CN102649963B - 可用于食管癌防治的基于hpv l1基因的重组腺病毒 - Google Patents

Abstract

可用于食管癌防治的基于HPV L1基因的重组腺病毒属于生物医药技术领域。本发明提供了一种优化型的编码HPV18型(HPV18)主要衣壳蛋白L1的基因序列，以及含有其的复制缺陷型重组HPV18L1腺病毒疫苗，并提供了制备上述重组腺病毒的方法。该重组HPV18L1腺病毒和重组HPV16L1腺病毒疫苗(专利号ZL200610056900.3)可用于食管癌的防治。

Description

可用于食管癌防治的基于HPV L1基因的重组腺病毒

技术领域

本发明属于生物医药技术领域。本发明涉及一种含密码子优化型HPV18L1基因的复制缺陷型重组腺病毒及其制备方法。

背景技术

食管癌是世界上最常见的六大恶性肿瘤之一，显著的地域性分布差异（高、低发区发病率相差500倍）是其突出的流行病学特征。全世界每年新确诊的40多万食管癌患者中，一半以上发生在中国。河南，河北和山西三省交界的太行山地区是世界上食管癌发病率和死亡率非常高的地区。研究发展食管癌预防及治疗性疫苗，是降低食管癌发病率和死亡率，防治食管癌的重要关键措施。

虽然食管癌的发病率存在明显的地区差异，HPV检测方法也不尽相同，使得不同研究中食管癌患者的HPV阳性率有较大差异，但越来越多的研究表明HPV感染和食管癌之间存在很大的相关性。大规模现场及实验室研究发现，食管癌高发区河南林州市，汕头市和揭阳市以及淮河流域地区的食管鳞癌组织标本中HPV16+18亚型高达60～80%，其中HPV16阳性癌组织细胞中80%以上的染色体整合有HPV DNA，检测发现HPV16阳性癌组织中HPV的染色体整合比例达86.9%，远远高于正常感染HPV的组织，并且在食管癌组织和食管癌细胞株中检测到了E6,E7病毒癌蛋白和衣壳蛋白L1的表达（未发表）。研究进一步发现，食管癌的发生是多因素协同作用的结果，其中HPV16和18型是中国人食管癌发生的重要致病因素（李淑英等，人乳头瘤病毒与食管癌病原学关系的Meta分析，中华实验和临床病毒学杂志，2009，23（2）：85-87）。

人乳头状瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）属乳多空病毒科，是无包膜的闭环双链DNA病毒。HPV的E6、E7蛋白能通过多种途径导致细胞周期异常及基因组不稳定，影响DNA的损伤修复，抑制细胞凋亡等，从而可能引起细胞癌变。HPV主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2一起共同构成病毒样颗粒（Virus-Like Particles）。HPV主要衣壳蛋白Ll可自我装配形成病毒样颗粒(VLPs)结构，其有着与天然病毒颗粒十分相似的空间结构和抗原表位，不含HPV DNA，且不会引起细胞癌变，相对HPV E6、E7蛋白来说要安全得多，是理想的诱发免疫反应的抗原。且已有研究表明，HPV16主要衣壳蛋白Ll特异性的CD8+细胞毒性T细胞（CTLs）在杀伤HPV16阳性的肿瘤细胞方面具有和E7特异性的CD8+细胞毒性T细胞（CTLs）相等同的效果，因此HPV主要衣壳蛋白Ll可以作为诱导细胞免疫的治疗性疫苗（Stefania Bellone,Karim El-Sahwi,Emiliano Cocco,FrancescaCasagrande,Marilisa Cargnelutti,Michela Palmieri,Eliana Bignotti,Chiara Romani,Dan-Arin Silasi,Masoud Azodi,Peter E.Schwartz,Thomas J.Rutherford,Sergio Pecorelli,and Alessandro D.Santin.Human Papillomavirus Type 16(HPV-16)Virus-Like ParticleL1-Specific CD8 Cytotoxic T Lymphocytes(CTLs)Are EquallyEffective as E7-Specific CD8 CTLs in Killing AutologousHPV-16-Positive Tumor Cells in Cervical Cancer Patients:Implicationsfor L1 Dendritic Cell-Based Therapeutic Vaccines.JOURNAL OFVIROLOGY,2009,83(13):6779-6789）。但是，由于野生型L1基因在密码子偏好上与哺乳动物细胞有着明显差异，因而导致Ll基因在哺乳动物细胞内表达水平低下。因此，对Ll基因的密码子进行改造以提高其在哺乳动物细胞内的表达水平，具有十分重要的意义。动物实验结果表明，病毒样颗粒免疫可在动物体内可产生高滴度的血清中和抗体，能保护动物免受HPV的实验性攻击，因此可以以此来研制针对HPV引起的疾病（如宫颈癌、食管癌等）的疫苗。

研究表明，复制缺陷型重组腺病毒嗜性广泛，能感染包括粘膜上皮细胞在内的多种细胞，介导外源基因在细胞内的稳定表达并刺激机体产生特异性体液及细胞免疫反应，重组腺病毒能通过消化道和呼吸道途径感染，被认为是诱导机体粘膜免疫中最为理想的载体之，它不仅能介导外源基因的有效表达，还可通过自然感染途径将抗原呈递给免疫系统，有效激发局部和远端粘膜表面的特异性免疫反应(Xiang ZQ,Pasquini S,Ertl H C J.Induction of genital immunity by DNA primingand intranasal booster immunization with a replication-defectiveadenoviral recombinant[J].J Immunol,1999,162:6716-6723)。而且，重组腺病毒基因不与受体细胞基因组发生整合，具有良好的生物安全性(McConnell M J,Human Gene Therapy,2004,15(11):1022-1033.)，便于大规模培养制备，成本低廉等优点，因此是理想的HPV候选预防性疫苗之一。所以我们确定以重组腺病毒作为疫苗载体。

目前，国际上还没有针对食管癌的预防性及治疗性疫苗研究，在大多数与高危型HPV相关的癌及癌前病变中，L1蛋白在感染的肿瘤细胞中持续表达，因而可以以此开发食管癌的HPV L1疫苗。

发明内容

本发明的目的是提供一种密码子优化型的编码人乳头瘤病毒18型（HPV18）主要衣壳蛋白L1的基因和一种含有所述优化型基因的复制缺陷型重组腺病毒。

一种密码子优化型的编码人乳头瘤病毒18型（HPV18）主要衣壳蛋白L1的基因，该基因具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

一种复制缺陷型重组腺病毒，该病毒携带有上述的基因。

制备所述复制缺陷型重组腺病毒的方法，该方法包括：

（1）通过用哺乳动物高频使用的密码子取代HPV18L1基因序列的密码子，得到密码子优化型HPV18L1基因；

（2）将步骤（1）得到的密码子优化型HPV18L1基因克隆入腺病毒穿梭质粒，得到携带密码子优化型HPV18L1基因序列的重组腺病毒穿梭质粒；

（3）用步骤（2）得到的重组腺病毒穿梭质粒和重组腺病毒骨架质粒共转染适当的腺病毒包装细胞，得到携带有优化型HPV18L1基因序列的复制缺陷型重组腺病毒。

所述基因在制备用于防治HPV引起的疾病的药物或疫苗组合物中的用途。

所述的复制缺陷型重组腺病毒和HPV16L1复制缺陷型重组腺病毒在制备用于预防和/或治疗食管癌方面的药物或疫苗组合物中的用途。

一种或多种HPV复制缺陷型重组腺病毒在制备用于预防和/或治疗食管癌方面的药物或疫苗组合物中的用途，一种或多种HPV型选自HPV6、11、16、18、30、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68型。

一方面，本发明提供了一种密码子优化型的编码人乳头瘤病毒18型（HPV18）主要衣壳蛋白L1的基因（mod.HPV18L1），该基因是在不改变HPV18主要衣壳蛋白L1氨基酸序列的条件下，用哺乳动物高频使用的密码子取代HPV18Ll基因序列的密码子得到的。

对野生型HPV18L1的基因（GenBank:FJ528600.1）全长编码区核昔酸序列(1524bp)进行密码子优化，使用Vector NTI软件打开野生型HPV18L1的氨基酸序列genbank文件，选择Analyses-BackTranslation打开密码子优化窗口，密码子使用表选择为Homo sapiens（智人），选择Copy all即得到优化后的序列，然后利用软件核查设计的序列：氨基酸序列比对一致，并确认序列中不含有克隆需要的酶切位点，在L1蛋白N端第2、37位的丙氨酸使用了次高频密码子GCU，第14、16、53、112、163、187、293、353、409、435、483、497位的脯氨酸使用了次高频密码子CCU和CCA，第41、109、178、252、263、338、420、484、486、500、502、504、506位的精氨酸使用了次高频密码子AGA和CGC，第106、189、196、369、401位的谷氨酸使用了次高频密码子GAA，第197、335、402、417、432位的天冬氨酸使用了次高频密码子GAU，优化基因的GC含量由41.7%提高至63.7%，这与哺乳动物密码子第三位碱基偏好G、C结尾的报道相一致（Nakamura Y,Nucleic Acids Res,2000,28:292)。将最终序列委托上海英潍捷基生物技术有限公司合成。经华大基因测序验证正确，最终得到优化后的HPV18L1基因序列，命名为mod.HPV18L1，其基因序列如SEQ ID NO:1所示。

在本发明的一个优选实施方案中，所述优化的编码乳头瘤病毒18型（HPV18）主要衣壳蛋白L1的基因（mod.HPV18L1）的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。将优化后的HPV18L1基因转染293细胞进行蛋白表达，结果发现：优化后的HPV18L1基因（mod.HPV18L1）能够高效地表达蛋白。

另一方面，本发明提供了一种复制缺陷型重组腺病毒，其中含有所述的优化型的编码乳头瘤病毒18型（HPV18）主要衣壳蛋白L1的基因。在一个优选实施方案中，所述的优化的编码乳头瘤病毒18型（HPV18）主要衣壳蛋白L1的基因具有如SEQ ID NO:1所示的基因序列。

为了得到携带密码子优化型HPV18L1基因的复制缺陷型重组腺病毒，我们首先通过全基因合成获得密码子优化型HPV18L1基因，并将其定向克隆到重组腺病毒穿梭质粒PDC316中，然后与已知的重组腺病毒骨架质粒一起共转染己知的腺病毒包装细胞，并在由所述的包装细胞提供的El蛋白的反向作用下包装病毒（参见图2）。

在一个优选的实施方案中，其中所述的腺病毒穿梭质粒是质粒PDC316。

在一个优选的实施方案中，其中所述的重组腺病毒骨架质粒是质粒pBHGlox△El,3Cre。

在一个优选的实施方案中，其中所述的腺病毒包装细胞是293细胞。

在本发明的一个优选实施方案中，所述的复制缺陷型重组腺病毒的病毒滴度不小于10⁸PFU/ml。

另一方面，本发明还提供了所述优化型的编码乳头瘤病毒18型（HPV18）主要衣壳蛋白L1的基因在制备用于防治HPV引起的疾病的药物或疫苗组合物中的用途，其中所述HPV优选为HPV18型。

另一方面，本发明还提供了本发明所述的重组HPV18L1腺病毒和专利200610056900.3所发明的HPV16L1重组腺病毒在制备用于预防和/或治疗食管癌方面的药物或疫苗组合物中的用途。

附图说明

图1为重组腺病毒穿梭质粒（图1A）和重组腺病毒骨架质粒（图1B）的结构示意图。

图2为重组腺病毒包装（构建）流程图。

图3为使用PCR方法检测重组腺病毒中mod.HPV18 L1基因的插入。

1：阳性对照                2：病毒上清原液的PCR产物

3：病毒上清10倍稀释的PCR产物  4：病毒上清100倍稀释的PCR产物

图4为免疫印迹法检测重组腺病毒rAd-mod.HPV18L1感染的293细胞内HPV18L1蛋白的表达。

1:不加病毒的阴性对照  2：贴壁细胞裂解液

3：培养基离心后上清    4：脱落细胞裂解液

本发明的优势之处在于：

1.疫苗安全性：以复制缺陷型重组腺病毒HPV L1作为疫苗，病毒不会复制，不会整合到宿主基因组，且L1蛋白不会导致细胞癌变。

2.HPV18L1基因的优化：本发明对编码乳头瘤病毒18型（HPV18）主要衣壳蛋白L1的基因（mod.HPV18L1）在不改变HPV18主要衣壳蛋白L1氨基酸序列的条件下，参照哺乳动物的高频密码子使用原则进行优化，实验证明，优化后的HPV18L1基因在293细胞中的表达量明显提高，并成功包装出重组Adv病毒。

下列实施例旨在进一步举例说明实现本发明的具体方式而不是限制本发明。应明确指出的是，在不违背本发明的精神和原则的前提下，对本发明的个别非必要技术特征所做的任何改动和改变都将落入本发明的待批权利要求范围内。另外，如前所述，由于用于实现本发明的分子生物学相关技术和载体质粒均是己知的，可从各种来源直接获得，并且本说明书的详细描述部分和相关实施例部分也己对本发明的方法作了完整、清楚的描述，所以申请人相信本领域技术人员在仔细阅读了本说明书后完全可以重复和再现本发明。

具体实施方式

材料和方法

质粒大量提取试剂盒QIAGEN Plasmid Midi Kits购自德国QIAGEN公司。常用限制性内切酶购自NEB公司。T4DNA连接酶购自大连宝生物工程有限公司。Pfu酶，dNTP购自北京天根生化科技有限公司。脂质体转染试剂Lipofectamine2000、Opti-MEM购自美国Invitrogen公司。小鼠抗HPV18L1单克隆抗体(8.F.324)购自Abcam公司。小鼠抗beta Actin单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术公司。低分子量蛋白预染marker购自Fermentas公司。硝酸纤维素膜购自millipore公司。

重组腺病毒穿梭质粒PDC316、重组腺病毒骨架质粒pBHGlox△E1,3Cre以及腺病毒包装细胞（293细胞）均购自加拿大Microbix Biosystems Inc．公司。

本发明所涉及的分子生物学和免疫学等相关技术如核酸操作技术，蛋白质定性和定量分析等在科学文献中都已有充分描述（如参见J·萨姆布鲁克E·F·弗里奇T·曼尼要蒂斯，分子克隆实验指南（第二版））。

实施例1密码子优化型HPV18L1基因的制备

1.1对野生型HPV18L1基因的分析表明，其密码子使用偏好与哺乳动物存在较大差异，这会导致宿主细胞中同工tRNA的使用效率低下，从而降低蛋白质翻译的速度。我们研究也证明，野生型HPV18L1基因在哺乳动物细胞中的表达水平极低，即使是在腺病毒载体介导下也无法通过Western印迹检测到明显的蛋白表达。因此，对HPV18L1基因的密码子进行优化可以通过提高同工tRNA的使用效率以及突变基因序列中的抑制性元件来提高基因在哺乳动物细胞中的表达水平。参照人的优势密码子使用原则，在不改变氨基酸序列的前提下，对野生型HPV18L1的基因（GenBank:FJ528600.1）全长编码区核昔酸序列(1524bp)进行密码子优化，使用Vector NTI软件打开野生型HPV18L1的氨基酸序列genbank文件，选择Analyses-Back Translation打开密码子优化窗口，密码子使用表选择为Homo sapiens（智人），选择Copy all即得到优化后的序列，然后利用软件核查设计的序列：氨基酸序列比对一致，并确认序列中不含有克隆需要的酶切位点(BglII和Sal I)。将最终序列委托上海英潍捷基生物技术有限公司合成。经华大基因测序验证正确，最终得到优化后的HPV18L1基因序列，命名为mod.HPV18L1，其基因序列如SEQ ID NO:1所示。

实施例2含密码子优化型HPV18L1基因复制缺陷型重组腺病毒的构建

以下按分步骤详细描述含密码子优化型HPV18L1基因复制缺陷型重组腺病毒的构建流程(参见图2)。

2.1含密码子优化型HPV18L1基因重组腺病毒穿梭质粒的构建

（1）大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备：

从37℃培养16～20h的新鲜平板上挑取DH5α单菌落，接种于5ml不含抗菌素的LB培养基中，37℃剧烈振荡培养过夜（12～16h）。次日从上述培养物中吸取0.5ml按1:100转入50ml LB培养基中继续培养约3h，至菌液的OD600值为3时，在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、用冰预冷的50ml离心管中，冰浴30min。在4℃条件下，4000rpm离心10min，弃上清，将管倒置1min，使残留培养液流尽，以10ml用冰预冷的100mmol/L CaCl₂溶液重悬细菌沉淀，冰浴30min。4℃,4000rpm离心10min，弃上清，每50ml初始培养物用2ml预冷的含15％甘油的100mmol/L CaCl₂溶液重悬细菌沉淀，分装成200μl每管，-80℃保存备用。

（2）PDC316穿梭质粒的转化和小量制备：

用无菌吸头吸取1μl PDC316质粒加入200μ1DH5α感受态细胞中，轻轻旋转混匀，冰浴30min。将管移入42℃水浴箱中水浴90s，然后将管快速转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min。每管加入800μl不含抗生素的LB培养基，将管转移至37℃摇床上，温育45min(转速<150RPM)。取50μl己转化的感受态细胞，用一无菌的弯头玻棒轻轻涂到含相应抗生素的琼脂平板表面将平板置于室温至液体被吸收，倒置平皿，于37℃培养12～16h。挑取单个PDC316转化菌落接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃剧烈振荡培养过夜。将培养物移入1.5ml Eppendorf管中，12000rpm离心30-60s，弃上清，用100μl预冷的溶液Ⅰ[50mmol/L Glucose,25mmol/L Tris-HCl(pH8.0),10mmol/L EDTA(pH8.0)]重悬菌体，剧烈振荡混匀；加入200μl新鲜配制的溶液Ⅱ（0.2mol/L NaOH,1%SDS），温和混匀，冰浴3min，至液体清亮；加入150μl预冷的溶液Ⅲ(100ml中含5mol/L KAc60ml,冰乙酸11.5ml，水28.5ml)温和混匀，冰浴10min，12000rpm离心10min，小心吸取上清，将上清转移至另一离心管中，加入2倍体积的无水乙醇室温沉淀30min，12000rpm离心10min，弃上清，沉淀用70%乙醇洗一次，室温晾干后，用30μl含RNaseA(100μg/ml)的TE（pH8.0）溶解沉淀，37℃水浴30～60min，得到PDC316质粒；将所述的PDC316质粒置-20℃保存备用。

（3）mod.HPV18L1基因的PCR法大量扩增

以含mod.HPV18L1基因的pmk-RQ（由上海英潍捷基生物技术有限公司合成）质粒为模板，以316F（序列：5’-agctagatctatggctctgtggcggcccagcgac-3’）和316R（序列：5’-atttgtcgactcacttgcgggctctcacgcgcacg-3’）为引物进行PCR扩增，PCR反应体系是：模板质粒0.5μl，316F1μl，316R1μl，10×Pfu Buffer5μl，dNTP4μl，Pfu1μl，ddH2O37.5μl，总体系50μl。经过25个循环（94℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸2min）获得mod.HPV18L1基因序列，PCR反应产物通过切胶回收进行纯化，得到所述的mod.HPV18L1基因序列；具体操作参见试剂盒说明书。

（4）重组腺病毒穿梭质粒的构建：

使用限制性内切酶Bgl II和Sal I对步骤1-（2）得到的PDC316穿梭质粒进行双酶切；同样使用限制性内切酶Bgl II和Sal I对步骤1-（3）得到的mod.HPV18L1基因序列进行双酶切。酶切体系为：PDC316质粒（或mod.HPV18L1基因序列）20μl，BSA0.5μl，10×NEBuffer35μl，限制性内切酶Bgl II1.5μl，Sal I1.5μl，ddH2O21.5μl，总的酶切体系50μl，37℃消化3-4h。双酶切反应产物分别使用凝胶回收试剂盒进行纯化，具体操作参见试剂盒说明书。然后将酶切后纯化回收的PDC316和mod.HPV18L1按1:4比例混合，依次加入10×T4DNA连接酶缓冲液和T4DNA连接酶，反应体积为20μ1，16℃连接过夜，取20μl连接反应产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。从接种转化产物的LB琼脂平板上挑取若干个单菌落，接种到5ml含相应抗生素的LB培养基中，37℃剧烈振荡培养过夜，按前述质粒的快速小量制备方法提取质粒。并用内切酶Bgl II和Sal I对质粒进行酶切鉴定，挑选阳性重组子。命名为PDC316-mod.HPV18L1。

2.2含密码子优化型HPV18L1基因重组腺病毒的构建

（1）重组腺病毒穿梭质粒PDC316-mod.HPV18L1和骨架质粒的制备：

使用质粒大量提取试剂盒QIAGEN Plasmid Midi Kits分别提取重组腺病毒骨架质粒pBHGlox△El,3Cre和含mod.HPV18L1基因的重组腺病毒穿梭质粒PDC316-mod.HPV18L1。具体实验步骤见QIAGEN Plasmid Midi Kits使用手册。

（2）重组腺病毒的包装：

转染前一天传代293细胞于25cm²细胞培养瓶，培养基用不含抗生素、含10%FBS的DMEM。配制转染液：A液：溶于纯水的重组腺病毒穿梭质粒（1.33μg，0.46μ1）和骨架质粒DNA（6.67μg，2.59μ1）和Opti-MEM培养基共500μ1；B液：20μ1Lipofectamine^TM2000和Opti-MEM培养液共500μ1。B液室温放置5min，A液和B液轻轻混匀，室温放置20min。吸弃旧细胞培养液，换2ml新鲜的不含抗生素、含10%FBS的DMEM，然后将A+B混合液加入培养细胞上，于37℃，5%CO₂孵育4～6h，然后吸弃旧细胞培养液，换液为5ml含10%FBS的DMEM（可含抗生素）。转染后7～10天，用细胞刮将细胞刮下，800RPM离心5min，弃上清，用2ml无菌PBS重悬细胞沉淀；-70℃和37℃反复冻融4次；3000rpm离心10min，吸取上清，即为原代病毒，命名为rAd-mod.HPV18L1，-70℃保存备用。用l ml上清接种293细胞，37℃,5%CO₂孵育1h，然后加入含2%小牛血清的DMEM维持液（6ml）并观察细胞病变。

观察结果显示，被转染的293细胞出现细胞肿胀、圆缩等典型的细胞病变。

实施例3重组腺病毒rAd-mod.HPV18L1的鉴定和病毒滴度测定

3.1重组腺病毒rAd-mod.HPV18L1的鉴定

使用PCR方法检测重组腺病毒中mod.HPV18L1基因的插入：取病毒上清50μl加入2μl蛋白酶K（20mg/ml），55℃水浴1h，煮沸10min，取2μl并稀释10倍和100倍，然后以原液、稀释10倍、稀释100倍三个浓度梯度作为PCR反应的模板。上游引物为316F（序列：5’-agctagatctatggctctgtggcggcccagcgac-3’），下游引物为316R（序列：5’-atttgtcgactcacttgcgggctctcacgcgcacg-3’），扩增得到大小约为1.5kb的mod.HPV18L1基因片段（见图-3）。同时，取部分病毒感染按照4×10⁵/孔的细胞量铺六孔板的293细胞，至细胞完全病变时，培养基离心，把贴壁细胞和脱落的细胞分别用PBS洗一遍，然后各加入50μl的细胞裂解液（50mM Tris-HCl(pH8.0)，150mM NaCl,1%Triton X-100,100ug/ml PMSF（临用前加入）），裂解细胞收集到1.5ml Eppendorf管中，12000r/min离心5min后，取上清加1/4体积的5×上样缓冲液，沸水中煮5～10min，取30μl进行SDS-PAGE电泳并转膜，用鼠抗HPV18L1单克隆抗体（8.F.324）为一抗，

标记的羊抗小鼠IgG为二抗，进行western blot印迹分析。结果显示，重组腺病毒rAd-mod.HPV18L1能够感染293细胞并高效表达HPV18L1蛋白（见图-4）。

3.2重组腺病毒滴度的测定

TCID50实验的基础是应用极限稀释法使293细胞出现病变从而估计滴度。细胞的准备:准备10ml含2%胎牛血清的DMEM重悬细胞，将细胞浓度调至1×10⁵/ml，接种于96孔细胞培养板，每孔加入100μl。细胞贴壁后，将上清弃去。病毒的稀释：第一管中加入0.9ml含2%胎牛血清的DMEM，其余则加入1.8ml。第一管中加入0.1ml病毒原液。上下吸打5次使它们混匀。每一次稀释后都更换吸头。从第一管中吸取0.2ml加入第二管。重复这个稀释步骤直到最高稀释度。96孔板的每一排10孔作为一个稀释度。11，12列不加病毒作为阴性对照。实验孔每孔加入0.1ml不同稀释度病毒。把96孔板放在37℃孵箱培养10天，观察病变。只要有一个小病变此孔即作为阳性对待，如果不易判断可跟阴性对照比较。最后按公式T=10^1+d(s-0.5)计算病毒的滴度(d为稀释度的对数值，s为病变比例的和)。

检测结果显示，第三代病毒滴度达到2×10⁸PFU/ml。

实施例4重组腺病毒rAd-mod.HPV16L1和rAd-mod.HPV18L1免疫小鼠实验

4.1小鼠免疫和分组

从商业途径获得的30只4～6周龄的SPF级的健康雌性C57BL/6小鼠随机分为3组，每组10只，在第0、14和28天大腿肌肉注射免疫三次，末次加强免疫后一周检测免疫反应。具体免疫内容和剂量见表1。

表1：小鼠免疫分组和剂量

4.2免疫小鼠中HPV16L1和HPV18L1体液免疫反应的检测

末次加强免疫后一周（第35天）采集小鼠的静脉血，分离血清。按文献报道的方法（Buck,C.B.,D.V.Pastrana,D.R.Lowy,et,al.J.Virol.2004,78:751–757.）制备HPV16、18假病毒颗粒。在检测前6h接种3×10⁴/孔293FT细胞于96孔细胞培养板中，将HPV16、18假病毒颗粒与系列稀释的血清孵育1h，将假病毒颗粒-待测血清混合液加入接种有293FT细胞的96孔板上，继续孵育72h，取40μl细胞培养上清，按顺序加入新的96孔板中，加入20μl0.05%CHAPS，加入200μl显色底物，室温避光孵育2h，Bio-Rad550型酶标仪测定405nm波长下的OD值。预期第2组和第3组产生的抗体效价达到1：10000以上，表明重组腺病毒rAd-mod.HPV16L1和rAd-mod.HPV18L1疫苗能在C57BL/6小鼠体内诱导较高的体液免疫应答。

4.3免疫小鼠中HPV16L1和HPV18L1细胞免疫反应的检测

末次加强免疫后一周（第35天）颈椎脱臼法处死小鼠，取小鼠脾脏，用淋巴细胞分离液分离小鼠脾淋巴细胞，采用酶联免疫斑点(ELISPOT)方法检测分泌IFN-γ（γ-干扰素）的T淋巴细胞，具体方法如下：取50μl4×10⁶/ml的小鼠脾淋巴细胞和等量的4μg/ml多肽(使用因特网http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/上的BIMAS肽结合软件鉴定预测的T细胞识别肽(H2-D^b限制)并经常规合成技术合成)加入已包被抗小鼠IFN-γ抗体并封闭过的ELISPOT板中，每只小鼠做复孔，另外，每只小鼠的阴性对照孔只加等量的细胞不加多肽，阳性对照孔加入细胞和终浓度为20μg/m1的刀豆蛋白(ConA)。37℃培养箱孵育36～48h，弃掉培养液，PBST洗涤ELISPOT板后分别经过生物素标记的一抗和链霉亲和素HRP的二抗进行反应，最后加入AEC显色液显色。可以预期，第2组和第3组小鼠脾淋巴细胞分别在相应的HPV16L1和HPV18L1合成多肽的刺激下分泌IFN-γ的细胞数量明显地高于第一组对照组，1×10⁶的脾淋巴细胞中的斑点数达到1500以上，表明重组腺病毒rAd-mod.HPV16L1和rAd-mod.HPV18L1疫苗能在C57BL/6小鼠体内诱导较高的细胞免疫应答。

Claims (7)

1.一种密码子优化型的编码人乳头瘤病毒18型（HPV18）主要衣壳蛋白L1的基因，该基因为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

2.一种复制缺陷型重组腺病毒，该病毒携带有权利要求1所述的基因。

3.一种制备权利要求2所述复制缺陷型重组腺病毒的方法，该方法包括：

（1）通过用哺乳动物高频使用的密码子取代HPV18L1基因序列的密码子，得到密码子优化型HPV18L1基因；

（2）将步骤（1）得到的密码子优化型HPV18L1基因克隆入腺病毒穿梭质粒，得到携带密码子优化型HPV18L1基因序列的重组腺病毒穿梭质粒；

（3）用步骤（2）得到的重组腺病毒穿梭质粒和重组腺病毒骨架质粒共转染适当的腺病毒包装细胞，得到携带有优化型HPV18L1基因序列的复制缺陷型重组腺病毒。

4.根据权利要求3的方法，其中所述的腺病毒穿梭质粒是质粒pDC316。

5.根据权利要求3的方法，其中所述的腺病毒包装细胞是293细胞。

6.权利要求1所述基因在制备用于防治HPV18L1引起的疾病的药物中的用途。

7.权利要求2所述的复制缺陷型重组腺病毒和HPV18L1复制缺陷型重组腺病毒在制备用于预防和/或治疗食管癌方面的药物中的用途。

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