CN113528469B - 一种高危型hpv核酸检测假病毒标准物质 - Google Patents
一种高危型hpv核酸检测假病毒标准物质 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113528469B CN113528469B CN202110815581.4A CN202110815581A CN113528469B CN 113528469 B CN113528469 B CN 113528469B CN 202110815581 A CN202110815581 A CN 202110815581A CN 113528469 B CN113528469 B CN 113528469B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hpv
- standard substance
- pseudovirus
- standard
- virus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种高危型HPV核酸检测假病毒标准物质。其是将编码HPV衣壳蛋白的L1基因连入腺病毒载体,转染细胞,收集假病毒颗粒,纯化假病毒颗粒,最终用保护剂溶解分装即成。本发明较好的克服了游离DNA对假病毒核酸定量准确性的影响,也利于保证分装后标准物质的均匀性。假病毒是由衣壳蛋白包裹DNA遗传物质,与HPV病毒的结构相近,克服了质粒DNA质控范围的局限性,是科学性更强的标准物质形式。
Description
技术领域:
本发明属于生物、化学分析领域,具体涉及一种高危型HPV核酸检测假病毒标准物质及其制备方法。
背景技术:
高危型HPV的检测在宫颈癌的筛查和诊断过程中发挥着重要的作用,在了解HPV基因功能与作用机制的基础上,研究者研发了多种针对HPV核酸的检测方法,进而形成了商品化的检测试剂盒。在基于PCR扩增的HPV DNA检测试剂盒中,多数将编码衣壳蛋白L1的基因作为检测的目标区域,少数针对E1、E2基因或多种不同基因同时进行检测。值得注意的是:HPV核酸检测过程存在一些影响因素,例如病毒裂解与DNA提取和纯化效率、引物探针的通用性等;对于荧光定量PCR过程,标准曲线的准确性将直接影响测量结果。上述多种影响因素可能导致检测结果缺乏可比性,可能误导对病情的判断,不利于及时干预治疗。
具有确定量值的标准物质可以对不同的检测试剂盒进行计量校准,提升检测的准确性。为了提高HPV检测结果的准确性和一致性,世界卫生组织(World HealthOrganization,WHO)在2008年针对两种高危型HPV16和HPV18,构建了包含全基因组序列的重组质粒,作为核酸标准物质对来自13个国家不同实验室的定性和定量检测结果进行了比对。随后,利用类似的方法,WHO还研制了包含2种低危型(HPV6、11)和5种高危型(HPV31、33、45、52、58)的核酸标准物质。然而国际标准物质不易购买,很难满足国内计量校准的巨大需求。国内的研究者相继研制了包含HPV L1基因序列和全基因组基因序列的重组质粒DNA标准物质和质控品,涵盖常见的低危和高危HPV亚型,为HPV DNA分型与检测过程提供了参考。我国卫生部临床检验中心参考国际标准物质研制方法,建立了以人基因组DNA为基质的HPV16、HPV18全基因组重组质粒DNA标准物质。使用4种实时荧光PCR试剂联合测试,通过国际标准物质建立标准曲线完成定值,并计算不确定度,HPV16标准物质量值为(7.1±1.0)×106IU mL-1,HPV18标准物质量值为(3.5±0.7)×106IU mL-1;上海市临床检验中心、广州邦德盛生物科技有限公司等单位也分别研制了HPV16和HPV18全基因组重组质粒DNA的国家有证标准物质。卫生部临床检验中心制备了7种常见HPV基因型(HPV6、11、31、33、39、51、52)的全基因组重组质粒DNA参考品并进行了定值:采用分光光度法测定重组质粒在260nm处吸光度值,根据质粒分子量计算得到GE mL-1浓度值,用含人基因组DNA的BSA溶液梯度稀释至106GE mL-1和105GE mL-1(张瑞.人乳头瘤病毒基因分型检测参考物质及其应用研究[D].北京协和医学院,2013.);中国药品生物制品检定所建立的包含L1基因的重组质粒DNA参考品,涵盖常见的30种HPV基因型(黄杰,曲守方,徐任,等.人乳头瘤病毒基因分型质控品的建立[J].中华检验医学杂志,2010,33(006):559-562.);中国食品药品检定研究院建立了包含20种HPV基因型的全基因组重组质粒DNA参考品,经1mg·mL-1人基因组溶液稀释至106copies mL-1(孙彬裕,曲守方,徐超,等.人乳头瘤病毒全基因组基因分型国家参考品的建立[J].药物分析杂志,2013,033(009):1597-1602.);长春理工大学也建立了涵盖14种中高危型和6种低危型的HPV全基因组重组质粒DNA参考品;将不同基因型参考品测定浓度值后统一调为50pg mL-1(108~109copies mL-1)(徐任.生物与化学分析方法在诊断试剂标准品制备中的应用[D].长春理工大学,2011.);利用HPV DNA分型参考品,可以对相关试剂盒和实验室的HPV分型检测过程进行质量评估。
针对高危型HPV的检测,质粒DNA形式的标准物质和参考品的应用过程中,虽然通过加入人类基因组DNA,可以一定程度上模拟检测过程中的基质效应,但质粒DNA作为质控时,其应用范围仅限于DNA扩增和检测环节,很难对病毒颗粒裂解、DNA提取与纯化等步骤的效率进行考察,其明显的局限性也提示了研制不同形式标准物质的重要性。近年来,假病毒的技术不断成熟发展,假病毒可以携带外源病毒的特定基因片段,因为不包含外源病毒的完整基因,假病毒只能对细胞进行“一次性”感染,在研究致病性病毒的过程中具有较好的安全性;假病毒颗粒具有衣壳蛋白包裹核酸的完整结构,更接近真实病毒样品的状态;在衣壳蛋白的“保护”下,假病毒可以更好的抵抗核酸酶降解,利于在运输和储存过程中保持其稳定性。
由于可以在假病毒的衣壳表达HPV的衣壳蛋白,同时操作安全性较高,研究者更多的将其应用于血清中的免疫原性检测。
发明内容:
本发明为了克服现有HPV质粒DNA标准物质应用范围的局限性,对包括DNA提取纯化、PCR扩增以及检测等全过程进行质量控制,针对最常见的两种高危亚型HPV16与HPV18,研制了包含编码L1基因的假病毒标准物质,假病毒标准物质的结构接近真实的检测样品,可以涵盖L1基因全序列,同时具有保存稳定和操作安全的优势。本发明首次将包含HPV L1基因的假病毒作为核酸检测的标准物质,在假病毒的大多数实验应用中,对于核酸没有定量的要求,质粒的残留问题也没有得到较多关注。现有文章报道的假病毒颗粒纯化过程多为单一步骤纯化,对质粒DNA的去除效果不够理想。针对假病毒颗粒的纯化,游离的质粒DNA去除不彻底将显著影响后续核酸定量检测的准确性,而现有单一的纯化方法的效果不甚理想,通过优化组合,本发明设计的多步骤假病毒纯化流程,可以较好的去除假病毒溶液中的游离DNA,有利于保证标准物质分装后的均匀性和核酸定量的准确性。同时优化了标准物质的保存液,保证在运输过程中控制温度不超过4℃,时间不超过14天,标准物质的量值可以保持稳定,确保了假病毒颗粒作为核酸标准物质的可行性。常见的荧光定量PCR技术相比,数字PCR不依赖标准曲线,可以对核酸进行绝对定量,是国际公认的核酸定量参考方法,在优化假病毒纯化方法的基础上,数字PCR定值方法确保标准物质的量值可溯源至自然单位。本发明研制假病毒形式的标准物质,能够为包含提取步骤的检测全过程提供质量控制的参考,有助于提高HPV DNA检测结果的准确性。
对此,本发明提供一种高危型HPV核酸检测的假病毒标准物质,其特征在于,由下述方法制备得到:
将编码HPV衣壳蛋白的L1基因连入腺病毒载体,转染细胞,收集假病毒颗粒,纯化假病毒颗粒,最终用保护剂溶解分装。
具体实施方式中,所述HPV是HPV16或HPV18。对应的,所述编码HPV衣壳蛋白的L1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
优选地,所述转染细胞是转染293细胞。
具体实施方式中,所述纯化包括超声处理、DnaseⅠ处理、超速离心以及PEG纯化步骤。
更具体地,所述纯化步骤如下:
(1)超声处理所述腺病毒载体,保留上清液;
(2)向上清液中加入DnasⅠ处理,优选于37℃处理4-6小时;
(3)超速离心,收集沉淀,优选地104-106g超速离心1-3小时;
(4)取溶解后的样品加入超速离心管中,并依次加入20%,40%和60%的蔗糖,0.7×105g-1.5×105g离心2-4小时,将分布于蔗糖条带之间的病毒颗粒吸取出来;
(5)溶解后再次于0.8×105g-1.5×105g离心2-4小时,溶解沉淀;
(6)向(5)中得到的病毒溶液中加入的PEG6000,使其终浓度为40%-60%;
(7)利用磁力搅拌器搅拌过夜,后于7000g-8000g离心20min-40min,收集病毒沉淀即得。
进一步优选地,第(7)步后还包括下述步骤:
(8)溶解病毒沉淀后,再次于7000g-8000g离心20min-40min,收集病毒沉淀;
任选地,进一步包括:
(9)利用含有保护剂的溶液重新溶解作为标准物质的假病毒,进行分装和冻存。
更进一步优选地,还包括对标准物质的数字PCR定值,即通过针对HPV L1基因的数字PCR方法进行定量检测,以标准物质中L1基因的拷贝数浓度作为其量值。
其中优选地,所述保护剂是海藻糖和牛血清白蛋白作为保护剂,优选为含有10%海藻糖和5%牛血清白蛋白作为保护剂。
此外,本发明优化得到了适合假病毒保存的保护液,能够保证假病毒标准物质量值的稳定性。
因此,本发明还提供上述的方法制备得到的假病毒标准物质的保存方法,其特征在于,将所述假病毒标准物质溶于含有海藻糖和牛血清白蛋白作为保护剂的溶液中,优选地,所述溶液中含有10%海藻糖和5%牛血清白蛋白作为保护剂;保存温度是室温以下,优选低于4℃的温度下进行保存。
现有针对高危型HPV16、HPV18的有证标准物质为质粒DNA形式,其量值溯源至HPV16、HPV18国际标准物质,其定值方法是通过分光光度法测定量值后,对标准物质直接赋值:在260nm处测定标准物质原液的吸光度值并根据质粒分子量计算其浓度(GenomeEquivalents mL-1,GE mL-1),按一定比例稀释到1×107GE mL-1,分装0.5mL/瓶,冻干后赋值为5×106IU/瓶。现有的有证标准物质不能为实际检测过程中病毒核酸提取过程提供质量控制的参考,其量值不能体现HPV特定基因的拷贝数浓度,存在一定的局限性。大多数针对HPV DNA检测的商品化试剂盒中,均以编码主要衣壳蛋白L1的基因作为检测目标。基于此本发明制备了假病毒形式的HPV16、HPV18核酸标准物质,将编码L1的基因序列连入腺病毒载体,转染293细胞后收集假病毒颗粒,对假病毒的纯化方式进行了优化,确保标准物质的量值准确。同时优化了标准物质的保存液,保证在运输过程中控制温度不超过4℃,时间不超过14天,标准物质的量值可以保持稳定。利用数字PCR方法对标准物质进行定值,可以实现对L1基因拷贝数浓度的绝对定量,其重复性和准确性均优于吸光度值测量法。通过将标准物质分发至8家不同的检测实验室进行应用验证,表明本发明得到HPV16、HPV18假病毒标准物质多家定值结果的相对标准偏差均小于5%。因此,本发明研制的HPV16、HPV18假病毒核酸标准物质,具有良好的均匀性与稳定性,以L1基因的拷贝数浓度作为量值(量值单位:copies/μL)。经不同检测平台的验证,其量值具有较好的重复。该标准物质可以为HPV16、HPV18的检测与分型提供全过程质量控制的参考,提升检测结果的准确性,助力实现宫颈癌等相关疾病的科学诊断。
附图说明
图1假病毒颗粒组装过程示意图。
图2假病毒颗粒纯化步骤示意图。
图3制备HPV假病毒标准物质的技术流程图。
图4 HPV16假病毒标准物质数字PCR定值反应体系优化
图5 HPV18病毒标准物质数字PCR定值反应体系优化
图6.HPV16假病毒标准物质稳定性结果。
图7.HPV18假病毒标准物质稳定性结果。
具体实施方式
下面描述的实施例是示例性的,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例一
国内常用针对HPV DNA进行检测的试剂盒中,主要的检测对象是编码HPV衣壳蛋白L1的基因;本发明从GeneBank数据库中下载了常见高危型HPV L1基因的序列。以HPV18亚型(MH057747.1)为例,其序列如下(SEQ ID NO.1):
ATGTGCCTGTATACACGGGTCCTGATATTACATTACCATCTACTACCTCTGTATGGCCCATTGTATCACCCACAGCCCCTGCCTCTACACAGTATATTGGTATACATGGTACACATTATTATTTGTGGCCATTATATTATTTTATTCCTAAGAAACGTAAACGTGTTCCCTATTTTTTTGCAGATGGCTTTGTGGCGGCCTAGTGACAATACCGTATATCTTCCACCTCCTTCTGTGGCAAGAGTTGTAAATACCGATGATTATGTGACTCGCACAAGCATATTTTATCATGCTGGCAGCTCTAGATTATTAACTGTTGGTAATCCATATTTTAGGGTTCCTGCAGGTGGTGGCAATAAGCAGGATATTCCTAAGGTTTCTGCATACCAATATAGAGTATTTAGGGTGCAGTTACCTGACCCAAATAAATTTGGTTTACCTGATACTAGTATTTATAATCCTGAAACACAACGTTTAGTGTGGGCCTGTGCTGGAGTGGAAATTGGCCGTGGTCAGCCTTTAGGTGTTGGCCTTAGTGGGCATCCATTTTATAATAAATTAGATGACACTGAAAGTTCCCATGCCGCCACGTCTAATGTTTCTGGGGACGTTAGGGATAATGCGTCTGTAGATTATAAGCAGACACAGTTATGTATTTTGGGCTGTGCCCCTGCTATTGGGGAACACTGGGCTAAAGGCACTGCTTGTAAATCGCGTCCTTTATCACAGGGCGATTGCCCCCCTTTAGAACTTAAAAACACAGTTTTGGAAGATGGTGATATGGTAGATACTGGATATGGTGCCACGGACTTTAGTACATTGCAAGATACTAAATGTGAGGTACCATTGGATATTTGTCAGTCTATTTGTAAATATCCTGATTATTTACAAATGTCTGCAGATCCTTATGGGGATTCCATGTTTTTTTGCTTACGGCGTGAGCAGCTTTTTGCTAGGCATTTTTGGAATGGAGCAGGTACTATGGGTGACACTGTGCCTCAATCCTTATATATTAAAGGCACAGGTATGCGTGCTTCACCTGGCAGCTGTGTGTATTCTCCCTCTCCAAGTGGCTCTATTGTTACCTCTGACTCCCAGTTGTTTAATAAACCATATTGGTTACATAAGGCACAGGGTCATAACAATGGTGTTTGCTGGCATAATCAATTATTTGTTACTGTGGTAGATACCACTCGCAGTACCAATTTAACAATATGTGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCAATATGATGCTACCAAATTTAAGCAGTATAGCAGACATGTTGAGGAATATGATTTGCAGTTTATTTTTCAGTTGTGTACTATTACTTTAACTGCAGATGTTATGTCCTATATTCATAGTATGAATAGCGGTATTTTAGAGGATTGGAACTTTGGTGTTCCCCCCCCGCCAACTACTAGTTTGGTGGATACATATCGTTTTGTACAATCTGTTGCTATTACCTGTCAAAAGGATGCTGCACCGGCTGAAAATAAGGATCCCTATGATAAGTTAAAGTTTTGGAATGTGGATTTAAAGGAAAAGTTTTCTTTAGACTTAGATCAATATCCCCTTGGACGTAAATTTTTGGTTCAGGCTGGATTGCGTCGCAAGCCCACCATAGGCCCTCGCAAACGTTCTGCTCCATCTGCCACTACGTCTTCTAAACCTGCCAAGCGTGTGCGTGTACGTGCCAGGAAGTAA
GeneBank数据库中高危型HPV16 L1基因的序列如下:
ATGTCTCTTTGGCTGCCTAGTGAGGCCACTGTCTACTTGCCTCCTGTCCCAGTATCTAAGGTTGTAAGCACGGATGAATATGTTGCACGCACAAACATATATTATCATGCAGGAACATCCAGACTACTTGCAGTTGGACATCCCTATTTTCCTATTAAAAAACCTAACAATAACAAAATATTAGTTCCTAAAGTATCAGGATTACAATACAGGGTATTTAGAATACATTTACCTGACCCCAATAAGTTTGGTTTTCCTGACACCTCATTTTATAATCCAGATACACAGCGGCTGGTTTGGGCCTGTGTAGGTGTTGAGGTAGGTCGTGGTCAGCCATTAGGTGTGGGCATTAGTGGCCATCCTTTATTAAATAAATTGGATGACACAGAAAATGCTAGTGCTTATGCAGCAAATGCAGGTGTGGATAATAGAGAATGTATATCTATGGATTACAAACAAACACAATTGTGTTTAATTGGTTGCAAACCACCTATAGGGGAACACTGGGGCAAAGGATCCCCATGTACCAATGTTGCAGTAAATCCAGGTGATTGTCCACCATTAGAGTTAATAAACACAGTTATTCAGGATGGTGATATGGTTGATACTGGCTTTGGTGCTATGGACTTTACTACATTACAGGCTAACAAAAGTGAAGTTCCACTGGATATTTGTACATCTATTTGCAAATATCCAGATTATATTAAAATGGTGTCAGAACCATATGGCGACAGCTTATTTTTTTATTTACGAAGGGAACAAATGTTTGTTAGACATTTATTTAATAGGGCTGGTACTGTTGGTGAAAATGTACCAGACGATTTATACATTAAAGGCTCTGGGTCTACTGCAAATTTAGCCAGTTCAAATTATTTTCCTACACCTAGTGGTTCTATGGTTACCTCTGATGCCCAAATATTCAATAAACCTTATTGGTTACAACGAGCACAGGGCCACAATAATGGCATTTGTTGGGGTAACCAACTATTTGTTACTGTTGTTGATACTACACGCAGTACAAATATGTCATTATGTGCTGCCATATCTACTTCAGAAACTACATATAAAAATACTAACTTTAAGGAGTACCTACGACATGGGGAGGAATATGATTTACAGTTTATTTTTCAACTGTGCAAAATAACCTTAACTGCAGACGTTATGACATACATACATTCTATGAATTCCACTATTTTGGAGGACTGGAATTTTGGTCTACAACCTCCCCCAGGAGGCACACTAGAAGATACTTATAGGTTTGTAACATCCCAGGCAATTGCTTGTCAAAAACATACACCTCCAGCACCTAAAGAAGATCCCCTTAAAAAATACACTTTTTGGGAAGTAAATTTAAAGGAAAAGTTTTCTGCAGACCTAGATCAGTTTCCTTTAGGACGCAAATTTTTACTACAAGCAGGATTGAAGGCCAAACCAAAATTTACATTAGGAAAACGAAAAGCTACACCCACCACCTCATCTACCTCTACAACTGCTAAACGCAAAAAACGTAAGCTGTAA。
实施例二、构建包含L1基因的腺病毒载体并转染293细胞。
图1示出了构建包含L1基因的腺病毒载体并转染293细胞的步骤。具体步骤如下:
(1)按照从GeneBank数据库的信息合成编码L1的基因片段(是HPV18和HPV16 L1基因的载体构建完全相同),在两端增加BamH1和EcoR1的酶切位点。引物设计如下表:
引物名称 | 序列设计 |
BamH1-L1 F primer | CGCGGATCCGCGATGTGCCTG |
EcoR1-L1 R primer | CCGGAATTCCGGTTACTTCCTGG |
(2)对腺病毒载体质粒和编码L1的基因片段进行BamH1和EcoR1双酶切处理,酶切反应体系组成如下表所示,酶切完成后利用PCR产物回收试剂盒回收酶切产物。
体积(μL) | |
Cut Smart缓冲液 | 2 |
BamH1 | 1 |
EcoR1 | 1 |
PCR扩增产物 | 1μg,加水补至总体积20μL |
酶切反应条件为:37℃,4小时。
(3)将编码L1的基因片段与腺病毒载体质粒的摩尔浓度调至3∶1,加入T4连接酶体系进行连接。连接反应体系如下表中所示
连接反应条件为:16℃,2小时。
(4)将连接后的质粒转染大肠杆菌,过夜培养后利用PCR方法筛选阳性克隆。
(5)对得到的阳性克隆扩大培养,提取质粒后进行测序分析,确保腺病毒载体中包含了编码L1基因的完整序列。
(6)利用PEI(聚乙烯亚胺)转染法将测序验证正确的腺病毒载体转染进入293细胞。转染步骤包括:转染前向贴壁培养的细胞中加入预热的无血清培养基,以HBS溶液(150mM NaCl,20mM HEPES,pH 7.4)溶解5g质粒,加入等体积的10M PEI溶液,充分混匀后室温静置30分钟,最后将混合液逐滴加入细胞培养基中,轻轻摇动培养皿混匀,放入5%二氧化碳的37℃培养箱中培养。
(7)筛选转染成功的293细胞,培养至90%以上细胞出现病变时,收集细胞,利用超声处理的(High energy,30s on,30s off,15次循环)方式制备病毒粗提液。
(8)按步骤(6)所述的方法,用病毒粗提液继续转染293细胞以扩增培养腺病毒。再次收集细胞后备用。
实施例三、假病毒颗粒的纯化
图2示出了假病毒颗粒纯化过程的步骤示意图。按照以下优化后的步骤进行:
(1)PBS缓冲液悬浮收集的细胞,超声处理(High energy,30s on,30s off,15次循环),释放假病毒颗粒。
(2)4℃5000g离心,去除细胞碎片,取上层清液。
(3)向上层清液中加入DnasⅠ,置于37℃处理5小时。
(4)DnasⅠ处理后的样品利用105g超速离心2小时,收集沉淀,用TE缓冲液溶解沉淀。
(5)取溶解后的样品6mL加入超速离心管中,并在离心管中依次加入20%,40%和60%的蔗糖,1.1×105g离心3小时,将分布于蔗糖条带之间的病毒颗粒吸取出来,用TE缓冲液重新溶解。
(6)1.2×105g离心3小时,收集沉淀,再次用TE缓冲液溶解。
(7)向(6)中得到的病毒溶液中加入适量的PEG6000,使其终浓度为50%。
(8)利用磁力搅拌器,在4℃搅拌过夜。
(9)8000g离心30min,收集病毒沉淀。
(10)向病毒沉淀中加入PBS溶液,置于4℃溶解过夜。
(11)8000g离心30min,收集病毒沉淀。
(12)利用保护剂重新溶解假病毒,进行分装和冻存。
纯化后的假病毒标准物质溶液中,离心后取上层清液,不经过DNA提取过程直接进行荧光定量PCR扩增,无扩增曲线出现(Ct>35),证明假病毒纯化过程可以较好的去除游离质粒DNA的影响。
实施例四、制备HPV假病毒标准物质及定值
图3是制备HPV假病毒标准物质的技术流程图。经过前述实施例一和二的过程,对获得的作为标准物质的假病毒分装冻存,然后再进行数字PCR定值。
分装完毕后,根据现有商用试剂盒中常用的引物GP5+/GP6+所在的位置设计引物与探针,在优化反应条件后,基于数字PCR技术对HPV假病毒标准物质进行定值,数字PCR技术的定值不依赖于标准曲线,可以对假病毒标准物质的核酸进行绝对定量,并确保标准物质的量值向自然单位溯源。
经验证表明,通过本发明对纯化过程的优化,可以较为彻底的去除假病毒制备过程中的质粒的影响,是后续进行准确定值的基础。分装完毕后,根据现有商用试剂盒中常用的引物GP5+/GP6+所在的位置设计引物与探针,针对HPV16、HPV18 L1基因的引物探针如下表中所示。
表1数字PCR引物探针序列
接下来,分别对数字PCR反应体系中的退火温度与引物探针的工作浓度进行了优化,如图4和图5所示,针对HPV16假病毒标准物质的定值,退火温度选定为56℃,引物和探针的工作浓度设置为500nM。
针对HPV18病毒标准物质的定值,退火温度选定为56℃,引物和探针的工作浓度分别为500nM、600nM。
实施例五、HPV假病毒标准物质均匀性
为检测过程提供质控参考的标准物质,应具有足够的均匀性与稳定性,才能保证其量值的准确性。
由于每个标准物质候选物均制备了200管,按照国家计量技术规范JJF 1343-2012《标准物质定值的通用原则及统计学原理》中对标准物质均匀性评估的技术要求,对每个标准物质随机抽取11个包装单元。对抽出的各样品在控制同样的实验条件下进行测定,从而使各样品间的差异完全由样品的不均匀性反映出来。基于已建立的数字PCR方法进行定值检测,每管样品重复测量三次,得到的数据结果见表4,5。对所取得数据进行F检验。根据公式(1)和(2)计算出组间差方和与组内差方和,根据公式(3)和(4)计算出组间和组内的自由度,然后根据公式(5)计算统计量F值,根据F的自由度(v1,v2)查F分布临界值,如果F<Fa,则表明样品均匀性良好。
ν1=m-1 公式(3)
v2=N-m 公式(4)
应用数字PCR方法对高危亚型HPV16、HPV18两种标准物质进行均匀性测定,对于测定结果,首先采用夏皮罗-威尔克法检验数据的正态性,再采用Dixon’s和Grubbs’s检验对可疑值进行剔除。经过检验,所有标准物质的均匀性数据均满足正态分布且没有发现可疑值。F检验结果如表1中所示,所有标准物质均满足F<F0.05(10,22),即标准物质内部均匀性无显著性差异(P>0.05),表明两种标准物质的均匀性良好。
表4.HPV16假病毒标准物质均匀性检验结果
表5 HPV18假病毒标准物质均匀性检验结果
实施例六、HPV假病毒标准物质稳定性
为确保标准物质在短期运输过程中量值的稳定性,进一步优化了标准物质的保护剂。本发明对假病毒保存液的成分进行了优化比较,在Hank’s平衡盐溶液的基础上,分别添加蛋白质与糖类成分以保持病毒衣壳蛋白的完整性,同时减小冻融过程对假病毒颗粒的损伤,不同蛋白质与糖类的保护剂的保存效果如下表中所示,保存条件为4℃,工作浓度均为10%。其中,利用已建立的数字PCR方法,对L1基因进行定量检测,不同保存时间与起始的L1基因拷贝数浓度进行比较,存在显著性差异即判定为不稳定。
蔗糖 | 乳糖 | 葡萄糖 | 海藻糖 | |
脱脂奶粉 | ☆ | ☆☆ | ☆ | ☆☆ |
氨基酸 | ☆☆ | ☆☆ | ☆☆ | ☆☆ |
牛血清白蛋白 | ☆☆ | ☆☆ | ☆☆ | ☆☆☆ |
其中,☆为在4℃稳定保存7天,☆☆为在4℃稳定保存7-14天,☆☆☆在4℃稳定保存14天以上。
接下来对海藻糖和牛血清白蛋白的浓度进行优化,结果如下表中所示,在海藻糖浓度不低于10%、牛血清白蛋白不低于5%的情况下,保存效率保持不变,综合经济合理的考虑,确定假病毒标准物质保存液的成分为在Hank’s平衡盐溶液中添加10%海藻糖和5%牛血清白蛋白。
☆☆为在4℃稳定保存7-14天,☆☆☆在4℃稳定保存14天以上。
图6显示HPV16假病毒标准物质稳定性结果,图7显示HPV18假病毒标准物质稳定性结果。比较结果,表明保护剂为Hank’s平衡盐溶液中添加10%海藻糖和5%牛血清白蛋白,对假病毒标准物质的稳定效果最好。接下来,在添加上述保护剂的条件下,分别监测了标准物质置于室温、4℃和-20℃条件下L1基因浓度随时间的变化,如图6-7中所示,其中以-80℃作为参考温度。可以证明:在-20℃和4℃保存条件下,14天标准物质基因拷贝数浓度没有显著变化(P>0.05)。因此在运输过程中加入干冰或控制温度不超过4℃条件下运输,该标准物质的量值可以保持稳定,为标准物质的应用提供了重要基础。
实施例六、HPV假病毒标准物质的应用验证
将本发明研制的标准物质分发至8家涉及相关检测的实验室或实验平台进行验证,标准的实验操作流程与标准物质同时寄送,由不同实验的技术人员在确保熟悉实验操作流程后分别独立进行定值,8家实验室的测量结果与标准偏差如下表所示。
表2. 8家实验室HPV16和HPV18假病毒标准物质定值结果
首先对每家实验室原始数据进行格拉布斯(Grubbs)检验剔除离群值,经过检验没有发现存在可疑值;根据科克伦(Cochran)准则计算可证明8家实验室的结果等精度。以贝塞尔公式计算8家不同实验室定值结果的标准偏差,贝塞尔公式如下:
通过计算可知:对于HPV16与HPV18两种假病毒标准物质,多家定值结果的相对标准偏差均小于5%(HPV16相对标准偏差为4.5%,HPV18相对标准偏差为3.4%),说明标准物质的量值在不同检测平台具有较好的重复性,标准物质的应用有利于提升不同机构检测结果的一致性与可比性,从而减少因重复测量造成的经济损失以及不可靠结果对有效诊断的影响。
序列表
<110> 中国计量科学研究院
<120> 一种高危型HPV核酸检测假病毒标准物质
<160> 10
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 1707
<212> DNA
<213> HPV 18
<400> 1
atgtgcctgtatacacgggtcctgatattacattaccatctactacctctgtatggcccattgtatcacccacagcccctgcctctacacagtatattggtatacatggtacacattattatttgtggccattatattattttattcctaagaaacgtaaacgtgttccctatttttttgcagatggctttgtggcggcctagtgacaataccgtatatcttccacctccttctgtggcaagagttgtaaataccgatgattatgtgactcgcacaagcatattttatcatgctggcagctctagattattaactgttggtaatccatattttagggttcctgcaggtggtggcaataagcaggatattcctaaggtttctgcataccaatatagagtatttagggtgcagttacctgacccaaataaatttggtttacctgatactagtatttataatcctgaaacacaacgtttagtgtgggcctgtgctggagtggaaattggccgtggtcagcctttaggtgttggccttagtgggcatccattttataataaattagatgacactgaaagttcccatgccgccacgtctaatgtttctggggacgttagggataatgcgtctgtagattataagcagacacagttatgtattttgggctgtgcccctgctattggggaacactgggctaaaggcactgcttgtaaatcgcgtcctttatcacagggcgattgcccccctttagaacttaaaaacacagttttggaagatggtgatatggtagatactggatatggtgccacggactttagtacattgcaagatactaaatgtgaggtaccattggatatttgtcagtctatttgtaaatatcctgattatttacaaatgtctgcagatccttatggggattccatgtttttttgcttacggcgtgagcagctttttgctaggcatttttggaatggagcaggtactatgggtgacactgtgcctcaatccttatatattaaaggcacaggtatgcgtgcttcacctggcagctgtgtgtattctccctctccaagtggctctattgttacctctgactcccagttgtttaataaaccatattggttacataaggcacagggtcataacaatggtgtttgctggcataatcaattatttgttactgtggtagataccactcgcagtaccaatttaacaatatgtgcttctacacagtctcctgtacctgggcaatatgatgctaccaaatttaagcagtatagcagacatgttgaggaatatgatttgcagtttatttttcagttgtgtactattactttaactgcagatgttatgtcctatattcatagtatgaatagcggtattttagaggattggaactttggtgttccccccccgccaactactagtttggtggatacatatcgttttgtacaatctgttgctattacctgtcaaaaggatgctgcaccggctgaaaataaggatccctatgataagttaaagttttggaatgtggatttaaaggaaaagttttctttagacttagatcaatatccccttggacgtaaatttttggttcaggctggattgcgtcgcaagcccaccataggccctcgcaaacgttctgctccatctgccactacgtcttctaaacctgccaagcgtgtgcgtgtacgtgccaggaagtaa 1707
<210> 2
<211> 1519
<212> DNA
<213> HPV 16
<400> 2
atgtctctttggctgcctagtgaggccactgtctacttgcctcctgtcccagtatctaaggttgtaagcacggatgaatatgttgcacgcacaaacatatattatcatgcaggaacatccagactacttgcagttggacatccctattttcctattaaaaaacctaacaataacaaaatattagttcctaaagtatcaggattacaatacagggtatttagaatacatttacctgaccccaataagtttggttttcctgacacctcattttataatccagatacacagcggctggtttgggcctgtgtaggtgttgaggtaggtcgtggtcagccattaggtgtgggcattagtggccatcctttattaaataaattggatgacacagaaaatgctagtgcttatgcagcaaatgcaggtgtggataatagagaatgtatatctatggattacaaacaaacacaattgtgtttaattggttgcaaaccacctataggggaacactggggcaaaggatccccatgtaccaatgttgcagtaaatccaggtgattgtccaccattagagttaataaacacagttattcaggatggtgatatggttgatactggctttggtgctatggactttactacattacaggctaacaaaagtgaagttccactggatatttgtacatctatttgcaaatatccagattatattaaaatggtgtcagaaccatatggcgacagcttatttttttatttacgaagggaacaaatgtttgttagacatttatttaatagggctggtactgttggtgaaaatgtaccagacgatttatacattaaaggctctgggtctactgcaaatttagccagttcaaattattttcctacacctagtggttctatggttacctctgatgcccaaatattcaataaaccttattggttacaacgagcacagggccacaataatggcatttgttggggtaaccaactatttgttactgttgttgatactacacgcagtacaaatatgtcattatgtgctgccatatctacttcagaaactacatataaaaatactaactttaaggagtacctacgacatggggaggaatatgatttacagtttatttttcaactgtgcaaaataaccttaactgcagacgttatgacatacatacattctatgaattccactattttggaggactggaattttggtctacaacctcccccaggaggcacactagaagatacttataggtttgtaacatcccaggcaattgcttgtcaaaaacatacacctccagcacctaaagaagatccccttaaaaaatacactttttgggaagtaaatttaaaggaaaagttttctgcagacctagatcagtttcctttaggacgcaaatttttactacaagcaggattgaaggccaaaccaaaatttacattaggaaaacgaaaagctacacccaccacctcatctacctctacaactgctaaacgcaaaaaacgtaagctgtaa 1519
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgcggatccgcgatgtgcctg 21
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccggaattccggttacttcctgg 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tattggttacaacgagcacagcg
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
catattcctccccatgtcgtag 22
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tcgatcccgtctgcctccaccaatct 26
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tttgttactgtggtagataccactc 25
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
caacatgtctgctatactgcttaa 24
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cagtaccaatttaacaatatgtgct 25
Claims (8)
1.一种高危型HPV假病毒颗粒作为HPV核酸检测的假病毒标准物质的用途,其中所述高危型HPV假病毒颗粒由下述制备方法得到:将编码HPV衣壳蛋白的L1基因连入腺病毒载体,转染293细胞,收集假病毒颗粒,纯化假病毒颗粒;其中,所述纯化步骤如下:
(1)超声处理所述腺病毒颗粒,保留上清液;
(2)向上清液中加入Dnase Ⅰ处理;
(3)采用104-106g超速离心1-3小时,收集沉淀;
(4)取溶解后的样品加入超速离心管中,并依次加入20%,40%和60%的蔗糖,0.7×105g -1.5×105g离心2-4小时,将分布于蔗糖条带之间的腺病毒颗粒吸取出来;
(5)溶解后再次于0.8×105g -1.5×105g离心2-4小时,溶解沉淀;
(6)向(5)中得到的腺病毒溶液中加入的PEG6000,使其终浓度为40%-60%;
(7)利用磁力搅拌器搅拌过夜,后于7000g-8000g离心20min-40min,收集溶解病毒沉淀;溶解病毒沉淀后,再次于7000g-8000g离心20 min-40min,收集沉淀;
所述用途是利用含有保护剂的溶液重新溶解第(7)步所得到的沉淀以作为HPV核酸检测的假病毒标准物质,并对其进行数字PCR定值,进行分装和冻存;所述保护剂是海藻糖和牛血清白蛋白作为保护剂,且海藻糖浓度不低于10%、牛血清白蛋白不低于5%。
2.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述HPV是HPV16或HPV18。
3.如权利要求2所述的用途,其特征在于,所述编码HPV衣壳蛋白的L1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
4.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述第(2)步中加入DnaseⅠ于37℃处理4-6小时。
5.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述对标准物质的数字PCR定值是通过针对HPV L1基因的数字PCR方法进行定量检测,以标准物质中L1基因的拷贝数浓度作为其量值。
6.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述保护剂是含有10%海藻糖和5%牛血清白蛋白作为保护剂。
7.如权利要求1至6任一项所述的用途,其特征在于,将所述假病毒标准物质于室温以下温度保存。
8.如权利要求7所述的用途,其特征在于,将所述假病毒标准物质于低于4℃的温度下进行保存。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110815581.4A CN113528469B (zh) | 2021-07-19 | 2021-07-19 | 一种高危型hpv核酸检测假病毒标准物质 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110815581.4A CN113528469B (zh) | 2021-07-19 | 2021-07-19 | 一种高危型hpv核酸检测假病毒标准物质 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN113528469A CN113528469A (zh) | 2021-10-22 |
CN113528469B true CN113528469B (zh) | 2023-05-09 |
Family
ID=78100284
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202110815581.4A Active CN113528469B (zh) | 2021-07-19 | 2021-07-19 | 一种高危型hpv核酸检测假病毒标准物质 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN113528469B (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN117987516A (zh) * | 2022-11-07 | 2024-05-07 | 深圳大学 | 一种核酸绝对定量检测体系及核酸绝对定量方法 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100785397B1 (ko) * | 2001-06-28 | 2007-12-13 | 아피메즈 주식회사 | 인체 파필로마 바이러스 유사 입자를 생산하는 재조합아데노바이러스 벡터 및 자궁경부암 생백신 |
CN100392084C (zh) * | 2006-03-13 | 2008-06-04 | 曾毅 | 含密码子优化型hpv16l1基因的重组腺病毒 |
CN102649963B (zh) * | 2012-04-01 | 2013-11-13 | 北京工业大学 | 可用于食管癌防治的基于hpv l1基因的重组腺病毒 |
CN110511926B (zh) * | 2019-09-06 | 2021-11-30 | 郑州安图生物工程股份有限公司 | 一种质粒、假病毒的保存液及其用途 |
CN112359022B (zh) * | 2020-07-30 | 2022-07-05 | 中国计量科学研究院 | 检测用新型冠状病毒核酸假病毒标准物质及其制备方法 |
-
2021
- 2021-07-19 CN CN202110815581.4A patent/CN113528469B/zh active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN113528469A (zh) | 2021-10-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN106947838A (zh) | 非洲猪瘟病毒非结构基因实时荧光lamp检测引物组、试剂盒及检测方法 | |
CN103572378A (zh) | 基于Ion ProtonTM测序平台的小片段DNA文库的构建方法及其应用 | |
CN103275862A (zh) | 一种检测甲型流感病毒h7n9亚型的荧光定量rt-pcr试剂盒 | |
WO2014079350A1 (zh) | 检测cho细胞dna的方法 | |
CN111286559B (zh) | 检测非洲猪瘟病毒的引物、探针及试剂盒 | |
Luan et al. | Development of a real-time quantitative RT-PCR to detect REV contamination in live vaccine | |
CN110628953B (zh) | 一种用于人乳头瘤病毒分型检测的试剂盒 | |
CN112029803A (zh) | 一种慢病毒过表达病毒载体及其制备方法、用途 | |
CN108929869B (zh) | Hpv全长基因组质控品的制备方法、扩增引物及检测试剂 | |
CN113528469B (zh) | 一种高危型hpv核酸检测假病毒标准物质 | |
CN109837345A (zh) | 检测小鼠细胞残留dna的引物及方法 | |
CN115927565A (zh) | 基于mNGS检测CAR-T细胞制品中病原微生物的方法建立及应用 | |
CN114075553B (zh) | 一种可用于新冠病毒中和抗体活性评价和作为核酸检测标准物的假病毒颗粒及其制备方法 | |
CN109439800B (zh) | 检测hiv-1基因pr区和rt区基因突变的试剂盒及方法 | |
CN114622005A (zh) | 用于检测mdck细胞dna片段大小分布的引物对及检测方法 | |
CN112011632A (zh) | 多粘菌素耐药基因mcr-4的RPA检测引物组、试剂盒和方法 | |
CN114717303B (zh) | 基于多重pcr及高通量测序技术检测成骨不全症相关基因的引物组、试剂盒及应用 | |
CN112941240B (zh) | 检测鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒的引物对、试剂盒及方法 | |
CN108531511A (zh) | 一种表达非洲猪瘟病毒e183l基因重组腺病毒载体、构建方法及重组腺病毒制备方法 | |
CN114836580A (zh) | 呼吸道感染性疾病病原体的多重qPCR检测引物组合 | |
CN109628640B (zh) | 一种快速检测鲤春病毒血症病毒的rpa-lfd引物、方法和试剂盒 | |
CN113930512A (zh) | 一种模拟血浆循环肿瘤游离dna标准品及其制备方法与应用 | |
CN109112134B (zh) | 一种视网膜变性疾病的best1新突变致病基因及其试剂盒 | |
CN114540538A (zh) | 一种同时定量检测ehv-1和ehv-4的检测试剂盒及其应用 | |
CN106929601A (zh) | 一种高灵敏人乳头瘤病毒6,11型核酸检测试剂盒 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |