CN114622005A - 用于检测mdck细胞dna片段大小分布的引物对及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物检测领域，尤其涉及用于检测MDCK细胞DNA片段大小分布的引物对、及检测方法，所述引物对至少包含4组引物对；其中：各引物对中的正向引物和反向引物分别特异性结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示区段；各组引物对扩增获得的扩增产物的长度分别为100bp以下、100‑200bp、200‑500bp以及500bp以上。本发明能够用于分析流感疫苗中间品、成品中的MDCK残留DNA片段，有利于改进工艺、提高产品质量，用于产品质量控制和放行。同时利用所述引物对的PCR检测方法操作简便快捷，从获得样本到给出检测报告只需4h；灵敏度高，定量限均为30 fg/rxn；专属性强，能区分E.coli、CHO细胞、NS0细胞、Vero细胞、毕赤酵母或人类等干扰性DNA。

Description

用于检测MDCK细胞DNA片段大小分布的引物对及检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测领域，尤其涉及用于检测MDCK细胞DNA片段大小分布的引物对及检测方法。
背景技术
生物制品中的疫苗、重组蛋白药、抗体药等产品多采用连续传代的动物细胞株表达生产。MDCK（Madin-Darby canine kidney）细胞系是一种连续传代的犬肾细胞系，具有病毒感染效率高、增殖快、不易变异等优点，目前欧洲药典已经批准使用此细胞系生产流感疫苗且已有相关疫苗上市。诺华（Novartis）公司分别在2007年和2009年推出MDCK细胞基质的流感疫苗Optaflu和甲型H1N1流感疫苗，相比传统的鸡胚接种培养技术，MDCK细胞培养技术大大节约了生产时间。
但是，市场对与使用MDCK细胞来生产流感疫苗仍存有顾虑。因为有文献报道，MDCK细胞对免疫缺陷动物性动物具有不同程度的致瘤性，且有研究表明，细胞培养基成分可以影响MDCK细胞是否具有致瘤性。尽管在MDCK细胞基质流感疫苗生产过程中，通过超滤、核酸酶处理、层析、β-丙内酯灭活等方法可以去除多数宿主细胞残留DNA，但疫苗产品中仍有可能残留DNA片段。因此，为控制疫苗生产质量，需要对疫苗中MDCK宿主细胞残留DNA的片段进行监测。
国内外监管机构对于疫苗中宿主细胞DNA的残留量和残留DNA片段的大小分布等有强烈的关注。对于宿主细胞DNA的残留量，根据宿主细胞类型、给药方式和给药频率，一般允许疫苗中其含量在100 pg~10 ng/剂之间。欧洲药典通则规定的生物制品残留DNA限度大多为不超过10 ng/剂，但对个别疫苗的残留DNA限定标准更严格，如甲型肝炎灭活疫苗中的DNA残留量不得超过100 pg/剂，乙型肝炎疫苗中的DNA残留量不得超过10 pg/剂。而在对于残留DNA片段，有报道表明一个功能基因的长度至少200 bp，现国家药品监督管理局（NMPA）生物制品药学部在基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（征求意见稿）中指出，残留DNA片段应小于200 bp。在美国，FDA要求疫苗生产企业应该测试成品中的残留DNA的数量和片段大小的分布情况，并在关于人类基因治疗新产品生产指导文件中明确指出HCD的片段要小于200 bp。
目前可见报道中对疫苗成品残留DNA片段的分析方法主要有毛细管电泳和定量PCR法（qPCR）。毛细管电泳是近年来发展起来一种分离、分析技术，用于对核酸浓度和纯度的测定，其对DNA/RNA的检测灵敏度约为1~5 pg/μL。相较于毛细管电泳法，qPCR法的检测限可达fg级别，具有更高的灵敏度，且qPCR法操作简便、样品通量较高，作为国际公认的残留DNA的检测方法，目前分子生物学实验室已普遍具备qPCR的实验条件。尽管市场对MDCK细胞基质疫苗的残留DNA片段检测分析有着迫切的需求，但尚未见相关报道。
背景技术中引用的相关参考文献如下所示：
1.E A Govorkova, G. M., B Meignier, C de Taisne, R G Webster, Africangreen monkey kidney (Vero) cells provide an alternative host cell system forinfluenza A and B viruses. 1996, 70 (8).。
2.Zhang DL, L. L., Xia GT, et al., Analyses of chromosomal karyotypesand cytogenetic variations of animal cell lines. Yi Chuan xue bao = ActaGenetica Sinica 2001, 28 (4), 327-344. 。
3.闫璐瑶, 张., 张青梅,等, 宿主细胞残留DNA片段大小分布检测方法的建立及验证 [J]. 中国生物制品学杂志 2021, 34 (3), 6. 。
4.闫璐瑶, 生物制品中宿主细胞残留DNA检测的研究进展 [J]. 国际生物制品学杂志 2021, 44 (3), 5. 。
5.FDA, Guidance for industry: characterization and qualification ofcell substrates and other biological materials used in the production ofviral vaccines for infectious disease indications. 2010. 。
6.国家药典委员会, 中华人民共和国药典2020年版三部 [M]. 北京：中国医药科技出版社 2020, 555. 。
7.FDA, 1130 NUCLEIC ACID-BASED TECHNIQUES—APPROACHES FOR DETECTINGTRACE NUCLEIC ACIDS (RESIDUAL DNA TESTING) [EB/OL]. 。https://www.drugfuture.com/Pharmacopoeia/usp35/data/v35300/usp35nf30s0_c1130.html. 。
发明内容
本发明是为了克服现有技术中对于MDCK细胞残留DNA的检测分析方法尚未完善，因此提供了一种用于检测MDCK细胞DNA片段大小分布的引物对及检测方法。
为实现上述发明目的，本发明通过以下技术方案实现：
在第一方面，本发明首先提供了一种用于检测MDCK细胞DNA片段大小分布的引物对，
至少包含4组引物对；其中：
各引物对中的正向引物和反向引物分别特异性结合于MDCK细胞基因组DNA 上SEQID NO:1所示区段；
各组引物对扩增获得的扩增产物的长度分别为100bp以下、100-200bp、200-500bp以及500bp以上。
作为优选，所述引物对选自以下引物对：
第一引物对，其中的正向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第774-816位；所述反向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第832-876位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为74-94bp；
第二引物对，其中的正向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第732-773位；所述反向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第850-893位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为132-152bp；
第三引物对，其中的正向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第746-786位；所述反向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第931-969位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为194-214bp；
第四引物对，其中的正向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第746-786位；所述反向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第1227-1269位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为494-514bp。
作为优选，所述引物对选自以下引物对：
第一引物对，其中的正向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第784-806位；所述反向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第842-866位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为84bp；
第二引物对，其中的正向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第742-763 位；所述反向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第860-883位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为142bp；
第三引物对，其中的正向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第756-776 位；所述反向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第941-959位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为204bp；
第四引物对，其中的正向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第756-776位；所述反向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第1237-1259位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为504bp。
作为优选，所述第一引物对的正向引物如SEQ ID NO:4所示，反向引物如SEQ IDNO:5所示；
所述第二引物对的正向引物如SEQ ID NO:2所示，反向引物如SEQ ID NO:6所示；
所述第三引物对的正向引物如SEQ ID NO:3所示，反向引物如SEQ ID NO:7所示；
所述第四引物对的正向引物如SEQ ID NO:3所示，反向引物如SEQ ID NO:8所示。
在第二方面，本发明还提供了用于检测MDCK细胞DNA片段大小分布的引物对的组合，
所述引物上所示，且至少包括下述组合：
所述第一引物对+所述第二引物对+所述第三引物对；
所述第一引物对+所述第二引物对+所述第四引物对；
所述第一引物对+所述第二引物对+所述第三引物对+所述第四引物对。
在第三方面，本发明还提供了用于检测MDCK细胞残留DNA的检测试剂，
所述检测试剂包括如上所述的引物对或者如上所述的引物对的组合。
作为优选，所述检测试剂中还包括探针。
作为优选，所述探针如SEQ ID NO:9所示，所述SEQ ID NO:9所示的序列结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第813-840位。
将正向引物、反向引物以及探针组合后，即可获得所述检测试剂，在此本申请提出以下几种优选的组合方式。
优选检测试剂组合1：正向引物如SEQ ID NO:4所示；反向引物如SEQ ID NO:5所示，探针如SEQ ID NO:9所示，所述检测试剂所扩增获得的扩增产物长度为84bp。
优选检测试剂组合2：正向引物如SEQ ID NO:2所示；反向引物如SEQ ID NO:6所示，探针如SEQ ID NO:9所示，所述检测试剂所扩增获得的扩增产物长度为142bp。
优选检测试剂组合3：正向引物如SEQ ID NO:3所示；反向引物如SEQ ID NO:7所示，探针如SEQ ID NO:9所示，所述检测试剂所扩增获得的扩增产物长度为204bp。
优选检测试剂组合4：正向引物如SEQ ID NO:3所示；反向引物如SEQ ID NO:8所示，探针如SEQ ID NO:9所示，所述检测试剂所扩增获得的扩增产物长度为504bp。
作为优选，所述检测试剂中的探针端部标记有荧光报告基团FAM以及淬灭基团TAMRA。
作为优选，所述检测试剂的灵敏度为30 fg/rxn。
在第四方面，本发明还提供了用于检测MDCK细胞残留DNA的检测试剂盒，
其包含所述的引物对或者引物对的组合或者所述的检测试剂。
作为优选，所述检测试剂盒中还包括标准品对照。
在第五方面，本发明还提供了一种MDCK细胞残留DNA的检测方法，
所述方法包括：利用所述的引物对或者引物对的组合或者所述的检测试剂或者所述的检测试剂盒，对待测样品进行qPCR，并检测qPCR扩增产物。
第六方面，本发明还提供了所述的引物对或者检测试剂或者检测试剂盒的用途，用于检测待测对象中是否存在MDCK细胞残留DNA及其片段大小分布。
作为优选，所述待测对象选自基于MDCK细胞基质培育制备的疫苗、重组蛋白药、抗体药中的任意一种。
因此，本发明具有以下有益效果：
本发明的目的是提供一种采用实时荧光定量PCR（real-time qPCR）技术定量检测MDCK残留DNA片段的试剂盒，用于分析流感疫苗中间品、成品中的MDCK残留DNA片段，有利于改进工艺、提高产品质量，用于产品质量控制和放行。
利用所述引物对的PCR检测方法操作简便快捷，从获得样本到给出检测报告只需4h；灵敏度高，定量限均为30 fg/rxn；专属性强，能区分E.coli、CHO细胞、NS0细胞、Vero细胞、毕赤酵母或人类等干扰性DNA。
通过对模拟样本及实际样本的检测，所建立的方法能得到流感疫苗中MDCK残留DNA片段大小分布情况的结果。
附图说明
图1为体系1的标准曲线的扩增曲线。
图2为体系1的线性关系图。
图3为体系2的标准曲线的扩增曲线。
图4为体系2的线性关系图。
图5为体系3的标准曲线的扩增曲线。
图6为体系3的线性关系图。
图7为体系4的标准曲线的扩增曲线。
图8为体系4的线性关系图。
图9 为专属性测试的扩增曲线。
图10 为定量限测试的扩增曲线。
具体实施方式
下面结合说明书附图以及具体实施例对本发明做进一步描述。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。此外，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
本发明的引物对
本发明所使用的术语“引物”具有本领域技术人员常规理解的意义。本发明的MDCK细胞残留DNA特异性引物不是针对外源基因本身或者病毒载体本身设计，而是针对MDCK细胞残留DNA的SEQ ID NO:1所示序列设计的。换言之，本发明的引物可以特异性结合于MDCK细胞基因组DNA的SEQ ID NO:1所示序列。
其中MDCK细胞基因组DNA的SEQ ID NO:1所示序列具体如下所示：
ATTCTCTGGCTGTCTTTGAGTTTTGTTGACTGTATCCTTTGCTGTGCAAAAGCTTCTTATCTTGATGAAGTCCCAATAGTTCATTTTTGCTTTTGTTTCTTTTGCCTTCGTGGATGTATCTTGCAAGAAGTTACTATGGCCGAGTTCAAAAAGGGTGTTGCCTGTGTTCTTCTCTAGGATTTTGATGGAATCTTGTCTCACATTTAGATCTTTCATCCATTTTGAGTTTATCTTTGTGTATGGTGAAAGAGAGTGGTCTAGTTTCATTCTTCTGCATGTGGATGTCCAATTTTCCCAGCACCATTTATTGAAGAGACTGTCTTTCTTCCAATGGATAGTCTTTCCTCCTTTATCGAATATTAGTTGCCCATAAAGTTCAGGGTCCACTTCTGGATTCTCTATTCTGTTCCACTGATCTATGTGTCTGAAGATATTTGCAAATGACATATCAGATAAAGGGCTAGTTTCCAAGATCTATAAAGAACTTATTAAACTCAACACCAAAGAAACAAACAATCCAATCATGAAATGGGCAAAAGACATGAACAGAAATCTCACAGAAGAAGACATAGACATGGCCAACATGCACATGAGAAAATGCTCTGCATCACTTGCCATCAGGGAAATACAAATCAAAACCACAATGAGATACCACCTCACACCAGTGAGAATGGGAAAAATTAACAAGGCAGGAAACAACAAATGTTGGAGAGGATGTGGAGAAAAGGGAACCCTCTTACACTGTTGGTGGGAATGTGAACTGGTGCAGCCACTGTGGAAAACTGTGTGGAGGTTCCTCAAACAGTTAAAAATATACCTGCCCTACGACCCAGCAATTGCACTGTTGGGGATTTACCCCAAAGATACAAATGCAATGAAACGCTGGGACACCTGCACCCCGATGTTTCTAGCAGCAATGGCCACGATAGCCAAACTGTGGAAGGAGCCTCGGTGTCCAACGAAAGATGAATGGATAAAGAAGATGTGGTTTATGTATACAATGGAATATTACTCAGCTATTAGAAATGACAAATACCCACCATTTGCTTCAACGTGGATGGAACTGGAGGGTATTATGCTGAGTGAAGTAAGTCAGTCGGAGAAGGACAAACATTATATGTTCTCATTCATTTGGGGAATATAAATAATAGTGAAAGGGAAAATAAGGGAAGGGAGAAGAAATGTGTGGGAAATATCAGAAAGGGAGACAGAACATAAAGACTGCTAACTCTGGGAAACGAACTAGGGGTGGTAGAAGGGGAGGAGGGCGGGGGGTGGGAGTGAATGGGTGACGGGCACTGGGTGTTATTCTGTATGTTAGTAAATTGAACACCAATAAAAATAAAATAAAATAAAATAAAATAAAATAAAATAAAAAAAAAAATAACATTCTCTGGC。
鉴于本发明的教导和本领域的公知常识，本领域技术人员应该理解，针对SEQ IDNO:1所示序列可以设计多种引物对。因此，本发明的引物对不限于实施例中具体的到的引物对。
在具体的实施方式中，正向引物如SEQ ID NO:2~4中的任意一项所示。
SEQ ID NO:2所示序列具体为：CTGTTGGTGGGAATGTGAACTG，其结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第742-763位。
SEQ ID NO:3所示序列具体为：GTGAACTGGTGCAGCCACTGT，其结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第756-776位。
SEQ ID NO:4所示序列具体为：TGTGTGGAGGTTCCTCAAACAGT，其结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第784-806位。
在具体的实施方式中，反向引物如SEQ ID NO:5~8中的任意一项所示。
SEQ ID NO:5所示序列具体为：GTATCTTTGGGGTAAATCCCCAACA，其结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第842-866位。
SEQ ID NO:6所示序列具体为：GCGTTTCATTGCATTTGTATCTTT，其结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第860-883位。
SEQ ID NO:7所示序列具体为：TTGGACACCGAGGCTCCTT，其结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第941-959位
SEQ ID NO:8所示序列具体为：CCTTCTACCACCCCTAGTTCGTT，其结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第1237-1259位。
在具体的实施方式中，所述引物对选自以下引物对：
第一引物对：正向引物如SEQ ID NO:4所示，反向引物如SEQ ID NO:5所示；
第二引物对：正向引物如SEQ ID NO:2所示，反向引物如SEQ ID NO:6所示；
第三引物对：正向引物如SEQ ID NO:3所示，反向引物如SEQ ID NO:7所示；
第四引物对：正向引物如SEQ ID NO:3所示，反向引物如SEQ ID NO:8所示。
引物对的组合
所述引物对如上所述第一引物对、第二引物对、第三引物对以及第四引物对所示，且至少包括下述组合：
所述第一引物对+所述第二引物对+所述第三引物对；
所述第一引物对+所述第二引物对+所述第四引物对；
所述第一引物对+所述第二引物对+所述第三引物对+所述第四引物对。
本发明的探针
本文所述的术语“探针”具有本领域技术人员常规理解的意义，即一小段单链DNA或者RNA片段，用于检测与其互补的核酸序列。
鉴于本发明的教导和本领域的公知常识，本领域技术人员应该理解，在知晓引物对的前提下，本领域技术人员可以根据正向引物和反向引物结合位点之间的模板序列自主设计探针，并检测该探针与引物对的技术效果。在具体的实施方式中，本领域普通技术人员可根据需要具体设计探针，所述探针可以处于液相中，也可以固定于固相上；可以在扩增前结合，也可以在扩增后结合。因此，本发明的探针并不限于实施例中具体公开的探针。本发明的引物对也不限 于与实施例中具体公开的探针配对使用。
在具体的实施方式中，本发明的探针如SEQ ID NO:9所示序列。
SEQ ID NO:9所示序列具体为：
FAM-TATACCTGCCCTACGACCCAGCAATTGC-TAMRA，其结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQID NO:1所示序列的第813-840位。
本发明的检测试剂
本发明还提供用于检测MDCK细胞残留DNA的检测试剂，所述检测试剂包含本发明的引物对、探针以及实施PCR所需的其它成分，例如qPCR reaction buffer，DNA稀释液，DNA定量参考品，样品提取纯化液。
在具体的实施方式中：
所述引物对，包含如上所述第一引物对、第二引物对、第三引物对以及第四引物。
所述探针为如SEQ ID NO:4所示的序列。
所述第一引物对、第二引物对、第三引物对以及第四引物与探针之间结合，在此本申请提出以下几种优选的组合方式。
优选检测试剂组合1：正向引物如SEQ ID NO:4所示；反向引物如SEQ ID NO:5所示，探针如SEQ ID NO:9所示，所述检测试剂所扩增获得的扩增产物长度为84bp。
优选检测试剂组合2：正向引物如SEQ ID NO:2所示；反向引物如SEQ ID NO:6所示，探针如SEQ ID NO:9所示，所述检测试剂所扩增获得的扩增产物长度为142bp。
优选检测试剂组合3：正向引物如SEQ ID NO:3所示；反向引物如SEQ ID NO:7所示，探针如SEQ ID NO:9所示，所述检测试剂所扩增获得的扩增产物长度为204bp。
优选检测试剂组合4：正向引物如SEQ ID NO:3所示；反向引物如SEQ ID NO:8所示，探针如SEQ ID NO:9所示，所述检测试剂所扩增获得的扩增产物长度为504bp。
在具体的实施方式中，本发明的检测试剂的检测灵敏度达到30 fg/rxn。
在本发明的引物对或检测试剂的基础上，本发明还提供了用于检测MDCK细胞残留DNA的检测试剂盒，所述试剂盒中包括容器以及位于容器中的上述本发明引物对以及探针。
在具体的实施方式中，本发明中的试剂盒还包括：qPCR reaction buffer、DNA稀释液、DNA定量参考品以及样品提取纯化液。
在本发明的引物对或检测试剂的基础上，本发明进一步提供了MDCK细胞残留DNA的检测方法，所述方法包括利用如上所述的引物对或者如上所述的检测试剂或者如上所述的检测试剂盒，对待测样品进行qPCR，并检测qPCR扩增产物。
下面结合具体实施例，对本发明作进一步阐述，应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或者按照制造厂商所建议的条件，除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
【实验材料】
qPCR检测体系：
qPCR reaction buffer，DNA稀释液，本发明引物对，本发明探针，DNA定量参考品，样品提取纯化液。其中本发明靶标序列、引物对以及探针的组成具体如下表1所示。
表1
Figure 876302DEST_PATH_IMAGE001
将引物对以及探针进行组合，得到如下表2所示的几种不同的体系。
表2
组合方式 产物大小
体系1 SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:5 84bp
体系2 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:6 142bp
体系3 SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:7 204bp
体系4 SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:8 504bp
【性能验证】
1.线性范围
扩增四种不同片段检测体系的标准曲线，计算标准曲线相关系数（R2）和扩增效率（En）。结果表明，建立的四种不同片段检测体系的线性范围为3 ng/rxn~30 fg/rxn，标准曲线R2≥0.990，En为83.3%~110.0%，NTC Ct值≥35.00，内部质控信号Ct值≤32.00。
其中体系1~体系4的标准曲线的扩增曲线以及线性关系图如图1~8所示，表3为四种不同片段检测体系的线性范围测试结果表。
表3. 四种不同片段检测体系的线性范围测试结果
Figure 864987DEST_PATH_IMAGE002
2.专属性
评估生产常用的工程细胞基因组CHO、E.coli、Human、NS0、Vero、毕赤酵母六种细胞/菌的基因组DNA对MDCK不同片段检测体系的干扰。结果表明，所选六种干扰基因组DNA的检测Ct值均≥35.00，说明其对已建立的四组体系干扰较小，体系表现出较优的专属性。专属性测试的扩增曲线如图9所示，专属性测试的扩增曲线如图9所示，表4为四种不同片段检测体系的专属性测试结果表。
表4专属性测试结果
Figure 679359DEST_PATH_IMAGE003
3. 定量限
扩增四种不同片段检测体系的标准曲线（3 ng/rxn~30 fg/rxn），同时测定各组在模板量为30 fg/rxn的检测Ct值（10复孔），将检测Ct值代入标准曲线计算得到各孔检测浓度，计算10复孔检测浓度的变异系数（CV）和偏差。结果表明，各体系30 fg/rxn检测浓度的CV和偏差均≤30.0%，定量限均为30 fg/rxn，定量限测试的扩增曲线如图10所示，定量限检测结果如表5所示。
表5. 定量限检测结果
Figure 970663DEST_PATH_IMAGE004
综上所述，本发明能够提供一种采用实时荧光定量PCR（real-time qPCR）技术定量检测MDCK残留DNA片段的试剂盒，其能够用于分析流感疫苗中间品、成品中的MDCK残留DNA片段，有利于改进工艺、提高产品质量，用于产品质量控制和放行。利用所述引物对的PCR检测方法操作简便快捷，从获得样本到给出检测报告只需4h；灵敏度高，定量限均为30fg/rxn；专属性强，能区分E.coli、CHO细胞、NS0细胞、Vero细胞、毕赤酵母或人类等干扰性DNA。通过对模拟样本及实际样本的检测，所建立的方法能得到流感疫苗中MDCK残留DNA片段大小分布情况的结果。
序列表
<110> 湖州申科生物技术有限公司
<120> 用于检测MDCK细胞DNA片段大小分布的引物对及检测方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1398
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
attctctggc tgtctttgag ttttgttgac tgtatccttt gctgtgcaaa agcttcttat 60
cttgatgaag tcccaatagt tcatttttgc ttttgtttct tttgccttcg tggatgtatc 120
ttgcaagaag ttactatggc cgagttcaaa aagggtgttg cctgtgttct tctctaggat 180
tttgatggaa tcttgtctca catttagatc tttcatccat tttgagttta tctttgtgta 240
tggtgaaaga gagtggtcta gtttcattct tctgcatgtg gatgtccaat tttcccagca 300
ccatttattg aagagactgt ctttcttcca atggatagtc tttcctcctt tatcgaatat 360
tagttgccca taaagttcag ggtccacttc tggattctct attctgttcc actgatctat 420
gtgtctgaag atatttgcaa atgacatatc agataaaggg ctagtttcca agatctataa 480
agaacttatt aaactcaaca ccaaagaaac aaacaatcca atcatgaaat gggcaaaaga 540
catgaacaga aatctcacag aagaagacat agacatggcc aacatgcaca tgagaaaatg 600
ctctgcatca cttgccatca gggaaataca aatcaaaacc acaatgagat accacctcac 660
accagtgaga atgggaaaaa ttaacaaggc aggaaacaac aaatgttgga gaggatgtgg 720
agaaaaggga accctcttac actgttggtg ggaatgtgaa ctggtgcagc cactgtggaa 780
aactgtgtgg aggttcctca aacagttaaa aatatacctg ccctacgacc cagcaattgc 840
actgttgggg atttacccca aagatacaaa tgcaatgaaa cgctgggaca cctgcacccc 900
gatgtttcta gcagcaatgg ccacgatagc caaactgtgg aaggagcctc ggtgtccaac 960
gaaagatgaa tggataaaga agatgtggtt tatgtataca atggaatatt actcagctat 1020
tagaaatgac aaatacccac catttgcttc aacgtggatg gaactggagg gtattatgct 1080
gagtgaagta agtcagtcgg agaaggacaa acattatatg ttctcattca tttggggaat 1140
ataaataata gtgaaaggga aaataaggga agggagaaga aatgtgtggg aaatatcaga 1200
aagggagaca gaacataaag actgctaact ctgggaaacg aactaggggt ggtagaaggg 1260
gaggagggcg gggggtggga gtgaatgggt gacgggcact gggtgttatt ctgtatgtta 1320
gtaaattgaa caccaataaa aataaaataa aataaaataa aataaaataa aataaaaaaa 1380
aaaataacat tctctggc 1398
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctgttggtgg gaatgtgaac tg 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtgaactggt gcagccactg t 21
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgtgtggagg ttcctcaaac agt 23
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtatctttgg ggtaaatccc caaca 25
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcgtttcatt gcatttgtat cttt 24
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttggacaccg aggctcctt 19
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccttctacca cccctagttc gtt 23
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tatacctgcc ctacgaccca gcaattgc 28

Claims (12)

1.用于检测MDCK细胞DNA片段大小分布的引物对，其特征在于，
至少包含4组引物对；其中：
各引物对中的正向引物和反向引物分别特异性结合于MDCK细胞基因组DNA 上SEQ IDNO:1所示区段；
各组引物对扩增获得的扩增产物的长度分别为100bp以下、100-200bp、200-500bp以及500bp以上。
2.根据权利要求1所述用于检测MDCK细胞DNA片段大小分布的引物对，其特征在于，
所述引物对选自以下引物对：
第一引物对，其中的正向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第774-816位；所述反向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第832-876位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为74-94bp；
第二引物对，其中的正向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第732-773位；所述反向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第850-893位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为132-152bp；
第三引物对，其中的正向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第746-786位；所述反向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第931-969位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为194-214bp；
第四引物对，其中的正向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第746-786位；所述反向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第1227-1269位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为494-514bp。
3.根据权利要求1或2中任意一项用于检测MDCK细胞DNA片段大小分布的引物对，其特征在于，
所述引物对选自以下引物对：
第一引物对，其中的正向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第784-806位；所述反向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第842-866位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为84bp；
第二引物对，其中的正向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第742-763 位；所述反向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第860-883位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为142bp；
第三引物对，其中的正向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第756-776 位；所述反向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第941-959位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为204bp；
第四引物对，其中的正向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第756-776位；所述反向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第1237-1259位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为504bp。
4.根据权利要求3所述用于检测MDCK细胞DNA片段大小分布的引物对，其特征在于，
所述第一引物对的正向引物如SEQ ID NO:4所示，反向引物如SEQ ID NO:5所示；
所述第二引物对的正向引物如SEQ ID NO:2所示，反向引物如SEQ ID NO:6所示；
所述第三引物对的正向引物如SEQ ID NO:3所示，反向引物如SEQ ID NO:7所示；
所述第四引物对的正向引物如SEQ ID NO:3所示，反向引物如SEQ ID NO:8所示。
5.用于检测MDCK细胞DNA片段大小分布的引物对的组合，其特征在于，
所述引物如权利要求2~4中任意一项所示，且至少包括下述组合：
所述第一引物对+所述第二引物对+所述第三引物对；
所述第一引物对+所述第二引物对+所述第四引物对；
所述第一引物对+所述第二引物对+所述第三引物对+所述第四引物对。
6.用于检测MDCK细胞残留DNA的检测试剂，其特征在于，
所述检测试剂包括如权利要求1~4中任意一项所述的引物对或者如权利要求5所述的引物对的组合。
7.根据权利要求6所述的用于检测MDCK细胞残留DNA的检测试剂，其特征在于，
还包括探针。
8.根据权利要求7所述的用于检测MDCK细胞残留DNA的检测试剂，其特征在于，
所述探针如SEQ ID NO:9所示。
9.用于检测MDCK细胞残留DNA的检测试剂盒，其特征在于，
其包含如权利要求1~4中任意一项所述的引物对或者如权利要求5所述的引物对的组合或者6~8中任意一项所述的检测试剂。
10.一种MDCK细胞残留DNA的检测方法，其特征在于，
所述方法包括：利用如权利要求1~4中任意一项所述的引物对或者如权利要求5所述的引物对的组合或者6~8中任意一项所述的检测试剂或者权利要求9所述的检测试剂盒，对待测样品进行qPCR，并检测qPCR扩增产物。
11.权利要求1~4中任意一项所述的引物对或者如权利要求5所述的引物对的组合或者6~8中任意一项所述的检测试剂或者权利要求9所述的检测试剂盒的用途，用于检测待测对象中是否存在MDCK细胞残留DNA及其片段大小分布。
12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，
所述待测对象选自基于MDCK细胞基质培育制备的疫苗、重组蛋白药、抗体药中的任意一种。
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