CN101182548B - Hpv16的1型重组腺相关病毒疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及HPV16的1型重组腺相关病毒疫苗及其制备方法。本发明提供一种1型重组腺相关病毒，含有SEQ ID No：1所示的核酸序列。本发明还提供制备上述1型重组腺相关病毒的方法。本发明更进一步提供一种HPV16的1型重组腺相关病毒疫苗，其有效成分为上述1型重组腺相关病毒。本发明提供的HPV16的1型重组腺相关病毒可用于制备治疗和预防子宫颈癌的药物。

Description

HPV16的1型重组腺相关病毒疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及HPV16的1型重组腺相关病毒疫苗及其制备方法。

背景技术

人乳头状瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)属乳多空病毒科，是无包膜的闭环双链DNA病毒。现已明确，高危型HPV如HPV16、18的持续感染与宫颈癌的发生密切相关，被确定为导致宫颈癌的主要病因，其中又以HPV16型最为常见(Bosch F X，J Natl Cancer Inst，1995，87：796-802.)。

HPV16主要衣壳蛋白L1是病毒的结构蛋白，它与次要衣壳蛋白L2一起共同构成病毒的颗粒结构。真核表达系统制备的L1蛋白可自我组装成病毒样颗粒(Virus-Like Particles)，具有与天然病毒颗粒十分相似的空间结构和抗原表位，是理想的诱发体液免疫反应的抗原。然而，野生型L1基因在密码子偏好上与哺乳动物细胞的明显差异是导致L1蛋白表达水平低下的重要原因。因此，对HPV16L1基因的密码子进行改造将明显提高L1蛋白的表达水平。国外已有相关成功的报道(Leder C，J Virol，2001，75：9201-9209.；Mossadegh N，Virology，2004，326(1)：57-66.)。根据哺乳动物密码子偏好对野生型HPV16L1基因进行优化的密码子优化型HPV16L1基因已申请专利，专利申请号为200610056900.3，见SEQ ID No：1序列。

在对密码子进行优化之后，还需要选择合适的载体，以使其获得高效表达和呈递。

发明内容

为了使优化得到的SEQ ID No：1序列能够获得高效表达和呈递，本发明提供一种HPV16的1型重组腺相关病毒疫苗。

本发明的技术方案如下：

本发明提供一种1型重组腺相关病毒，含有SEQ ID No：1所示核酸序列。

本发明还提供制备上述1型重组腺相关病毒的方法，包括如下步骤：

(1)将SEQ ID No：1所示的核酸序列克隆到腺相关病毒穿梭质粒中，得到重组腺相关病毒穿梭质粒。

(2)用步骤(1)制备的重组腺相关病毒穿梭质粒和pHelper质粒、pAAV2/1质粒共转染腺相关病毒包装细胞，得到含有SEQ ID No：1所示的核酸序列的1型重组腺相关病毒。

所述腺相关病毒穿梭质粒是质粒pAAV-MCS，所述腺相关病毒包装细胞是293细胞。

本发明更进一步提供一种HPV16的1型重组腺相关病毒疫苗，其有效成分为上述1型重组腺相关病毒。

本发明提供的HPV16的1型重组腺相关病毒可用于制备治疗和预防子宫颈癌的药物。

本发明实现的技术效果如下：

本发明提供的HPV16的1型重组腺相关病毒，用于制备HPV16的1型重组腺相关病毒疫苗，产生中和抗体的滴度明显提高，得到良好的预防效果。

附图说明

图1：rAAV-mod.HPV16L1电镜图；

图2：抗HPV 16 L1中和抗体的检测结果图。

具体实施方式

实验例1：含SEQ ID No：1所示的核酸序列的重组腺相关病毒的构建

1.含SEQ ID No：1所示的核酸序列的I型重组腺相关病毒穿梭质粒的构建

(1)大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备：

从37℃培养16～20h的新鲜平板上挑取DH5α单菌落，接种于5ml不含抗菌素的LB培养基中，37℃剧烈振荡培养过夜(12～16h)。次日从上述培养物中吸取0.5ml按1∶100转入50ml LB培养基中继续培养约3h，至菌液的OD600值为3时，在无菌条件下将细菌转移到一无菌、用冰预冷的50ml离心管中，冰浴30min。在4℃条件下，4000rpm离心10min，弃上清，将管倒置1min，使残留培养液流尽，以10ml用冰预冷的100mmol/L CaCl2溶液重悬细菌沉淀，冰浴30min。4℃，4000rpm离心10min，弃上清，每50ml初始培养物用2ml预冷的含15％甘油的100mmol/L CaCl₂溶液重悬细菌沉淀，分装成200μl每管，-80℃保存备用。

(2)PUC-mod.HPV16L1及pAAV-MCS质粒的转化：

PUC-mod.HPV16L1(SEQ ID No：1所示的核酸序列)由上海博亚生物技术有限公司全基因合成，并用内切酶EcoRI和HindIII克隆到PUC18质粒上。用无菌吸头分别吸取1μg含SEQ ID No：1所示的核酸序列的PUC 18质粒和pAAV-MCS质粒(购自Stratagene公司)，加入200μl DH5α感受态细胞中，轻轻旋转混匀，冰浴30min。将管移入42℃水浴箱中水浴90s，然后将管快速转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min。每管加入800μl不含抗生素的LB培养基，将管转移至37℃摇床上，温育45min(转速＜150rpm)。取50μl已转化的感受态细胞，用一无菌的弯头玻棒轻轻涂到含相应抗生素的琼脂平板表面，将平板置于室温至液体被吸收，倒置平皿，于37℃培养12～16h。

(3)PUC-mod.HPV16L1质粒及pAAV-MCS质粒的小量制备和鉴定

分别挑取单个PUC-mod.HPV16L1及pAAV-MCS质粒转化菌落接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃剧烈振荡培养过夜。将培养物移入1.5mlEppendorf管中，12000rpm离心30-60s，倒去培养液，倒置离心管，使上清流尽，用100μl预冷的溶液I[50mmol/L Glucose，25mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，10mmol/L EDTA(pH8.0)]重悬菌体，剧烈振荡混匀；加入200μl新鲜配制的溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS)，温和混匀，冰浴3min，至液体清亮；加入150μl预冷的溶液III(100ml中含5mol/L KAc 60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml)温和混匀，冰浴10min，12000rpm离心10min，小心吸取上清，将上清转移至另一离心管中，加入2倍体积的无水乙醇室温沉淀30min，12000rpm离心10min，弃上清，沉淀用70％乙醇洗一次，室温晾干后，用30μl含RNaseA(100μg/ml)的TE(pH 8.0)溶解沉淀，37℃水浴30～60min后置-20℃保存备用。

使用限制性内切酶EcoRI和HindIII消化如上小量制备的质粒PUC-mod.HPV16L1及pAAV-MCS质粒，然后用1％琼脂糖凝胶分离酶切产物，在紫外灯下切下含有目的片段的琼脂糖凝胶，使用北京天根生物公司凝胶回收试剂盒对1500bp大小的目的DNA mod.HPV16L1及双酶切的pAAV-MCS质粒进行回收，具体操作参见相关说明书。

(4)重组腺相关病毒穿梭质粒的构建：

使用限制性内切酶EcoRI和HindIII消化重组腺相关病毒穿梭质粒pAAV-MCS，然后将所回收片段与同样用EcoRI和HindIII双酶切回收的mod.HPV16L1片段按1∶4比例混合，依次加入10×T4 DNA连接酶缓冲液和T4DNA连接酶，反应体积为10μl，16℃连接过夜，取10μl连接反应产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。从接种转化产物的LB琼脂平板上挑取若干个单菌落，接种到5ml含相应抗生素的LB培养基中，37℃剧烈振荡培养过夜，按前述质粒的快速小量制备方法提取质粒。并用内切酶EcoRI和HindIII对质粒进行酶切鉴定，挑选阳性重组子。命名为PAAV-mod.HPV16L1。

2.1型重组腺相关病毒辅助质粒pAAV2/1的构建

(1)AAV-1Cap基因的设计及基因合成：在AAV-1Cap基因(GenBank号：NC002077 2223-4433bp)的5’端插入SwaI酶切位点及pAAV-RC(购自Stratagene公司)载体2000-2013bp间的片段，3’端插入SmaI酶切位点。将设计好的序列命名为AAV-1Cap，送上海博亚生物技术有限公司全基因合成，并克隆到PUC18载体，命名为PUC-AAV-1Cap。

(2)1型重组腺相关病毒辅助质粒pAAV2/1的构建：将pAAV-RC质粒及PUC-AAV-1Cap质粒用SwaI及SmaI双酶切，使用天根生物公司凝胶回收试剂盒分别回收双酶切之pAAV-RC载体片段及AAV-1Cap片段。使用大连宝生物公司T4连接酶参照使用说明进行pAAV-RC载体片段及AAV-1Cap片段的连接，连接产物命名为pAAV2/1。参照实验例1的方法，将连接产物pAAV2/1转化DH5α感受态细胞，小量提取pAAV2/1质粒，进行酶切及测序鉴定。

3.含SEQ ID No：1所示的核酸序列的重组腺相关病毒的构建及纯化

(1)重组腺相关病毒穿梭质粒PAAV-mod.HPV16L1和辅助质粒的制备：

使用QIAGEN Plasmid Giga Kits质粒大量提取试剂盒分别提取重组腺相关病毒辅助质粒pHelper、pAAV2/1及重组腺相关病毒穿梭质粒PAAV-mod.HPV16L1。具体实验步骤见QIAGEN Plasmid Giga Kits使用手册。

(2)重组腺相关病毒的包装

转染前一天传代293细胞于10个175cm²培养瓶中，根据磷酸钙转染试剂盒说明进行转染：依次混合10μg的pHelper和pAAV2/1及PAAV-mod.HPV16L1质粒和90μl 2M CaCl₂，加入无菌的去离子水至750μl，轻轻混匀。加入750μl2×HeBS，迅速上下吹打3-5次，室温孵育，分别于5min后逐滴加入300μl混合液于2ml细胞培养液中，十字交叉混匀。置37℃5％CO₂继续培养。转染后7～10天，用细胞刮将细胞刮下，800rpm离心5min，弃上清，用2ml无菌PBS重悬细胞沉淀；-20℃和37℃反复冻融4次；3000rpm离心10min，吸取上清，即为重组腺相关病毒粗制品，命名为rAAV-mod.HPV16L1，-70℃保存备用。

(3)重组腺相关病毒的纯化

1.离子交换层析：

使用5ml的HiTrap SP XL预装柱，用10个柱体积的buffer1(20mMTris，15mM NaCl，PH 8.5)平衡柱子，将重组腺相关病毒粗制品用buffer1按1∶1比例稀释后，以3ml/min流速上柱，收集流穿液。用10个柱体积的buffer1(20mMTris，15mM NaCl，PH 8.5)平衡5ml的HiTrap Q预装柱，将上步收集的流穿液以3ml/min流速上柱，用10个柱体积的buffer1洗涤柱子，以0-100％buffer2(20mM Tris，500mM NaCl，PH 8.5)线性梯度洗脱并收集病毒组分。

2.分子筛精细纯化：

使用10个柱体积的buffer3(20mM Tris，15mM NaCl，PH 7.0)平衡SephercrylS50016/100层析柱，离子交换洗脱收集的病毒组分以0.5ml/min流速上柱，依次收集各峰，SDS-PAGE电泳确定病毒所在组分。

实验例2：重组腺相关病毒rAAV-mod.HPV16L1的鉴定、病毒滴度分析及电镜观察

(1)重组腺相关病毒中mod.HPV16L1基因的表达：

以10个MOI的rAAV-mod.HPV16L1病毒感染1×10⁶293细胞，同时加入终浓度为10mmol/L的丁酸钠，48h后将细胞刮下，冰预冷PBS洗2遍，按照TRIzol试剂说明提取细胞总蛋白，溶于1％SDS溶液中，0.1％SDS透析3次，4℃10000g离心10min，收集上清。BCA细胞总蛋白含量，调整蛋白浓度至5mg/ml。以50μg TRIzol提取的细胞总蛋白进行SDS-PAGE电泳，转膜。用鼠抗HPV 16L1单克隆抗体(camvir-1)为一抗，辣根酶标记羊抗小鼠IgG抗体为二抗，进行Western blot分析。结果显示，rAAV-mod.HPV16L1可见明显的55kD条带，未感染293细胞未检测到目的蛋白的表达。证明mod.HPV16L1基因在重组腺相关病毒介导下在哺乳动物细胞内获得了有效表达。

(2)重组腺相关病毒滴度的测定

用地高辛标记的CMV探针点杂交方法检测病毒液中rAAV-mod.HPV16L1的物理滴度(以病毒基因组数/mL，vg/ml表示)。将质粒pAAV-mod.HPV16L1准确定量，用稀释缓冲液以一系列稀释度稀释后点到尼龙膜上；待测的病毒液rAAV-mod.HPV16L1样品用DNase I和RNase(终浓度均为1μg/mL)于37℃消化1h。提取rAAV-mod.HPV16L1病毒DNA，沸水浴5min变性之后置于冰浴中。用试剂盒提供的稀释缓冲液以一定比列做系列稀释后点膜。预杂交、杂交、洗膜、显色按Boehringer Mannheim公司试剂盒说明书进行。通过计算pAAV-mod.HPV16L1的拷贝数、再乘以与其杂交信号强度一致的病毒液样品的稀释倍数而得出rAAV-mod.HPV16L1。检测结果显示，纯化的病毒滴度达到1×10¹²vg/ml。

(3)重组腺相关病毒rAAV-mod.HPV16L1电镜观察：

取20μl纯化的rAAV-mod.HPV16L1重组腺相关病毒悬液用磷钨酸负染，在透射电镜下观察病毒样颗粒的形态。结果如图1所示，电镜下可见直径约20nm的病毒颗粒的存在。

实验例3：重组腺相关病毒rAAV-mod.HPV16L1免疫效果的初步研究：

1.小鼠的免疫接种

将4～6周龄雌性C57BL/6小鼠20只，随机分成2个实验组，每组5只小鼠，分别为rAAV-mod.HPV16L1组；含有SEQ ID No：1所示的核酸序列的重组腺病毒rAd-mod.HPV16L1。各实验组按接种途径分别设置相应rAAV-EGFP及rAd-EGFP对照组(对照病毒均购自本原正阳基因技术有限公司)。使用剂量分别为rAAV 1×10¹¹vg/只；rAd 1×10⁷IU/只，双侧胫前肌注射，各组均免疫一次。所有实验操作在小鼠麻醉状态下进行。于免疫后第12周分别收集各组小鼠血清及阴道分泌物备用。

2.抗HPV 16L1中和抗体的检测

按文献报道的方法(Buck，C.B.，D.V.Pastrana，D.R.Lowy，et，al.J.Virol.2004，78：751-757.)制备HPV16假病毒颗粒。在检测前6h接种3×10⁴/孔293FT细胞于96孔细胞培养板中，将HPV16假病毒颗粒与系列稀释的血清或阴道分泌物标本孵育1h，将假病毒颗粒-待测血清或阴道分泌物混合液加入接种有293FT细胞的96孔板上，继续孵育72h，取40μl细胞培养上清，按顺序加入新的96孔板中，加入20μl 0.05％CHAPS，加入200μl显色底物，室温避光孵育2h，Bio-Rad 550型酶标仪测定405nm波长下的OD值。结果判定：中和抗体的滴度定义为SEAP活性较阴性对照组降低50％的血清最大稀释度。结果如图2所示，rAAV-mod.HPV16L1单针肌注可诱导高滴度的血清中和抗体，免疫后第12周，血清中和抗体平均滴度可达1∶15520，而rAd-mod.HPV16L1单针免疫组诱导的血清中和抗体平均滴度为1∶1470，rAAV-mod.HPV16L1单针肌注免疫效果优于rAd-mod.HPV16L1单针肌注组(P＜0.01)。

根据本发明重组腺相关病毒的一个优选实施方案，其中所述的重组腺相关病毒的病毒滴度不小于2×10¹²vg/ml。

本发明提供如上限定的重组腺相关病毒作为子宫颈癌预防性疫苗的应用。根据本发明重组腺相关病毒的一个优选实施方案，经肌注可在小鼠体内激发滴度不小于1∶10000的血清中和抗体。

序列表

Claims (4)

1.1型重组腺相关病毒rAAV-mod.HPV16L1，其特征在于，所述病毒含有SEQ ID No：1所示的核酸序列，所述病毒的制备方法包括如下步骤：

(1)使用限制性内切酶EcoRI和HindIII消化重组腺相关病毒穿梭质粒pAAV-MCS，然后将所回收片段与同样用EcoRI和HindIII双酶切的SEQ IDNo：1所示的核酸序列连接，得到重组腺相关病毒穿梭质粒PAAV-mod.HPV16L1；

(2)用步骤(1)制备的重组腺相关病毒穿梭质粒和pHelper质粒、pAAV2/1质粒共转染腺相关病毒包装细胞，得到含有SEQ ID No：1所示的核酸序列的1型重组腺相关病毒rAAV-mod.HPV16L1，其中，所述pAAV2/1质粒的构建方法为：a.在AAV-1 Cap基因的5’端插入SwaI酶切位点及pAAV-RC载体2000-2013bp间的片段，3’端插入SmaI酶切位点，全基因合成，克隆到PUC18载体中得到PUC-AAV-1 Cap质粒；b.将pAAV-RC质粒及PUC-AAV-1 Cap质粒用SwaI及SmaI双酶切，将pAAV-RC载体片段及AAV-1 Cap片段连接，连接产物为pAAV2/1。

2.根据权利要求1所述的1型重组腺相关病毒rAAV-mod.HPV16L1，其特征在于，所述腺相关病毒包装细胞是293细胞。

3.HPV16的1型重组腺相关病毒rAAV-mod.HPV16L1疫苗，其特征在于，所述疫苗的有效成分为权利要求1所述的1型重组腺相关病毒rAAV-mod.HPV16L1。

4.权利要求1所述1型重组腺相关病毒rAAV-mod.HPV16L1在制备治疗和预防子宫颈癌的药物中的应用。

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