，淋洗平衡后，通过 100%缓冲液 A至 100%缓冲液 B线性梯度洗脱，收集 70〜100ms/cm层析峰；其中所述缓冲液 A含有 50±20 mM MOPS, 0.75±0.3M NaCl, 0.05 ±0.02%Tween-80， pH6.5±l; 所述缓冲液 B 含有 50 ±20 mM MOPS, 1.5 MNaCl, 0.05 ±0.02% Tween-80， pH6.5±l; 或者

采用 CHT柱层析的纯化方法为：将经过 POROS 50 HS柱层析纯化的产物上样到经清洗、平衡的 CHT柱，淋洗平衡后，通过缓冲液 C至 100%缓冲液 D线性梯度洗脱，收集 50〜70ms/cm层析峰；其中所述缓冲液 C含有 50±20 mM MOPS, 0.5±0.2M NaCl, 0.04±0.02M PB， 0.05 ±0.02% Tween-80, pH6.5±l; 所述缓冲液 D含有 0.5 ± 0.2M NaCl, 200mM PB, 0.05 ±0.02% Tween-80， pH6.5±l。
15. 一种具有免疫原性的组合物，其特征在于，所述的组合物中含有：

有效量的权利要求 10所述的具有免疫原性的大分子；和

药学上可接受的载体。
16. 权利要求 10所述的具有免疫原性的大分子的用途，其特征在于，用于预防或治疗人乳头状瘤病毒感染相关疾病。
17. 一种预防或治疗人乳头状瘤病毒感染相关疾病的方法，其特征在于，所述方法包括：给予需要预防或治疗的对象有效量的权利要求 10所述的具有免疫原性的大分子，或权利要求 15所述的具有免疫原性的组合物。