CN100392084C - 含密码子优化型hpv16l1基因的重组腺病毒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程和肿瘤治疗领域。具体而言，本发明公开了密码子优化型的编码HPV16主要衣壳蛋白L1的基因序列，本发明还公开了含密码子优化型HPV16L1基因的复制缺陷型重组腺病毒及其制备方法。
Description
发明领域
本发明属于生物工程和肿瘤治疗领域。更具体地，本发明涉及含含密码子优化型HPV16L1基因的复制缺陷型重组腺病毒及其制备方法。
发明背景
人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)属乳多空病毒科，是无包膜的闭环双链DNA病毒。根据核苷酸序列同源性，HPV可分为80多个型，引起多种疾病。现已明确，其中高危型的HPV，如HPV16、18的持续感染与宫颈癌的发生密切相关，被确定为导致宫颈癌的主要病因，其中又以HPV16型最为常见(Bosch F X，J Natl Cancer Inst，1995，87：796-802.)。
人乳头瘤病毒(HPV)感染是一种常见的性传播疾病，可导致生殖器疣及子宫颈癌(ZurHausen H，Nat Rev Cancer，2002，2：342-350.；Clifford G M，Br J Cancer，2003，88：63-73.；Bosch F X，J Natl Cancer Inst，1995，87：796-802.)。世界卫生组织的统计资料表明，宫颈癌在全球妇女癌症死亡率中位居第二，在一些发展中国家甚至居于首位，每年全球大约有50万例新发宫颈癌病例，约20万人死于宫颈癌，其中，80％的死亡发生在发展中国家(WorldHealth Report 2004：Changing History.Statistical Annex)。据不完全统计，我国现有宫颈癌病人约13.8万，每年约有5万人死于宫颈癌。大量研究资料证明，宫颈癌的发生与生殖道的HPV持续感染之间有着十分密切的关系，其中又以HPVl6型最为常见，超过50％的宫颈癌病例与HPV16感染有关(Bosch F X，J Natl Cancer Inst，1995，87：796-802.)。目前，临床上尚无预防HPV16感染的有效措施，因此，研制开发出高效、廉价的HPV预防性疫苗，通过免疫接种激发机体产生特异性抗体，阻断HPV病毒侵入机体，从而降低宫颈癌的发生率，显得尤为重要。
HPV16主要衣壳蛋白L1是病毒的结构蛋白，它与次要衣壳蛋白L2一起共同构成病毒的颗粒结构。真核表达系统制备的L1蛋白可自我组装成病毒样颗粒(Virus-Like Particles)，具有与天然病毒颗粒十分相似的空间结构和抗原表位，是理想的诱发体液免疫反应的抗原。但是，由于野生型L1基因在密码子偏好上与哺乳动物细胞有着明显差异，因而导致HPV16L1基因在哺乳动物细胞内表达水平低下。因此，对HPV16 L1基因的密码子进行改造提高其在哺乳动物细胞内的表达水平，具有十分重要的意义。
HPV16主要衣壳蛋白L1可自我装配形成病毒样颗粒(VLPs)结构，其有着与天然病毒颗粒十分相似的空间结构和抗原表位，且不含HPV DNA。动物实验结果表明，病毒样颗粒免疫可在动物体内可产生高滴度的血清中和抗体，能保护动物免受HPV的实验性攻击。而且，这种保护作用可随着动物的血清传递。
虽然HPV16 L1蛋白自我装配形成的病毒样颗粒(VLPs)疫苗具有良好的免疫效果，但其纯化工艺繁琐，成本高昂，不利于在发展中国家进行推广。因此，本发明人试图构建一种成本低廉，同时可有效激发机体产生特异性体液免疫反应的疫苗，作为HPV16 L1病毒样颗粒(VLPs)疫苗的替代疫苗。
鉴于高危型HPV的嗜粘膜特性以及与宫颈癌的密切关系，有效预防HPV感染的疫苗应能在病毒入侵的生殖道粘膜局部提供免疫保护作用。分泌型IgA(SIgA)能够与病毒结合，阻止其附着上皮细胞，因此，HPV预防性疫苗的研究重点已逐渐转向于在生殖道粘膜表面激发足够强度的具有病毒中和活性的SIgA上。
研究表明，复制缺陷型重组腺病毒嗜性广泛，能感染包括粘膜上皮细胞在内的多种细胞，介导外源基因在细胞内的稳定表达并刺激机体产生特异性体液及细胞免疫反应，重组腺病毒能通过消化道和呼吸道途径感染，被认为是诱导机体粘膜免疫中最为理想的载体之一，它不仅能介导外源基因的有效表达，还可通过自然感染途径将抗原呈递给免疫系统，有效激发局部和远端粘膜表面的特异性免疫反应(Xiang Z Q，Pasquini S，Ertl H C J.Induction ofgenital immunity by DNA priming and intranasal booster immunization with a replication-defective adenoviralrecombinant[J].J Immunol，1999，162：6716-6723)。而且，重组腺病毒基因不与受体细胞基因组发生整合，具有良好的生物安全性(McConnell M J，Human Gene Therapy，2004，15(11)：1022-1033.)。便于大规模培养制备，成本低廉等优点，因此是理想的HPV候选预防性疫苗之一。所以我们确定以重组腺病毒作为密码子优化型HPV16 L1基因的病毒载体。
发明内容
本发明提供了一种密码子优化型编码HPV16主要衣壳蛋白L1的基因序列。
本发明提供了一种复制缺陷型重组腺病毒，其中含有所述的密码子优化型HPV16L1基因序列。
一个方面，本发明提供了一种密码子优化型的编码乳头瘤病毒16型(HPV16)主要衣壳蛋白L1的基因序列(mod.HPV L1)，该基因是在不改变HPV16主要衣壳蛋白L1氨基酸序列的条件下，用哺乳动物高频使用的密码子取代HPV16 L1基因序列的密码子得到的。
增强疫苗的体液免疫效果可通过提高相关抗原的表达水平来实现，对于HPV16预防性疫苗而言就是提高HPV主要衣壳蛋白L1在哺乳动物细胞中的表达水平。对野生型HPV16 L1基因的分析表明，其密码子使用偏好与哺乳动物存在较大差异，这会导致宿主细胞中同工tRNA的使用效率低下，从而降低蛋白质翻译的速度。Tan等人发现在HPV16L1开放阅读框中存在限制蛋白表达的抑制性元件(Tan W，J Virol，1995，69：5607-5620.)。我们的研究也证明，野生型HPV16 L1基因在哺乳动物细胞中的表达水平极低，即使是在腺病毒载体介导下也无法通过Western印迹检测到明显的蛋白表达。因此，对HPV16 L1基因的密码子进行优化可以通过提高同工tRNA的使用效率以及突变基因序列中的抑制性元件来提高基因在哺乳动物细胞中的表达水平。我们在进行密码子优化时，在L1蛋白N端第30、41、71、74位的精氨酸使用了次高频密码子CGC和CGG，而其余氨基酸密码子均替换为哺乳动物高频使用的密码子(如SEQ ID NO：1所示)。优化基因GC含量由38％提高至64％，这与哺乳动物密码子第三位碱基偏好G、C结尾的报道相一致(Nakamura Y，Nucleic Acids Res，2000，28：292.)。通过序列同源比对证明：本发明的密码子优化型HPV16L1基因(mod.HPV16L1)的核苷酸序列与现有技术中的重组HPV16L1基因(WO 01/14416 A2，以及Leder C，J Virol，2001，75：9201-9209)均不相同。
另一方面，本发明提供了一种复制缺陷型重组腺病毒，其中含有所述的优化型的编码乳头瘤病毒16型(HPV16)主要衣壳蛋白L1的基因。
为了得到携带密码子优化型HPV16L1基因的复制缺陷型重组腺病毒，我们首先通过全基因合成获得密码子优化型HPV16 L1基因，并将其定向克隆到重组腺病毒穿梭质粒pDC316中，然后与已知的重组腺病毒骨架质粒一起共转染已知的腺病毒包装细胞。，并在由所述的包装细胞提供的E1蛋白的反向作用下包装病毒(参见图2)。
在一个优选的实施方案中，其中所述的腺病毒穿梭质粒是质粒pDC316。
在一个优选的实施方案中，其中所述的重组腺病毒骨架质粒是质粒pBHGloxΔE1，3Cre。
在一个优选的实施方案中，其中所述的腺病毒包装细胞是293细胞。
在本发明的一个优选实施方案中，所述的复制缺陷型重组腺病毒的病毒滴度不小于108PFU/ml。
Western印迹试验检测结果显示：与野生型基因相比，本发明所述的优化型HPV16L1基因(mod.HPV16L1)在哺乳动物细胞中的表达水平提高了约50倍。这表明我们对HPV16L1基因的改造是成功的，并且mod.HPV16L1基因可在腺病毒载体介导下在哺乳动物细胞中获得高效表达。所以，本发明所述的含mod.HPV16L1基因的复制缺陷型腺病毒可作为开发预防和/或治疗宫颈癌的疫苗和药物的有效候选物。
因此，另一方面，本发明提供了本发明所述的含优化型HPV16L1基因重组腺病毒在制备用于预防和/或治疗宫颈癌的疫苗和药物中的用途
另一方面，本发明提供了一种含mod.HPV L1的复制缺陷型重组腺病毒(rAd-mod.HPVL1)的方法，该方法包括：
(1)通过用哺乳动物高频使用的密码子取代HPV16 L1基因序列的密码子，得到密码子优化型HPV16 L1基因序列；
(2)将步骤(1)得到的携带密码子优化型HPV16 L1基因序列克隆入腺病毒穿梭质粒，得到携带密码子优化型HPV16 L1基因序列的重组腺病毒穿梭质粒；
(3)用步骤(2)得到的重组腺病毒穿梭质粒和重组腺病毒骨架质粒共转染适当的腺病毒包装细胞，得到携带有优化型HPV16 L1基因序列的复制缺陷型重组腺病毒。
在本发明的一个具体实施方案中，所述的腺病毒穿梭质粒是质粒pDC316。
在本发明的一个具体实施方案中，所述的重组腺病毒骨架质粒是质粒pBHGloxΔE1，3Cre。
在本发明的一个具体实施方案中，其中所述的腺病毒包装细胞是293细胞。
附图简述
图1图示的是重组腺病毒穿梭质粒(图1A)和重组腺病毒骨架质粒(图1B)的结构示意图。
图2图示的是重组腺病毒包装(构建)流程图。
图3显示的是通过RT-PCR和SDS-PAGE方法检测，得到的本发明重组腺病毒(rAd-mod.HPV16L1)感染的293细胞中密码子优化型HPV16 L1基因转录水平。泳道1是正常293细胞总RNA的RT-PCR产物；泳道2是感染野生型腺病毒(Ad5)的293细胞总RNA的RT-PCR产物；泳道3是感染本发明重组腺病毒(rAd-mod.HPV16L1)的293细胞总RNA的RT-PCR产物；泳道4是DL2000 DNA Marker。
图4显示的是免疫印记法检测rAd-mod.HPV16L1感染的293T细胞内L1蛋白的表达。其中泳道1是Ad5感染的293T细胞；泳道2是含野生型HPV16L1基因的重组腺病毒rAd-wt.HPV16L1感染的293T细胞；泳道3是rAd-mod.HPV16L1感染的293T细胞。泳道4是蛋白预染Marker。
图5图示的是电镜观察rAd-mod.HPV16L1感染的293T细胞内L1蛋白自我组装形成的病毒样颗粒结构。
下列实施例旨在进一步举例说明而不是限制本发明。应明确指出的是，在不违背本发明的精神和原则的前提下，对本发明的个别非必要技术特征所做的任何改动和改变都将落入本发明的待批权利要求范围内。另外，如前所述，由于用于实现本发明的分子生物学相关技术和载体质粒均是已知的，可从各种来源直接获得，并且本说明书的详细描述部分和相关实施例部分也已对本发明的方法作了完整、清楚的描述，所以申请人相信本领域技术人员在仔细阅读了本说明书后完全可以重复和再现本发明。
实施例
材料和方法
质粒大量提取试剂盒QIAGEN Plasmid Midi Kits购自德国QIAGEN公司。常用限制性内切酶、T4 DNA连接酶、rTaq酶、核酸凝胶纯化试剂盒及RT-PCR试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。脂质体转染试剂Lipofectamine 2000、Opti-MEM及TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司。小鼠抗HPV16L1单克隆抗体(camvir-1)购自Chemicon公司。Brij58、Benzonase购自Sigma公司。Optiprep购自Axis-shield公司。BCA蛋白定量试剂盒购自Pierce公司。辣根酶标记羊抗小鼠IgG抗体购自北京中杉金桥生物技术公司。低分子量蛋白预染marker购自晶美生物公司。硝酸纤维素膜购自Pall公司。
重组腺病毒穿梭质粒pDC316、重组腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1，3Cre以及腺病毒包装细胞(293细胞)均购自加拿大Microbix Biosystems Inc.公司。
本发明所涉及的分子生物学相关技术如核酸操作技术，蛋白质定性和定量分析等在科学文献中都已有充分描述(如参见J·萨姆布鲁克E·F·弗里奇T·曼尼要蒂斯，分子克隆实验指南(第二版))。
实施例1
密码子优化型HPV16L1基因的制备
根据哺乳动物细胞使用密码子的偏嗜性和HPV16L1的已知序列(GenBank登录号AY686583)，在不改变氨基酸序列的前提下，对野生型HPV16L1基因的密码子进行了改造，除第30位，第41、71、74位的精氨酸分别使用了次高频密码子CGC和CGG以外，其余氨基酸的密码子均替换为哺乳动物细胞高频使用的密码子。改造后序列由上海博亚生物技术有限公司全基因合成，命名为mod.HPV16L1并克隆到pUC18载体，命名为pUC-mod.HPV16L1。序列测定表明：合成序列与设计完全一致，优化后的基因具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。优化基因GC含量由38％提高至64％。
实施例2
含密码子优化型HPV16L1基因复制缺陷型重组腺病毒的构建
以下按分步骤详细描述含密码子优化型HPV16L1基因复制缺陷型重组腺病毒的构建流程(参见图2)。
1.含密码子优化型HPV16L1基因重组腺病毒穿梭质粒的构建
(1)大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备：
从37℃培养16～20h的新鲜平板上挑取DH5α单菌落，接种于5ml不含抗菌素的LB培养基中，37℃剧烈振荡培养过夜(12～16h)。次日从上述培养物中吸取0.5ml按1∶100转入50ml LB培养基中继续培养约3h，至菌液的OD600值为3时，在无菌条件下将细菌转移到一无菌、用冰预冷的50ml离心管中，冰浴30min。在4℃条件下，4000rpm离心10min，弃上清，将管倒置1min，使残留培养液流尽，以10ml用冰预冷的100mmol/L CaCl2溶液重悬细菌沉淀，冰浴30min。4℃，4000rpm离心10min，弃上清，每50ml初始培养物用2ml预冷的含15％甘油的100mmol/L CaCl2溶液重悬细菌沉淀，分装成200μl每管，-80℃保存备用。
(2)pUC-mod.HPV16L1质粒的转化：
用无菌吸头吸取1μl含密码子优化型HPV16L1基因的质粒(pUC-mod.HPV16L1，由上海博亚生物技术有限公司全基因合成并克隆到pUC18质粒上)加入200μl DH5α感受态细胞中，轻轻旋转混匀，冰浴30min。将管移入42℃水浴箱中水浴90s，然后将管快速转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min。每管加入800μl不含抗生素的LB培养基，将管转移至37℃摇床上，温育45min(转速＜150rpm)。取50μl已转化的感受态细胞，用一无菌的弯头玻棒轻轻涂到含相应抗生素的琼脂平板表面，将平板置于室温至液体被吸收，倒置平皿，于37℃培养12～16h。
(3)pUC-mod.HPV16L1质粒的小量制备、酶切和电泳分析
挑取单个pUC-mod.HPV16L1转化菌落接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃剧烈振荡培养过夜。将培养物移入1.5ml Eppendorf管中，12000rpm离心30-60s，倒去培养液，倒置离心管，使上清流尽，用100μl预冷的溶液I[50mmol/L Glucose，25mmol/LTris-HCl(pH 8.0)，10mmol/L EDTA(pH8.0)]重悬菌体，剧烈振荡混匀；加入200μl新鲜配制的溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS)，温和混匀，冰浴3min，至液体清亮；加入150μl预冷的溶液III(100ml中含5mol/L KAc 60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml)温和混匀，冰浴10min，12000rpm离心10min，小心吸取上清，将上清转移至另一离心管中，加入2倍体积的无水乙醇室温沉淀30min，12000rpm离心10min，弃上清，沉淀用70％乙醇洗一次，室温晾干后，用30μl含RNaseA(100μg/ml)的TE(pH 8.0)溶解沉淀，37℃水浴30～60min后置-20℃保存备用。
按照供应商提供的条件，使用限制性内切酶EcoRI和HindIII消化如上小量制备的质粒pUC-mod.HPV16L1，然后用1％琼脂糖凝胶分离酶切产物，在紫外灯下切下含有目的片段的琼脂糖凝胶，使用TaKaRa公司Agarose Gel DNA Purification Kit试剂盒对1500bp大小的目的DNA mod.HPV16L1进行回收，具体操作参见相关说明书。
(4)重组腺病毒穿梭质粒的构建：
使用限制性内切酶EcoRI和HindIII消化重组腺病毒穿梭质粒pDC316，然后将所回收片段与同样用EcoRI和HindIII双酶切回收的mod.HPV16L1片段按1∶4比例混合，依次加入10×T4 DNA连接酶缓冲液和T4 DNA连接酶，反应体积为10μl，16℃连接过夜，取10μl连接反应产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。从接种转化产物的LB琼脂平板上挑取若干个单菌落，接种到5ml含相应抗生素的LB培养基中，37℃剧烈振荡培养过夜，按前述质粒的快速小量制备方法提取质粒。并用内切酶EcoRI和HindIII对质粒进行酶切鉴定，挑选阳性重组子。命名为pDC-mod.HPV16L1。
2.含密码子优化型HPV16L1基因重组腺病毒的构建
(1)重组腺病毒穿梭质粒pDC-mod.HPV16L1和骨架质粒的制备：
使用质粒大量提取试剂盒QIAGEN Plasmid Midi Kits分别提取重组腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1，3Cre和含mod.HPV16L1基因的重组腺病毒穿梭质粒pDC-mod.HPV16L1。具体实验步骤见QIAGEN Plasmid Midi Kits使用手册。
(2)重组腺病毒的包装
转染前一天传代293细胞于25cm2细胞培养瓶，培养基用不含抗生素、含5％FCS的DMEM。配制转染液：A液：溶于纯水的重组腺病毒穿梭质粒和骨架质粒DNA各5μl(各4μg)和Opti-MEM培养基共250μl；B液：5μl LipofectamineTM2000和Opti-MEM培养液共250μl。B液室温放置5min，A和B液轻轻混匀，室温放置20min。吸弃旧细胞培养液，换2ml新鲜的不含抗生素、含5％FCS的DMEM，然后将A+B混合液加入培养细胞上，于37℃，5％CO2孵育8h，补充新鲜的培养基2.5ml。24h后换含2％FCS的DMEM维持。转染后7～10天，用细胞刮将细胞刮下，800rpm离心5min，弃上清，用2ml无菌PBS重悬细胞沉淀；-20℃和37℃反复冻融4次；3000rpm离心10min，吸取上清，即为原代病毒，命名为rAd-mod.HPV16L1，-70℃保存备用。用1ml上清接种293细胞，37℃，5％CO2孵育1h，然后加入含2％小牛血清的DMEM维持液(6ml)并观察细胞病变。
观察结果显示，被转染的293细胞出现细胞肿胀、圆缩等典型的细胞病变。
实施例3
重组腺病毒rAd-mod.HPV16L1的鉴定、病毒滴度分析和HPV16L1蛋白病毒样颗粒的电镜观察
(1)重组腺病毒感染的293细胞内mod.HPV16L1基因的转录：
TRIzol一步法分别提取正常293细胞和感染了rAd-mod.HPV16L1和Ad5(不含本发明所述mod.HPV L1的腺病毒，对照用)的293细胞的总RNA，进行RT-PCR鉴定。RT-PCR反应参数如下：逆转录体系为20μl。以1μg细胞总RNA为模板，Oligod(T)15为引物，50℃30min进行逆转录反应，94℃ 2min灭活逆转录酶，以合成的cDNA为模板进行PCR反应，94℃ 1min，58℃30s，72℃ 90s，30个循环，取5μl PCR及RT-PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。结果显示，rAd-mod.HPV16L1感染的293细胞总DNA和RNA及病毒裂解液中均可扩增到1500bp左右特异性条带，而Ad5野毒株和正常293细胞结果均为阴性，这表明mod.HPV16L1基因正确插入腺病毒基因组中，并且能有效转录(参见图3)。
(2)重组腺病毒感染的293T细胞内mod.HPV16L1基因的表达：
分别以1PFU/cell滴度的rAd-mod.HPV16L1、rAd-wt.HPV16L1和Ad5病毒感染1×106293细胞，48h后将细胞刮下，冰预冷PBS洗2遍，按照TRIzol试剂说明提取细胞总蛋白，溶于1％SDS溶液中，0.1％SDS透析3次，4℃ 10000g离心10min，收集上清。BCA细胞总蛋白含量，调整蛋白浓度至5mg/ml。以50μg TRIzol提取的细胞总蛋白进行SDS-PAGE电泳，转膜。用鼠抗HPV 16 L1单克隆抗体(camvir-1)为一抗，辣根酶标记羊抗小鼠IgG抗体为二抗，进行Western印迹分析。
Western印迹检测结果显示：rAd-wt.HPV16L1的几乎看不见条带，而rAd-mod.HPV16L1可见明显的55kD条带，Ad5未检测到目的蛋白的表达(参见图4)。mod.HPV16L1基因在重组腺病毒介导下获得了高效表达。
通过比较Western blot各条带信号的强弱，我们推算出优化基因表达水平至少提高了50倍。这表明优化基因mod.HPV16L1在哺乳动物细胞中的表达较野生型基因有十分显著的提高，证明我们对HPV16L1基因的改造是成功的，mod.HPV16L1基因可在腺病毒载体介导下在哺乳动物细胞中获得高效表达。
(3)重组腺病毒滴度的测定
TCID50实验的基础是应用极限稀释法使293细胞出现病变从而估计滴度。细胞的准备：准备10ml含2％胎牛血清的DMEM重悬细胞，将细胞浓度调至1×105/ml，接种于96孔细胞培养板，每孔加入100μl。细胞贴壁后，将上清弃去。病毒的稀释：第一管中加入0.9ml含2％胎牛血清的DMEM，其余则加入1.8ml。第一管中加入0.1ml病毒原液。上下抽吸5次使它们混匀。每一次稀释后都更换吸头。从第一管中吸取0.2ml加入第二管。重复这个稀释步骤直到最高稀释度。96孔板的每一排10孔作为一个稀释度。11，12列不加病毒作为阴性对照。实验孔每孔加入0.1ml不同稀释度病毒。把96孔板放在37℃孵箱培养10天，观察病变。只要有一个小病变此孔即作为阳性对待，如果不易判断可跟阴性对照比较。最后按公式T＝101+d(s-0.5)计算病毒的滴度(d为稀释度的对数值，s为病变比例的和)。
检测结果显示，第六代病毒滴度达到4×108PFU/ml。
(4)HPV16L1蛋白病毒样颗粒的电镜观察：
rAd-mod.HPV16L1重组腺病毒以1 PFU/cell滴度感染5×108293T细胞，48h收获细胞，参照Pyeon D报道的纯化方法(Pyeon D，Proc Natl Acad Sci USA，2005，102：9311-9316.)，用lml含10mmol/LMgCl2的D-PBS重悬细胞，加入Brij58至终浓度0.25％，37℃孵育24h，加入0.2％Benzonase核酸酶37℃孵育30min。裂解产物加入0.17体积5mol/L NaCl，置冰上10min，4℃4000g离心10min，收集上清置4℃备用。Ultra-Clear离心管中依次铺上27％、33％、39％的Optiprep(用含0.8mol/L NaCl的PBS配制)，室温避光静置4h后将500μl离心收集的裂解上清小心加入密度梯度介质上，Beckman Optima L-XP超速离心机SW41转头16℃ 215000g离心3.5h，由下至上用针刺分别收集离心管中下部浮力密度约1.15～1.18g/ml之间各组分，置1.5ml硅化离心管内，1ml/管共收集5管，取5μl进行SDS-PAGE电泳，转膜。免疫印迹法检测HPV16 L1蛋白。取20μl纯化的HPV16L1病毒样颗粒(VLPs)悬液用磷钨酸负染，在透射电镜下观察病毒样颗粒的形态。结果显示，电镜下可见直径约55nm的病毒样颗粒的存在，证明重组腺病毒载体介导表达的HPV16L1蛋白可正确组装成病毒样颗粒(参见图5)。
序列表
<110>曾毅
<120>含密码子优化型HPV16 L1基因的重组腺病毒
<130>
<160>1
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1518
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒(HPV)16型
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1518)
<223>
<400>1
atg agc ctg tgg ctg ccc agc gag gcc acc gtg tac ctg ccc ccc gtg 48
Met Ser Leu Trp Leu Pro Ser Glu Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val
1 5 10 15
ccc gtg agc aag gtg gtg agc acc gac gag tac gtg gcc cgg acc aac 96
Pro Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Ala Arg Thr Asn
20 25 30
atc tac tac cac gcc ggc acc agc cgc ctg ctg gcc gtg ggc cac ccc 144
Ile Tyr Tyr His Ala Gly Thr Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro
35 40 45
tac ttc ccc atc aag aag ccc aac aac aac aag atc ctg gtg ccc aag 192
Tyr Phe Pro Ile Lys Lys Pro Asn Asn Asn Lys Ile Leu Val Pro Lys
50 55 60
gtg agc ggc ctg cag tac cgg gtg ttc cgg atc cac ctg ccc gac ccc 240
Val Ser Gly Leu Gln Tyr Arg Val Phe Arg Ile His Leu Pro Asp Pro
65 70 75 80
aac aag ttc ggc ttc ccc gac acc agc ttc tac aac ccc gac acc cag 288
Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro Asp Thr Gln
85 90 95
agg ctg gtg tgg gcc tgc gtg ggc gtg gag gtg ggc agg ggc cag ccc 336
Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Val Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro
100 105 110
ctg ggc gtg ggc atc agc ggc cac ccc ctg ctg aac aag ctg gac gac 384
Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Leu Asp Asp
115 120 125
acc gag aac gcc agc gcc tac gcc gcc aac gcc ggc gtg gac aac agg 432
Thr Glu Asn Ala Ser Ala Tyr Ala Ala Asn Ala Gly Val Asp Asn Arg
130 135 140
gag tgc atc agc atg gac tac aag cag acc cag ctg tgc ctg atc ggc 480
Glu Cys Ile Ser Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Leu Ile Gly
145 150 155 160
tgc aag ccc ccc atc ggc gag cac tgg ggc aag ggc agc ccc tgc acc 528
Cys Lys Pro Pro Ile Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Ser Pro Cys Thr
165 170 175
aac gtg gcc gtg aac ccc ggc gac tgc ccc ccc ctg gag ctg atc aac 576
Asn Val Ala Val Asn Pro Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Asn
180 185 190
acc gtg atc cag gac ggc gac atg gtg gac acc ggc ttc ggc gcc atg 624
Thr Val Ile Gln Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met
195 200 205
gac ttc acc acc ctg cag gcc aac aag agc gag gtg ccc ctg gac atc 672
Asp Phe Thr Thr Leu Gln Ala Asn Lys Ser Glu Val Pro Leu Asp Ile
210 215 220
tgc acc agc atc tgc aag tac ccc gac tac atc aag atg gtg agc gag 720
Cys Thr Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Ile Lys Met Val Ser Glu
225 230 235 240
ccc tac ggc gac agc ctg ttc ttc tac ctg agg agg gag cag atg ttc 768
Pro Tyr Gly Asp Ser Leu Phe Phe Tyr Leu Arg Arg Glu Gln Met Phe
245 250 255
gtg agg cac ctg ttc aac agg gcc ggc gcc gtg ggc gag aac gtg ccc 816
Val Arg His Leu Phe Asn Arg Ala Gly Ala Val Gly Glu Asn Val Pro
260 265 270
gac gac ctg tac atc aag ggc agc ggc agc acc gcc aac ctg gcc agc 864
Asp Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gly Ser Thr Ala Asn Leu Ala Ser
275 280 285
agc aac tac ttc ccc acc ccc agc ggc agc atg gtg acc agc gac gcc 912
Ser Asn Tyr Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Asp Ala
290 295 300
cag atc ttc aac aag ccc tac tgg ctg cag agg gcc cag ggc cac aac 960
Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln Gly His Asn
305 310 315 320
aac ggc atc tgc tgg ggc aac cag ctg ttc gtg acc gtg gtg gac acc 1008
Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr
325 330 335
acc agg agc acc aac atg agc ctg tgc gcc gcc atc agc acc agc gag 1056
Thr Arg Ser Thr Asn Met Ser Leu Cys Ala Ala Ile Ser Thr Ser Glu
340 345 350
acc acc tac aag aac acc aac ttc aag gag tac ctg agg cac ggc gag 1104
Thr Thr Tyr Lys Asn Thr Asn Phe Lys Glu Tyr Leu Arg His Gly Glu
355 360 365
gag tac gac ctg cag ttc atc ttc cag ctg tgc aag atc acc ctg acc 1152
Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Lys Ile Thr Leu Thr
370 375 380
gcc gac gtg atg acc tac atc cac agc atg aac agc acc atc ctg gag 1200
Ala Asp Val Met Thr Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Thr Ile Leu Glu
385 390 395 400
gac tgg aac ttc ggc ctg cag ccc ccc ccc ggc ggc acc ctg gag gac 1248
Asp Trp Asn Phe Gly Leu Gln Pro Pro Pro Gly Gly Thr Leu Glu Asp
405 410 415
acc tac agg ttc gtg acc agc cag gcc atc gcc tgc cag aag cac acc 1296
Thr Tyr Arg Phe Val Thr Ser Gln Ala Ile Ala Cys Gln Lys His Thr
420 425 430
ccc ccc gcc ccc aag gag gac ccc ctg aag aag tac acc ttc tgg gag 1344
Pro Pro Ala Pro Lys Glu Asp Pro Leu Lys Lys Tyr Thr Phe Trp Glu
435 440 445
gtg aac ctg aag gag aag ttc agc gcc gac ctg gac cag ttc ccc ctg 1392
Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln Phe Pro Leu
450 455 460
ggc agg aag ttc ctg ctg cag gcc ggc ctg aag gcc aag ccc aag ttc 1440
Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ala Gly Leu Lys Ala Lys Pro Lys Phe
465 470 475 480
acc ctg ggc aag agg aag gcc acc ccc acc acc agc agc acc agc acc 1488
Thr Leu Gly Lys Arg Lys Ala Thr Pro Thr Thr Ser Ser Thr Ser Thr
485 490 495
acc gcc aag agg aag aag agg aag ctg tga 1518
Thr Ala Lys Arg Lys Lys Arg Lys Leu
500 505
Claims (7)
1.一种密码子优化型的编码乳头瘤病毒16型(HPV16)主要衣壳蛋白L1的基因，该基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
2.一种复制缺陷型重组腺病毒，该病毒携带有权利要求1所述的基因。
3.一种制备权利要求2所述复制缺陷型重组腺病毒的方法，该方法包括：
(1)通过用哺乳动物高频使用的密码子取代HPV16 L1基因序列的密码子，得到密码子优化型HPV16 L1基因；
(2)将步骤(1)得到的携带密码子优化型HPV16 L1基因克隆入腺病毒穿梭质粒，得到携带密码子优化型HPV16 L1基因序列的重组腺病毒穿梭质粒；
(3)用步骤(2)得到的重组腺病毒穿梭质粒和重组腺病毒骨架质粒共转染适当的腺病毒包装细胞，得到携带有优化型HPV16 L1基因序列的复制缺陷型重组腺病毒。
4.根据权利要求3的方法，其中所述的腺病毒穿梭质粒是质粒pDC316。
5.根据权利要求3的方法，其中所述的重组腺病毒骨架质粒是质粒pBHGloxΔE1，3Cre。
6.根据权利要求3的方法，其中所述的腺病毒包装细胞是293细胞。
7.权利要求3所述的重组腺病毒在制备用于预防和/或治疗宫颈癌的药物中的用途。
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| 按酵母基因优化的HPV6型L1蛋白在大肠杆菌中高校表达. 李平川等.病毒学报，第20卷第3期. 2004 |
| 按酵母基因优化的HPV6型L1蛋白在大肠杆菌中高校表达. 李平川等.病毒学报，第20卷第3期. 2004 * |
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